專利名稱：：應用新型全血樣品墊處理方法的免疫層析檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明應用新型全血樣品墊處理方法的免疫層析檢測試劑盒涉及一種新型全血樣品墊的處理方法和用此技術制備的免疫層析試劑盒及其檢測方法，其成本低廉、操作簡便、診斷快速、安全可靠，可廣泛應用于同時檢測全血/血清/血漿樣本的免疫層析檢測試劑盒。
背景技術：
：免疫快速檢測試劑為適應同時檢測人或動物全血和血清樣本的要求，一般采用在樣品墊上附著一定孔徑的聚酯材料以實現(xiàn)血細胞、血清的分離和檢測同時進行。其工作原理是當血細胞體積大于或等于聚酯材料孔徑而被過濾，血清得以通過。該聚酯材料已有商品化產(chǎn)品，如GelmanSciencesInc.的水平紅細胞分離材料、垂直紅細胞分離材料和Whatman公司的全血濾膜。該方法應用于檢測時全血樣本使用量大，分離速度慢，價格昂貴。國內專利(CN1243251A)提供了另一種瞬間分離血細胞和血清的方法，即在全血中混入山羊抗紅細胞血清，紅細胞凝集成團被玻璃纖維墊完全阻擋，血清透過玻纖墊并通過反應膜的毛細作用沿反應膜向吸水墊端移動。此種方法具有樣本用量小價格便宜等優(yōu)點，但不同來源不同批次山羊抗紅細胞血清質量差異大，易失效，生產(chǎn)工藝復雜不易掌握。因此開發(fā)一種簡便、有效、樣本用量小的快速分離血細胞和血清的方法對于免疫層析檢測試劑盒的制備十分必要。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供了一種新型的全血樣品墊的處理方法，并利用該項技術制備適用于同時檢測全血/血清/血漿的免疫層析檢測試劑盒。本發(fā)明所說一種新型全血樣品墊的處理方法可通過以下技術方案實現(xiàn)1.非生物活性凝血激活劑與含磷脂類以及鈣離子<:32+溶液按照如下方法配制1~50g/L非生物活性凝血激活劑0.5~4g/L磷脂0.1~0.5mmol/LCa2+2.將上述制備所得溶液均勻分散在樣品墊上，烘干，即得全血樣品墊。本發(fā)明所說非生物活性凝血激活劑包括白陶土(又稱高嶺土、高錳粉)、鞣花酸、二氧化硅微粒中的一種或幾種。本發(fā)明所說磷脂包括磷脂酰膽堿(PC，又稱卵磷脂)，磷脂醇(PA)、磷酯酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)，神經(jīng)鞘磷脂(SPH)，磷脂醇(PA)，磷脂酰乙醇胺(PE，又稱腦磷脂)中的一種或幾種。本發(fā)明所說樣品墊材質為聚酯膜、玻璃纖維素膜、纖維素濾紙、無紡布中的一種或復合材質。本發(fā)明所說一種應用新型全血樣品墊處理方法的免疫層析檢測試劑盒可通過以下技術方案實現(xiàn)1.用本發(fā)明所說技術方案制備全血樣品墊；2.制備免疫層析用標記物；3.標記抗體或抗原的交聯(lián)及固相化；4.在免疫膜上固定捕捉抗體或抗原或質控線抗體；5.將背板、全血樣品墊、標記物墊、免疫膜和吸水濾紙按照附圖所示裝配成免疫層析試劑盒。6.使用方法將12滴全血樣本滴于樣品墊上同時加入等體積的樣本稀釋液。血液在樣品墊上迅速凝集，被稀釋的血清因毛細作用透過樣品墊并向吸水紙端移動，可在30分鐘內完成檢測反應。本發(fā)明所說免疫層析檢測試劑盒由背板、全血樣品墊、標記物墊、免疫膜和吸水濾紙組成，其中底襯可為聚氯乙烯材料；標記物墊可為聚酯或玻璃纖維素材料并載有抗原抗體標記物；免疫膜可為硝酸纖維素或醋酸纖維素材料。本發(fā)明所說免疫層析用標記物可為膠體金顆粒、乳膠顆粒或熒光納米顆粒等。本方法所說抗原抗體標記方法和固定方法均為制備免疫層析試劑常規(guī)方法。