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一種測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法

文檔序號:5839854閱讀:662來源:國知局

專利名稱::一種測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域
,具體涉及測定聚山梨酯含量的方法,特別涉及測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法。
背景技術(shù)
:表面活性劑在與人體接觸的體系如藥物、食品、化妝品及個人衛(wèi)生用品中的應(yīng)用越來越廣泛,但是表面活性劑及其代謝產(chǎn)物對機體可能造成毒副作用,包括急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性、對生育繁殖的影響、胚胎毒性、致畸性、致突變性、致癌性、致敏性、溶血性等等。因此需要根據(jù)制品用途、表面活性劑的種類等情況對表面活性劑在制品中的含量加以控制。非離子表面活性劑毒性較低,其中聚山梨酯類非離子表面活性劑在藥劑中廣泛用作乳化劑、分散劑、增溶劑和穩(wěn)定劑,主要用于制造多種液體制劑(如芳香水劑、合劑、洗劑、乳劑等)、半固體制劑(如油膏劑、乳膏劑、栓劑等),包括無菌、滅菌制劑(如滴眼劑、眼膏齊!J、注射液等),一般含量為0.1%2.0%。根據(jù)國內(nèi)外臨床和非臨床安全性試驗研究結(jié)果,這在安全范圍之內(nèi)。對于生物類藥劑而言,這類物質(zhì)在制劑(特別是注射類制劑)中的含量一般不高于0.05%。對于其中使用聚山梨酯作為穩(wěn)定劑的蛋白質(zhì)制劑而言,即使不需考慮毒性方面的因素,也需要控制聚山梨酯的含量。這是因為蛋白質(zhì)的性質(zhì)比較脆弱,如果聚山梨酯的含量過低,則達不到穩(wěn)定效果,如果聚山梨酯的含量過高,則反而可能促使蛋白質(zhì)降解。目前,測定聚山梨酯含量的方法主要有分光光度法、熒光光度比色法和分子排阻-蒸發(fā)光散射(SEC-ELSD)法。其中,熒光法和SEC-ELSD法實驗條件要求較高,不利于推廣,而分光光度法靈敏度高且操作簡便,應(yīng)用范圍最廣?!吨袊幍洹分幸?guī)定的聚山梨酯80殘留量測定方法就是分光光度法(參見《中國藥典》(2005年版)三部附錄VIH),其原理是利用聚山梨酯80中的聚乙氧基和銨鈷硫氰酸鹽反應(yīng)形成的藍色復(fù)合物溶于二氯甲垸后在620nm處有特異吸收,并且在一定劑量范圍內(nèi),其吸收值呈劑量依賴。但該方法需要對樣品中的蛋白質(zhì)進行沉淀、洗滌、分離,并且還需要進行空氣吹掃,樣品在處理過程中容易丟失,會造成較大偏差;同時該方法需要在室溫下放置過夜,時間較長,而二氯甲烷又易揮發(fā),這也會影響實驗結(jié)果。已有人提出在上述測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法中使用9CTC水浴來代替空氣吹掃以濃縮樣品溶液,其中仍需要進行蛋白質(zhì)沉淀、洗滌、分離等步驟(參見"聚山梨酯80含量測定方法的改進驗證",崔志偉、楊黎明、高瓊,科技資訊,2006年第12期第186頁)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法,該方法不需要對制劑中的蛋白質(zhì)進行沉淀處理而直接進行測定,也不需要將樣品過夜反應(yīng),并且克服由于二氯甲烷易揮發(fā)而檢測時間間隔過長造成的差異。為此,本發(fā)明提供一種測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法,該方法包括以下步驟(1)將被檢測樣品與三氯甲烷和硫氰鈷銨水溶液混合,得到混合液;(2)使混合液分層;(3)測量分層后得到的三氯甲烷層在紫外-可見波長下的吸光度;(4)根據(jù)所測得的吸光度計算被檢測樣品中聚山梨酯的濃度。在步驟(1)中,優(yōu)選將被檢測樣品與三氯甲烷和硫氰鈷銨水溶液以1:2:3的體積比混合。步驟(2)優(yōu)選包括將混合液置于60-65"的水浴中5-30分鐘,從而使所述混合液分層。