專利名稱：：細(xì)胞培養(yǎng)表型的差異表達(dá)譜分析及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過差異表達(dá)謙分析來鑒定參與賦予特定細(xì)胞表型的基因和蛋白質(zhì)的方法，以及所述基因和蛋白質(zhì)在優(yōu)化細(xì)胞系培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的用途。
背景技術(shù)：
：當(dāng)今生物學(xué)研究的基礎(chǔ)在于最佳培養(yǎng)與維持細(xì)胞系的能力。細(xì)胞系不只提供了用于生物系統(tǒng)和疾病研究的體外模型，而且還被用于生產(chǎn)有機(jī)試劑。特別重要的是4吏用遺傳工程化原核或真核細(xì)胞系來產(chǎn)生大量的重組蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)可以用在生物學(xué)研究中，或者作為治療性化合物用于治療特定的不適或疾病。生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)用于生物制藥學(xué)應(yīng)用一般需要大量的細(xì)胞和/或影響細(xì)胞生長(zhǎng)和/或表達(dá)的特定細(xì)胞培養(yǎng)條件。在某些情況下，重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)得益于向細(xì)胞培養(yǎng)基中引入化學(xué)誘導(dǎo)劑(如丁酸鈉或戊酸)。鑒定響應(yīng)培養(yǎng)條件(或特定試劑)增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基因和有關(guān)的遺傳通路可能闡明潛在的能被操縱用于增加重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)和/或影響細(xì)胞生長(zhǎng)的把標(biāo)。對(duì)于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的研究一直主要是致力于研究基因調(diào)控、細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞代謝及響應(yīng)未折疊蛋白質(zhì)而激活的通路。目前還沒有可行的方法，能允許同時(shí)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)和鑒定參與轉(zhuǎn)基因表達(dá)的遺傳通路。例如，目前可行的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法包括僅測(cè)定已知蛋白質(zhì)的存在和量(如Western(蛋白質(zhì))印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和熒光激活的細(xì)胞分選)、或是已知信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物的存在和量(如Northern(RNA)印跡分析和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的那些。這些及類似的方法不只局限于能夠一次檢測(cè)的已知蛋白質(zhì)和/或mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目，而且它們還需要研究人員在實(shí)驗(yàn)前知道或"猜測(cè)，，什么基因參與轉(zhuǎn)基因表達(dá)(因此使用適當(dāng)?shù)目贵w或寡核苷酸探針)。印跡分析和類似方法另一固有的局限是同樣大小的蛋白質(zhì)或mRNA不能被區(qū)分開來。考慮到在單個(gè)基因組內(nèi)包含的大量的基因，即便使用上述方法鑒定參與遺傳通路的少數(shù)基因也是昂貴而費(fèi)時(shí)的事情。此外，要求研究人員對(duì)于涉及哪些基因有些想法，就不能夠用于鑒定以前未發(fā)現(xiàn)的或未知的參與轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控的基因和有關(guān)通路。因此，在細(xì)胞系工程領(lǐng)域中需要更系統(tǒng)的方法來鑒定(直接或間接)參與特定細(xì)胞培養(yǎng)表型[如增加的和有效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)I的基因和蛋白質(zhì)(包括以前未發(fā)現(xiàn)的基因和蛋白質(zhì))和有關(guān)遺傳通路。發(fā)現(xiàn)這些基因和/或有關(guān)通路將提供能被操縱用來改善重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率和質(zhì)量、影響細(xì)胞生長(zhǎng)的新靼標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過^f吏用核酸微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法提供工業(yè)相關(guān)細(xì)胞系表型的差異表達(dá)i普分析而解決了這些問題。特別是，本發(fā)明提供了通過表達(dá)鐠分析而系統(tǒng)地鑒定最大化蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌的基因和蛋白質(zhì)及有關(guān)通路的方法。本發(fā)明還提供了用于操縱鑒定的基因和蛋白質(zhì)來工程化改進(jìn)細(xì)萬包系的方法。7因此，一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定調(diào)控或指示細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)表型的蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括生成得自測(cè)試細(xì)胞系的樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)譜；將所述蛋白質(zhì)表達(dá)譜與得自對(duì)照細(xì)胞系的對(duì)照謙比較；和基于比較[其中測(cè)試細(xì)胞系具有和對(duì)照細(xì)胞系不同的細(xì)胞培養(yǎng)表型l鑒定一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，且所述一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠調(diào)控或指示細(xì)胞培養(yǎng)表型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞系是中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。在另一實(shí)施方案中，通過熒光二維差異凝膠電泳生成蛋白質(zhì)表達(dá)i昝。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)表型是細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞生產(chǎn)力(例如最大細(xì)胞生產(chǎn)力或持續(xù)高細(xì)胞生產(chǎn)力)、峰值細(xì)胞密度、持續(xù)細(xì)胞活力、氨生產(chǎn)或消耗速率、或乳酸生產(chǎn)或消耗速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)表型是最大細(xì)胞生產(chǎn)力。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)表型是持續(xù)細(xì)胞活力。而在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)表型是峰值細(xì)胞密度。又在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)表型是細(xì)胞生長(zhǎng)速率。本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)依照上述方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)改進(jìn)細(xì)胞系的方法。在此所用的"上調(diào)"包括提供編碼目的蛋白質(zhì)或保留其活性的變體(例如，其哺乳動(dòng)物同源物，例如靈長(zhǎng)動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物同源物)的外源核酸(例如過表達(dá)構(gòu)建體)，或提供間接增強(qiáng)蛋白質(zhì)或基因活性或表達(dá)水平的因子或分子。在此使用的"下調(diào)"包括敲除編碼目的蛋白質(zhì)的基因、提供RNA干擾構(gòu)建體、或提供間接抑制蛋白質(zhì)或基因活性或表達(dá)水平的抑制劑或其他因子。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過RNA千擾下調(diào)依據(jù)上述方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)來改進(jìn)細(xì)胞系的方法。特別地，本發(fā)明提供了改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生產(chǎn)力的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)依據(jù)上述方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生產(chǎn)力的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)選自表2、3、9、10、11和12的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)速率的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)依據(jù)上述方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。特別地，本發(fā)明提供了改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)速率的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)選自表4、5、6、13、14、27和28的一個(gè)或多個(gè)基因和蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于增加細(xì)胞系的峰值細(xì)胞密度的方法，包括依據(jù)上述方法調(diào)節(jié)(即上調(diào)或下調(diào))一個(gè)或多個(gè)鑒定的蛋白質(zhì)。特別地，本發(fā)明提供了用于增加細(xì)胞系的峰值細(xì)胞密度的方法，包括調(diào)節(jié)(即上調(diào)或下調(diào))一個(gè)或多個(gè)選自表8、15、16和17的基因或蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加細(xì)胞系的持續(xù)細(xì)胞活力的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)依據(jù)上述方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。特別地，本發(fā)明提供了增加細(xì)胞系的持續(xù)細(xì)胞活力的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)選自表7、18和19的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)控細(xì)胞系的乳酸生產(chǎn)或消耗的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)依據(jù)上述方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。特別地，本發(fā)明提供了調(diào)控細(xì)胞系的乳酸生產(chǎn)或消耗的方法，包括調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)選自表7、18和19的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。而在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)依據(jù)上述方法鑒定的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)來改進(jìn)細(xì)胞系的方法。特別地，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)選自表20、24、25和26的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)來改進(jìn)細(xì)胞系的方法。另一方面，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)即上調(diào)或下調(diào)至少兩種基因或蛋白質(zhì)來改進(jìn)細(xì)胞系的方法，其中第一基因或蛋白質(zhì)影響第一細(xì)胞培養(yǎng)表型，而第二基因或蛋白質(zhì)影響不同的第二細(xì)胞培養(yǎng)表型，其中細(xì)胞培養(yǎng)表型選自細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞生產(chǎn)力、峰值細(xì)胞密度、持續(xù)細(xì)胞活力、氨生產(chǎn)或消耗速率、或乳酸生產(chǎn)或消耗速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括上調(diào)或下調(diào)影響不同于第一和笫二細(xì)胞培養(yǎng)表型的第三細(xì)胞培養(yǎng)表型的第三種基因或蛋白質(zhì)。又另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了評(píng)估細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)表型的方法。所述方法包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中依照上述任一方法鑒定的蛋白質(zhì)的表達(dá)9水平，并將所述表達(dá)水平與參照水平相比較，其中比較指示細(xì)胞培養(yǎng)表型?？