本發(fā)明所說樣本稀釋液為pH值在5~8范圍內具備一定離子強度水溶液，可為生理鹽水、Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液和硼酸-硼砂緩沖液等。本發(fā)明采用廉價、無生物活性的凝血激活劑與含磷脂類按照所需比例混合分散在樣品墊上，即得全血樣本墊，優(yōu)越性在于生產(chǎn)工藝簡單、成本低、使用無生物活性的物質降低了批間差，延長了樣品墊的保存時間。大量實驗數(shù)據(jù)表明，使用此種全血樣品墊處理方法的免疫層析檢測試劑盒，樣本用量小、濾血速度快，可用于同時檢測全血、血清和血漿樣本，其檢測卡(條)的特異性、靈敏度等符合臨床檢測要求。附圖，免疫層析試劑盒組裝示意圖。其中，l-背板、2-全血樣品墊、3-標記物墊、4-免疫膜、5-吸水濾紙、6-檢測線(T線)、7-質控線(C線)具體實施例方式以下實施例描述了本發(fā)明的特殊實施例子，以便對本發(fā)明作進一步的說明，這些實施例只是說明而不表示本發(fā)明所有的可能性。本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例中提到的材料、反應條件或參數(shù)，任何在相關領域具備經(jīng)驗的人，都可以按照本專利的原理，利用其它類似材料或反應條件實現(xiàn)本發(fā)明所描述的免疫層析技術制備出檢測試劑盒。這些并不脫離本發(fā)明描述的基本概念。因此，這些修改或者不同的應都在本發(fā)明的覆蓋范圍之內。實施例一應用白陶土-腦磷脂懸濁液處理全血樣品墊制備乙型肝炎表面抗原膠體金免疫層析檢測試劑盒1.制備白陶土-腦磷脂懸濁液(含24g/l白陶土、2g/l腦磷脂、0.25mmol/lCaCl2);2.將聚酯膜完全浸入懸濁液中充分浸泡，取出平攤烘干即得全血樣品墊。3.膠體金顆粒制備取0.01。/。HAuCl4溶液50ml，加熱煮沸，隨即快速加入1%檸檬酸三鈉溶液0.5ml;繼續(xù)煮沸約5分鐘后結束反應，溶液變成櫻桃紅色，制成膠體金溶液，冷卻后保存。4.標記抗體及固化將膠體金溶液和鼠抗HBsAg單克隆抗體分別以O.lmol/1K2C03調pH值至8.2,電磁攪拌膠體金溶液，加入鼠抗HBsAg單抗，繼續(xù)攪拌10分鐘，加入5%BSA使其終濃度為1%;再加入占1/10終體積的1%聚乙二醇溶液。先低速離心金標蛋白溶液，用1800Xg，4'C離心20分鐘，棄去凝聚的沉淀。然后將金標蛋白溶液用10000Xg，4'C離心1小時；仔細吸出上清，將沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3)重懸為原體積的1/10，噴涂至金標墊上，烘干保存，制成標記物墊。5.制備免疫膜將檢測線蛋白羊抗HBsAg多抗及質控線蛋白羊抗鼠IgG分別用PBS溶液稀釋至lmg/ml，用噴膜儀或劃膜儀將蛋白溶液劃在免疫膜上，烘干保存。6.裝配將全血樣品墊、噴涂有金標蛋白溶液的標記物墊、包被有檢測線蛋白及質控線蛋白的免疫膜、吸水濾紙、背板等按照附圖的形式粘貼組裝。然后剪切成試紙條。7.檢測將一滴或兩滴全血滴加至試紙條的全血樣品墊上，再滴加同等體積的0.01MPB(pH7.4)。15-30分鐘時觀察免疫膜區(qū)域產(chǎn)生的條帶數(shù)量及位置，觀察試驗結果。8.結果評價使用此試紙條檢測乙型肝炎表面抗原陽性全血/血清乙型肝炎表面抗原陰性全血/血清、臨檢中心質控血清。觀察結果，與己獲得上市資格產(chǎn)品進行比對，結果見表l。表l應用白陶土-腦磷脂懸濁液處理全血樣品墊制備乙型肝炎表面抗原免疫層析檢測試劑盒結果評價自產(chǎn)試紙條結果對比試紙條結果+一-合計+52052—05252合計5252104用全血測試時，血液凝集及時，試紙條判讀區(qū)背景清晰，無溶血及紅細胞爬至免疫膜的現(xiàn)象。