步驟(3)優(yōu)選包括20測量三氯甲烷層在620nm波長下的吸光度。步驟(4)優(yōu)選包括根據(jù)聚山梨酯標準品的吸光度-濃度標準曲線計算被檢測樣品中聚山梨酯的濃度。聚山梨酯優(yōu)選為聚山梨酯20或聚山梨酯80。蛋白質(zhì)優(yōu)選為非糖蛋白。蛋白質(zhì)還優(yōu)選為分子量在IO千道爾頓以下的蛋白質(zhì)。硫氰鈷銨水溶液優(yōu)選是由3重量份的硝酸鈷和20重量份的硫氰酸銨加水溶解至IOO體積份配制而成的。本發(fā)明的方法的優(yōu)點在于用三氯甲烷代替二氯甲垸,不需要使用乙醇一氯化鈉飽和溶液等試劑對蛋白質(zhì)進行沉淀,從而也不需要洗滌沉淀和分離沉淀,也不需要濃縮、放置過夜等步驟,并且克服由于二氯甲烷易揮發(fā)而檢測時間間隔過長造成的差異,操作簡便、快速、重復(fù)性好。圖1是聚山梨酯20含量測定的線性標準曲線;圖2是聚山梨酯20和聚山梨酯80含量測定的線性標準曲線比較。具體實施例方式本發(fā)明方法中所涉及的聚山梨酯(吐溫(Tween))是指聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯,包括聚山梨酯20(聚氧乙烯(20)失水山梨醇月桂酸酯)、聚山梨酯40(聚氧乙烯(20)失水山梨醇棕櫚酸酯)、聚山梨酯60(聚氧乙烯(20)失水山梨醇硬脂酸酯)、聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)失水山梨醇油酸酯)等,其中優(yōu)選的是聚山梨酯20和聚山梨酯80。本發(fā)明方法中所涉及的蛋白質(zhì)包括糖蛋白和非糖蛋白,優(yōu)選非糖蛋白。蛋白質(zhì)含量優(yōu)選在2mg/ml以內(nèi)。蛋白質(zhì)的分子量優(yōu)選為在10千道爾頓以下。本發(fā)明方法中所用的硫氰鈷銨水溶液可按常規(guī)方法將硝酸鈷(Co(N03)2'6H20)和硫氰酸銨(NH4SCN)溶于水配制而成。在一個實施方案中,將3重量份的硝酸鈷和20重量份的硫氰酸銨加水至100體積份而得到硫氰鈷銨水溶液。例如,將6g硝酸鈷和40g硫氰酸銨加水溶解并稀釋至200ml而得到硫氰鈷銨水溶液。在本發(fā)明方法的步驟(1)中,可按常規(guī)方法混合被檢測樣品與三氯甲烷和硫氰鈷銨水溶液,例如將被檢測樣品與三氯甲烷和硫氰鈷銨水溶液置于容器中每間隔一段時間震蕩一次,并重復(fù)幾次。在本發(fā)明方法的步驟(2)中,可按常規(guī)方法使所述混合液分層,例如在室溫下將混合液靜置至分層,或者在水浴中將混合液靜置至分層。優(yōu)選將混合液在60-65。C的水浴中靜置5-30分鐘,更優(yōu)選將混合液在6(TC的水浴中靜置IO分鐘。在本發(fā)明方法的步驟(3)中,可按常規(guī)方法測量分層后得到的三氯甲烷層在紫外-可見波長下的吸光度,例如使用紫外-可見分光光度劑測量620nm波長下的吸光度。在本發(fā)明方法的步驟(4)中,可以根據(jù)聚山梨酯標準品的吸光度-濃度標準曲線計算所述被檢測樣品中聚山梨酯的濃度。其中聚山梨酯標準品的吸光度-濃度標準曲線可按如下方法得到制備一系列濃度的聚山梨酯標準溶液;將這些聚山梨酯標準溶液按照本發(fā)明方法步驟(1)、(2)和(3)進行操作分別得到吸光度;以聚山梨酯標準溶液的濃度為橫坐標,以對應(yīng)的吸光度為縱坐標,作直線回歸,求回歸方程。將被檢測樣品的吸光度代入方程即得被檢測樣品中聚山梨酯的濃度。對聚山梨酯標準溶液按照本發(fā)明方法步驟(1)、(2)和(3)進行的操作可以與對被檢測樣品按照本發(fā)明方法步驟(1)、(2)和(3)進行的操作同時進行,也可以不同時進行,例如先進行或后進行。以下參照實施例來對本發(fā)明進行進一步說明,應(yīng)該理解本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1重組人紅細胞生成素(Fc)融合蛋白rhEPO-Fc注射液中Tween-20(聚山梨酯20)含量的測定取rhEPO-Fc注射液(Lot.20060301)進行試驗,注射液中Tween-20的含量為0.01%,即約100|ag/ml。