專利名稱：：一種藥用乳酸鈉溶液質(zhì)量的測(cè)定方法一種藥用乳酸鈉溶液質(zhì)量的測(cè)定方法所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種藥物的分析測(cè)定方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及一種對(duì)藥用乳酸鈉溶液中成分的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：乳酸鈉溶液是由藥用稀乳酸加氫氧化鈉(或碳酸鈉)溶液中和而制得(中國(guó)藥典二部注釋1990:358)。由于乳酸分子中具有手性結(jié)構(gòu)，在發(fā)酵生產(chǎn)及后處理純化、精制、中和等過(guò)程中又未經(jīng)外削旋體拆分處理，因而藥用乳酸鈉中含有D-乳酸鈉和L-乳酸鈉兩種光學(xué)異構(gòu)體。中國(guó)藥典乳酸鈉溶液項(xiàng)下含量測(cè)定采用酸堿滴定法(中國(guó)藥典二部2005:348)，測(cè)得的是D-乳酸鈉、L-乳酸鈉的總含量，不能測(cè)定具有生物活性的L-乳酸鈉含量以及人體不能利用的D-乳酸鈉含量?，F(xiàn)有的各種化學(xué)分析方法包括滴定法、比色法、高效液相色譜法均無(wú)法專一測(cè)定乳酸鈉溶液中L-乳酸鈉或D-乳酸鈉含量。酶電極分析法是將卨度立體專一性的生物催化劑酶蛋白分子通過(guò)物理化學(xué)交聯(lián)作用固定化做成固定化酶膜，然后與電化學(xué)傳感器結(jié)合構(gòu)成酶電極(enzymeelectrode)用于分析的一項(xiàng)技術(shù)，酶電極分析法集酶反應(yīng)的高專一性、固定化酶的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、電化學(xué)分析快速靈敏的特點(diǎn)T一體。我國(guó)的乳酸酶電極研究始于20世紀(jì)80年代末，1990年國(guó)產(chǎn)的固定化乳酸酶膜達(dá)到實(shí)用化水平，主要應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的周期性耐力項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員血液中L-乳酸測(cè)定，以控制訓(xùn)練量。后L-乳酸分析又逐歩應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。本文采用固定化D-乳酸氧化酶結(jié)合HA電極構(gòu)成D-乳酸酶電極生物傳感分析儀，用于藥用乳酸鈉中D-乳酸鈉分析只需將樣品稀釋50倍即可測(cè)定，25秒自動(dòng)顯示、打印結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有分析方法的不足，本發(fā)明提供一種藥用乳酸鈉溶液質(zhì)量的測(cè)定方法，具體是采用酶電極型生物傳感器法定量測(cè)定藥用乳酸鈉溶液中D-乳酸鈉含量，用固定化酶技術(shù)將D-乳酸氧化酶(EC1.1.1.26)制成固定化酶膜，結(jié)合過(guò)氧化氫型電極構(gòu)成D-乳酸酶電極生物傳感器，用于乳酸鈉溶液中D-乳酸鈉的含量測(cè)定，從而方便、準(zhǔn)確、快速地對(duì)乳酸鈉溶液的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。技術(shù)方案本發(fā)明提供的乳酸鈉溶液質(zhì)量的測(cè)定方法，包括下述順序的步驟.1固定化D-乳酸鈉酶膜的制備1.1載體膜圈制備取直徑10mm的核微孔膜片用環(huán)氧樹(shù)脂粘貼在內(nèi)徑9.5mra的橡膠密封圈上，放置過(guò)夜使固化完全即得。1.2載體膜圈表面處理將載體膜圈置20%甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸餾水沖凈、晾干。1.3固定化復(fù)合酶膜制備取D-乳酸氧化酶O.l單位、20%牛血清白蛋白5^1、2。/。戊二醛2pl、均勻噴涂在載體膜圈表面，靜置固化15用蒸餾水洗去多余反應(yīng)物，冷凍干燥即得。將此固定化酶膜裝在過(guò)氧化氫電極頭部便構(gòu)成酶電極。2固定化D-乳酸酶膜參數(shù)基礎(chǔ)活性>50，線性l~270mg/L;各點(diǎn)偏差小于lmg，響應(yīng)30s測(cè)定值大于60s測(cè)定值的90%,膜完整性亞鐵氫化鉀測(cè)定值-26范圍內(nèi)，工作壽命>25&3過(guò)氧化氫電極制備兩電極均為長(zhǎng)20咖的圓柱體，鉑電極表面積4mm2，銀電極表面積60mm2，用專用模具置備。