所有樣本的實驗結果與對比試劑結果相同。說明本全血樣品墊完全能達到分離血液的效果。實施例二應用鞣花酸-腦磷脂懸濁液處理全血樣品墊制備乙型肝炎表面抗原膠體金免疫層析檢測試劑盒1.制備溶液(含2g/L的鞣花酸、3g/L腦磷脂、0.25mmolZLCaCl2);2.將玻璃纖維素膜完全浸入溶液中充分浸泡，取出平攤烘干制得全血樣品墊。37.同實施例一步驟37。8.結果評價用此試紙條檢測乙型肝炎表面抗原陽性全血/血清乙型肝炎表面抗原陰性全血/血清、臨檢中心質控血清。觀察結果，與市面上產(chǎn)品進行比對，結果見表2。表2應用鞣花酸-腦磷脂處理全血樣品墊制備乙型肝炎表面抗原免疫層析檢測試劑盒結果評價<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>用全血測試時，血液凝集及時，試紙條判讀區(qū)背景清晰，無溶血及紅細胞爬至免疫膜的現(xiàn)象。所有樣本的實驗結果與對比試劑結果相同。說明本全血樣品墊完全能達到分離血液的效果。權利要求1.一種應用新型全血樣品墊處理方法其特征在于將非生物活性凝血激活劑與含磷脂類以及鈣離子Ca2+溶液按照一定比例混合，均勻分散在樣品墊上制備所得。2.權力要求1所述非生物活性凝血激活劑包括白陶土(又稱高嶺土、高錳粉)、鞣花酸、二氧化硅微粒中的一種或幾種。3.權力要求1所述磷脂包括磷脂酰膽堿(PC，又稱卵磷脂)，磷脂醇(PA)、磷酯酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)，神經(jīng)鞘磷脂(SPH)，磷脂醇(PA)，磷脂酰乙醇胺(PE,又稱腦磷脂)中的一種或幾種。4.權力要求1所述樣品墊材質包括聚酯膜、玻璃纖維素膜、纖維素濾紙、無紡布中的一種或復合材質。5.—種應用新型全血樣品墊處理方法的免疫層析檢測試劑盒其特征在于所用全血樣品墊按照權利要求1所述處理方法制備所得。6.根據(jù)權利要求5制備所得免疫層析檢測試劑盒，其特征在于由背板、全血樣品墊、標記物墊、免疫膜和吸水濾紙裝配而成。7.根據(jù)權利要求5制備所得免疫層析檢測試劑盒，其特征在于可同時用于檢測全血、血清和血漿樣本。8.根據(jù)權利要求5制備所得免疫層析檢測試劑盒，其特征在于應用于檢測全血樣本時，將1~2滴全血樣本滴于樣品墊上同時加入等體積的樣本稀釋液。血液在樣品墊上迅速凝集，被稀釋的血清因毛細作用透過樣品墊，可在30分鐘內完成檢測反應。9.權力要求8所述樣本稀釋液，其特征在于為pH值在5~8范圍內具有一定離子強度水溶液，可為生理鹽水、Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液和硼酸-硼砂緩沖液等。全文摘要本發(fā)明應用新型全血樣品墊處理方法的免疫層析檢測試劑盒，涉及一種新型全血樣品墊的處理方法和用此技術制備的免疫層析試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明所說全血樣品墊可通過將非生物活性凝血激活劑與含磷脂類以及鈣離子Ca²⁺溶液均勻分散在樣品墊上實現(xiàn)，可廣泛用于同時檢測全血/血清/血漿樣本的免疫檢測試劑盒。該方法可使以全血為檢測樣本的免疫層析試劑制備生產(chǎn)工藝更加簡便、有效，同時兼有成本低廉，樣本用量小，檢測速度快等優(yōu)點。文檔編號G01N33/543GK101614736SQ200810105330公開日2009年12月30日申請日期2008年6月27日優(yōu)先權日2008年6月27日發(fā)明者爭李,欣李,王宇帆申請人:北京華大吉比愛生物技術有限公司