試驗步驟為(1)分別取0、20、40、60、80、lOO]ulTween-20標準溶液(lmg/ml)到帶塞玻璃試管中,補水至lml;(2)每管分別加入2ml三氯甲烷和3ml硫氰鈷銨水溶液(稱取硝酸鈷6.0g、硫氰酸銨40.0g,加水溶解并稀釋至200ml),混勻;每間隔15分鐘充分震蕩混勻1次,共4次;(3)靜置于6CTC水浴中IO分鐘;(4)尖細移液管移去上層溶液,取下層溶液測定0062。值,并以濃度為橫坐標,對應(yīng)的OD62o為縱坐標繪制標準曲線(見圖l);(5)取被檢測樣品500^1(補水至lml)、1000^1,按本例子中步驟(2)、(3)、(4)同法處理;(6)根據(jù)本例子中步驟(4)繪制的標準曲線(見圖1)求出被檢測樣品中Tween-20的含量。結(jié)果見表1。表1:rhEPO-Fc注射液中Tween-20含量測定結(jié)果加樣體積Tween-20含量測定值(嗎)Tween-20含量理論值(嗎)偏差(%)50052.45504.90100091.661008.34實施例2常規(guī)方法與改良方法的比較試驗取rhEPO-Fc注射液(Lot.20060301)(含50嗎/mlTween-20)和自配制的100pg/mlBSA(牛血清白蛋白)溶液(分別含50、80嗎/mlTween-20)作為試驗樣品。改良方法按照實施例1執(zhí)行。常規(guī)方法如下(1)分別取上述樣品1.0ml于帶塞離心管中,加乙醇一氯化鈉飽和溶液5ml,搖勻,在3000rpm下離心10分鐘;(2)取上清液,再用1.0ml乙醇一氯化鈉飽和溶液小心沖洗管8壁,洗液與上清液合并,在3000rpm下離心IO分鐘;(3)取上清液置55"C水浴中,用電吹風吹掃,將其濃縮至0.1-0.5ml,加lml水溶解;(4)加入二氯甲垸2.0ml、硫氰鈷銨水溶液3.0ml,加塞,混勻,室溫放置過夜,間隔15分鐘振蕩1次,測定前靜置30分鐘;(5)棄上層液,在波長620nm處測定下層二氯甲烷溶液的吸收值,其中用二氯甲烷作空白對照;(6)準備梯度濃度的Tween-20標準溶液各lml,按本例子中步驟(4)、(5)執(zhí)行。結(jié)果見表2。表2:常規(guī)方法與改良方法測定不同蛋白制劑中Tween-20含量結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>該結(jié)果表明通過改良方法測定的結(jié)果與常規(guī)方法比較,結(jié)果同樣穩(wěn)定可靠,而且操作更加簡便,試驗更加快捷。實施例3不同蛋白質(zhì)對聚山梨酯含量測定的影響采用上述改良方法分別檢測不同濃度的rhEPO-Fc、重組人淋巴細胞相關(guān)因子(Fc)融合蛋白rhLFA-Fc、重組人甲狀旁腺激素1-3rhPTHl-34、Exendin-4禾卩BSA溶液對聚山梨酯含量測定的影響。實驗結(jié)果見表3。表3:幾種蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量測定結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>具體實驗過程中,觀察到以下現(xiàn)象(1)糖蛋白rhEPO-Fc禾BrhLFA-Fc融合蛋白其濃度在50pg/ml內(nèi),加熱前基本能分層,濃度高于50Mg/ml時,不能分層;但加熱后,濃度在150jig/ml內(nèi)能分層,其中100叫/ml內(nèi)能夠取樣檢測;濃度高于150嗎/ml,即使加熱也不能分層;(2)甲狀旁腺激素1-34和Exendin-4:其為分子量約4千道爾頓的小肽分子,其濃度在2mg/ml以內(nèi)加熱前后都能較好的分層;(3)BSA:其分子量約為66千道爾頓,如果其蛋白質(zhì)濃度高于100i!g/ml不能很好分層,加熱后濃度在lmg/ml也能分層檢測。以上現(xiàn)象及結(jié)果表明不同蛋白質(zhì)對聚山梨酯含量測定的影響不同,大分子蛋白對檢測的影響高于小分子蛋白,糖蛋白對檢測的影響程度遠高于非糖蛋白。隨著被檢測樣品中蛋白濃度的提高,檢測體系溶液分層效果越差,通過靜置加熱,在一定濃度條件下,分層效果明顯改善,并能檢測聚山梨酯的含量。該法聚山梨酯的線性范圍在0~400pg/ml,檢測回收率在95%~110%之間,偏差在20%以內(nèi)。