兩電極之間填充環(huán)氧樹(shù)脂，電極套頭端與醇膜圈應(yīng)嵌合良好，鉑電極與酶膜須緊密接觸(見(jiàn)圖1),鉑電極為正極；銀電極為負(fù)極。兩電極之間極化電壓0.65V,酶電極輸出電流0500nA。4D-乳酸酶電極生物傳感器結(jié)構(gòu)D-乳酸酶電極生物傳感器由生化反應(yīng)系統(tǒng)(一次儀表)和電信號(hào)處理系統(tǒng)(二次儀表)組成(見(jiàn)圖2)。5.測(cè)定方法儀器定標(biāo)采用0.l誦cl'L—'pH7.2的磷酸鹽緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)液含D-乳酸鈉500rag'L—',取25u1標(biāo)準(zhǔn)液注入反應(yīng)池，20s后儀器自動(dòng)顯示酶膜基礎(chǔ)活性，按動(dòng)定標(biāo)鍵定標(biāo)500mg'L—'，自動(dòng)清洗后即可測(cè)定樣品。樣品制備取藥用乳酸鈉溶液lml，置50ml量瓶中加水適量使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，即得，進(jìn)樣量25^1。有益效果用固定化D-乳酸氧化酶復(fù)合11202電極測(cè)定乳酸鈉溶液中D乳酸鈉含量是目前該分析領(lǐng)域最先進(jìn)的測(cè)試手段，其先進(jìn)性表現(xiàn)為(l)與紫外分光光度法相比具有方法簡(jiǎn)單、分析專一性好的優(yōu)點(diǎn)，能測(cè)出單一D-乳酸鈉組分，而不是具有紫外吸收的多個(gè)組分；(2)與常規(guī)酶法分析相比較，因?yàn)椴捎霉潭ɑ夹g(shù)將可溶性酶固定在電極頭部反復(fù)使用，在測(cè)定過(guò)程中不會(huì)造成酶的流失，從而減低了酶法測(cè)定的成本；(3)采用HA電極為基礎(chǔ)電極，較之pH電極和氧電極其基線電流更加穩(wěn)定，分析精度高于其它方法。(4)采用酶電極法測(cè)定乳酸鈉溶液中的D-乳酸鈉含量，由于酶促反應(yīng)專一性高、樣品不需分離直接稀釋50倍即可進(jìn)樣分析、處理?xiàng)l件溫和、反應(yīng)時(shí)間短暫結(jié)果較為可靠。圖1是D-乳酸酶電極結(jié)構(gòu)示意圖；其中l(wèi)鉑電極；反應(yīng)(2),2銀電極；反應(yīng)(3)，3內(nèi)膜，4固定化D-乳酸氧化酶；反應(yīng)(1)，5核微孔膜，6密封圈，7底物圖2是D-乳酸酶電極生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖；其中l(wèi)進(jìn)樣器，2光電開(kāi)關(guān)，3信號(hào)處理器，4酶電極，5攪拌子，6電磁攪拌器，7泵1，8緩沖液，9泵2，10廢液具體實(shí)施例方式1儀器與試藥D-乳酸氧化酶(EC1.1.1.26):美國(guó)Sigma公司；D-乳酸鈉美國(guó)Sigma公司戊二醛上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站進(jìn)口分裝；核微孔膜美國(guó)Nucleopore公司(d>0.2uni);鉑、銀中國(guó)人民銀行濟(jì)南分行(純度為99.999%);其他試劑均為分析純，藥用乳酸鈉溶液(規(guī)格乳酸鈉不低于40%，批號(hào)070812、070817、070928):無(wú)錫某制藥廠。儀器SBA-40型乳酸生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)。2測(cè)定原理固定化D-乳酸氧化酶結(jié)合HA電極測(cè)定D-乳酸鈉原理0-乳酸鈉+02貼化乳酸氧化酵>HA+丙酮酸鈉鉑電極、HA+2H+02+2e-+H20銀電極、AgCl+e^Ag+C丄3D-乳酸鈉對(duì)照品溶液制備精密稱取D-乳酸鈉對(duì)照品50mg置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解、定容，作為對(duì)照品溶液。4酶電極專一性試驗(yàn)取可能的干擾物配成濃度500mg/L的溶液，以500mg/l,的D-乳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液在D-乳酸酶電極上的響應(yīng)為500，測(cè)定干擾物溶液在問(wèn)一酶電極上的相對(duì)響應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表l表1酶電極專"性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果L-乳酸鈉等其它有機(jī)酸(鹽)在D-乳酸氧化酶HA電極上的響應(yīng)為0，表明D-乳酸酶電極具有高度的專一性。