專利名稱：一種基于微球生物檢測的微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基于微球生物檢測的微流控芯片及其制備方法。它可 以用來檢測蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，能夠廣泛應(yīng)用于臨床檢測、檢驗(yàn)檢疫、 環(huán)境監(jiān)測、藥物篩選、微生物鑒定以及核酸和蛋白功能分析等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微流控分析芯片是指通過微電子、微加工技術(shù)在平方厘米大小的固相介質(zhì) 表面構(gòu)建的微型分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對組織和細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)和其他生物 組分的快速、高效、靈敏的處理與分析。它是20世紀(jì)90年代初中期在分析化 學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來的一種分析技術(shù)，以分析化學(xué)和分析生物化學(xué)為基礎(chǔ)，應(yīng)用微 電子加工技術(shù)，在微芯片上加工出微米級的容器、泵、閥、管道等微結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)， 將樣品的制備、反應(yīng)和檢測的這個(gè)過程進(jìn)行集成的微全分析系統(tǒng)。芯片的大小 在幾個(gè)平方厘米左右，選用硅片、玻璃、硅橡膠、塑料等材料作為基片和蓋片， 通過蝕刻、光刻或印模等方法加工微通道，采用電、壓力、重力等方式驅(qū)動(dòng)通 道內(nèi)的流體，最后采用化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)、熒光檢測器等進(jìn)行檢測。該芯片在 裝置上的主要特征是其容納流體的有效結(jié)構(gòu)(包括其通道、反應(yīng)室和其它功能 部件)至少在一個(gè)維度上為微米級尺度。與宏觀尺寸的實(shí)驗(yàn)裝置相比，微流控 分析芯片的微米級結(jié)構(gòu)可以顯著增大流體環(huán)境的面積/體積的比例。這一變化 在微流控系統(tǒng)中導(dǎo)致一系列與物體表面有關(guān)的決定其特殊性能的特有效應(yīng)，如 層流效應(yīng)，表面張力及毛細(xì)效應(yīng)，快速熱傳導(dǎo)效應(yīng)以及擴(kuò)散效應(yīng)等。這些效應(yīng) 可以使微流體分析芯片的分析性能得到顯著的改善，包括可以使分析裝備的體 積減小，裝備更加的集成化自動(dòng)化，可以顯著提高分析效率以及使試樣和試劑 消耗顯著下降等。把實(shí)驗(yàn)室大型設(shè)備集成在盡可能小的操作平臺(tái)上,用以完成不 同的實(shí)驗(yàn)過程，并能對產(chǎn)物進(jìn)行分析的技術(shù)。它不僅使試劑的消耗降低,而且使 實(shí)驗(yàn)速度提高，費(fèi)用降低，充分體現(xiàn)了當(dāng)今實(shí)驗(yàn)室設(shè)備微型化、集成化和便攜化的發(fā)展趨勢。現(xiàn)在微流控芯片巳在生物化學(xué)分析和環(huán)境分析諸方面發(fā)有了廣泛 的應(yīng)用和快速的發(fā)展。由于微流控芯片將整個(gè)樣品分析的過程，包括取樣和樣 品的處理、預(yù)濃集、稀釋和混合、分離、化學(xué)反應(yīng)和信號(hào)檢測全部集成化在一 塊小的芯片上，它與傳統(tǒng)的分析裝置相比實(shí)現(xiàn)了亞微升甚至納升級的試劑和樣 品消耗，反應(yīng)空間的大大縮小使反應(yīng)的均一性提高，反應(yīng)速度加快，同時(shí)降低 了生產(chǎn)成本并便于攜帶。發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種基于微球生物檢測的微流控芯片， 用于以微球?yàn)楣滔噍d體進(jìn)行生物分子檢測。