專利名稱：結核病抗原特異的全血IFN-γ診斷試劑盒及其制作方法和應用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及結核病病人和結核桿菌感染者的快速、早期和特異的檢測方法， 特別是一種結核病抗原特異的全血IFN-Y診斷試劑盒及其制作方法和應用方法。
背景技術：
結核病是主要經(jīng)呼吸道傳播的、嚴重危害我國和全世界的重要傳染病之一。 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界有超過1/3的結核桿菌感染者，其中的10%在其一 生中可以發(fā)展成為結核病病人。因此，篩檢感染者在結核病的防治甚至最終的 消滅中扮演中極其重要的作用[CDC.MMWR 44(1995) 1-17.]。
現(xiàn)有的診斷技術對結核桿菌感染者的診斷非常難。近幾十年來，臨床上采 用結核菌素試驗(TST)來診斷結核桿菌感染者。但TST活性成份是純蛋白衍 生物(PPD)，該成份是一種混合物，且非結核分枝桿菌特異的。其檢測結果可 被現(xiàn)在臨床上廣泛使用的疫苗——卡介苗免疫所干擾[P. Andersen, et al. Lancet 356(2000) 1099-1104.]。從1921年發(fā)明卡介苗到現(xiàn)在為止，全世界已有35億人 接種卡介苗。因此TST對感染者的診斷價值受到很大的影響。
對結核病病人的診斷技術包括痰涂片抗酸染色或痰菌培養(yǎng)，陽性率僅 40%-60%左右；肺部X射線檢査肺部病理改變也僅在具有典型的臨床癥狀后才 能診斷；其他血清學診斷方法和分子診斷方法缺乏特異性，假陽性率高。因此， 必須盡快研究結核病和結核桿菌感染者的早期、快速、特異和敏感的診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對上述診斷方法的困難和不足之處，提出一種結核病抗原特異 的全血IFN-Y診斷方法，可實現(xiàn)對結核病病人和感染者早期、快速、特異的診斷， 在阻斷結核病的傳播和流行，對結核病的控制具有重大意義。本發(fā)明是基于以下原理來實現(xiàn)的。結核分枝桿菌感染人體后，首先會被人
體的免疫系統(tǒng)識別，激活機體的T細胞免疫應答，分泌產(chǎn)生IFN-Y，后者發(fā)揮抗 結核感染作用。部分T細胞轉化為免疫記憶細胞，當再次與結核桿菌相遇后， 會再次分泌產(chǎn)生IFN-Y，發(fā)揮抗結核感染作用。抗原特異的IFN-Y產(chǎn)生量與機體 是否感染或發(fā)病密切相關。因此如果采用結核桿菌特異的抗原在體外刺激感染 者和患者的T細胞，可誘導這些T細胞產(chǎn)生高水平的結核桿菌抗原特異的IFNi， 而非結核桿菌感染者或非結核病患者產(chǎn)生的IFN-Y的量與未用抗原刺激產(chǎn)生的 量相近，從而實現(xiàn)診斷的目的。
因此發(fā)現(xiàn)并尋找結核桿菌特異性抗原的鑒定對發(fā)展新一代的診斷試劑具有 重要價值和意義。結核桿菌和卡介苗比較基因組學的研究揭示了卡介苗缺失了 幾個區(qū)(regions of difference, RD)，其中之一命名為RD1區(qū)[M. A. Behr, et al. Science 284 (1999) 1520-1523.]。進一步研究證實RD1區(qū)集中在結核桿菌復合體
(人型結核桿菌、牛型結核桿菌)，而在世界各地的卡介苗菌株中全部缺失[P. Andersen, et al. Lancet 356 (2000) 1099—1104. M.A. Behr, et al. Vaccine 17 (1999) 915-922.]。大量的研究證實RD1區(qū)編碼的抗原Rv3875，是結核桿菌培養(yǎng)過程中 早期產(chǎn)生的分泌性蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量6kDa，或24kDa， 9.9kDa等，主要是 由于該蛋白在自然情況下以多聚體形式存在。該蛋白能夠刺激強的遲發(fā)性變態(tài) 反應和誘導結核病人和他們的接觸者的外周血產(chǎn)生高水平的IFN-y [P. W. Roche, et al. Clin. Exp. Immunol. 103(1996) 226-232. P. W. Roche, et al. Scand. J Immunol. .43 (1996) 662-670. M. J. Elhay ,et al. Infect Immun. 66 (1998) 3454-3456. R. M. Nakamura, et al. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2 (1998) 541~46.]。進一步發(fā)現(xiàn)，能 夠刺激機體產(chǎn)生特異性細胞免疫應答的表位分別是是位于該蛋白的以下肽段[H. M. Vordermeier， etal. Clin. diag. Lab. Immunol., (3)2001,571—578]，艮卩P. 1-16.............................................................MTEQQWNFAGIEAAAS