蛇x的，本發(fā)明提供了評(píng)估細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)表型的方法。所述方法包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中指示細(xì)胞培養(yǎng)表型的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記，其中所述標(biāo)記從由選自圖7-138的肽、或選自表1-20和表24-30的基因或蛋白質(zhì)組成的組中選擇。另一方面，本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)表型的工程細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)依照上述不同方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。特別地，本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的細(xì)胞生產(chǎn)力的工程細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表2、3和9-12的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的細(xì)胞生長(zhǎng)速率的工程細(xì)胞系，其包括工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包括上調(diào)或下調(diào)選自表4、5、6、13、14、27和28的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的峰值細(xì)胞密度的工程細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包括上調(diào)或下調(diào)選自表8、15、16和17的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的持續(xù)細(xì)胞活力的工程細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表18和26的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有調(diào)控的乳酸生產(chǎn)或消耗的工程細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表29和3010的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改進(jìn)的工程細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表20、24、25和26的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。在其他實(shí)施方案中，工程構(gòu)建體是千擾RNA構(gòu)建體。而在另一方面，本發(fā)明提供了使用如上所述工程細(xì)胞系表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括向根據(jù)上述任一實(shí)施方案的工程細(xì)胞系中引入編碼目的蛋白質(zhì)的核酸和收獲目的蛋白質(zhì)的步驟。又在另一方面，本發(fā)明還提供了分離的基因或蛋白質(zhì)、或是以前未發(fā)現(xiàn)基因或蛋白質(zhì)的、和/或參與調(diào)控或指示目的細(xì)胞培養(yǎng)表型的多核苷酸或多肽。特別地，本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸，其包含選自表9、13和15的序列、其互補(bǔ)物、其亞序列。本發(fā)明還提供了分離的或重組的蛋白質(zhì)，其包含選自表2和3的序列或其片段。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸分子或蛋白質(zhì)的遺傳工程表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此外本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明蛋白質(zhì)編碼核酸的抑制性多核苷酸，如反義和RNA干擾(RNAi)分子。本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)勢(shì)在下面的發(fā)明詳述中顯而易見。但是應(yīng)當(dāng)理解，雖然發(fā)明詳述指出了本發(fā)明的實(shí)施方案，但其僅作為舉例說明給出，而不作為限制?；诎l(fā)明詳述，在本發(fā)明范圍內(nèi)的多種改變和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖的簡(jiǎn)短說明圖l是鑒定本發(fā)明基因和蛋白質(zhì)的例示性方法的流程圖。圖2圖解了CHO細(xì)胞系和細(xì)胞表型的例示性矩陣。圖3描述了測(cè)試細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系之間關(guān)于"高細(xì)胞生長(zhǎng)速率"表型的例示性性表型比較。圖4圖解了蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析方法。圖5及圖6描述了例示性凝膠上的Cy3和Cy5染色模式，并給出了所選擇蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度的圖示。圖5顯示了在cy5標(biāo)記的測(cè)試細(xì)胞提取物中顯示有5倍上調(diào)的蛋白質(zhì)。圖6顯示了在cy5標(biāo)記的測(cè)試細(xì)胞提取物中顯示有4倍下調(diào)的蛋白質(zhì)。圖7-138圖解了差異表達(dá)的個(gè)體蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)和分析。圖139和140圖示了無監(jiān)督的皮爾森(Pearson)聚類分析。圖141描述了用成對(duì)差異進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的例示性方法。圖142描述了不依賴于成對(duì)差異進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的例示性方法。圖143-146描述了所鑒定的基因在3C7細(xì)胞系中的例示性評(píng)估。圖147和148圖解了評(píng)估過表達(dá)所鑒定的基因?qū)τ诩?xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)力的影響的24孔形式。圖149-151圖解了過表達(dá)所鑒定的基因?qū)τ诩?xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)力的例示性結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了鑒定影響目的細(xì)胞培養(yǎng)表型的基因和蛋白質(zhì)的系統(tǒng)方法。本發(fā)明的方法基于工業(yè)相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)表型的差異表達(dá)譜分析，整合使用DNA^f效陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。特別地，所述方法包括生成測(cè)試細(xì)胞系樣品的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)i普；將基因或蛋白質(zhì)表達(dá)語與細(xì)胞培養(yǎng)表型不同于測(cè)試細(xì)胞系的對(duì)照細(xì)胞系的對(duì)照鐠相比較；基于所述比較來鑒定一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的基因或蛋白質(zhì)。此處使用的測(cè)試細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系可以是具不同遺傳背景的不同細(xì)胞系，或是在不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相同細(xì)胞系。一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的基因或蛋白質(zhì)是調(diào)控或指示目的細(xì)胞培養(yǎng)表型的候選基因或蛋白質(zhì)。所鑒定的基因或蛋白質(zhì)可以經(jīng)進(jìn)一步確認(rèn)和證實(shí)。還可以操縱所鑒定的基因或蛋白質(zhì)以改進(jìn)目的細(xì)胞培養(yǎng)表型。因此，本發(fā)明為細(xì)胞工程領(lǐng)域理性設(shè)計(jì)改進(jìn)細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)條件方面的重大進(jìn)展。本發(fā)明的種種方面在下面的分節(jié)中有進(jìn)一步的詳述。分節(jié)的使用無意限制本發(fā)明。各分節(jié)可以應(yīng)用到本發(fā)明的任何方面。在本申請(qǐng)中，除非另有聲明，"或"表示"和/或"。勿^屑型本發(fā)明設(shè)想對(duì)不同生物、包括但不限于細(xì)菌、植物、真菌和動(dòng)物(后者包括但不限于昆蟲和哺乳動(dòng)物)的細(xì)胞系進(jìn)行差異表達(dá)鐠分析和優(yōu)化。例如，本發(fā)明可以應(yīng)用于大腸桿菌OE^^WcW"co/0、草地夜蛾(S/wfe/7tem,Mg^7^Y/")、煙草屬物種(A^'cW""fl5/;.)、玉蜀黍(Zefl附fl")、浮萍屬物種(丄簡(jiǎn)""夢(mèng))、酵母屬物種(5"flc由ra附戸"/;.)、畢赤酵母屬物種(戶/c/^Vi5p.)、裂殖酵母屬物種(5^/^zM"cc/i"/w^cesw.)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、包括但不限于COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、A431細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、L細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、U937細(xì)胞、HEK細(xì)胞、PerC6細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、正常二倍體細(xì)胞、來自原代組織(primarytissue)體外培養(yǎng)和原代移植物(primaryexplant)的細(xì)胞林。所述生物和細(xì)胞系名錄僅意在提供非限制性的例子。特別地，本發(fā)明考慮對(duì)工業(yè)相關(guān)細(xì)胞系例如CHO細(xì)胞進(jìn)行差異表達(dá)譜分析。CHO細(xì)胞是用于治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)例如單克隆抗體生產(chǎn)、受體生產(chǎn)及Fc融合蛋白生產(chǎn)的主要宿主，因?yàn)镃HO細(xì)胞確保折疊、加工和糖基化的保真度。CHO細(xì)胞也適合于深層、無血清培養(yǎng)并具有很好的安全記錄。本發(fā)明使人們能夠理解影響期望細(xì)胞培養(yǎng)表型或特性[例如允許高生產(chǎn)力的分批補(bǔ)料過程的細(xì)胞表型的通路、基因和蛋白質(zhì)。這樣的期望細(xì)胞表型包括但不限于高細(xì)胞生長(zhǎng)速率、高峰值細(xì)胞密度、持續(xù)的高細(xì)胞活力、高最大細(xì)胞生產(chǎn)力、持續(xù)高細(xì)胞生產(chǎn)力、低氨產(chǎn)量和低乳酸產(chǎn)量。期望的表型或特性可以是具有特定基因組背景的已建細(xì)胞系的固有特性。還可以通過在不同條件如溫度、細(xì)胞密度、使用試劑如丁酸鈉的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，使其處于不同動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)期(例如停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期或死亡期)和/或使其變?yōu)檠宸且蕾囆缘葋碣x予細(xì)胞期望的表型或特性。在誘導(dǎo)這些13表型的期間和/或在獲得這些表型之后，可以從細(xì)胞制備靼核酸或蛋白質(zhì)樣品庫并用寡核苷酸陣列分析，以確定和鑒定哪些基因響應(yīng)于特定刺激物(如溫度、丁酸鈉)顯示出改變的表達(dá)，并因此有可能參與賦予期望的表型或特性。游/s裙鑀岸為了進(jìn)行基因表達(dá)鐠分析，從來自細(xì)胞系的樣品中制備靶核酸庫。任何生物樣品可以用做靶核酸的來源。靼核酸庫可以是總RNA,或由之衍生的任何核酸，包括通過反轉(zhuǎn)錄mRNA制備的每條cDNA單鏈、或是自雙鏈cDNA中間體轉(zhuǎn)錄的RNA。分離靼核酸以通過寡核苷酸陣列或其他探針進(jìn)行分析的方法，例如酚-氯仿抽提、乙醇沉淀、磁珠分離或硅膠親和純化，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。舉例來說，不同的方法可用于分離或富集RNA。這些方法包括但不限于RNeasy試劑盒(由凱杰公司(Qiagen)提供)、MasterPure試劑盒(由EpicentreTechnologies公司提供)、charge-switch才支術(shù)(見例^口美國(guó)公布專利申請(qǐng)?zhí)?003/0054395和2003/0130499)及TRIZOL(由GibcoBRL公司提供)。由昂飛公司(Affymetrix)提供的RNA分離方法也可用于本發(fā)明，見例如《基因芯片表達(dá)分析技術(shù)指南》(GeneChipEXPRESSIONANALYSISTECHNICALMANUAL)(701021rev.3，昂飛公司(Affymetrix,Inc.),2002)。優(yōu)選耙核酸庫(即由之衍生的mRNA或核酸)應(yīng)反映基因編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)例子中，通過除去rRNA富集mRNA?？捎貌煌姆椒▉硐蚪档蜆悠分械膔RNA量。例如，可通過酶消化去除rRNA。依照后面的方法，rRNA首先使用反轉(zhuǎn)錄酶和特異引物擴(kuò)增來產(chǎn)生cDNA。使rRNA與cDNA退火。然后用RNA酶H處理樣品，其能特異消化RNA:DNA雜合體中的RNA。可以擴(kuò)增把核酸，之后與寡核香酸陣列或其他探針孵育。