將固定有生物探針分子的編碼微球 通過芯片進(jìn)行進(jìn)樣、與待測樣品反應(yīng)、洗滌和檢測，提供一種檢測分析的芯片 平臺(tái)。技術(shù)方案本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的基于微球生物檢測的微流控芯片由位于上半部的蓋片和位于下 半部的基片所組成；在基片或蓋片內(nèi)設(shè)有功能性的微通道網(wǎng)絡(luò)，在微通道網(wǎng)絡(luò) 中設(shè)有具有編碼的微球作為生物分子檢測的載體，在微通道網(wǎng)絡(luò)中，反應(yīng)池的外周是篩分管道，篩分管道的外周是輔助管道，輔助管道與出口相接，反應(yīng)池 通過長通道接進(jìn)口。生物分子檢測以微球作為載體，微球具有編碼，在微球的表面固定有生物 分子探針，所用的生物分子探針可以是核酸、蛋白質(zhì)、多肽中的一種。在芯片反應(yīng)池中進(jìn)行微球與待測樣品的反應(yīng)；待測溶液和洗滌緩沖液通過 進(jìn)口進(jìn)入反應(yīng)池，在反應(yīng)池中與微球反應(yīng)或洗滌微球， 反應(yīng)結(jié)束微球被輸入通道中檢測并輸出。微球作為探針分子載體，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和橡膠，微球的 大小在50txm 300um之間；芯片的基質(zhì)材料可以是玻璃、硅、聚甲基丙烯 酸甲酯PMMA、聚二甲基硅氧垸PDMS及聚碳酸酯PC中的一種。編碼微球是條形碼編碼、熒光編碼、量子點(diǎn)編碼、光子晶體編碼、拉曼標(biāo) 簽編碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼、大小編碼以及位置編碼中的一 種。反應(yīng)池的直徑在200 P m 1200 n m之間，長通道寬度在60 u m 550 ix m之間，長度在10mm 50mm之間。 其工作原理是a) 在芯片出口處連接一個(gè)往返式注射泵或者蠕動(dòng)泵，將芯片外編碼微球 連其運(yùn)載緩沖液通過長通道，吸入反應(yīng)池。由于篩分通道的尺寸小于 編碼微球的直徑，因此通過泵的繼續(xù)抽吸，微球留在反應(yīng)池中，而運(yùn) 載微球的緩沖液則被吸干；b) 此時(shí)，在通過進(jìn)口吸入待測樣品溶液到反應(yīng)池，使待測樣品溶液與微 球充分反應(yīng)；C)反應(yīng)完畢，繼續(xù)通過進(jìn)口吸入洗滌緩沖液；d)洗滌完全之后，通過出口注入微球運(yùn)載緩沖液，使微球隨運(yùn)載緩沖液進(jìn)入長通道，在微球通過長通道時(shí)，檢測微球表面的反應(yīng)結(jié)果。 有益效果根據(jù)本發(fā)明，利用芯片進(jìn)行檢測載體、樣品注樣，反應(yīng)，洗滌 和檢測的連續(xù)化操作，以編碼微球?yàn)樯锓肿訖z測的固相載體具有以下優(yōu)點(diǎn)(1) 檢測速度快由于雜交反應(yīng)只在微通道內(nèi)進(jìn)行，雜交液循環(huán)流動(dòng)， 可以減少溶液的揮發(fā)和目的靶分子到達(dá)探針的時(shí)間，提高反應(yīng)的速度，縮短檢 測時(shí)間；(2) 可以實(shí)現(xiàn)多元分析檢測每次進(jìn)樣的微球具有編碼，因此可以編碼 多元生物分子檢測，同時(shí)檢測同一個(gè)樣品中的多個(gè)指標(biāo)。同時(shí)球形載體具有比 表面積大，可以滾動(dòng)等特點(diǎn)，所以檢測反應(yīng)的靈敏度高，樣品需要量少，反應(yīng) 速度快；(3) 準(zhǔn)確度高微球在進(jìn)入長通道的時(shí)候，由于通道尺寸略大于微球直 徑，遠(yuǎn)小于兩個(gè)微球的直徑，因此微球只能單個(gè)通過，依次被檢測，準(zhǔn)確性 高；(3)可擴(kuò)展性高由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同樣品預(yù) 處理等微流控芯片集成，促進(jìn)了分析系統(tǒng)的微型化和自動(dòng)化(3)本發(fā)明同時(shí)結(jié)合了微球載體以及微流控芯片的生物檢測優(yōu)勢，對小 尺寸的微球操作簡單，具有鮮明的優(yōu)勢。