P.9—24............................................................AGIEAAASAIQGNVTS
P. 17-32..........................................................AIQGNVTSIHSLLDEG
P.57-72 ..........................................................KWDATATELNNALQNL
P.80—95 ..........................................................GQAMASTEGNVTGMFA
RD1區(qū)編碼的另外一個抗原Rv3874，也是結核桿菌培養(yǎng)過程中早期產(chǎn)生的 分泌蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量10kDa，也是一種強免疫原性蛋白。能夠刺激機體產(chǎn) 生特異性細胞免疫應答的T細胞表位分別是位于該蛋白的以下肽段[H. M. Vordermeier, etal. Clin. diag. Lab. Immunol" (3)2001,571—578]，即
Pl.l-18........................................................MAEMKTDA ATL AQE AGNF
P2.13-28.......................................................QEAGNFERISGDLKTQ
P4.55-72 .......................................................VVRFQEAANKQKQELDEI
P7.75-92 ........................................................NIRQAGVQYSRADEEQQQ
P8.85—100 ......................................................RADEEQQQALSSQMGF
因此，本發(fā)明所選用的抗原Rv3875和Rv3874具有結核病特異診斷的上述 潛在的T細胞表位，并構成本發(fā)明抗原選擇的依據(jù)。
首先由于這些蛋白的分子量較小，從結核桿菌的培養(yǎng)物中直接分離純化較 為困難；國外盡管采用合成肽的方法來解決上述困難，肽合成的成本非常高， 由此建立的臨床應用試劑盒的成本大大增加。最后，單獨通過基因工程技術獲 得上述抗原的表位，由于體外和體內(nèi)的差異，表達的產(chǎn)物如國內(nèi)外已經(jīng)報道的， 也容易因為形成包涵體而失去蛋白質(zhì)的活性。
為了克服這些困難和缺陷，本發(fā)明提出的重組蛋白，就是將已經(jīng)公開的， 已知的Rv3875和Rv3874(均來源于美國GenBanK數(shù)據(jù)庫)的基因連接在一起，克隆入大腸桿菌表達載體進行工程化表達，然后進一步大規(guī)模純化重組蛋白。 可集中兩種抗原的T細胞表位和免疫原性的優(yōu)勢，達到優(yōu)勢互補，為臨床大規(guī) 模生產(chǎn)應用奠定了基礎。
盡管國內(nèi)外已有研究報道用上述蛋白作為結核病患者的血清學診斷，但由
于Rv3875和Rv3874蛋白含有大量上述的T細胞表位，主要刺激機體的細胞免 疫應答，因而將上述蛋白作為抗原檢測患者體內(nèi)的產(chǎn)生的相應抗體實現(xiàn)診斷結 核病的目的并未達到。本發(fā)明和這些研究報道有顯著和本質(zhì)的區(qū)別。在獲得本 發(fā)明提出的特異重組蛋白的基礎之上，本發(fā)明進一步提出全血IFN-Y釋放分析方 法，該方法是通過分析結核桿菌抗原特異的細胞免疫應答而診斷結核病患者和 結核病感染者，并建立了結核病抗原特異的全血IFN-y診斷試劑盒。
本發(fā)明提出的試劑盒由兩部分組成，一是結核桿菌特異抗原Rv3875-Rv3874
融合蛋白，該蛋白的氨基酸序列特征為SEQ.ID.No.6，并且至少包含本發(fā)明題及 的兩種以上的T細胞表位，這些T細胞表位分別位于該蛋白氨基酸組成的第1 位到第16位(Rl-16: MTEQQWNFAGIEAAAS);第9位到第24位(P,9-24: AG正AAASAIQGNVTS);第17位到第32位(P.17—32: AIQGNVTSIHSLLDEG); 第52位到第72位(P.57-72: KWDATATELNNALQNL);第80位到第95位
