專利名稱：甘藍(lán)型油菜雜交種種子純度快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于油菜育種與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及油菜雜交品種種子純度的鑒定方法。
背景技術(shù)：
雜交油菜作為我國推動油菜生產(chǎn)發(fā)展的主要育種技術(shù)近年取得了快速發(fā)展，顯著特征是 育成品種越來越多，應(yīng)用范圍越來越廣。隨著雜交油菜的日益普及，種子的純度質(zhì)量控制則 顯得越來越重要，尤其是對以細(xì)胞質(zhì)雄性不育為主體的雜交種類型，該不育類型的母本對溫 度反應(yīng)敏感，在低溫下易產(chǎn)生微量花粉，并以自交方式產(chǎn)生不育母本型假雜種，嚴(yán)重時可造 成雜交油菜的大幅度減產(chǎn)。因此，在油菜雜交種應(yīng)用于生產(chǎn)以前，必須進(jìn)行嚴(yán)格的純度鑒定。
種子純度鑒定仍是目前困擾油菜種子檢驗(yàn)工作的一個難題。目前我國油菜雜交種純度鑒 定大多采用異地異季種植鑒定，然而異地異季鑒定的缺陷也日益突出 一則鑒定周期長，滿 足不了生產(chǎn)銷售的時間要求；二則冬性強(qiáng)的品種可能會因春化受阻不能進(jìn)行鑒定；再則，異 季鑒定要求及時播種，需要在種子未完全成熟時進(jìn)行取樣，樣品種子的發(fā)芽率低，極有可能 造成鑒定結(jié)果與真實(shí)值不符。因此，快速、可靠的雜交油菜純度鑒定方法在油菜生產(chǎn)應(yīng)用中 顯得極為緊迫和必要。
生化標(biāo)記具有簡便、廉價、高效等優(yōu)點(diǎn)，特別是以同工酶、貯藏蛋白電泳技術(shù)為代表的 生化標(biāo)記，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的種子純度鑒定工作，并取得了較好的效果。隨著 生化技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者不斷致力于各種生化標(biāo)記電泳檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化研究，技 術(shù)得到了不斷地完善。近幾年，同工酶已開始被應(yīng)用于油菜的品種純度鑒定，例如利用酯酶 同工酶譜分析鑒定雜交油菜秦優(yōu)2號種子的純度結(jié)果與種植鑒定吻合，還有利用酯酶同工酶 和AFLP (擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)標(biāo)記鑒定甘藍(lán)型油菜"中油雜2號"種子純度的結(jié)果和種植鑒 定、AFLP均很吻合。然而，同工酶鑒定方法需要對油菜育苗，從發(fā)芽到出苗需要幾天的時 間，并且同工酶電泳譜帶較模糊，易錯讀而造成鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差，給純度鑒定帶來諸多不 便。醇溶蛋白電泳技術(shù)直接以種子為材料進(jìn)行分析，不需要育苗，作為一種貯藏蛋白電泳技 術(shù)已在小麥、玉米、水稻等禾本科作物的種子純度鑒定中得到應(yīng)用，但是甘藍(lán)型油菜種子醇 溶蛋白含量很少，利用目前禾本科作物上廣泛應(yīng)用的電泳、染色方法較難進(jìn)行檢測，而其他 生化鑒定及分子標(biāo)記方法操作步驟復(fù)雜、成本較高、檢測周期較長。迄今為止，尚未有成功 利用醇溶蛋白電泳技術(shù)鑒定雜交油菜種子純度的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、成本低、效率高且能有效鑒定雜交種子純度的甘藍(lán)型油菜雜交種種子純度快速鑒定方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的要點(diǎn)在于利用已有的禾谷類作物上的醇溶蛋白提取技術(shù) 和油菜的同工酶電泳技術(shù)，組合并研制了一套適合于甘藍(lán)型油菜醇溶蛋白的電泳檢測技術(shù)， 并應(yīng)用到甘藍(lán)型油菜雜交品種純度的鑒定工作中。為此，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種甘藍(lán) 型油菜雜交種種子純度快速鑒定方法，具體包括以下步驟