圖1為本發(fā)明芯片的的俯視圖。圖2為本發(fā)明芯片使用時(shí)，整個(gè)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。 以上的圖中有進(jìn)口 1、出口2、長通道3、反應(yīng)池4、輔助管道5、篩分 管道6。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明是一種基于微球的微流控分析芯片，該生物芯片由位于上半部的蓋 片和位于下半部的基片所組成；在基片或蓋片內(nèi)設(shè)有功能性的微通道網(wǎng)絡(luò)，在 微通道網(wǎng)絡(luò)中設(shè)有具有編碼的微球作為生物分子檢測的載體，在微通道網(wǎng)絡(luò) 中，反應(yīng)池4的外周是篩分管道6,篩分管道6的外周是輔助管道5，輔助管 道5與出口2相接，反應(yīng)池4通過長通道3接進(jìn)口 1。生物分子檢測以微球作為載體，微球具有編碼，在微球的表面固定有生物 分子探針，所用的生物分子探針可以是核酸、蛋白質(zhì)、多肽中的一種。在芯片 反應(yīng)池4中進(jìn)行微球與待測樣品的反應(yīng)；待測溶液和洗滌緩沖液通過進(jìn)口 1進(jìn) 入反應(yīng)池4，在反應(yīng)池4中與微球反應(yīng)或洗滌微球，反應(yīng)結(jié)束微球被輸入通道 3中檢測并輸出。微球作為探針分子載體，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和 橡膠，微球的大小在50um 300um之間；芯片的基質(zhì)材料可以是玻璃、硅、 聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚二甲基硅氧垸PDMS及聚碳酸酯PC中的一種。 編碼微球是條形碼編碼、熒光編碼、量子點(diǎn)編碼、光子晶體編碼、拉曼標(biāo)簽編 碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼、大小編碼以及位置編碼中的一種。 反應(yīng)池4的直徑在200um 1200um之間，長通道3寬度在60u m 550u m 之間，長度在10mm 50mm之間。作為探針分子載體的微球其材料可以是玻璃、聚苯乙烯或橡膠等。實(shí)施例一以PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)作為芯片材料，在光子晶體 編碼玻璃微球上固定探針進(jìn)行生物檢測，微球直徑為50ixm。a、 基片的制備采用激光微加工方法。通過AutoCAD設(shè)計(jì)微通道圖形， 將CAD圖形轉(zhuǎn)換成激光微加工系統(tǒng)可識(shí)別指令；采用激光微加工系統(tǒng) 在基片(或蓋片)上加工成所需的網(wǎng)絡(luò)微通道，其中，長通道寬度為 60nm，長20mm,反應(yīng)池直徑為250um，篩分管道寬為20um，通 道的深度為60um。兩端打孔分別作為進(jìn)樣口和出樣口；b、 蓋片的制備選擇與基片同樣大小的PMMA片子作為蓋片；蓋片和基片的封裝:直接通過玻璃態(tài)熱鍵和方法進(jìn)行基片和蓋片的封裝; C、微球上固定探針洗凈的微球經(jīng)硅烷化和雙功能試劑修飾，然后將不同 的探針分子固定到光子晶體編碼的玻璃微球上；d、 微流控芯片的連接進(jìn)口 1通過管線連接樣品池，出口 2接往復(fù)式注射 泵；e、 進(jìn)樣通過注射泵將編碼微球連同其運(yùn)載緩沖液吸入長通道3，然后進(jìn) 入反應(yīng)池4，最后抽干運(yùn)載緩沖液，編碼微球留在反應(yīng)池4中；f、 反應(yīng)通過注射泵將待檢測溶液吸入長通道3，最后進(jìn)入反應(yīng)池4中與 編碼微球表面的探針分子進(jìn)行反應(yīng)；g、 洗滌反應(yīng)完畢后，通過注射泵從入口 1吸入洗滌緩沖液到反應(yīng)池4 對微球進(jìn)行充分洗滌；h、 檢測抽干反應(yīng)池4中的洗滌緩沖液，利用注射泵從出口2注入微球的 運(yùn)載緩沖液，運(yùn)載緩沖液將微球帶入長通道(3)，微球依次通過長通道 3)，并在長通道3中依次被檢測。