(P.80-95: GQAMASTEGNVTGMFA);第111位到第129位(Plll-129: MAEMKTDAATLAQEAGNF ); 第 123 位至U第 137 位(P123-137: QEAGNFERISGDLKTQ); 第 165 位至[J第 182 位(P165-182: VVRFQEAANKQKQELDEI); 第 185 位至U第 202 位 (Pl85-202: NIRQAGVQYSRADEEQQQ ); 第 195 位至ij第 210 位 (P195-210: RADEEQQQALSSQMGF ) 。 二是市場上廣泛銷售的雙抗原夾心法人IFN-y ELISA檢測試劑盒(如國內(nèi)深圳達科為生物技術公司，晶美生物技術公司等)。在建立結核病抗原特異的全血IFN-Y診斷試劑盒的基礎上，本發(fā)明進一步提 出兩步的檢測方法。 一是抗原特異的IFN-y釋放階段具體包括采集受試者的外 周靜脈血3ml，加入24孔板中的兩個孔(lml/孔)；在采血后6h之內(nèi)，分別加 入用稀釋鹽水溶液稀釋到特定濃度的結核桿菌特異重組蛋白Rv3875-Rv3874(終 濃度5-20微克/ml)，等體積的生理鹽水(陰性對照)和PHA (終濃度5微克/ml， 陽性對照)；混勻后，37度靜止放置20-24h;收集培養(yǎng)上清中的血漿。二是抗原 特異的IFN-y檢測階段具體的方法是按照市售的雙抗原夾心法人IFN-y ELISA 檢測試劑kit中的說明，檢測上述血漿中IFN-Y的含量。
本發(fā)明提出的結核病抗原特異的全血IFN-y診斷具有以下優(yōu)勢 診斷需要的時間短，較為快速，共需要時間1-2天。而結核桿菌培養(yǎng)診斷 需時間l-2月，TST檢測需要3天。
早期診斷。由于結核桿菌一旦感染人體，首先就會被機體的免疫系統(tǒng)所識 別，激活體液和細胞免疫應答，發(fā)生時間在感染后l-2個月，因此利用我們的細 胞免疫學檢測方法即可作出診斷。X光片診斷只有在感染者肺部出現(xiàn)明顯的病 理改變后才可作出診斷，這通常需要很長的時間。抗原抗體檢測法也只有在疾 病癥狀處于活動期的情況下檢測，但環(huán)境中分枝桿菌廣泛存在，其與結核桿菌 的共同抗原，可干擾實驗的診斷結果。
特異診斷。由于采用的是結核桿菌特異性的抗原，只與結核桿菌感染人體 后產(chǎn)生的免疫記憶T細胞起反應，因而產(chǎn)生的干擾素是結核桿菌抗原特異性的 IFN-y。
敏感性高。與TST檢測相比，結核病抗原特異的全血IFN-Y診斷的敏感性 為100%，特異性高達83.3%，具有良好的診斷符合率(^:=0.70)。
因此，本發(fā)明提出結核病抗原特異的全血IFN-Y診斷試劑盒及其制備方法和應用方法，對結核病的控制和消滅具有重要意義。


圖1本發(fā)明的Rv3875-Rv3874的表達載體pPro610的結構示意圖。 圖2 Rv3875-Rv3874在大腸桿菌中的高效表達和純化的SDS-PAGE分析。其中 M代表蛋白質(zhì)分子量標準，1代表重組蛋白Rv3875-Rv3874的純化，2 — 7代表 雜蛋白的去除過程，8代表IPTG誘導前的工程菌裂解產(chǎn)物，9-10分別代表IPTG 誘導后4 h和6 h的工程菌裂解產(chǎn)物。
圖3本發(fā)明診斷方法rCE-WBIA與TST診斷的結果比較。rCE-WBIA診斷的敏 感性為100%，特異性為89%。
下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解這些實施例僅用于說明 本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體的實施方法， 通常是按照實驗室技術常規(guī)或市場公開銷售的試劑盒的說明書進行。
具體實施例方式
實施例l本發(fā)明的目的基因的擴增和表達載體的構建
(l)首先設計引物擴增Rv3875和Rv3874 Rv3875上游GCGGATCCATGACAGAGCAGCAGTG (SEQ.ID.N0.2)
說明單下劃線代表Bflw/7/酶切位點
Rv3875下游
ACATCCCAGTGACGTTGCCTTC (SEQ.ID.N0.3)
說明雙下劃線代表linker基因序列 Rv3874上游CAGAGATGAAGACCGATG (SEQ.ID.NO.4)
說明雙下劃線代表linker基因序列
Rv3874下游CCAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAG (SEQ.ID.NO.5)
說明單下劃線代表///wd///酶切位點 '
以結核桿菌標準毒株(H37Rv)基因組DNA為模板，用以上引物分別進 行擴增CFP21禾t!MPT64， PCR反應條件如下94'C預變性5分鐘；94'C變性1 分鐘，6(TC復性1分鐘，72X:延伸45秒，30個循環(huán)；72。C延伸5分鐘。PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒純化。