合適的擴(kuò)增方法包括但不限于反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、自主序列復(fù)制和體外轉(zhuǎn)錄，為本領(lǐng)域所熟知。要注意的是應(yīng)選擇寡核苷酸探針與靼核酸互補(bǔ)。因此，如果提供反義革巴核酸庫(當(dāng)通過體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增革巴核酸時(shí)通常如此)，寡核苷酸探針應(yīng)對(duì)應(yīng)于有義互補(bǔ)鏈的亞序列。反之，如果乾核酸庫是有義的，寡核苷酸陣列應(yīng)與之互補(bǔ)(即反義)。最后，如果耙核酸是雙鏈，寡核苷酸探針可以是有義或反義。本發(fā)明包括檢測(cè)耙核酸和互補(bǔ)寡核苷酸探針之間的雜交強(qiáng)度。為實(shí)現(xiàn)之，粑核酸可以直接或間接與合適可檢測(cè)標(biāo)記相連。直接標(biāo)記是直接附著于或摻入靶核酸的可檢測(cè)標(biāo)記。間接標(biāo)記是在雜交后附著于多核苦酸，通常通過附著于在雜交前已附著于靼核酸的結(jié)合部分實(shí)現(xiàn)。此類直接和間接標(biāo)記為本領(lǐng)域所熟知。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，靶核酸使用生物素-鏈霉親和素-PE偶聯(lián)系統(tǒng)來檢測(cè)，其中生物素?fù)饺氚泻怂?，并通過鏈霉親和素-PE與生物素的結(jié)合來檢測(cè)雜交。耙核酸可以在與寡核苷酸陣列孵育之前、期間或之后標(biāo)記。優(yōu)選在孵育前標(biāo)記耙核酸?？梢酝ㄟ^在反應(yīng)中使用已經(jīng)標(biāo)記的核苷酸(如生物素偶聯(lián)的dUTP或dCTP)在擴(kuò)增步驟摻入標(biāo)記?？蛇x的是，標(biāo)記可以直接加入到原始核酸樣品(例如mRNA、cDNA)中，或在擴(kuò)增完成后加入到擴(kuò)增產(chǎn)物中。將標(biāo)記附著至核酸的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，包括但不限于缺口翻譯、末端標(biāo)記以及將耙核酸連至核酸接頭，借助接頭將其與標(biāo)記連在一起?？蛇x地，專門設(shè)計(jì)用于分離和制備靶核酸進(jìn)行微陣列分析的幾種試劑盒是可商購(gòu)的，包括但不限于GeneChipIVT標(biāo)記試劑盒(加州圣克拉拉市昂飛公司(Affymetrix，SantaClara,Calif.))和BioarrayTMHighYieldTMRNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒，配有熒光素-UTP用于核酸P車列(紐約州法明岱爾市因助生命科學(xué)公司(EnzoLifeSciences,Inc.,Farmingdale,N.Y.))。在用可檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記之前多核苷酸可以被片段化。用于片段化的例示性方法包括但不限于熱或離子介導(dǎo)的水解。15適用于本發(fā)明的探針包括寡核苷酸陣列或能夠檢測(cè)細(xì)胞(或細(xì)胞系)、包括已知的細(xì)胞或來自未測(cè)序生物的細(xì)胞中多種基因(包括以前未發(fā)現(xiàn)的基因)的表達(dá)、鑒定可能參與誘導(dǎo)特定細(xì)胞表型(如增加的及有效的轉(zhuǎn)基因表達(dá))的基因(包括以前未發(fā)現(xiàn)基因)和有關(guān)通路的其他探針。本發(fā)明使用的寡核苷酸探針可以是核苷酸多聚體或類似物和其修飾形式，從而與乾核酸庫的雜交以序列特異性的方式在寡核苷酸陣列雜交條件下發(fā)生。在此使用的術(shù)語"寡核苷酸陣列雜交條件"意指通常用于寡核苷酸陣列雜交的溫度和離子條件。在許多實(shí)例中，這些條件包括于45。C雜交16小時(shí)，接著在室溫洗滌至少三次，每次10分鐘。雜交緩沖液包含100mMMES、lM[Na+、20mMEDTA和0.01%Tween20。雜交緩沖液的pH范圍可以是6.5到6.7。洗滌緩沖液是6xSSPET，其中包含0.9MNaCl、60mMNaH2P04、6mMEDTA和0.005%TritonX-IOO。在更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓押塑账彡嚵须s交條件下，洗滌緩沖液可以含IOOmMMES、0.1M[Na+]和0.01%Tween20。參見《基因芯片表達(dá)分析技術(shù)指南》(GENECHIPEXPRESSIONANALYSISTECHNICALMANUAL)(701021rev.3，昂飛公司(Affymetrix,Inc.)2002),在此以其整體引入作為參考。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，寡核苷酸探針可以是任何長(zhǎng)度。優(yōu)選適用于本發(fā)明的寡核苷酸長(zhǎng)度為20到70個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地，合適的寡核苷酸探針長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸探針具有相對(duì)高的序列復(fù)雜度。在許多實(shí)例中，探針不含長(zhǎng)段的相同核苷酸。此外，可以設(shè)計(jì)探針，從而其3，端沒有高比例的G或C殘基。在另一實(shí)施方案中，探針沒有3，末端T殘基。取決于欲實(shí)施的測(cè)定或檢測(cè)的類型，探針序列中可以納入或者排除預(yù)測(cè)會(huì)形成發(fā)夾或鏈內(nèi)結(jié)構(gòu)如"引物二聚體"的序列。在許多實(shí)施方案中，本發(fā)明所采用的^#針不含任何的不明確堿基。制備寡核苷酸探針，使之特異于模板序列(例如與之互補(bǔ)，即能夠與之雜交)。模板序列的任何部分能夠用來制備探針。每個(gè)模板序列可以制備多重?fù)]:4十，如5、10、15、20、25、30個(gè)或更多。這些多重探針可能互相重疊，可能不重疊。不同探針間的重疊在某些測(cè)定中可能是期望的。在許多實(shí)施方案中，模板序列的探針和其他模板序列或其互補(bǔ)物序列同一性低。例如，模板序列的每個(gè)探針和其他模板序列或其互補(bǔ)物的序列同一性可以不超過70%、60%、50%或更低。這降低了不期望的交叉雜交風(fēng)險(xiǎn)。可以4吏用本領(lǐng)域已知的方法確定序列同一性。這些方法包括但不限于BLASTN、FASTA和FASTDB。也可使用遺傳計(jì)算組(GeneticsComputerGroup,GCG)程序，它是包括BLASTN和FASTA的批程序。模板序列的優(yōu)選序列包括但不限于共有序列、轉(zhuǎn)基因序列和對(duì)照序列(即用于控制或標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)、樣品、嚴(yán)謹(jǐn)度需求及乾核酸制品間差異的序列)。此外，任何共有序列、轉(zhuǎn)基因和對(duì)照序列的亞序列君可以用做模板序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，僅利用共有序列、轉(zhuǎn)基因和對(duì)照序列的某些區(qū)域(即疊片區(qū)域(tilingregion))作為本發(fā)明所用寡核苷酸探針的模板序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到可用于實(shí)施本發(fā)明的方法(如體外轉(zhuǎn)錄方法)通常導(dǎo)致偏向于乾核酸3，端。因此，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，共有序列或轉(zhuǎn)基因序列中最接近于共有序列3'端的區(qū)域最常用作寡核苷酸探針的模板。一般而言，如果能夠鑒定出多聚腺苷酸(poly-A)信號(hào)，緊靠共有序列或轉(zhuǎn)基因序列末端之前的1400個(gè)核苷酸被指定為疊片區(qū)域?？蛇x地，如果不能鑒定出poly-A信號(hào)，僅共有序列或轉(zhuǎn)基因序列最后的600個(gè)核苷酸被指定為疊片區(qū)域。然而，應(yīng)注意的是本發(fā)明不限于只使用這些共有序列、轉(zhuǎn)基因和對(duì)照序列內(nèi)的疊片區(qū)域作為寡核苷酸探針的模板。事實(shí)上，疊片區(qū)域可能出現(xiàn)在共有序列、轉(zhuǎn)基因或?qū)φ招蛄袃?nèi)的任何處。例如，對(duì)照序列的疊片區(qū)域可能包含來自對(duì)照序列的5，和3，端的區(qū)域。實(shí)際上，完整共有序列、轉(zhuǎn)基因或?qū)φ招蛄锌梢员挥米鞴押塑账崽结樀哪０?。適用于本發(fā)明的寡核苷酸陣列可以包括和如上所述鑒定的多種共有序列(即多序列簇的共有序列及例示性序列的共有序列)精確配對(duì)的探針。適用于本發(fā)明的寡核苷酸陣列還可以包括與共有和轉(zhuǎn)基因序列都精確配對(duì)的探針。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，當(dāng)細(xì)胞系經(jīng)遺傳改造以表達(dá)由轉(zhuǎn)基因序列編碼的重組蛋白質(zhì)、分析目的是證實(shí)轉(zhuǎn)基因表達(dá)及確定此表達(dá)水平時(shí)，在轉(zhuǎn)基因序列中納入寡核苷酸探針是有用的。在那些轉(zhuǎn)基因以雙順反子mRNA連接至下游ORF如二氬葉酸還原酶(DHFR)的情況下，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平也可以根據(jù)下游序列的表達(dá)水平來確定。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，寡核苷酸陣列還包含標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)、樣品、嚴(yán)謹(jǐn)度需求和靶核酸制品間固有差異的對(duì)照探針。這些類型對(duì)照揮:針中每一類的例示性組成參見美國(guó)專利號(hào)6,040,138和美國(guó)公開號(hào)20060010513中，兩者的教導(dǎo)在此以其整體引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的是，從同一樣品獨(dú)立加工的兩個(gè)革S核酸庫能夠與兩個(gè)單獨(dú)但相同的寡核苷酸陣列雜交而有不同的結(jié)果。這些陣列間的不同結(jié)果歸因于幾個(gè)因素，如標(biāo)記靼核酸庫的強(qiáng)度和孵育條件。為了控制這些差異，可以在陣列中標(biāo)準(zhǔn)化添加對(duì)照探針。標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照探針是與摻和在粑核酸庫中的已知核酸序列精確互補(bǔ)的寡核苷酸。任何寡核苷酸序列可以用作標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照探針。例如，標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照探針可以從得自不同于待分析細(xì)胞系來源生物的沖莫板創(chuàng)建。在一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)哺乳動(dòng)物序列的寡核苷酸陣列包含針對(duì)下列基因的標(biāo)準(zhǔn)化寡核苷酸探針來自生物大腸桿菌的Wo"、WoC和6"D、來自生物噬菌體PI的cm、以及來自生物枯草芽孢桿菌(5"7/附s"M7Zs)的J"/;,或他們的亞序列。從標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照探針獲得的信號(hào)強(qiáng)度接著用于標(biāo)準(zhǔn)化來自陣列中所有其他探針的信號(hào)強(qiáng)度。此外，當(dāng)已知核酸序列對(duì)于每一轉(zhuǎn)錄物而言以已知的不同濃度摻和在靶核酸庫中時(shí)，可以生成將信號(hào)強(qiáng)度與轉(zhuǎn)錄物濃度相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且可以定量陣列上呈現(xiàn)的所有轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平(見例如Hill等(2001)GenomeBiol.2(12):research0055.1-0055.13)。因?yàn)榧?xì)胞間天然不同的代謝狀態(tài)，具體靶核酸的表達(dá)隨著樣品的不同而存有差異。此外，某個(gè)庫中的輩巴核酸與另一個(gè)庫相比可能更傾向于降解。因此，在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，寡核苷酸陣列還包含與反映細(xì)胞代謝狀態(tài)的組成型表達(dá)基因或其亞序列精確互補(bǔ)的寡核苷酸探針。這些類型的基因的非限制性例子是P-肌動(dòng)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。18在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸庫通過使用在美國(guó)公開號(hào)20060010513中所述的方法將分離自樣品的總RNA轉(zhuǎn)換成雙鏈cDNA、并將產(chǎn)生的cDNA轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)RNA(cRNA)來獲得，所述方法的教導(dǎo)在此以其整體引入作為參考。RNA轉(zhuǎn)換方法始于RNA轉(zhuǎn)錄物的3，端，并且如果所述過程無法進(jìn)行完全(例如，如果RNA是缺口的，等)，則3，端信息的量相對(duì)于5，端信息將更大，導(dǎo)致3'偏向。此外，RNA降解可能始于5，端(JacobsAnderson等(1998)EMBOJ.17:1497-506)。這些方法的使用暗示著寡核苷酸陣列中優(yōu)選應(yīng)納入衡量操作質(zhì)量和樣品降解量的對(duì)照探針。此類對(duì)照探針的例子有與組成型表達(dá)基因如上述p-肌動(dòng)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和GAPDH的3，和5，端精確互補(bǔ)的寡核苷酸。從而所產(chǎn)生的組成型表達(dá)基因的3，對(duì)5，表達(dá)比率指示了操作的質(zhì)量和樣品的降解量，即大于3的3，對(duì)5，比率指示著不完全的操作或是高RNA降解(Auer等(2003)Nat-Genet.35:292-93)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸陣列包括與組成型表達(dá)基因3，和5'端互補(bǔ)的對(duì)照探針。