實(shí)施例二以玻璃作為芯片材料，在量子點(diǎn)編碼聚苯乙烯微球上固定探針進(jìn) 行生物檢測，微球直徑為100um。a、 基片的制備采用標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)進(jìn)行濕法刻蝕。在干凈平滑的玻璃基片表面上鍍一層金屬鉻，在鉻層上用甩膠機(jī)均勻的涂布一層光刻膠，將芯 片結(jié)構(gòu)圖通過光刻掩膜用紫外光曝光到光刻膠上，顯影以除去曝光的光刻膠，再用去鉻液腐蝕去鉻層，顯出微通道網(wǎng)絡(luò)的平面二維圖形；最后 即可濕法刻蝕出所需的微通道。其中，長通道寬度為130 P m，長30mm, 反應(yīng)池直徑為500um,篩分管道寬為40nm,通道的深度為130wm;b、 蓋片的制備選擇與基片同樣大小的玻璃作為蓋片；C、蓋片和基片的封裝:在進(jìn)口 l和出口2處打孔后的玻璃基片和平的玻璃 蓋片清洗后即可進(jìn)行高溫加壓鍵合；d、 微球上固定探針:將不同的探針分子固定到不同編碼的聚苯乙烯微球表 面；e、 微流控芯片的連接進(jìn)口 1通過管線連接樣品池，出口 2接往復(fù)式微蠕 動(dòng)泵；f、 進(jìn)樣通過蠕動(dòng)泵將編碼微球連同其運(yùn)載緩沖液吸入長通道3，然后進(jìn)入反應(yīng)池4，最后抽干運(yùn)載緩沖液，編碼微球留在反應(yīng)池4中；g、 反應(yīng)通過蠕動(dòng)泵將待檢測溶液吸入長通道3，最后進(jìn)入反應(yīng)池4中與 編碼微球表面的探針分子進(jìn)行反應(yīng)；h、 洗滌反應(yīng)完畢后，通過蠕動(dòng)泵從入口 1吸入洗絡(luò)緩沖液到反應(yīng)池4對微球進(jìn)行充分洗滌；i、 檢測抽干反應(yīng)池4中的洗滌緩沖液，利用蠕動(dòng)泵從出口 2注入微球的 運(yùn)載緩沖液，運(yùn)載緩沖液將微球帶入長通道3，微球依次通過長通道3， 并在長通道3中依次被檢測。實(shí)施例三以PDMS (聚二甲基硅氧烷)作為芯片材料，在熒光編碼玻璃微 球上固定探針進(jìn)行生物檢測，微球直徑為200ym。a、 基片的制備選擇PDMS的基質(zhì)和固化劑的比例為10: 1 (質(zhì)量比)， 混合均勻后，經(jīng)真空抽氣以除去氣泡后，澆注在事先加工好的陽模上， 進(jìn)行加熱固化25min,其中，長通道寬度為250U m，長50mm,反應(yīng)池 直徑為1200ixm，篩分管道寬為50wm，通道的深度為250 u m。固化 好后將PDMS從模版上揭下，即制成基片；b、 蓋片的制備選擇PDMS的基質(zhì)和固化劑的比例為5: 1 (質(zhì)量比)，混 合均勻后，經(jīng)真空抽氣以除去氣泡后，直接水平放置加熱固化20min 即制成蓋片；C、蓋片和基片的封裝固化好的基片和蓋片再用氧等離子體處理后貼合， 然后直接通過熱鍵合方法進(jìn)行基片和蓋片的封裝；d、 微球上固定探針將不同的探針分子固定到不同編碼的玻璃微球表面；e、 微流控芯片的連接進(jìn)口 1通過管線連接樣品池，出口 2接往復(fù)式微注 射泵；f、 進(jìn)樣通過注射泵將編碼微球連同其運(yùn)載緩沖液吸入長通道3，然后進(jìn) 入反應(yīng)池4，最后抽干運(yùn)載緩沖液，編碼微球留在反應(yīng)池4中；g、 反應(yīng)通過注射泵將待檢測溶液吸入長通道3，最后進(jìn)入反應(yīng)池4中與 編碼微球表面的探針分子進(jìn)行反應(yīng)；h、 洗滌反應(yīng)完畢后，通過注射泵從入口 1吸入洗滌緩沖液到反應(yīng)池4 對微球進(jìn)行充分洗滌；i、 檢測抽干反應(yīng)池4中的洗滌緩沖液，利用注射泵從出口 2注入微球的運(yùn)載緩沖液，運(yùn)載緩沖液將微球帶入長通道3，微球依次通過長通道3, 并在長通道3中依次被檢測。