實施例4聚山梨酯20及80標準曲線的比較本實驗的目的在于比較最常用到的兩種聚山梨酯對該法的適應(yīng)性及相互之間的關(guān)系。用本發(fā)明闡述的方法同時作Tween-20和Tween-80的標準曲線,選取的標準溶液濃度都為5、10、20、40、60、80、100ng/ml,測定的OD62o與對應(yīng)的標準溶液做線性回歸計算(見圖2)。實驗得出Tween-20和Tween-80在相同濃度條件下,吸收值具有較高的一致性,線性關(guān)系好。結(jié)果表明本發(fā)明方法對于聚山梨酯都適用。本發(fā)明不局限于上述實施例,應(yīng)該理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不脫離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的條件下對本發(fā)明做出各種修改和改變。權(quán)利要求1.一種測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法,該方法包括以下步驟(1)將被檢測樣品與三氯甲烷和硫氰鈷銨水溶液混合,得到混合液;(2)使所述混合液分層;(3)測量分層后得到的三氯甲烷層在紫外-可見波長下的吸光度;(4)根據(jù)所測得的吸光度計算所述被檢測樣品中聚山梨酯的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中在步驟(1)中,將所述被檢測樣品與三氯甲烷和硫氰鈷銨水溶液以1:2:3的體積比混合。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其中步驟(2)包括將所述混合液置于60-65'C的水浴中5-30分鐘,從而使所述混合液分層。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其中步驟(3)包括測量所述三氯甲烷層在620nm波長下的吸光度。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其中步驟(4)包括根據(jù)聚山梨酯標準品的吸光度-濃度標準曲線計算所述被檢測樣品中聚山梨酯的濃度。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述聚山梨酯為聚山梨酯20或聚山梨酯80。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述蛋白質(zhì)為非糖蛋白。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述蛋白質(zhì)為分子量在10千道爾頓以下的蛋白質(zhì)。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述硫氰鈷銨水溶液是由3重量份的硝酸鈷和20重量份的硫氰酸銨加水至100體積份配制而成的。全文摘要本發(fā)明涉及一種測定蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量的方法,該方法包括以下步驟(1)將被檢測樣品與三氯甲烷和硫氰鈷銨水溶液混合,得到混合液;(2)使所述混合液分層;(3)測量分層后得到的三氯甲烷層在紫外-可見波長下的吸光度;(4)根據(jù)所測得的吸光度計算所述被檢測樣品中聚山梨酯的濃度。該方法不需要對制劑中的蛋白質(zhì)進行沉淀處理而直接進行測定,也不需要將樣品過夜反應(yīng),并且克服由于二氯甲烷易揮發(fā)而檢測時間間隔過長造成的差異。該方法可用于對蛋白質(zhì)溶液中聚山梨酯含量進行控制。文檔編號G01N21/33GK101639439SQ20081012626公開日2010年2月3日申請日期2008年7月28日優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日發(fā)明者凱何,張仁懷,粟建輝,羅蘭兵,聞亞磊,勇陽,韓為躍申請人:東莞太力生物工程有限公司
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