5酶電極最適pH不同pH磷酸鹽緩沖液對(duì)肌苷酶電極響應(yīng)的影響見(jiàn)表2所示，在pH7.2時(shí)酶電極響應(yīng)值最高，所以本研究釆用PH7.2的磷酸鹽緩沖液。表2不同PH緩沖液對(duì)乳酸酶電極響應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6精密度試驗(yàn)取D-乳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液50mg*L_1、250mg'L—'、500mg'L/'照"儀器定標(biāo)"項(xiàng)下操作，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)測(cè)定20次，每次進(jìn)樣25ix1，結(jié)果如下50mg.L—'組RSDW.22呢、250mg'L—'組RSD=0.36%、500mg.L—'組RSD=1.0%。7線性關(guān)系試驗(yàn)用乳酸酶電極分別測(cè)定50、100、200、300、400、500mg'L—1D-乳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，以濃度為X，響應(yīng)值為Y，進(jìn)行回歸分析得線性回歸方程Y=0.23+0.995X,r=0.9989。8加樣回收試驗(yàn)取稀釋的乳酸鈉樣品溶液分為5份加己知濃度的D乳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行回收試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3表3肌苷回收試驗(yàn)結(jié)果Tab3RecoveryresultsforD-lactate(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>9酶電極法與酸堿滴定法對(duì)比試驗(yàn)藥用乳酸鈉樣品測(cè)定藥用乳酸鈉溶液中乳酸鈉含量測(cè)定按照中國(guó)藥典藥用乳酸鈉溶液項(xiàng)下含量測(cè)定要求操作；D-乳酸鈉測(cè)定照"技術(shù)方案5.測(cè)定方法"項(xiàng)下操作，采用對(duì)照品法結(jié)果見(jiàn)表4。表4藥用乳酸鈉樣品測(cè)定結(jié)果(n=5，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表4數(shù)據(jù)可見(jiàn)同一廠家不同批號(hào)的藥用乳酸鈉溶液中D—乳酸鈉含量約占乳酸鈉總量的90y。。權(quán)利要求1固定化D-乳酸氧化酶膜的制備載體膜圈制備取直徑10mm的核微孔膜片用環(huán)氧樹(shù)脂粘貼在內(nèi)徑9.5mm的橡膠密封圈上，放置過(guò)夜使固化完全即得。載體膜圈表面處理將載體膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸餾水沖凈、晾干。固定化復(fù)合酶膜制備取D-乳酸氧化酶0.1單位、20％牛血清自蛋自5μl、2％戊二醛2μl、均勻噴涂在載體膜圈表面，靜置固化15min，用蒸餾水洗去多余反應(yīng)物，冷凍干燥即得。將此固定化復(fù)合酶膜裝在過(guò)氧化氫電極頭部便構(gòu)成酶電極。全文摘要本發(fā)明涉及一種藥用乳酸鈉溶液質(zhì)量的測(cè)定方法，屬生物傳感器
技術(shù)領(lǐng)域：
。制備方法是將D-乳酸氧化酶固定化后與H₂O₂電極結(jié)合構(gòu)成D-乳酸酶電極生物傳感器，采用0.1mmol.L^-1pH7.2的磷酸鹽緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)液含D-乳酸500mg.L^-1，取標(biāo)準(zhǔn)液25μl注入反應(yīng)池20s后儀器自動(dòng)顯示酶膜基礎(chǔ)活性，按動(dòng)定標(biāo)鍵(Calibrate)定標(biāo)500，自動(dòng)清洗后即可測(cè)定樣品。文檔編號(hào)G01N27/327GK101349668SQ20081013842公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2008年7月22日優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日發(fā)明者史建國(guó),孫士青,孟慶軍,張利群,李雪梅,艷楊,楊俊慧,王丙蓮,趙曉華,馬耀宏申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院生物研究所