(2)擴增融合基因Rv3875-Rv3874和克隆入pProEXHTb質(zhì)粒 利用基因拼接(GeneSOEing)方法，以Rv3875和Rv3874 PCR產(chǎn)物混合物為模 板，用Rv3875的上游引物和Rv3874的下游引物進行擴增Rv3875-Rv3874融合基 因(SEQ.ID.NO. 1) ， PCR反應條件如下94°C預變性5分鐘；94°C變性1分鐘，60°C 復性1分鐘，72。C延伸l分鐘，30個循環(huán)；72X:延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑 盒純化。。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用^^///和///^//77雙酶切，克隆構建在質(zhì)粒 pProEXHTb中，建立表達載體pPro610。酶切鑒定pPro610，證實構建成功。表達 載體pPro610的結構示意圖見圖l。
具體實施例2重組蛋白Rv3875-Rv3874 (SEQ.ID.NO.6)在大腸桿菌中的高效表 達
將構建好的表達載體pPro610轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株并進行高效表 達。其步驟為活化菌體，移入l升LB培養(yǎng)基中搖2-3小時后，經(jīng)IPTG(lmM)37。C 誘導不同時間。離心收集菌體，力[]2XSDS加樣緩沖液，沸水浴3分鐘，表達產(chǎn)物 經(jīng)12.5。/。SDS-PAGE電泳檢測證實。結果見圖2。將該菌種保存于甘油中即為工 程菌。
10具體實施例3 重組蛋白Rv3875-Rv3874的純化
10000rpm離心10min收集誘導表達工程菌，分別將菌裂解上清和沉淀進行 SDS-PAGE電泳檢測，結果上清中和沉淀中均有發(fā)現(xiàn)所需的重組蛋白，蛋白純化 的操作按照Ni-NTA純化體系(Invitrogen,美國)說明書進行。簡要概括步驟如下， 50ml的菌液離心收集后重懸于8ml的鹽酸胍裂解液(6 M鹽酸胍，20 mM磷酸 鈉pH 7.8, 500mM氯化鈉)，冰浴超聲破碎細菌后，于4 。C進行3000rpm離心 10min，上清加到用變性結合緩沖液(8M尿素，200 mM PBS pH 7.8， 500 mM氯 化鈉)預處理的Ni-NTA樹脂中。室溫下孵育30min，結合柱用4ml的變性結合緩 沖液(8 M Urea， 200 mM PBS pH 7.8, 500 mM NaCl)洗兩次，變性洗滌緩沖液 (8 M Urea, 20 mM PBS pH 6.0, 500 mM NaCl)洗兩次，非變性洗滌緩沖液(20 mM PBS, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)洗四次，最后用8ml非變性洗 脫緩沖液(20 mM PBS, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)洗脫。純化過程 中每步驟取上清10pl進行SDS-PAGE (12%)分析。將上清裝入透析帶中，分別 用6M， 4M， 2M， 1M， 0.5M尿素洗液(每種尿素洗液中均含5mM Tris-Cl)各 洗一次，最后用OM尿素(含Tris-C10.6057g)洗兩次，將透析液用真空冰凍干燥 獲得重組蛋白Rv3875-Rv3874凍干粉。-20°(:儲存?zhèn)溆?。純化過程及最終純化的 重組蛋白Rv3875-Rv3874的SDS-PAGE鑒定見圖2。重組蛋白Rv3875-Rv3874的分 子量為34kDa，純度高達95%以上。定量采用BCA法，回收效率為150mg/L。 具體實施例4受檢者外周血產(chǎn)生的Rv3875-Rv3874特異的IFN-Y的產(chǎn)生及其檢測
采集數(shù)十例TST陰性和TST陽性的健康人群的新鮮肝素抗凝靜脈血3ml。各 取lml全血置于24孔板中，l孔加重組蛋白Rv3875-Rv3874(5-20)ig/ml)刺激。另 外兩孔為對照，分別加植物血凝素(PHA， 5pg/ml)或生理鹽水，混勻10min后， 37。C孵育20-24h。每孔收集200pL血清，根據(jù)IFN-y的ELISA檢測試劑盒(如達科為公司或晶美公司等市售)的說明書進行血清中IFN-Y含量的檢測。依據(jù)40例TST 陰性人群用重組蛋白Rv3875-Rv3874刺激產(chǎn)生的血清IFN-y的數(shù)值是 250±100pg/ml (Mean士SD)，其均數(shù)的兩倍數(shù)值確定為診斷標準(cut-off value)。 可將76例受檢人群分為四類(見圖3)，即TST陽性rCE-WBIA陽性
(TST+rCE-WBIA+)者有8例；TST強陽性rCE-WBIA陽性(TST++rCE-WBIA+) 者有8例；TST陰性rC.E-WBIA陽性(TST-rCE-WBIA+)者有10例；TST陰性 rCE-WBIA陰性(TST-rCE-WBIA-)者有50例?？梢娭亟M蛋白Rv3875-Rv3874可 刺激受檢人群外周血產(chǎn)生的IFN-Y分析技術(rCE-WBIA)診斷結核病感染者的 敏感性為100%,特異性為83.3%，與TST診斷結果比較，顯示良好的診斷一致性
(1^0.70)。因此，本發(fā)明提出的重組蛋白Rv3875-Rv3874及建立的新型全血IFN-Y 釋放分析診斷試劑盒和應用方法，必將在結核病和結核桿菌感染者診斷應用上 具有重要意義。
