專利名稱：一種測(cè)定奶粉中肽含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及奶粉中肽含量的測(cè)定方法。
技術(shù)背景肽是兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸以肽鍵相連的化合物，是介于大分子蛋白質(zhì)和氨基酸之 間的一種具有生物活性、容易吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。肽以其具有生物活性、利于人體消化吸收 等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用在乳制品、保健食品等行業(yè)。因此，建立準(zhǔn)確快速的測(cè)定奶粉中肽含量的 方法符合行業(yè)的發(fā)展需求。蛋白質(zhì)的分析方法包括光譜法、色譜法和生物化學(xué)法等。目前的科學(xué)研究中，肽的測(cè) 定方法是利用高效液相色譜儀來(lái)分離檢測(cè)。蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的氨基酸有20種，每一種氨基 酸在肽中的位置又可以不同，因此肽的種類巨大，準(zhǔn)確測(cè)定其中每一種肽的含量非常復(fù)雜。 因此高效液相色譜法檢測(cè)肽含量的方法既不快速，也不實(shí)用，不適合應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的 質(zhì)量監(jiān)控。光譜法具有快速性和方便性的特點(diǎn)。光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法很多，如 ①基于堿性條件下含有肽鍵的化合物與Cl^+形成紫紅色絡(luò)合物的雙縮脲法；②基于堿性條件下Folin酚試劑易被蛋白質(zhì)中的酪氨酸或色氨酸還原成藍(lán)色化合物的Folin酚試劑法(即 Lowry法)；③基于酪氨酸或色氨酸在280nm處有吸收高峰的紫外吸收法；④基于肽鍵在 215nm和225nm有特征吸收的紫外吸收法；⑤基于蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后發(fā)生顏色變化的考 馬斯亮藍(lán)染色法等。其中方法①和④是建立在肽鍵的基礎(chǔ)之上的，并以雙縮脲法比較常用， 而且方法④的干擾因素較多。奶粉中除了肽以外，還含有大分子的蛋白質(zhì)，二者都含有肽鍵(-CO-NH-)，都會(huì)與雙 縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)而形成紫紅色絡(luò)合物，因此，在采用雙縮脲法測(cè)定奶粉中肽含量的過(guò)程 中，必須排除大分子蛋白質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于建立一個(gè)操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)的奶粉中肽含量的快速檢測(cè)方法。上 述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種測(cè)定奶粉中肽含量的方法，包括以下步驟
1) 將奶粉溶解于水，在酸性條件下采用加熱沉淀法和重金屬鹽溶液沉淀法沉淀其中 的大分子蛋白質(zhì)，離心去除沉淀；
2) 取上清液進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)，然后在540nm檢測(cè)溶液的吸光度值；
3) 配制一系列濃度的肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)，然后在540nrn檢測(cè)溶液的 吸光度值，制作肽濃度-吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
4) 根據(jù)吸光度值與肽濃度成正比的規(guī)律，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得步驟2)得到的吸光度值 對(duì)應(yīng)的肽濃度，從而計(jì)算出奶粉中的肽含量。
上述步驟1)充分考慮了奶粉中大分子蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，乳蛋白中的蛋白質(zhì)有兩類，一 類是酪蛋白，另一類是乳清蛋白，前者在酸性條件下沉淀，后者在加熱和有重金屬鹽存在 的條件下沉淀，因此，本發(fā)明沉淀奶粉中大分子蛋白質(zhì)的方法是酸性條件下加熱并加重金 屬鹽溶液的沉淀法。具體的做法一般是，將奶粉溶解于水，用酸調(diào)節(jié)pH值至4.0-4.8后先 進(jìn)行加熱沉淀，然后冷卻至室溫，離心去除沉淀，上清液進(jìn)一步用重金屬鹽溶液進(jìn)行沉淀， 再次離心去除沉淀。上述加熱的溫度可為80-120°C,加熱時(shí)間10-30min。重金屬鹽溶液沉 淀時(shí)所用重金屬鹽的濃度一般在0.1-100 g/L的范圍內(nèi)。沉淀物的去除采用離心的方法，即 在大于或等于2b00r/min的轉(zhuǎn)速下離心5-20min,然后取上清液進(jìn)行步驟2)的反應(yīng)。
在步驟l)中，用于調(diào)節(jié)pH的酸可選自鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、三氯乙酸和磺基水 楊酸中的一種或多種。所用的重金屬鹽可選自乙酸鉛、硫酸鉛、氯化鉛、乙酸銅、硫酸銅、 氯化銅、乙酸汞、硫酸汞和氯化汞中的一種或多種。
上述步驟2)進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)采用的雙縮脲試劑的配制方法一般是稱取硫酸銅 (CuS04*5H20) 1.5g，酒石酸鉀鈉5g，用500mL水溶解，再加10%的氫氧化鈉300mL， 溶解后用水定容至1000mL。
上述步驟3)制作肽濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，通常是先將含有2-10個(gè)氨基酸殘基的 任意一種肽用酸性水溶液配制成肽濃度為1-5 g/L的溶液，然后用酸性水溶液進(jìn)行梯度稀 釋，獲得一系列濃度的肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入雙縮脲試劑進(jìn)行反應(yīng)，并于540nm下測(cè)定吸