(1) 醇溶蛋白提取將甘藍(lán)型油菜雜交種樣品種子(數(shù)量可以為150-250粒)及其父母
本的種子(例如5~10粒)壓扁，每粒種子用35~4(^1的2-氯乙醇溶液浸泡2~3h，所述2-氯 乙醇溶液中溶質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)為20~30%;
(2) 電泳分離選用雙夾芯式垂直平板電泳槽(可外購，按商品說明書組裝)，往所述
電泳槽的膠室中灌分離膠室離膠室的后玻璃板頂端3 4cm處，待分離膠凝固后，再往膠室中 灌濃縮膠至膠室的后玻璃板頂端，插好點(diǎn)樣梳，光照下靜置待濃縮膠凝固；拔出點(diǎn)樣梳，取 每粒種子的浸泡液30~35^1上樣于點(diǎn)樣孔中，上樣完畢后將電泳槽注滿pH值為8.0~8.5的電 極緩沖液，并往電極緩沖液里滴加溴酚藍(lán)溶液作指示劑；在20 40mA條件下穩(wěn)流電泳，電泳 過程中低濃度的醇溶蛋白經(jīng)過濃縮膠后被濃縮成薄層，以便于提高分辨率；待指示劑溴酚藍(lán) 由濃縮膠頂端向下移動至分離膠頂部時，調(diào)電流至50 70mA繼續(xù)穩(wěn)流電泳，在分離膠中各種 醇溶蛋白將根據(jù)不同的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)分別聚集于分離膠的不同位置，待溴酚藍(lán)下移 至分離膠底部時結(jié)束電泳；
(3) 染色顯帶電泳結(jié)束后，從電泳槽中取出分離膠，并將其置于固定液中固定 20 30min，然后用染色液染色30 40min，最后在脫色液中脫色至肉眼可見的譜帶出現(xiàn)；
(4) 讀帶將上述脫色后的分離膠置于觀片燈上讀帶，對比油菜雜交種及父、母本種子 的譜帶特征，統(tǒng)計(jì)出油菜雜交種種子樣品中具有母本譜帶特征的種子數(shù)量，根據(jù)計(jì)算公式計(jì) 算出油菜雜交種種子的純度，所述計(jì)算公式為
油菜雜交種種子純度=(l-具有母本譜帶特征的種子數(shù)量/雜交種種子樣品檢測數(shù)量) xlOO%。
上述鑒定方法主要是利用了甘藍(lán)型油菜親本間醇溶蛋白具有差異性的特點(diǎn)，在實(shí)施本發(fā) 明方法的讀帶過程中，具有父、母本雙方譜帶特征的個體為真雜種，只具有母本譜帶特征的 個體為假雜種，據(jù)此便可計(jì)算出送檢雜交種種子樣品的純度。
上述鑒定方法所用到的分離膠中，丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為7~10%;濃縮膠中丙烯酰胺的 質(zhì)量濃度為2.3-2.5%;所述溴酚藍(lán)溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量濃度為0.1~0.2%。
上述鑒定方法的電泳分離步驟中，分離膠凝固所需的時間優(yōu)選30 40min;濃縮膠凝固所 需的時間優(yōu)選20 30min上述鑒定方法中用到的固定液由三氯乙酸、甲醇和雙蒸水配制而成，其中三氯乙酸的質(zhì) 量濃度為10~15%，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為20~40%;所述染色液由乙醇、冰乙酸、考馬斯亮藍(lán) R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250和雙蒸水配制而成，其中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為20~30%，冰乙酸的體 積分?jǐn)?shù)為5~15%，考馬斯亮藍(lán)R-250的質(zhì)量濃度為0.01 0.02%，考馬斯亮藍(lán)G-250的質(zhì)量濃 度為0.04~0.05%;所述脫色液由乙醇、冰乙酸和雙蒸水配制而成，其中乙醇的體積分?jǐn)?shù) 10 15%，冰乙酸的體積分?jǐn)?shù)為5~10%。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明中的醇溶蛋白提取步驟不需研磨和離心， 可大大減少工作量，提高工作效率；本發(fā)明篩選并改良的電泳分離工藝及染色顯帶技術(shù)，具 有操作簡便、分辨率高、帶紋清晰等技術(shù)優(yōu)勢。利用本發(fā)明方法與田間種植鑒定、簡單重復(fù) 序列(SSR)鑒定對同一批樣品進(jìn)行純度分析，分析結(jié)果顯示本發(fā)明具有與其它現(xiàn)有鑒定技 術(shù)同等的準(zhǔn)確性和可靠性，更重要的是本發(fā)明的鑒定方法操作更為簡單、成本更低、效率更 高，有效地克服了油菜種植鑒定方法周期長的缺陷，又比SSR鑒定方法簡單可行、易于推廣， 這為降低甘藍(lán)型油菜雜交品種推廣應(yīng)用中的風(fēng)險提供了技術(shù)保障。