此外，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域的技術人員可以對本 發(fā)明作各種改動和技術修改，這些等價形式同樣落于本申請的權利要求書所限 定的范圍。序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 范雄林
<120>結核病抗原特異的全血IFN- Y診斷試劑盒及其制作方法和應用方法 <130>
<140> 200810045220.0
<141> 200&01-21
<160> 6
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213>編碼rCE融合蛋白的核苷酸序列
<400> 1
aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120ggcggtggcg gaagcggcgg tggcggcagc atggcgaga tgaagaccga tgccgctacc 360
ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg atctccggcg acctgaaaac. ccagatcgac 420
caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag ggccagggc gcggcgcggc ggggacggcc 480
gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa gcagccaata agcagaagca ggaactcgac 540
gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc gtccaatact cgagggccga cgaggagcag 600
cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc tga 633
<210> 2 <211> 25 <212> DNA
<213>人工合成序列(Artificial) <400> 2
gcggatccat gacagagcag cagtg 25
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213>人工合成序列(Artificial)
<400> 3cgccaccgcc gcttccaccg ccacctgcga acatcccagt 60 gacgttgcct tc 72
<210> 4
<211> 67
<212> DNA
<213>人工合成序列(Artificial)
<400> 4
ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc ggcggtggcg gcagcatggc agagatgaag accgatg
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213>人工合成序列(Artificial)
<400> 5
ccaagctttc agaagcccat ttgcgag 27
15<210> 6 <211> 210 <212> PRT
<213> rCE融合蛋白的氨基酸序列 <400> 6
Met Thr Glu Gin Gin Trp Asn Phe Ala Gly He Glu Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15
Ala lie Gin Gly Asn Val Thr Ser lie His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gin Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gin Gly Val Gin Gin Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gin Asn Leu Ala Arg Thr lie Ser Glu Afa Gly 65 70 75 80
Gin Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala 100 105 110Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gin Glu Ala Gly Asn Phe
115 120 125
Glu Arg lie Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gin lie Asp Gin Val Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Gly Ser Leu Gin Gly dn Tip Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala 145 150 155 160