乾核酸庫的質(zhì)量不只反映于操作和靼核酸的降解，而且反映在草巴核酸的來源。污染的序列如基因組DNA可能干擾熟知的定量方法。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，陣列還包含精確互補(bǔ)于細(xì)菌基因、核糖體RNA和/或基因組基因間區(qū)域的寡核苷酸探針，以提供控制樣品制備物質(zhì)量的手段。這些探針控制靶核酸庫被細(xì)菌DNA、非mRNA物質(zhì)和基因組DNA污染的可能性。在美國(guó)公開號(hào)20060010513中公布了這類例示性對(duì)照序列，其教導(dǎo)在此以其整體引入作為參考。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸陣列還包含對(duì)于各完美匹配探針而言的對(duì)照錯(cuò)配寡核苷酸探針。錯(cuò)配探針控制雜交特異性。優(yōu)選地，錯(cuò)配對(duì)照探針除了一個(gè)或多個(gè)取代的堿基之外，與其相應(yīng)的完美匹配探針完全相同。更優(yōu)選的是，取代發(fā)生在探針的中心位置。例如，當(dāng)完美匹配探針長(zhǎng)度是25個(gè)核苷酸時(shí)，相應(yīng)的錯(cuò)配探針將具有相同的長(zhǎng)度和序列，除了發(fā)生在13位處的單堿基取代(例如將腺噤呤取代為胸腺嘧啶、胸腺嘧咬取代為腺嘌呤、鳥嘌呤取代為胞嘧啶或胞嘧咬取代為鳥嘌呤)。錯(cuò)配寡核苷酸探針中一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基的存在不允許在適當(dāng)條件下與互補(bǔ)的完美匹配探針結(jié)合的靶核酸與相應(yīng)的錯(cuò)配對(duì)照探針結(jié)合。因此，錯(cuò)配的寡核苷酸探針指示孵育條件是否為最佳，即所用的嚴(yán)謹(jǐn)度是否確保乾核酸只與陣列中存在的精確互補(bǔ)探針結(jié)合。對(duì)每一模板來說，可以使用多種策略選擇一套精確互補(bǔ)于共有、轉(zhuǎn)基因和/或?qū)φ招蛄械膩喰蛄?或其疊片區(qū)域)的完美匹配探針。本領(lǐng)域:汰術(shù)人員知道每個(gè)模板可以提供大量的潛在探針。正如公知的那樣，表觀(apparent)探針有時(shí)不適于包括到陣列中。這可能因?yàn)樵诨蚪M其他區(qū)域存在相似的亞序列，導(dǎo)致針對(duì)這些亞序列的探針交叉雜交，給出假信號(hào)。某些表觀#^十可能不適于包括在陣列內(nèi)的另一個(gè)原因在于它們可能形成阻礙有效雜交的二級(jí)結(jié)構(gòu)。最后，靶核酸與(或?qū)?包含大量探針的陣列的雜交要求每個(gè)探針在相同孵育條件下與其特異性靶核酸序列雜交。寡核苷酸陣列可能包含針對(duì)共有、轉(zhuǎn)基因或?qū)φ招蛄械囊粋€(gè)完美匹配探針，或可能包含針對(duì)共有、轉(zhuǎn)基因或?qū)φ招蛄械奶结樇?即多于一個(gè)完美匹配探針)。例如，寡核苷酸陣列可能包含針對(duì)共有、轉(zhuǎn)基因或?qū)φ招蛄械膌、5、10、25、50、100或多于100個(gè)不同的完美匹配探針。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，陣列包含至少11-150個(gè)精確互補(bǔ)于每個(gè)共有和轉(zhuǎn)基因序列的亞序列的不同完美匹配寡核苷酸。在甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，只納入每個(gè)模板的最佳探針集合。可以使用多種計(jì)算機(jī)程序評(píng)價(jià)雜交用探針的適合度。為此目的的合適的程序包括^旦不限于LaserGene(DNAStar)、Oligo(國(guó)家生物科學(xué)公司，NationalBiosciences,Inc.)、MacVector(Kodak/IBI)和由GCG提供的標(biāo)準(zhǔn)程序。本領(lǐng)域已知的任何方法或軟件程序可用于制備本發(fā)明模板序列的探針。例如，通過使用由加州森尼韋爾市(Simnyvale，Calif.)TdeChem國(guó)際公司提供的軟件包ArrayDesigner可以生成寡核苷酸纟笨針。用于選擇最佳探針集合的另一例示性運(yùn)算法參見美國(guó)專利號(hào)6,040,138,其教導(dǎo)在此引入作為參考。最佳化探針集合的其他合適的手段將產(chǎn)生相當(dāng)?shù)墓押塑账彡嚵?，為本領(lǐng)域熟知，并且可以在例如Lockhart等(1996)Nat.Biotechnol.14:1675-80和Mei等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:11237-42中找到?？梢杂枚喾N方法合成本發(fā)明的寡核苷酸纟笨針。這些方法的例子包括但不限于使用自動(dòng)化或高通量DNA合成儀，例如由密理博公司(Millipore)、基因儀器公司(GeneMachines)和生物自動(dòng)化公司(BioAutomation)提供的那些。在許多實(shí)施方案中，合成的探針基本上不含雜質(zhì)。在其他許多實(shí)施方案中，探針基本上不含可能會(huì)妨礙期望探針功能的其他污染物。可以用許多方法純化或濃縮探針，例如反相層析、乙醇沉淀、凝膠過濾、電泳或其任意組合。在美國(guó)公開號(hào)20060010513中公開了更為詳細(xì)的制備適用于本發(fā)明的寡核苷酸陣列的信息和例示性陣列，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。如美國(guó)^Hf號(hào)20060010513中所述，適于本發(fā)明的CHO芯片^f效陣列包括122個(gè)陣列質(zhì)量控制序列(非CHO)、732個(gè)公開的倉鼠序列、2835個(gè)文庫來源的CHO序列和22個(gè)產(chǎn)物/過程特異性序列。其他合適的陣列描述于美國(guó)專利號(hào)6，040，138，其公開內(nèi)容引入作為參考。乾核^與萍W^^以承成染爻潘孵育反應(yīng)可以以絕對(duì)或差異雜交形式進(jìn)行。在絕對(duì)的雜交形式中，來自一個(gè)樣品的多核苷酸與寡核苷酸陣列中的探針雜交。在形成雜交復(fù)合物之后檢測(cè)到的信號(hào)與樣品中的多核苷酸水平相關(guān)。在差異雜交形式中，來自兩個(gè)樣品的多核苷酸用不同的標(biāo)記部分標(biāo)記。將這些差異標(biāo)記的多核苷酸的混合物加入到寡核苷酸陣列中。然后在兩個(gè)不同標(biāo)記的發(fā)射可獨(dú)立檢測(cè)的條件下檢查寡核苷酸陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用Cy3和Cy5(新澤西州皮斯卡^荅韋市安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)>^司(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，N.J.))作為差異雜交形式的標(biāo)記基團(tuán)。在本發(fā)明中，孵育條件應(yīng)是便于靶核酸只與具有高度互補(bǔ)性的寡核苷酸探針雜交。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這是通過使靶核酸庫和寡核苷酸陣列在保證雜交的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下孵育、然后以持續(xù)升高的嚴(yán)謹(jǐn)度進(jìn)行洗滌直至達(dá)到期望雜交特異性水平而實(shí)現(xiàn)。在其他實(shí)施方案中，靶核酸在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕蚴熘墓押塑账彡嚵须s交條件下與本發(fā)明的陣列孵育。在許多實(shí)例中，這些寡核苷酸陣列雜交條件包括45。C孵育16小時(shí)，然后在室溫洗滌至少三次，每次10分鐘。雜交緩沖液包含100mMMES、lM[Na+、20mMEDTA和0.01。/。Tween20。雜交緩沖液的pH范圍可以是6.5到6.7。洗滌緩沖液是6xSSPET，其包含0.9MNaCl、60mMNaH2P04、6mMEDTA和0.005%TritonX-IOO。在更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓押塑账彡嚵须s交條件下，洗滌緩沖液可以包含100mMMES、0.1M[Na+和0.01%Tween20。參見《基因芯片表達(dá)分析技術(shù)指南》(GENECHIPEXPRESSIONANALYSISTECHNICALMANUAL)(701021rev.3，昂飛公司(Affymetrix，Inc.)2002)，在此以其整體引入作為參考。^并差西《這浮為^f用來檢測(cè)靶核酸與寡核苷酸探針雜交鐠的方法在本領(lǐng)域廣為人知。特別是，檢測(cè)和記錄各獨(dú)立耙核酸-寡核苷酸探針雜合體熒光的手段已經(jīng)充分建立，并且在本領(lǐng)域廣為人知，描述于例如美國(guó)專利號(hào)5,631,734、美國(guó)公開號(hào)20060010513，在此以其整體引入作為參考。例如，可以通過計(jì)算才幾控制共聚焦顯微鏡來自動(dòng)檢測(cè)整個(gè)陣列的雜交語。此外，作為另一非限制性例子，顯微鏡可以配備光傳感器，連接于數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)，來自動(dòng)記錄各獨(dú)立雜合體產(chǎn)生的熒光信號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，雜交謙的評(píng)估依賴于陣列的組成，即納入了哪些寡核苷酸纟笨針進(jìn)行分析。例如，當(dāng)陣列只包括共有序列的寡核普酸探針、或只包括共有序列和轉(zhuǎn)基因序列的寡核苷酸探針時(shí)(即陣列不包括用于標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)、樣品、嚴(yán)謹(jǐn)度需求和靶核酸制品間差異的對(duì)照探針)，通過測(cè)量陣列上每個(gè)位置的絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度來評(píng)估雜交鐠?？蛇x地，陣列的平均值、截尾平均值(即去除2-5%具有最低和最高信號(hào)強(qiáng)度的探針集合之后的所有探針的平均信號(hào)強(qiáng)度)或中值信號(hào)強(qiáng)度可以對(duì)預(yù)設(shè)的目標(biāo)值按比例計(jì)算來生成比例因子，隨后可以應(yīng)用到陣列上每個(gè)探針集合來生成每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值(見例如昂飛公司(Affymetrix)(2000)ExpressionAnalysisTechnicalManual,A5-14頁)。反之，在陣列還包含對(duì)照寡核苷酸探針的情況下，通過對(duì)對(duì)照寡核苷酸探針?biāo)紦?jù)的每個(gè)位置的絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，來標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試寡核苷酸探針?biāo)紦?jù)的每個(gè)位置的絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度，來評(píng)估所產(chǎn)生的雜交鐠。一般的標(biāo)準(zhǔn)化策略為本領(lǐng)域所熟知，并且包括在例如美國(guó)專利號(hào)6,040,138與Hill等(2001)GenomeBiol,2(12):research0055.1-0055.13中。從寡核苷酸陣列收集到的信號(hào)可以用商購(gòu)軟件來分析，例如由昂飛公司(Affymetrix)或安捷倫科技有P艮公司(AgilentTechnologies)提供的那些。在雜交實(shí)驗(yàn)中可以包括(例如用于掃描靈敏度、揮:針標(biāo)記和cDNA或cRNA定量的)對(duì)照。陣列雜交信號(hào)在進(jìn)行進(jìn)一步分析前可以按比例計(jì)算或標(biāo)準(zhǔn)化。例如，考慮到在類似測(cè)試條件下使用一個(gè)以上陣列時(shí)雜交強(qiáng)度間有差異，可以對(duì)每個(gè)探針的雜交信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。與互補(bǔ)探針雜交的獨(dú)立靶核酸的信號(hào)也可以利用來自每個(gè)陣列上包含的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照的強(qiáng)度來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。此外，可以使用在不同樣品間具有相對(duì)一致表達(dá)水平的基因來標(biāo)準(zhǔn)化其他基因的表達(dá)水平。為了鑒定賦予或與期望表型或特性關(guān)聯(lián)的基因，對(duì)來自測(cè)試細(xì)胞系樣品的基因表達(dá)錯(cuò)和來自目的細(xì)胞培養(yǎng)表型與測(cè)試細(xì)胞系不同的的對(duì)照細(xì)胞系的對(duì)照"i普相比較，并鑒定差異表達(dá)的基因。例如，用于鑒定細(xì)胞生產(chǎn)力涉及的基因和相關(guān)通路的方法可以包括如下1)培養(yǎng)具有特定細(xì)胞生長(zhǎng)力的第一細(xì)胞系的笫一樣品，以及培養(yǎng)具有不同細(xì)胞生長(zhǎng)力的第二細(xì)胞系的第二樣品；2)分離、加工來自第一樣品的總RNA，并與第一寡核苷酸陣列雜交；3)分離、加工來自第二樣品的總RNA，并與第二寡核苷酸陣列雜交；和4)比較產(chǎn)生的雜交譜，以鑒定在第一和第二樣品間差異表達(dá)的序列?？梢允褂妙愃品椒▉龛b定其他表型涉及的基因。一般來講，每個(gè)細(xì)胞系至少通過三份生物重復(fù)樣品來展示。本領(lǐng)域已知的程序，例如GeneExpress2000(GeneLogic,Gaithersburg，Md,)可用于分析革巴序列的有無，并確定其在一群樣品(例如細(xì)胞系或條件或時(shí)間點(diǎn))中與另一群樣品相比較而言的相對(duì)表達(dá)水平。在所有重復(fù)樣品中存在的探針集合可考慮做進(jìn)一步分析。一般地，如果p值小于或等于0.05，倍數(shù)變化值為1.2倍、1.5倍或更大可認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。鑒定與一個(gè)或多個(gè)特定細(xì)胞表型(如細(xì)胞生長(zhǎng)速率、峰值細(xì)胞密度、持續(xù)高細(xì)胞活力、最大細(xì)胞生產(chǎn)力、持續(xù)高細(xì)胞生產(chǎn)力、氨生產(chǎn)或消耗、乳酸生產(chǎn)或消耗等)相關(guān)的差異表達(dá)基因可以導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)調(diào)控或指示細(xì)胞表型的(包括那些以前未發(fā)現(xiàn)的)基因和通路。