光度值OD，nm。以肽濃度(g/L)為橫坐標(biāo)X, OD540咖為縱坐標(biāo)Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中
所述酸性水溶液所含酸的種類及其pH值通常要求與步驟l)相同，pH值一般為4.0-4.8。 上述步驟2)和3)檢測(cè)吸光度值時(shí)使用的空白對(duì)照應(yīng)相同。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，上述步驟l)將質(zhì)量為m (g)的奶粉用水溶解，用酸 調(diào)節(jié)pH值為4.0-4.8，加熱至80-120。C沉淀10-30min，離心后將所有去除沉淀后的上清液 用重金屬鹽溶液沉淀，靜置后離心取上清液，用pH值為4.0-4.8的酸性水溶液將上清液定
容至V(mL)，搖勻后取樣加入雙縮脲試劑進(jìn)行步驟2)，在步驟2)和步驟3)進(jìn)行雙縮脲 反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件完全相同的情況下，步驟4)計(jì)算奶粉中的肽含量(mg/g) ="^，其 中C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線査到的步驟2)測(cè)得的吸光度值對(duì)應(yīng)的肽濃度(g/L)。
本發(fā)明所測(cè)定的是奶粉中肽的總含量，而無(wú)需測(cè)定肽混合物中的單一肽。利用含2-10 個(gè)氨基酸殘基的肽中的任意一種肽作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將奶粉溶解后在酸性條件下加熱和重金 屬鹽溶液沉淀奶粉樣品中的大分子蛋白后，加入雙縮脲試劑完成雙縮脲反應(yīng)，檢測(cè)吸光度 值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算得到樣品中的肽含量。該方法準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、實(shí) 用性強(qiáng)，能快速檢測(cè)奶粉中肽的含量，可用于奶粉實(shí)際生產(chǎn)中的質(zhì)量監(jiān)控。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例一中測(cè)定的肽濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖2是本發(fā)明實(shí)施例二中測(cè)定的肽濃度-吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例一
1、 雙縮脲試劑的配制
稱取硫酸銅(CuSCV5H20) L5g，酒石酸鉀鈉5g，用500mL水溶解，再加10%的氫 氧化鈉300mL，溶解后用水定容至1000mL。
2、 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
用pH4.5的鹽酸水溶液為溶劑配制3 g/L的四肽(Gly-Gly-Tyr-Arg)溶液，取10支比 色管，依次加入O.O、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6和1.8 mL上述溶液，再分別 用pH4.5的鹽酸水溶液補(bǔ)足至6.0mL，混合均勻后，分別加入雙縮脲試劑4.0mL混合均勻， 穩(wěn)定顯色后于540nm下測(cè)定OD值。以Gly-Gly-Tyr-Arg的質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)X,
ODs咖m值為縱坐標(biāo)Y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖l。
3、 樣品處理
3-1、將質(zhì)量為m (g)的奶粉樣品用水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)奶粉溶液pH值至4.5，制成 樣品溶液；
3-2、水浴鍋中IOO"C下加熱20min，然后冷至室溫，在4500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，
將全部上清液用20g/L的乙酸鉛溶液沉淀，靜置10min,再在4500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min 后，將全部上清液用pH4.5的鹽酸水溶液定容至r (mL)，搖勻；3-3、取6.0 mL上述溶液置試管中，加入雙縮脲試劑4.0mL，混合均勻，穩(wěn)定顯色后 于540nm下測(cè)定OD值(以6.0 mL的pH4.5的鹽酸水溶液加4.0mL雙縮脲試劑反應(yīng)后的 溶液作為空白對(duì)照)； 4、濃度計(jì)算從標(biāo)準(zhǔn)曲線査到步驟3-3測(cè)得的OD540nm值對(duì)應(yīng)肽濃度為C(g/L)，貝U:奶粉中的肽含量(mg/g) =^。例如，當(dāng)m二5g， F二50mL時(shí)，肽含量(mg/g) =，^ 。實(shí)施例二1、 雙縮脲試劑的配制稱取硫酸銅(CuS04*5H20) 1.5g，酒石酸鉀鈉5g，用500mL水溶解，再加10%的氫 氧化鈉300mL，溶解后用水定容至1000mL。2、 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用pH4.6的三氯乙酸水溶液為溶劑配制1 g/L的三肽(Glu-Val-Phe)溶液，取10支比 色管，依次加入O.O、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6和1.8 mL上述溶液，再分別 用pH4.6的三氯乙酸水溶液補(bǔ)足至6.0mL，混合均勻后，分別加入雙縮脲試劑4.0 mL混合 均勻，穩(wěn)定顯色后于540nm下測(cè)定OD值。以Glu-Val-Phe的質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)X，ODs40nm值為縱坐標(biāo)Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。3、 樣品處理3-1、將質(zhì)量為2.5000g的奶粉樣品用水溶解，用三氯乙酸調(diào)節(jié)奶粉溶液pH值至4.6， 制成樣品溶液；3-2、上述溶液在水浴鍋中10(TC下加熱30min，然后冷至室溫，4000r/min離心15min， 將全部上清液用15g/L的硫酸汞溶液沉淀，靜置10min，再在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min 后，將全部上清液用pH4.6的三氯乙酸水溶液定容至50mL，搖勻；3-3、取6.0mL上述溶液置試管中，加入雙縮脲試劑4.0mL混合均勻，穩(wěn)定顯色后于 540nm下測(cè)定OD值(以6.0 mL的pH4.6的三氯乙酸水溶液加4.0mL雙縮脲試劑反應(yīng)后的 溶液作為空白對(duì)照)。4、 濃度計(jì)算