圖1為油菜雜交品種"豐油701"的母本、父本和真雜種的醇溶蛋白電泳圖譜，其中泳道A、 B、 C分別代表母本、父本和真雜種。
圖2為本實(shí)施例中"豐油701"雜交種部分樣品種子的檢測結(jié)果，其中泳道Pl代表母本， 具有圖示的a、 b兩條譜帶；泳道P2代表父本，具有a、 b、 c三條譜帶；泳道F為檢測到的 假雜種，只有a、 b兩條譜帶。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
利用本發(fā)明方法對湖南省作物研究所選育的甘藍(lán)型油菜雜交品種"豐油7or進(jìn)行檢測，以
下為檢測方法的具體操作流程
1、主要試劑的配制
(1) 醇溶蛋白提取液取25ml2-氯乙醇，用雙蒸水(ddH20)定容到100ml， 4'C保存；
(2) 貯備液I :取30g丙烯酰胺和0.8g亞甲基雙丙烯酰胺，用ddH20定容至100ml， 4°C
保存；
(3) 貯備液II:取10g丙烯酰胺和2.5g亞甲基雙丙烯酰胺，用ddH20定容至100ml, 4°C
保存；
(4) 分離膠緩沖液(pH=8.9):取36g三羥甲基氨基甲烷(Tris)、 48ml lmol/L的鹽酸和 0.46ml四甲基乙二胺(TEMED)，用ddH20定容至100ml， 4。C保存；(5) 濃縮膠緩沖液(pH=6.8):取5.9gTris、 48ml lmol/L的鹽酸和0.46ml TEMED，用 ddH20定容至lOOml， 4。C保存；
(6) 電極緩沖液(pH=8.3):取6g Tris和28.8g甘氨酸，ddH20定容至1L， 4"避光保 存(用時稀釋IO倍)；
(7) 蔗糖溶液取40g蔗糖，用ddH20定容至100ml， 4T:保存；
(8) 核黃素溶液取4mg核黃素，用ddH20定容至100ml， 4。C保存；
(9) 過硫酸銨溶液取1.4g過硫酸銨，用ddH20定容至100ml， 4'C保存；
(10) 固定液取12.5g三氯乙酸和30ml甲醇，用ddH20定容至100ml， 4。C保存；
(11) 染色液取27ml乙醇、10ml冰乙酸、0.015g考馬斯亮藍(lán)R-250和0.045g考馬斯 亮藍(lán)G-250，用ddH20定容至100ml，常溫下保存；
(12) 脫色液取120ml乙醇和70ml冰乙酸，用ddH20定容至1L，常溫下保存；
(13) 保存液取7ml冰乙酸，用ddH20定容至100ml，常溫下保存。
2、 醇溶蛋白提取
取甘藍(lán)型油菜雜交品種"豐油701"的雜交種種子樣品200粒及其父、母本種子各10粒， 將所取的種子用平頭玻璃棒輕輕壓扁，置于PCR板(聚碳酸酯材料，96孔)中，每孔中添加 醇溶蛋白提取液35^1，常溫下密封浸泡2h得浸泡液。浸泡液在4'C條件下可保存7天。
3、 電泳分離
(1)凝膠的制備選用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCP-37B型雙夾芯式垂直平板電泳槽， 將配套的前、后玻璃平板夾在膠框內(nèi)形成膠室，用70°C (50 75'C范圍內(nèi)均可)的質(zhì)量濃度
為1.5%的瓊脂糖溶液密封玻璃平板底部；將體積比分別為18 : 9 : 2 : 40的貯備液I 、分離
膠緩沖液、過硫酸胺溶液和ddH20混合均勻配制成40ml的分離膠，將分離膠灌入膠室，灌 入體積達(dá)到離后玻璃板頂部3cm處，加一層蒸餾水覆蓋，靜置聚合30min，倒掉蒸餾水；將
體積比分別為2:i:4:i的貯備液II、濃縮膠緩沖液、蔗糖溶液和核黃素溶液混合均勻配制
成10ml的濃縮膠，將配制的濃縮膠灌入已裝有分離膠的膠室至后玻璃板頂端，并迅速插好點(diǎn) 樣梳，陽光下靜置聚合20min;