對(duì)隨后鑒定的基因進(jìn)行測(cè)序，并針對(duì)不同的數(shù)據(jù)庫對(duì)所述序列進(jìn)行blast,來確定它們是否為已知基因或未知基因。如果基因已知，可以基于本領(lǐng)域已有的知識(shí)進(jìn)行通路分析。已知和未知基因均通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)一步確認(rèn)或證實(shí)。例如，可以操縱(如上調(diào)或下調(diào))所鑒定的基因來誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞的特定表型。闡明此過程的協(xié)調(diào)決策樹示于圖1。更詳細(xì)的鑒定和驗(yàn)證步驟進(jìn)一步描述于實(shí)施例，使用本發(fā)明方法鑒定的例示性差異表達(dá)基因示于表9-16。^7ff4^^4這謬》浙本發(fā)明還提供了通過蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)表達(dá)鐠可以通過允許分辨和檢測(cè)來自細(xì)胞系樣品的蛋白質(zhì)的任何方法來生成。通常優(yōu)選具有較高分辨力的方法，因?yàn)樵黾臃直媛士稍试S分析更多的獨(dú)立蛋白質(zhì)，增加鐠圖的說服力和有效性?？梢栽诘鞍踪|(zhì)分辨和檢測(cè)之前預(yù)處理樣品以去除樣品中的富余蛋白質(zhì)，例如免疫清除，因?yàn)楦挥嗟鞍踪|(zhì)的存在可能掩蓋其他蛋白質(zhì)表達(dá)上更細(xì)微的變化，尤其是低豐度蛋白質(zhì)。樣品還可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)操作來降低樣品復(fù)雜度。例如，可以用層析法來對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)；各級(jí)分將具有降低的復(fù)雜度，利于分析級(jí)分中的蛋白質(zhì)。用于同時(shí)分辨和檢測(cè)幾種蛋白質(zhì)的三種有用方法包括基于陣列的方法、基于質(zhì)譜的方法和基于二維凝膠電泳的方法。蛋白質(zhì)陣列通常包括大量數(shù)目的不同蛋白質(zhì)捕獲試劑，例如抗體或抗體可變區(qū)，分別固定在固相支持物的不同位置。此類陣列可獲自例如西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)，作為其PanoramaTM$列陣列的一部分。陣列與蛋白質(zhì)樣品接觸，而捕獲試劑選擇性地捕獲特異蛋白質(zhì)靼標(biāo)。通過檢測(cè)標(biāo)記來檢測(cè)捕獲的蛋白質(zhì)。例如，在接觸陣列前可以標(biāo)記蛋白質(zhì)；在陣列的特定位置上檢測(cè)到標(biāo)記指示著檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。如果陣列沒有飽和，檢測(cè)到的標(biāo)記量可以與樣品中的蛋白質(zhì)濃度或量相關(guān)。還可以像在夾心免疫測(cè)定形式中那樣，通過隨后接觸第二捕獲試劑(其本身可經(jīng)標(biāo)記或以其他方式檢測(cè))來檢測(cè)捕獲的蛋白質(zhì)?；谫|(zhì)譜的方法包括，例如，基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)、液相色鐠/質(zhì)鐠/質(zhì)譜(LC-MS/MS)和表面增強(qiáng)激光解吸/電離(SELDI)技術(shù)。例如，可以利用電噴射電離和MALDI生成蛋白質(zhì)鐠。例如，如美國(guó)專利號(hào)6,225,047所述，SELDI在質(zhì)謙芯片上引入滯留表面。蛋白質(zhì)樣品中的蛋白質(zhì)亞群滯留在表面上，P爭(zhēng)低了混合物的復(fù)雜度。后面的時(shí)間飛行質(zhì)譜生成滯留蛋白質(zhì)的"指紋"。在包括二維凝膠電泳的方法中，在SDS-PAGE期間，樣品中的蛋白質(zhì)一般通過等電點(diǎn)在第一維中分開，而在第二維中通過分子量分開。依靠?jī)删S的分辨，成百成千的蛋白質(zhì)可以同時(shí)進(jìn)行分辨和分析。通過應(yīng)用染色如銀染或通過蛋白質(zhì)上的標(biāo)記如Cy2、Cy3或Cy5染料來檢測(cè)蛋白質(zhì)。為鑒定蛋白，可以切掉凝膠上的斑點(diǎn)，并進(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化產(chǎn)物可以通過質(zhì)譜如MALDI分析。針對(duì)序列數(shù)據(jù)庫搜索產(chǎn)生的肽質(zhì)譜、肽質(zhì)量指紋或PMF。將PMF與通過搜索程序在硅片(insilico)上生成的所有理論胰蛋白酶肽段的質(zhì)量相比較?？梢允褂弥T如Prospector、Sequest和MasCot(MatrixScience,Ltd.,London,UK)等程序用于數(shù)據(jù)庫搜索。例如MasCot產(chǎn)生基于統(tǒng)計(jì)的Mowse分值，其指示任何配對(duì)是有顯著意義的還是無顯著意義的。質(zhì)鐠/質(zhì)譜可以用來增加得到數(shù)據(jù)庫配對(duì)的可能性?？梢允褂秒牡腃ID-MS/MS(碰撞誘導(dǎo)解離的串聯(lián)質(zhì)譜)來給出包含關(guān)于氨基酸序列信息的碎片離子的頻譜。向肽質(zhì)量指紋中加入此信息允許Moscot增大配對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在某些情況下還有可能通過只提交未加工的單個(gè)肽的MS/MS鐠來鑒定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)表達(dá)鐠比較方面的近期進(jìn)展包括使用兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的混合物，分別用不同的、光譜可分辨的、電荷與質(zhì)量匹配的染料如Cy3和cy5來標(biāo)記。此進(jìn)展稱為熒光二維差異凝膠電泳(DIGE),優(yōu)勢(shì)在于測(cè)試和對(duì)照蛋白質(zhì)樣品在同一凝膠上跑樣，利于匹配兩個(gè)樣品間的蛋白質(zhì)，避免了在不同凝膠上涉及的不同電泳條件的復(fù)雜性。凝膠成像獨(dú)立進(jìn)行，并且產(chǎn)生的圖像可以直接疊加，無需進(jìn)一步修飾。可以使用第三個(gè)光譜可分辨的染料如Cy2來標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品庫，作為實(shí)驗(yàn)中不同凝膠跑樣之間的內(nèi)部對(duì)照。因此，所有可檢測(cè)的蛋白質(zhì)可納入作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，有利于不同凝膠之間的比較。工程/A勿^系以攻迷勿^4型如上所述，本發(fā)明提供了在具有至少一個(gè)不同細(xì)胞表型的不同細(xì)胞系或細(xì)胞樣品中差異表達(dá)的基因的多核苷酸序列(或亞序列)或蛋白質(zhì)的多肽序列(或亞序列)。這些序列統(tǒng)稱為差異序列。差異序列可用作為靶標(biāo)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表型，特別是表現(xiàn)為增加的和有效的重組轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)、增加的細(xì)胞生長(zhǎng)速率、高峰值細(xì)胞密度、持續(xù)高細(xì)胞活力、高最大細(xì)胞生產(chǎn)力、持續(xù)高細(xì)胞生產(chǎn)力、低氨產(chǎn)量和低乳酸產(chǎn)量等特點(diǎn)的細(xì)胞表型。更特別的是，本發(fā)明提供了相關(guān)表格中述及的每個(gè)純化和/或分離的多核苷酸或多肽序列，其表明是用于調(diào)控CHO細(xì)胞表型的合適靶標(biāo)，即第一個(gè)CHO細(xì)胞系和第二個(gè)CHO細(xì)胞系相比差異表達(dá)之，在此命名為"差異CHO序列"。特別地，在此使用的差異CHO序列包括具有和/或基本上由從表格中述及的基因序列中選擇的序列組成的序列、其片段或互補(bǔ)物。在此使用的差異CHO序列還包括選自表中述及的蛋白質(zhì)序列的多肽序列或其片段。在此使用的差異CHO序列還包括編碼選自表中述及的蛋白質(zhì)序列的多肽序列的多核苷酸序列、其片段或互補(bǔ)物。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的差異CHO序列可以包括(如下面所討論的)新CHO序列、具有不參與或以前不參與轉(zhuǎn)基因表達(dá)功能的已知基因序列、以及以前無已知功能但可能現(xiàn)在知道作為調(diào)控CHO細(xì)胞表型的靶標(biāo)起作用的已知序列。26本發(fā)明考慮可以用于改變(即調(diào)控(如增強(qiáng)、減弱或修4牟))與細(xì)胞或生物體內(nèi)差異CHO序列對(duì)應(yīng)的基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的方法和組合物。本發(fā)明包含的細(xì)胞或生物體內(nèi)差異CHO序列的表達(dá)改變可以通過下調(diào)或上調(diào)相應(yīng)基因或蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。例如，差異CHO序列可以通過使用不同的抑制性多核苷酸如反義多核苷酸、結(jié)合和/或切割轉(zhuǎn)錄自本發(fā)明基因的mRNA的核酶、靶向基因調(diào)控區(qū)域的三鏈形成寡核苷酸及導(dǎo)致粑mRNA序列特異性降解的短干擾RNA而下調(diào)(例如Galderisi等(1999)^Cell.Physiol.181:251-57;Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1:575-88;Knauert和Glazer(2001)Hum.Mol.Genet.10:2243-51;Bass(2001)Nature411:428-29)。適合本發(fā)明的抑制性反義或核酶多核苷酸可以互補(bǔ)于本發(fā)明基因完整編碼鏈或只互補(bǔ)于其一部分?？蛇x地，抑制性多核苷酸可以互補(bǔ)于本發(fā)明基因編碼鏈的非編碼區(qū)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域廣為人知的方法用化學(xué)合成和/或酶法連接反應(yīng)來構(gòu)建本發(fā)明的抑制性多核苷酸。化學(xué)合成多核苷酸的核苷連接可經(jīng)〗務(wù)飾來增強(qiáng)其抗核酸酶介導(dǎo)的降解的能力，以及增強(qiáng)其序列特異性。此類連接修飾包括但不限于硫代磷酸酯、曱基膦酸酯、磷酰胺、硼代磷酸酯、嗎啉和肽核酸(PNA)連接(Galderisi等，同前；Heasman(2002)Dev.Biol.243:209-14;Mickelfield(2001)Curr.Med.Chem.8:1157-70)?？蛇x地，反義分子可以利用以反義(即相反)方向亞克隆了本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行生物學(xué)生產(chǎn)。而在另一實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的反義多核苷酸分子是a-異頭多核苷酸分子。a-異頭多核苷酸分子和互補(bǔ)RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中與通常的p-單位相反，鏈走向彼此平行。依照本領(lǐng)域已知的技術(shù)，反義多核苷酸分子還包括2，-o-甲基核糖核苷酸或嵌合RNA-DNA類似物。適于本發(fā)明的抑制性三鏈形成寡核苷酸(TFO)以高特異性和親和性結(jié)合在雙鏈體DNA的大溝內(nèi)(Knauert和Glazer，同前)。可以通過靼向互補(bǔ)于基因調(diào)控區(qū)(即啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子序列)的TFO形成防止基因轉(zhuǎn)錄的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)來抑制本發(fā)明的基因表達(dá)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，抑制性多核苷酸是短干擾RNA(siRNA)分子。這些siRNA分子是導(dǎo)致靶mRNA序列特異性降解的短(優(yōu)選19-25個(gè)核苷酸；最優(yōu)選19或21核苷酸)雙鏈RNA分子。此降解稱為RNA干擾(RNAi)(例如Bass(2001)Nature411:428-29)。最初在低等生物中發(fā)現(xiàn)的RNAi已經(jīng)被有效應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且最近已經(jīng)顯示以耙向FasmRNA的siRNA分子處理能預(yù)防小鼠的重型肝炎(Song等(2003)Nat.Med.9:347-51)。此外，最近有報(bào)道鞘內(nèi)遞送siRNA能夠阻斷兩種大鼠模型(激動(dòng)劑誘導(dǎo)的疼痛模型和神經(jīng)性疼痛模型)的疼痛反應(yīng)(Dom等(2004)NucleicAcidsRes.32(5):e49)?？梢酝ㄟ^一起退火兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子(其中之一與粑mRNA的一部分互補(bǔ))(Fire等，美國(guó)專利號(hào)6，506，559)、或通過使用單個(gè)發(fā)夾RNA分子自身折回生成必需的雙鏈部分(Yu等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:6047-52),來生成適用于本發(fā)明的siRNA分子。siRNA分子可以經(jīng)化學(xué)合成(Elbashir等，(2001)Nature411:494-98),或通過使用單鏈DNA模^反體外轉(zhuǎn)錄來生產(chǎn)(Yu等，同前)?？蛇x地，siRNA分子可以或瞬時(shí)(Yu等，同前；Sui等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:5515-20)或穩(wěn)定地(Paddison等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:1443-48)使用包含有義和反義siRNA序列的表達(dá)載體來生物法生產(chǎn)。