肽含量(mg/g) =^f"，其中C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中査到的步驟3-3測(cè)得的OD54o^值對(duì) 應(yīng)的肽濃度(g/L)。
權(quán)利要求
1. 一種測(cè)定奶粉中肽含量的方法，包括以下步驟1)將奶粉溶解于水，在酸性條件下采用加熱沉淀法和重金屬鹽溶液沉淀法沉淀其中的大分子蛋白質(zhì)，離心去除沉淀；2)取上清液進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)，然后在540nm檢測(cè)溶液的吸光度值；3)配制一系列肽標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，同樣進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)，然后在540nm檢測(cè)溶液的吸光度值，制作肽濃度-吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；4)根據(jù)吸光度值與肽濃度成正比的規(guī)律，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得步驟2)得到的吸光度值對(duì)應(yīng)的肽濃度，從而計(jì)算出奶粉中的肽含量。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟l)將奶粉溶解于水，用酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0-4.8后先進(jìn)行加熱沉淀，然后冷卻至室溫，離心去除沉淀，上清液進(jìn)一步用重 金屬鹽溶液進(jìn)行沉淀，再次離心去除沉淀。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟l)中所述酸選自鹽酸、硝酸、硫酸、磷 酸、三氯乙酸和磺基水楊酸中的一種或多種。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟l)加熱沉淀的溫度為80-120°C,加 熱時(shí)間為10-30min。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟l)中所述重金屬鹽選自乙酸鉛、硫 酸鉛、氯化鉛、乙酸銅、硫酸銅、氯化銅、乙酸汞、硫酸汞或氯化汞中的一種或多種。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟l)中重金屬鹽溶液沉淀所用重金屬 鹽的濃度為0.1-100g/L。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟l)離心的轉(zhuǎn)速大于或等于2000 r/min，時(shí)間5-20min。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟3)以含有2-10個(gè)氨基酸殘基 的任意一種肽配制肽標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟3)以酸性水溶液為溶劑配制肽濃度 為1-5 g/L的溶液，其中所述酸性水溶液所含酸的種類及其pH值與步驟1)相同，然后 用同樣的溶劑進(jìn)行梯度稀釋，獲得一系列濃度的肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)。
10. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟l)將質(zhì)量為m的奶粉溶解于水后 用酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.0-4.8，加熱至80-120。C沉淀10-30min，離心后將所有上清液 用重金屬鹽溶液沉淀，靜置后離心，去除沉淀后的所有上清液再用pH值為4.0-4.8的 酸性水溶液定容至體積V，搖勻后取樣進(jìn)行步驟2)，在步驟2)和步驟3)進(jìn)行雙縮 脲反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件完全相同的情況下，步驟4)計(jì)算奶粉中的肽含量=，，其中C 為從標(biāo)準(zhǔn)曲線査到的步驟2)測(cè)得的吸光度值對(duì)應(yīng)的肽濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定奶粉中肽含量的方法。該方法利用蛋白質(zhì)和肽分子中含有的肽鍵(-CO-NH-)具有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與Cu²⁺形成紫紅色絡(luò)合物的特性，以某種肽作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將奶粉用水溶解，在酸性條件下加熱并在重金屬鹽存在的條件下沉淀去除奶粉樣品中的大分子蛋白，然后加入雙縮脲試劑反應(yīng)，檢測(cè)吸光度值，通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中的肽含量。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)，能快速檢測(cè)奶粉中肽的含量，可用于實(shí)際生產(chǎn)中的質(zhì)量監(jiān)控。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101398375SQ20081022603
公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2008年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日
發(fā)明者任國(guó)譜, 燦 彭, 彭美純, 肖蓮榮, 偉 魯 申請(qǐng)人:湖南亞華乳業(yè)有限公司