上述配制成的分離膠中含有質(zhì)量濃度為7.5%的丙烯酰胺(一般優(yōu)選在7~8%)、質(zhì)量濃度 為0.2%的亞甲基雙丙烯酰胺(一般優(yōu)選在0.2~0.3%)、質(zhì)量濃度為5%的Tris、體積分?jǐn)?shù)為6% 的鹽酸(1M)、體積分?jǐn)?shù)為0.09%的四甲基乙二胺(一般優(yōu)選在0.09-0.15%)和質(zhì)量濃度為 0.04%的過硫酸銨(一般優(yōu)選在0.04~0.06%)，余量為ddH20;
上述配制成的濃縮膠中含有質(zhì)量濃度為2.5%的丙烯酰胺(一般優(yōu)選在2.3~2.5%)、質(zhì)量 濃度為0.6%的亞甲基雙丙烯酰胺(一般優(yōu)選在0.5~0.7%)、質(zhì)量濃度為0.7%的Tris、體積分?jǐn)?shù)為6%的鹽酸(1M)和體積分?jǐn)?shù)為0.19%的四甲基乙二胺(一般優(yōu)選在0.15~0.25%)，余量 為蔗糖、核黃素及ddH20;
(2)電泳檢測小心拔出點(diǎn)樣梳，吸干點(diǎn)樣孔內(nèi)殘留的蒸餾水，每粒種子取30^d浸泡 液上樣于點(diǎn)樣孔；上樣完畢后，先用pH值為8.3的電極緩沖液小心覆蓋浸泡液，防止傾倒電 極緩沖液時沖動浸泡液，然后用電極緩沖液將電泳槽注滿，并往電極緩沖液中加1滴質(zhì)量濃 度為0.2%的溴酚藍(lán)溶液作指示劑；4 15'C條件下，先30mA穩(wěn)流電泳，醇溶蛋白在電壓的作 用下自上而下泳動，在濃縮膠中被濃縮成高濃度的醇溶蛋白薄層；待指示劑溴酚藍(lán)由濃縮膠 頂端向下移動至分離膠頂端時，調(diào)電流至60mA繼續(xù)穩(wěn)流電泳，在分離膠中各種醇溶蛋白將 根據(jù)不同的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)分別聚集于分離膠中的不同位置，待溴酚藍(lán)至分離膠底部 時結(jié)束電泳。
4、 染色顯帶
電泳結(jié)束后，將中間夾有濃縮膠和分離膠的前、后玻璃板從電泳槽中取出，用刀片小心 將后玻璃板與韌性較強(qiáng)的分離膠分開，并將分離膠轉(zhuǎn)移至固定液中固定30min，然后轉(zhuǎn)移至 染色液中染色30min，最后在脫色液中脫色至肉眼清晰可見的譜帶出現(xiàn)。若需保存分離膠， 可置于4"C保存液中最長保存6個月。
5、 讀帶
將上述脫色后的分離膠置于觀片燈上讀帶，對比油菜雜交種及父、母本種子的譜帶特征， 統(tǒng)計(jì)出"豐油701"油菜雜交種種子樣品中具有母本譜帶特征的種子數(shù)量，并根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算 出油菜雜交種種子的純度為81.9%,計(jì)算公式為
油菜雜交種種子純度=(l-具有母本譜帶特征的種子數(shù)量/雜交種種子樣品檢測數(shù)量) xlOO%。
6、 技術(shù)效果檢驗(yàn)
將上述"豐油701"雜交種種子樣品同時進(jìn)行種植鑒定和SSR鑒定，其中種植鑒定利用盛 花期育性表現(xiàn)調(diào)査純度，純度計(jì)算結(jié)果83.8%; SSR鑒定利用母本與雜交種間PCR擴(kuò)增片段 差異進(jìn)行鑒定，純度計(jì)算結(jié)果為81.2%。種植鑒定的雜交種種子純度計(jì)算公式為雜交種種 子純度=(l-不育株數(shù)/總調(diào)査株數(shù))xlOO%; SSR雜交種種子純度的計(jì)算公式為雜交種種子 純度=(l-具母本譜帶特征的個體數(shù)量/總檢測數(shù)量)xlOO%。
可見，三種方法檢測的純度結(jié)果非常吻合，表明了本發(fā)明方法在油菜雜交種種子純度鑒 定上具有很好的可靠性；并且從鑒定周期的長短上考慮，種植鑒定的周期至少為100天，SSR 鑒定的周期至少為4天，而本發(fā)明方法的鑒定周期最短可為1天，這又充分說明本發(fā)明方法 在達(dá)到相同鑒定效果的前提下，檢測效率大大提高。
權(quán)利要求