最近，已顯示使用表達(dá)發(fā)夾RNA(其進(jìn)一步被加工成siRNA)的腺病毒載體以有效和序列特異性方式降低原代人類細(xì)胞中靶mRNA的水平(Arts等(2003)GenomeRes.13:2325-32)。可以基于本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)靶向本發(fā)明差異CHO序列的siRNA分子(例如Elbashir等(2001)EMBOJ.20:6877-88)。例如，靼mRNA的靶區(qū)段應(yīng)起始于AA(優(yōu)選)、TA、GA或CA;siRNA分子的GC比應(yīng)為45-55%;siRNA分子不應(yīng)包含連續(xù)的三個(gè)同樣的核苷酸；siRNA分子不應(yīng)包含七個(gè)連續(xù)的混合G/C;而且靶區(qū)段應(yīng)位于靶mRNA的ORF區(qū)域，并且應(yīng)在起始ATG之后的至少75bp、在終止密碼子之前至少75bp處。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用上述標(biāo)準(zhǔn)或其他已知標(biāo)準(zhǔn)能夠設(shè)計(jì)靶向本發(fā)明多核苷酸的siRNA分子。還可以通過插入外源多核苷酸序列破壞對(duì)應(yīng)于本發(fā)明差異CHO序列的內(nèi)源基因，來創(chuàng)建細(xì)胞或生物(即敲除細(xì)胞或生物)，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或生物體內(nèi)本發(fā)明基因或蛋白質(zhì)的下調(diào)?？善茐膬?nèi)源基因的編碼區(qū)，從而產(chǎn)生了非功能性蛋白質(zhì)?？蛇x地，可破壞內(nèi)源基因的上游調(diào)控區(qū)或替換為不同的調(diào)控元件，導(dǎo)致仍為功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)改變。用來生成敲除細(xì)胞的方法包括同源重組，并在本領(lǐng)域廣為人知(例如Wolfer等(2002)TrendsNeurosci.25:336-40)。還可以通過上調(diào)相應(yīng)于本發(fā)明CHO差異序列的基因或蛋白質(zhì)來改變CHO差異序列的表達(dá)或活性。上調(diào)包括提供編碼目的蛋白質(zhì)或基因或保留其活性的變體的外源核酸(如過表達(dá)構(gòu)建體)，或提供間接增強(qiáng)蛋白質(zhì)活性的因子或分子。變體通常和目的蛋白質(zhì)或基因享有共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并應(yīng)保留允許改進(jìn)細(xì)胞表型的活性。變體可以對(duì)應(yīng)于來自其他物種的同源物(如嚙齒動(dòng)物同源物；靈長(zhǎng)動(dòng)物同源物如人同源物；另一哺乳動(dòng)物同源物；或保留足以傳達(dá)期望細(xì)胞表型效應(yīng)的序列保守性的較為遠(yuǎn)源的同源物)。在某些情況下，變體可以保留與CHO序列或與已知同源物至少70%、至少80%、至少卯％、或至少95%的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，變體是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CHO核酸序列雜交或與已知同源物核酸序列雜交的核酸分子。例如，相應(yīng)于本發(fā)明差異CHO序列的分離的多核苷酸可以有效連接于一表達(dá)控制序列如pMT2和pED表達(dá)載體，用于重組生產(chǎn)本發(fā)明差異表達(dá)的基因或蛋白質(zhì)。表達(dá)重組蛋白質(zhì)的一般方法在本領(lǐng)域廣為人知。本發(fā)明差異表達(dá)基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性還可以通過可以直接或間接調(diào)節(jié)本發(fā)明基因或蛋白質(zhì)活性的外源物質(zhì)、小分子、藥物化合物或其他因子來改變。因此，可以利用這些物質(zhì)、小分子、藥物化合物或其他因子來調(diào)控CHO細(xì)胞的表型，例如重組轉(zhuǎn)基因增加的表達(dá)、增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速率、高峰值細(xì)胞密度、持續(xù)高細(xì)胞活力、高最大細(xì)胞生產(chǎn)力、持續(xù)高細(xì)胞生產(chǎn)力、低氨產(chǎn)量和低乳酸產(chǎn)量等。29上述改變基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的方法的任意組合均落在本發(fā)明范圍之內(nèi)。影響不同細(xì)胞表型的基因或蛋白質(zhì)的任意組合可以基于在此描述的方法進(jìn)行調(diào)整，并且落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。,奇差萄成f如上所述，本發(fā)明提供了差異序列，包括新發(fā)現(xiàn)的由CHO細(xì)胞表達(dá)的序列。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了新的、分離的和/或純化的至少是以前未發(fā)現(xiàn)基因的一部分的多核苷酸。新發(fā)現(xiàn)的由CHO細(xì)胞表達(dá)的基因的例示性新多核苷酸序列(或亞序列)示于表9、13和15。本發(fā)明還提供了分離的和/或純化的至少是以前未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的一部分的多肽。新發(fā)現(xiàn)的由CHO細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的例示性新多肽序列(或亞序列)示于表2和4。本發(fā)明還提供了編碼如表2和4中所示多肽序列的新多核苷酸。這樣，本發(fā)明提供了選自表9、13和15的各純化的和/或分離的多核苷酸序列，為從前未發(fā)現(xiàn)的基因(即未被測(cè)序和/或未顯示由CHO細(xì)胞表達(dá)的基因)或?yàn)槠湟徊糠?，?jīng)證實(shí)由CHO細(xì)胞表達(dá)?？蛇x地，本發(fā)明提供了選自表2和4的各純化的和/或分離的多肽序列，為從前未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)(即未被測(cè)序和/或未顯示由CHO細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì))或?yàn)槠湟徊糠郑?jīng)證實(shí)由CHO細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明還提供了分離的和/或純化的編碼來自表2和4的各多肽序列的多核苷酸序列。這些序列在此統(tǒng)稱為"新CHO序列"。本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸序列包括DNA序列，包括基因組和cDNA序列和化學(xué)合成DNA序列，RNA序列，或其他修飾的核酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的多肽序列包括氨基酸序列或修飾的氨基酸序列。本發(fā)明的一部分提供了上述各新CHO序列的抑制性多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸還包括這樣的多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與新CHO序列或其互補(bǔ)物雜交，和/或編碼基本上保留由本發(fā)明新CHO序列所編碼多肽的生物活性的多肽。本發(fā)明的多核苷酸還包括包含至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的新CHO序列的連續(xù)部分。本發(fā)明的多核苷酸還包括編碼由上述多核苷酸編碼的任何氨基酸序列的多核苷酸，或其連續(xù)部分，并且其與上述多核苷酸的不同只在于眾所周知的遺傳密碼簡(jiǎn)并性。本發(fā)明的分離多核苷酸可用作雜交探針(例如，作為如上所述的寡核苷酸陣列)和引物來鑒定和分離其序列與編碼所公開多核苷酸的序列相同或相似的核酸。用于鑒定和分離核酸的雜交方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Southern雜交和Northern雜交，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。雜交反應(yīng)可以在不同嚴(yán)謹(jǐn)度條件下進(jìn)行。雜交反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)度包括任何兩個(gè)核酸分子彼此雜交的難度。優(yōu)選各雜交多核苷酸與其相應(yīng)多核苷酸在降低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下雜交，更優(yōu)選嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，而最優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)度條件。在下表l中顯示了嚴(yán)謹(jǐn)度條件的實(shí)例例如，高嚴(yán)謹(jǐn)度條件是那些至少和條件A-F—樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模焕?，?yán)謹(jǐn)條件是至少和條件G-L—樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模欢档蛧?yán)謹(jǐn)度條件是例如至少和條件M-R—樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?。?.嚴(yán)謹(jǐn)度條件<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>、雜合體長(zhǎng)度是雜交多核苷酸的雜交區(qū)域的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)多核苷酸與未知序列的乾多核苷酸雜交時(shí)，假定雜合體長(zhǎng)度是雜交的多核香酸的長(zhǎng)度。當(dāng)已知序列的多核苷酸雜交時(shí)，雜合體長(zhǎng)度可以通過比對(duì)多核苷酸序列并鑒定區(qū)域或最佳序列互補(bǔ)性區(qū)域來確定。H:在雜交和洗滌緩沖液中，SSPE(lxSSPE是0.15MNaCl、10mMNaH2P04和1.25mMEDTA，pH7.4)可以替代SSC(1xSSC是0.15MNaCI和15mM檸檬酸鈉)。TB*-TR*:預(yù)期長(zhǎng)度小于50個(gè)堿基對(duì)的雜合體的雜交溫度應(yīng)比雜合體的溶解溫度(TJ低S-1(TC,其中Tm依照下列方程式確定。對(duì)于長(zhǎng)度小于18個(gè)堿基對(duì)的雜合體，Tm('C)=2(A+T堿基數(shù))+4(G+C堿基數(shù)).對(duì)于長(zhǎng)度為18到49個(gè)堿基對(duì)的雜合體，Tm('C)=81.5+16.6(log1()Na+])+0.41(%G+C)-(600/N),其中N是雜合體中的堿基數(shù)目，而[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的摩爾濃度(lxSSC的[Na+=0.165M)。通常和如上文所聲明的那樣，本發(fā)明分離的多核苷酸還可以用作雜交探針和引物來鑒定和分離與所公開的多核苷酸同源的DNA。這些同源物是分離自與那些所公開的多核苷酸不同物種的多核苷酸，或是在同一物種分離的，但和所公開的多核苷酸有明顯的序列相似性。優(yōu)選多核普酸同源物和所公開的多核苷酸有至少60%序列同一性(更優(yōu)選至少75%同一性；最優(yōu)選至少90%同一性)。優(yōu)選地，公開的多核苷酸同源物分離自哺乳動(dòng)物物種。本發(fā)明的分離多核苷酸還可以用作雜交探針和？j物來鑒定表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞和組織及它們表達(dá)的條件。本發(fā)明還考慮重組表達(dá)由新CHO序列編碼的蛋白質(zhì)或多肽。許多細(xì)胞類型可以擔(dān)任合適的宿主細(xì)胞，用于重組表達(dá)由本發(fā)明新CHO序列編碼的多肽。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括^f旦不限于，例如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、A431細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、L細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、U937細(xì)胞、HEK細(xì)胞、PerC6細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、正常二倍體細(xì)胞、來自原代組織體外培養(yǎng)和原代移植物的細(xì)胞系?？蛇x地，可以在低等真核生物例如酵母或在原核生物中重組生產(chǎn)由本發(fā)明的新CHO序列編碼的多肽。潛在的合適的酵母菌林包括釀酒酵母(5Wc/e"w附j(luò)^esccev/5iW)、粟酒裂殖酵母(jSc/t"Atfw附y(tǒng)ces"附6e)、克魯維酵母屬(isr/foww/^c^)菌林及假絲酵母屬(am^^)菌林。潛在的合適的細(xì)菌菌林包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(4^/附0^/&0;/^Z附wWm附)。如果多肽在酵母或細(xì)菌中制備，為了得到功能性，可能有必要通過例如合適位點(diǎn)的磷酸化或糖基化來修飾它們。此類共價(jià)連接可用眾所周知的化學(xué)或酶法來實(shí)現(xiàn)。還可以通過將分離的本發(fā)明的新CHO序列有效連接于一個(gè)或多個(gè)昆蟲表達(dá)載體(如桿狀病毒載體)中的適當(dāng)控制序列，并使用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來重組生產(chǎn)由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽。用于桿狀病毒/Sf9表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒形式商購(gòu)(例如MaxBac⑧試劑盒，加州卡爾斯班英^Z/^司(Invitrogen，Carlsbad，Calif.))。在合適宿主細(xì)胞中重組表達(dá)之后，接著可以用公知的純化方法如凝膠過濾和離子交換層析，從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽。純化還可以包括用已知結(jié)合本發(fā)明多核苷酸所編碼的多肽的試劑進(jìn)行親和層析。這些純化方法還可用于純化來自天然來源的多肽?？蛇x地，由本發(fā)明的新CHO序列編碼的多肽也可以重組表達(dá)為利于純化的形式。例如，多肽可以表達(dá)為與蛋白質(zhì)如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX)融合的形式。用于表達(dá)和純化此類融合蛋白的試劑盒可分別從麻州比佛利紐英倫生物技術(shù)有限公司(NewEnglandBioLabs,Beverly,Mass.)、新澤西州皮斯卡塔韋市發(fā)瑪西亞^^司(Pharmacia,Piscataway，N.J.)和力口州卡爾-Jf班英-脧/〉司(Invitrogen，Carlsbad,Calif.)商購(gòu)。由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽還可以用小表位標(biāo)記，而后用針對(duì)表位的特異性抗體鑒定或純化。優(yōu)選的表位是FLAG表位，從康涅狄格州紐黑文伊斯曼柯達(dá)公司(EastmanKodak,NewHaven，Conn.)商購(gòu)。由本發(fā)明的新CHO序列編碼的多肽還可以用已知傳統(tǒng)化學(xué)合成來生產(chǎn)。用于化學(xué)合成由本發(fā)明的新CHO序列編碼的多肽的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。此類化學(xué)合成多肽可以擁有與天然的、純化的多肽共同的生物學(xué)性質(zhì)，因此可以用作天然多肽的生物活性或免疫替代物。應(yīng)理解上述實(shí)施方案和下面的實(shí)施例以舉例說明方式給出，不是限制。根據(jù)本說明書，在本發(fā)明范圍內(nèi)的不同改變和變動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。實(shí)施例實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng)在兩種基本條件下以兩種基本方式在無血清懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)細(xì)胞。一種方式是小量、搖瓶培養(yǎng)，其中細(xì)胞在通氣組織培養(yǎng)瓶中，以小于100ml的體積，在C02孵箱中的有軌搖床上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。第二種方式是在臺(tái)式生物反應(yīng)器中，以2L或更少的工作體積，控制pH、營(yíng)養(yǎng)、溶氧和溫度。兩種基本培養(yǎng)條件是37。C的普通傳代條件，或補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件。在基本補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，細(xì)胞培養(yǎng)更長(zhǎng)一段時(shí)期，并且轉(zhuǎn)換到低一些的溫度以延長(zhǎng)細(xì)胞活力和擴(kuò)展培養(yǎng)物的生產(chǎn)期。實(shí)施例2.CHO細(xì)胞培養(yǎng)物分類基于如下有益于高產(chǎn)分批補(bǔ)料細(xì)胞培養(yǎng)過程的每一種表型的來分類CHO細(xì)胞系高細(xì)胞生長(zhǎng)速率、高峰值細(xì)胞密度、持續(xù)高細(xì)胞活力、高最大細(xì)胞生產(chǎn)力、持續(xù)高細(xì)胞生產(chǎn)力、低氨產(chǎn)量和低乳酸產(chǎn)量。生成細(xì)胞樣品矩陣，其中各表型類別由取自搖瓶和臺(tái)式細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)物的合適34CHO細(xì)胞樣品增殖，并且包括375個(gè)獨(dú)立樣品(包括生物學(xué)上一式三份或一式四份的重復(fù))和29個(gè)表達(dá)單克隆抗體、細(xì)胞因子、凝血因子及Fc:受體融合分子的不同rCHO細(xì)胞系。圖2描述了細(xì)胞樣品矩陣的例示性部分，其中縮寫詞Qp表示細(xì)胞生產(chǎn)力。圖3描述了測(cè)試細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系之間有關(guān)"高細(xì)胞生長(zhǎng)速率"表型的例示性表型比較。實(shí)施例3.差異表達(dá)蛋白質(zhì)檢測(cè)才法收集細(xì)胞并在7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、30mMTris、5mM醋酸4美pH8.5中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)裂解。使用pH4-7的18cm固定的pH梯度等點(diǎn)聚焦梯度膠條、以二維凝膠電泳分析150ng小份裂解物，來確定樣品質(zhì)量。膠條以每塊膠條340nl緩沖液再水化過夜。于膠條的陰極端上樣，進(jìn)行1小時(shí)500V、1小時(shí)1000V和4小時(shí)8000V電泳，儲(chǔ)存于-80"C,直至在12.5%丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行第二維電泳。以每塊凝膠1.5W進(jìn)行第二維電泳30分鐘，然后用Dalt6對(duì)6塊大型膠進(jìn)行總共100W5小時(shí)電泳。銀染觀察蛋白質(zhì)來證實(shí)裂解物中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。接著用熒光染料標(biāo)記小部分最初裂解物，以備熒光二維差異凝膠電泳(DIGE)，圖4顯示了其概覽。細(xì)胞培養(yǎng)物的每次比較用一式兩份凝膠進(jìn)行四次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)共8塊DIGE凝膠，每塊凝膠使用50jig各Cy2-、Cy3-和Cy5-標(biāo)記的細(xì)胞裂解物。匯集實(shí)驗(yàn)中使用的所有細(xì)胞裂解物，并用Cy2標(biāo)記用做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照細(xì)胞裂解物以Cy3標(biāo)記，而測(cè)試細(xì)胞裂解物以Cy5標(biāo)記。在冰上于黑暗中進(jìn)行標(biāo)記30分鐘，接著在水上于黑暗中使用10mM賴氨酸淬火反應(yīng)10分鐘。然后匯集Cy2-、Cy3-和Cy5-標(biāo)記的裂解物并在水上于黑暗中與2x樣品緩沖液混合15分鐘。將樣品施加到固定的pH梯度等點(diǎn)聚焦膠條。膠條過夜再水化大約20小時(shí)。于條帶的陰極端上樣，并進(jìn)行300V/3hr/G、600V/3hr/S&H、1000V/3hr/G、8000V/3hr/G、8000V/4hr/S&H和500V/12hr/S&H電泳。35在SDS-PAGE前1小時(shí)，對(duì)膠條進(jìn)行8000V電泳1小時(shí)。膠條在SDS緩沖液+1%DTT中平衡15分鐘，在SDS緩沖液+2.5。/。碘乙酰胺中平衡15分鐘。將膠條施加到聚丙烯酰胺凝膠上，并用瓊脂糖覆蓋。在Dalt12上用U塊大型膠在l(TC以1.5W/膠大約18小時(shí)進(jìn)行穿過凝膠的電泳。以可變模式成像儀在Typhoon9400掃描儀上掃描凝膠；切割并輸入到DeCyderTM軟件。使用生物方差分析(BVA)鑒定差異調(diào)控的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)與上樣了400jtg蛋白質(zhì)并以釕染色的預(yù)制膠相匹配。從預(yù)制膠上，用EttanSpotPicker挑選出通過DIGE鑒定為差異調(diào)控的蛋白質(zhì)。使用EttanDigestor以過夜胰蛋白酶孵育來消化個(gè)體蛋白質(zhì)。用質(zhì)謙分析得到的肽。使用MALDI來分析肽質(zhì)量指紋，尤其是膠上的高豐度樣品。對(duì)于豐度低些的樣品，使用MDLCLTQ機(jī)器進(jìn)行LC-MS/MS。來自二維凝膠斑點(diǎn)的胰蛋白酶消化樣品重懸于含0.1。/。TFA的20pLLC-MS級(jí)水中，并通過一維LC-MS使用以高通量配置與FinniganLTQTM(熱電公司，ThermoElectron)直接連接的EttanMDLC系統(tǒng)(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，GEHealthcare)來分析。濃縮樣品，在RPC捕獲柱(ZorbaxTM300SBC18,0.3mmx5mm，安捷倫科技有限公司(AgilentTechnologies))上脫鹽，并在RPC納米柱(Zorbax300SBC18，0.075mmxlOOmm，安捷倫科技有限公司(AgilentTechnologies))使用0-65%乙腈(Riedel-deHaSn公司LC-MS級(jí))的線性乙腈梯度進(jìn)行為時(shí)60分鐘的肽分離，直接經(jīng)由10納升電噴霧(nanoESI)發(fā)射器(PresearchFS360-20-10-CE-20)進(jìn)入LTQ。LTQ離子阱質(zhì)鐠儀用于MS/MS。使用300-2000的m/z范圍約0.15s的掃描時(shí)間(一幀樣吏掃描的最大離子注射時(shí)間10ms)，繼以MS/MS分析從每幀掃描得到的3個(gè)最大豐度峰，接著在下面60秒將其排除，然后繼以MS/MS分析下面的三個(gè)豐度峰，依次在60秒將其排除，依此類推。離子分裂采用35%的"碰撞能量，，設(shè)置，并使用動(dòng)態(tài)排除來區(qū)別開以前分析的離子(數(shù)據(jù)依賴性分析)。用于納升液相色鐠(nanoLC)分離的所有緩沖液包含0.1。/。蟻酸(Fluka公司)作為離子對(duì)試劑。以鐠圖方式記錄全程掃描質(zhì)譜，并以質(zhì)心模式記錄串聯(lián)質(zhì)譜。通過使用SEQUESTTM搜索SWISSPROT數(shù)據(jù)庫、用串聯(lián)質(zhì)譜中的信息來鑒定肽。作為統(tǒng)計(jì)截?cái)嘀邓褂玫腦corr值對(duì)帶單電荷的肽是>1.5,對(duì)帶雙電荷的肽是>2.0,而對(duì)帶三電荷的肽是>2.5。處義敘應(yīng)i,力辨^尹記將過表達(dá)PACE(弗林前原蛋白)、具有高最大細(xì)胞生產(chǎn)力的細(xì)胞系的四份培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)表達(dá)鐠與對(duì)照細(xì)胞系的四份培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)表達(dá)鐠相比較。所有8個(gè)凝膠實(shí)驗(yàn)(包括總共24張圖像)中大約有2000個(gè)蛋白質(zhì)匹配。為在DeCyder分析中視為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)必須已經(jīng)在所有24張圖像中被鑒定；已被證明至少1.5倍上調(diào)或下調(diào)；并且已被證明T檢驗(yàn)分值小于0.05。188種蛋白質(zhì)被鑒定為差異調(diào)控，多數(shù)具有高度顯著意義的T檢-驗(yàn)分值，包括幾種低豐度蛋白質(zhì)。圖5顯示了例示性凝膠上的Cy3和Cy5染色模式。圖中顯示了在Cy5標(biāo)記的測(cè)試細(xì)胞提取物中顯示5倍上調(diào)的蛋白質(zhì)，還給出了Cy5標(biāo)記的測(cè)試細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)相對(duì)豐度的圖示。圖6顯示了在Cy5標(biāo)記的測(cè)試細(xì)胞提取物中顯示4倍下調(diào)的蛋白質(zhì)，并且給出了類似于前圖5中的那些圖示。表2和3中列出了鑒定為在高最大細(xì)胞生產(chǎn)力細(xì)胞系中差異表達(dá)的幾個(gè)斑點(diǎn)。對(duì)表中列出的每個(gè)斑點(diǎn)，MALDI序列分析鑒定了一個(gè)或兩個(gè)相應(yīng)的氨基酸序列。對(duì)于每個(gè)斑點(diǎn)號(hào)，表中提供了測(cè)試和對(duì)照樣品間蛋白質(zhì)水平的倍數(shù)差異，標(biāo)記為"平均比率"；在測(cè)試樣品中水平降低的蛋白質(zhì)以負(fù)號(hào)顯示。表中還提供了表達(dá)差異可能是隨機(jī)發(fā)生結(jié)果的p值和相應(yīng)于任何所鑒定氨基酸序列的蛋白質(zhì)名稱及登錄號(hào)。在MALDI序列分析中，胰蛋白酶片段的分子量和已知序列的胰蛋白酶片段的預(yù)測(cè)分子量相比較。在某些情況下，在本申請(qǐng)中包括的此序列分析和其他肽序列分析中，檢測(cè)的分子量指示檢測(cè)到肽修飾形式，例如其中半胱氨酸以碘乙酰胺修飾，或其中甲硫氨酸被部分氧化。應(yīng)理解這不必然反映就細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中蛋白質(zhì)而言的肽的原始狀態(tài)。因此，在序列表中提供的肽序列反映了肽的未修飾形式，并且在某些實(shí)施方案中，欲工程化改造以具有期望細(xì)胞表型的細(xì)胞將被工程化改造來調(diào)控表達(dá)包含一個(gè)或多個(gè)所述肽的氨基酸序列的基因。在表中，"％覆蓋率"意指實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的相應(yīng)胰蛋白酶片段占數(shù)據(jù)庫序列總長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)。pl和MR表示蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的表觀等電點(diǎn)和表觀分子量。對(duì)于一些蛋白質(zhì)，表中還提供了推定的蛋白質(zhì)功能。表2:鑒定為非倉鼠蛋白質(zhì)的新同源物的高M(jìn)axQpProt蛋白質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>圖7-59提供了鑒定的蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)。