Ala Gin Ala Ala Val Val Arg Phe Gin Glu Ala Ala Asn Lys Gin Lys
165 170 175
Gin Glu Leu Asp Glu lie Ser Thr Asn He Arg GlnAla Gly Val Gin
180 185 190
Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gin Gin Gin Ala Leu Ser Ser Gin Met
195 200 205
Gly Phe 210
1權利要求
1、本發(fā)明涉及結核病和結核分枝桿菌感染者的診斷試劑盒及在結核病和結核桿菌感染者的早期、快速和特異性診斷的應用方法。
2、 根據(jù)權利要求1所述的建立診斷試劑盒，其原理是利用結核桿菌特異的抗原， 刺激受檢者的外周血并產(chǎn)生IFN-y，按照市售的雙抗原夾心法人IFN-y ELISA檢 測說明，檢測IFN-y的濃度。因為結核病病人和結核分枝桿菌感染者可產(chǎn)生高水 平的IFN-Y，達到對結核病和結核分枝桿菌感染者的診斷目的。
3、 根據(jù)權利要求2所述建立的診斷試劑盒，其組成的特征在于包括以下組份(1) 根據(jù)權利要求4所述的結核桿菌的特異重組蛋白；(2) 雙抗原夾心法人IFN-y ELISA檢測試劑kit (市售)
4、 根據(jù)權利要求3所述的一種結核桿菌特異重組蛋白，其特征在于組成該特異 重組蛋白的成份包括結核分枝桿菌抗原Rv3875和Rv3874，其核苷酸的序列特 征為SEQ.ID.NO.l，氨基酸序列特征為SEQ.ID.N0.6。
5、 如權利要求4所述的抗原，用于機體的細胞免疫應答檢測，至少包含以下兩 種以上的T細胞表位，這些表位在SEQ.ID.NO.6中的位置和特征如下 Rl-16: MTEQQWNFAG正AAAS; P.9-24: AG正AAASAIQGNVTS; P.17-32: AIQGNVTSIHSLLDEG ; P.57-72 : KWDATATEL麗ALQNL ; P.80—95 : GQAMASTEGNVTGMFA; Pll 1—129: MAEMKTDAATLAQEAGNF; P123-137: QEAGNFERISGDLKTQ; P165-182: WRFQEAANKQKQELDEI ; P185陽202:NIRQAGVQYSRADEEQQQ; P195-210: RADEEQQQALSSQMGF。
6、 如權利要求4所述的抗原Rv3875和Rv3874來源的細菌菌種，僅限于結核分 枝桿菌的不同型別(人型和牛型)及由這些型別衍生的細菌菌株，以實現(xiàn)結核 桿菌特異抗原的目的。
7、 如權利要求4所述的結核桿菌特異重組蛋白的構建表達和純化方法，其特征在于具體步驟如下首先重組蛋白編碼基因通過PCR技術從權利要求3所述的 細菌DNA中擴增獲得；其次將重組蛋白的編碼基因，克隆構建在原核表達質(zhì)粒 中，并將上述質(zhì)粒轉化工程宿主菌大腸桿菌；最后進一步從表達該蛋白的大腸桿菌工程菌中分離純化該蛋白。
8、 如權利要求4所述建立該重組蛋白的工程菌的PCR擴增引物序列包括 SEQ.ID.NO,2， SEQ.ID.N0.3， SEQ.ID.NO,4和SEQ.ID.N0.5。
9、 根據(jù)權利要求1所述的結核病抗原特異的全血IFN-Y診斷試劑盒的應用方法， 其特征在于該應用方法包括以下兩大階段 一是抗原特異的IFN-y釋放階段包 括采集的樣本為受檢者的外周靜脈血；用權利要求4所述的特異重組蛋白刺激 外周血細胞，37度培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)20-24h;收集培養(yǎng)上清中的血漿。二是抗原特 異的IFN-y檢測階段按照市售的雙抗原夾心法人IFN-y ELISA檢測試劑kit中 的說明，檢測上述血漿中IFN-y的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及結核病和結核分枝桿菌感染者的診斷試劑盒及其制作方法和應用方法。是利用編碼15個氨基酸(G4S1)3的linker，將結核分枝桿菌特異抗原Rv3875和Rv3874的編碼基因(SEQ.ID.NO.6)串聯(lián)起來后，插入大腸桿菌表達載體，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了Rv3875和Rv3874融合蛋白的高效表達和純化。該重組蛋白至少包含了8個可用于細胞免疫診斷的T細胞表位，并以該蛋白為基礎結合人IFN-γ的酶聯(lián)免疫分析技術，建立了全血IFN-γ釋放分析方法的診斷試劑盒以及診斷方法，可以用于結核病和結核桿菌感染者的早期、特異性診斷和篩檢。
文檔編號G01N33/50GK101493454SQ200810045220
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月21日 優(yōu)先權日2008年1月21日
發(fā)明者范雄林 申請人:范雄林