1、一種甘藍(lán)型油菜雜交種種子純度快速鑒定方法，具體包括以下步驟(1)醇溶蛋白提取將甘藍(lán)型油菜雜交種種子及其父母本的種子壓扁，每粒種子用35～40μl的2-氯乙醇溶液浸泡2～3h，所述2-氯乙醇溶液中溶質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)為20～30％；(2)電泳分離選用雙夾芯式垂直平板電泳槽，往所述電泳槽的膠室中灌分離膠至離膠室的后玻璃板頂端3～4cm處，待分離膠凝固后，再往膠室中灌濃縮膠至膠室的后玻璃板頂端，插好點(diǎn)樣梳，光照下靜置待濃縮膠凝固；拔出點(diǎn)樣梳，取每粒種子的浸泡液30～35μl上樣于點(diǎn)樣孔中，上樣完畢后將電泳槽注滿pH值為8.0～8.5的電極緩沖液，并往電極緩沖液里滴加溴酚藍(lán)溶液；控制電流為20～40mA條件下穩(wěn)流電泳，待指示劑溴酚藍(lán)由濃縮膠頂端向下移動至分離膠頂部時，調(diào)電流至50～70mA繼續(xù)穩(wěn)流電泳，待溴酚藍(lán)下移至分離膠底部時結(jié)束電泳；(3)染色顯帶電泳結(jié)束后，從電泳槽中取出分離膠，并將其置于固定液中固定20～30min，然后用染色液染色30～40min，最后在脫色液中脫色至肉眼可見的譜帶出現(xiàn)；(4)讀帶將上述脫色后的分離膠置于觀片燈上讀帶，對比油菜雜交種及父、母本種子的譜帶特征，統(tǒng)計(jì)出油菜雜交種種子樣品中具有母本譜帶特征的種子數(shù)量，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算出油菜雜交種種子的純度，所述計(jì)算公式為油菜雜交種種子純度＝(1-具有母本譜帶特征的種子數(shù)量/雜交種種子樣品檢測數(shù)量)×100％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述分離膠中丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為7 10%;所述濃縮膠中丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為2.3~2.5%;所述溴酚藍(lán)溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量濃度 為0.1~0.2%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于在電泳分離步驟中，分離膠凝固所需的時間為30 40min;濃縮膠凝固所需的時間為20 30min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述固定液由三氯乙酸、甲醇和雙蒸 水配制而成，其中三氯乙酸的質(zhì)量濃度為10 15%，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為20~40%;所述染色液 由乙醇、冰乙酸、考馬斯亮藍(lán)R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250和雙蒸水配制而成，其中乙醇的體 積分?jǐn)?shù)為20 30%，冰乙酸的體積分?jǐn)?shù)為5 15。/。，考馬斯亮藍(lán)R-250的質(zhì)量濃度為0.01~0.02%， 考馬斯亮藍(lán)G-250的質(zhì)量濃度為0.04-0.05%;所述脫色液由乙醇、冰乙酸和雙蒸水配制而成， 其中乙醇的體積分?jǐn)?shù)10 15%，冰乙酸的體積分?jǐn)?shù)為5 10%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于在電泳分離步驟的穩(wěn)流電泳過程中， 溫度控制在4 15'C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)型油菜雜交種種子純度快速鑒定方法，具體包括以下步驟將種子壓扁用2-氯乙醇溶液浸泡2～3h提取醇溶蛋白，然后用分離膠和濃縮膠進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后進(jìn)行固定、染色、脫色顯帶，最后通過讀帶計(jì)算出油菜雜交種種子的純度。本發(fā)明的鑒定方法具有操作簡單、成本低、效率高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N27/447GK101430273SQ200810143770
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日
發(fā)明者亮 曲, 莓 李, 王同華, 范連益, 陳衛(wèi)江 申請人:湖南省作物研究所