權(quán)利要求
1、一種基于微球生物檢測的微流控芯片，其特征在于該生物芯片由位于上半部的蓋片和位于下半部的基片所組成；在基片或蓋片內(nèi)設(shè)有功能性的微通道網(wǎng)絡(luò)，在微通道網(wǎng)絡(luò)中設(shè)有具有編碼的微球作為生物分子檢測的載體，在微通道網(wǎng)絡(luò)中，反應(yīng)池(4)的外周是篩分管道(6)，篩分管道(6)的外周是輔助管道(5)，輔助管道(5)與出口(2)相接，反應(yīng)池(4)通過長通道(3)接進(jìn)口(1)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微球生物檢測的微流控芯片，其特征在 于生物分子檢測以微球作為載體，微球具有編碼，在微球的表面固定有生物分 子探針，所用的生物分子探針可以是核酸、蛋白質(zhì)、多肽中的一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種基于微球生物檢測的微流控芯片，其特 征在于在芯片反應(yīng)池(4)中進(jìn)行微球與待測樣品的反應(yīng)；待測溶液和洗滌緩 沖液通過進(jìn)口 (1)進(jìn)入反應(yīng)池(4)，在反應(yīng)池(4)中與微球反應(yīng)或洗滌微球， 反應(yīng)結(jié)束微球被輸入通道(3)中檢測并輸出。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于微球生物檢測的微流控芯片，其特征 在于微球作為探針分子載體，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和橡膠，微球的 大小在50ym 3O0um之間；芯片的基質(zhì)材料可以是玻璃、硅、聚甲基丙烯 酸甲酯PMMA、聚二甲基硅氧垸PDMS及聚碳酸酯PC中的一種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于微球生物檢測的微流控芯片，其 特征在于編碼微球是條形碼編碼、熒光編碼、量子點(diǎn)編碼、光子晶體編碼、拉 曼標(biāo)簽編碼、紅外光譜編碼、形狀編碼、射頻編碼、大小編碼以及位置編碼中 的一種。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微球生物檢測的微流控芯片，其特征 在于反應(yīng)池(4)的直徑在200 u m 1200 um之間，長通道(3)寬度在60u m 550um之間，長度在10mm 50mm之間。
全文摘要
一種基于微球生物檢測的微流控芯片可以用來檢測蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，在臨床檢測、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境監(jiān)測、藥物篩選、微生物鑒定以及核酸和蛋白功能分析等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。該生物芯片由位于上半部的蓋片和位于下半部的基片所組成；在基片內(nèi)設(shè)有微通道網(wǎng)絡(luò)，在微通道中設(shè)有具有編碼的微球作為生物檢測中探針分子的固相載體，在微通道的兩頭設(shè)有一個(gè)進(jìn)口(1)、一個(gè)出口(2)，一個(gè)長通道(3)、一個(gè)反應(yīng)池(4)，一組輔助管道(5)以及篩分管道(6)。在芯片的使用過程中，樣品的進(jìn)樣、反應(yīng)以及反應(yīng)結(jié)果的檢測都在芯片上進(jìn)行，具有集成度高，使用方便，樣品消耗量小，檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101221168SQ20081001939
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者靖 扈, 趙文舉, 趙祥偉, 趙遠(yuǎn)錦, 顧忠澤 申請人:東南大學(xué)