對(duì)于來自DIGE的特定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，每張圖提供了在胰蛋白酶消化產(chǎn)物中檢測(cè)到的分子量語；相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配或匹配群，包括與預(yù)測(cè)胰蛋白酶肽萃殳相匹配的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫錄入肽的個(gè)數(shù)、登錄號(hào)、名稱和來自數(shù)據(jù)庫錄入的蛋白質(zhì)的物種、覆蓋率百分?jǐn)?shù)、等電點(diǎn)和質(zhì)量；對(duì)于與預(yù)測(cè)肽的預(yù)測(cè)質(zhì)量相匹配的每個(gè)分子量而言，提供了測(cè)量的質(zhì)量、預(yù)期的(比較的)質(zhì)量、兩者間的差異和相應(yīng)的肽序列；以及來自數(shù)據(jù)庫錄入的蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)序列。^敘應(yīng)衛(wèi)長(zhǎng)遽,W標(biāo)記具有高細(xì)胞生長(zhǎng)速率的PADUKX378的蛋白質(zhì)表達(dá)譜與PADUKX153.8的蛋白質(zhì)表達(dá)鐠相比較。表4和5列出了在高最大細(xì)胞生產(chǎn)力細(xì)胞系中鑒定為差異表達(dá)的幾個(gè)斑點(diǎn)。對(duì)于表中列出的每個(gè)斑點(diǎn)，MALDI序列分析鑒定了和相應(yīng)來自中國(guó)倉鼠或來自其他物種的氨基酸序列的匹配。對(duì)于每個(gè)斑點(diǎn)號(hào)，表中提供了測(cè)試和對(duì)照樣品間蛋白質(zhì)水平的倍數(shù)差異(標(biāo)作"平均比率，，)；在測(cè)試樣品中水平降低的那些蛋白質(zhì)以負(fù)號(hào)表示。表中還提供了p值(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義)、及蛋白質(zhì)名稱、登錄號(hào)、和對(duì)應(yīng)于任何鑒定的氨基酸序列的物種。43表4:鑒定為非倉鼠蛋白質(zhì)新同源物的高細(xì)胞生長(zhǎng)率蛋白質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>圖60-112提供了鑒定的蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)。對(duì)于得自DIGE的特定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，每張圖提供了在胰蛋白酶消化產(chǎn)物中檢測(cè)到的分子量譜；相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配或匹配群，包括與預(yù)測(cè)胰蛋白酶肽段相匹配的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫錄入肽的個(gè)數(shù)、登錄號(hào)、名稱和來自數(shù)據(jù)庫錄入的蛋白質(zhì)的物種、覆蓋率百分?jǐn)?shù)、等電點(diǎn)和質(zhì)量；對(duì)于與預(yù)測(cè)肽的預(yù)測(cè)質(zhì)量相匹配的每個(gè)分子量而言，提供了測(cè)量的質(zhì)量、預(yù)期的(比較的)質(zhì)量、兩者間的差異和相應(yīng)的肽序列；以及來自數(shù)據(jù)庫錄入的蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)序列。實(shí)施例4.在具有持續(xù)高細(xì)胞活力或高峰值細(xì)胞密度的細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)表7列出了利用如實(shí)施例3所述的方法鑒定為在具有持續(xù)高細(xì)胞活力的細(xì)胞中差異表達(dá)的幾個(gè)斑點(diǎn)。圖113到127提供了鑒定的蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)。表8列出了用類似方法在具有高峰值細(xì)胞密度的細(xì)胞中鑒定為差異表達(dá)的幾個(gè)斑點(diǎn)；圖128到138顯示了相應(yīng)的序列數(shù)據(jù)。對(duì)于每個(gè)斑點(diǎn)號(hào)，表中提供了測(cè)試和對(duì)照樣品間蛋白水平的倍數(shù)差異(標(biāo)作"平均比率")；在測(cè)試樣品中水平降低的蛋白質(zhì)以負(fù)號(hào)注明。表中還提供了表達(dá)差異可能是隨機(jī)發(fā)生結(jié)果的p值和對(duì)應(yīng)于任何所鑒定氨基酸序列的蛋白質(zhì)名稱及登錄號(hào)。通過質(zhì)譜分析了得到的肽。使用MALDI(特別是對(duì)凝膠上高豐度樣品)來分析肽質(zhì)量指紋。對(duì)較低豐度樣品，使用利用MDLCLTQ儀器的LC-MS/MS。在MALDI序列分析中，胰蛋白酶片段的分子量和已知序列的胰蛋白酶片段的預(yù)測(cè)分子量相比較。在表中，"％覆蓋率"意指其在實(shí)驗(yàn)中被檢測(cè)到的相應(yīng)胰蛋白酶片段占數(shù)據(jù)庫序列全長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)。pl和Mr表示蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的表觀等電點(diǎn)和表觀分子量。表7.在具有持續(xù)細(xì)胞活力的細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表8.HCD3蛋白列表所有測(cè)試樣品相對(duì)于所有對(duì)照樣品(3、5、7天)，(過濾-1.2倍上/下調(diào)，t-檢驗(yàn)〈0.01,雙向AnovaO.Ol,Decyder統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實(shí)施例5.mRNA表達(dá)鐠分析獲得來自測(cè)試和對(duì)照CHO細(xì)胞系的RNA樣品，并在含有如美國(guó)專利申請(qǐng)公開US2006/0010513中所述的CHOmRNA序列(其完整內(nèi)容在此引入作為參考)的探針的微芯片進(jìn)行上分析。使用標(biāo)記的已知濃度的對(duì)照序列的片段化cRNA，雜交混合物用片段化cRNA標(biāo)準(zhǔn)分析來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，使得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并能評(píng)價(jià)芯片的靈敏度和飽和度。使用p-肌動(dòng)蛋白和GAPDH的3V5，比、信號(hào)強(qiáng)度和一致性及呈現(xiàn)的百分?jǐn)?shù)對(duì)掃描的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。通常，用軟件工具Affy5.0和Genesis2.0、或dChiP(見Li等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:31-36和Li等(2001)GenomeBiol.2:0032.1-0032.11)和Genespring來進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。在進(jìn)一步考察基因之前，需要P值小于或等于0.05并且測(cè)試和對(duì)照系間的最小倍數(shù)變化為1.2。圖139和140描述了無監(jiān)督的Pearson聚類分析。在圖141中描述了數(shù)據(jù)分析的例示性方法。比較了對(duì)于高細(xì)胞生長(zhǎng)速率而言的成對(duì)測(cè)試和對(duì)照細(xì)胞系，并且鑒定了符合1.2倍變化需求的mRNA表達(dá)^t式。其中65個(gè)基因鑒定為在四個(gè)不同成對(duì)測(cè)試和對(duì)照細(xì)胞系的每對(duì)中均為差異表達(dá)。65個(gè)中的29個(gè)是在測(cè)試細(xì)胞系中或持續(xù)上調(diào)或持續(xù)下調(diào)；優(yōu)先對(duì)這些進(jìn)行進(jìn)一步分析。圖142描述了不依賴于成對(duì)差異的數(shù)據(jù)分析的例示性方法。鑒定了590個(gè)基因，其在高細(xì)胞生長(zhǎng)率的測(cè)試CHO細(xì)胞系群中平均表達(dá)水平比對(duì)照CHO細(xì)胞系群的平均表達(dá)高至少1.2倍。當(dāng)需要表達(dá)有1.5倍差異、并且附加地使用更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，78個(gè)基因通過了標(biāo)準(zhǔn)；更優(yōu)先對(duì)這些進(jìn)行進(jìn)一步分析。實(shí)施例6.在具有高最大細(xì)胞生產(chǎn)力的細(xì)胞中差異表達(dá)的基因表9和10中提供了鑒定為具有高最大細(xì)胞生產(chǎn)力的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸概要。對(duì)于每個(gè)核酸，提供了合格者名錄、符號(hào)和名錄，還有在具有高最大細(xì)胞生產(chǎn)力的細(xì)胞中核酸是上調(diào)還是下調(diào)。對(duì)于在Unigene數(shù)據(jù)庫中具有人或小鼠同源物的核酸，表中提供了UnigeneID號(hào)和比較相關(guān)的統(tǒng)計(jì)，包括e值、CHO序列和Unigene數(shù)據(jù)庫錄入間的序列同一性百分?jǐn)?shù)、及覆蓋率百分?jǐn)?shù)("％QC，，)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或高爾基復(fù)合體相關(guān)蛋白質(zhì)的編碼核酸可能對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)力特別是分泌蛋白質(zhì)的生產(chǎn)有作用。表11總結(jié)了在過表達(dá)PACE細(xì)胞中差異表達(dá)至少為1.2倍并編碼ER相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸。表12總結(jié)了在過表達(dá)PACE細(xì)胞中差異表達(dá)為1.2倍并編碼高爾基體相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>人Unigene小鼠Unigene倍數(shù)變變化方向合格者名錄符號(hào)名稱IDe值%ID0/oQCIDe值%ID%QC化WAN008D眼at環(huán)氣化物水解酶1，微粒體的(Ephxl)(SEQIDNO:1^03)EPHX1Hs.896499E-8587.98760.392Mm.90751E-II391.22362.5491.319上調(diào)WA翻8盯7at細(xì)胞色素P450,家族51，亞家族多(SEQIDNO:T504)肽I(CYP51AI)Hs.41707786.87998.051Mm.460441E-15288.51598.4411.297上調(diào)WAN008ELHat(SEQIDNO:1505)RPN1核糖體結(jié)合蛋白IHs.518244090—51999.643Mm.188544092.335100.0001.295上調(diào)WAN0088K7xat熱休克70kDa蛋白5(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋(SEQIDNO:r5一HSPA5白，78kDa)00.000O扁Min.3301600.000009跳OOO6.9233—401上調(diào)LOO176at(SEQIlJNO:1500)HMGCR3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶Hs.118997E-5487.98157.939Mm.3166523E-8294.47255.4322.551上調(diào)L00H8at(SEQn5"NO:1507)腹GCR3_羥基_3_甲基戊二酰輔酶A還原酶Hs.U8993E-4790.06242.819Mm.3166521E-5793.03842.0212.033上調(diào)LOO169at(SEQnJNO:i508)HMGCR3-羥基-3-曱基戊二酰輔酶A還原酶Hs.I18992E-1989.53533.992Mm.3166527E-2794.87230.8302.020上調(diào)LOO180at(SEQn5"NO:1509)HMGCR3_羥基_3_甲基戊二酰輔酶A還原酶Hs.U柳5E-3586.31068.016Mm.3166521E-49卯.24466.397l細(xì)上調(diào)L00181at(SEQh5"nO:1510)畫GCR3—羥基_3_曱基戊二酰輔酶A還原酶Hs.118991e-3789.78132.697Mm.3166523e-5293.61733.6521.976上調(diào)L00171at(SEQn5"NO:1511)HMGCR3_幾基_3_甲基戊二酰輔酶A還原酶Hs.U8995E-3691.52533，Mm.3166525E-4193.22033細(xì)1-934上調(diào)L00170xat(SEQ115"l70:1512)HMGCR3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶Hs.脂97E-27訓(xùn)9170.968Mm.3166526E-5494.81587—0971.718上調(diào)LOO173at(SEQIJ5"N0:1513)HMGCR3-羥基—3—甲基戊二酰輔酶A還原酶Hs.ll柳2E-3385.88230.466Mm.3166528E-7889.91944.444L621上調(diào)LOO182at(SEQn3"NO:m4)畫GCR3一雍基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶Hs.118993E-6594.01248.688Mm.3166522E-6594.47947.5221.546上調(diào)AF380341at(SEQIDN"5:1515)CANX鈣聯(lián)結(jié)蛋白Hs.5679681E-10193.35967.016Mm.2488271E-11495.00068.0633.165上調(diào)WAN013I86xat(SEQ〖DNO:l細(xì)CANX鈣聯(lián)結(jié)蛋白Hs.567968IE-Ill86.05397J87Mm.2488271E-16992.072100.0001.508上調(diào)WAN008ES3at(SEQIDNO:T5")CANX鈣聯(lián)結(jié)蛋白Hs.56796S5E-1888—42122.565Mm.2488271E-11492.56286.2231.376上調(diào)WA畫犯HWat(SEQ〖DNO:1^8)OPRS1阿片樣受體，olHs.5220871E-14187.77695.777Mm.290251E-16389.34997.313上調(diào)XI5652at(SEQIDNO:1519)NSFN-乙基馬來酰亞胺敏感因子Hs.431279089.89999.331Mm.260117094.649i[00.0001.346上調(diào)WA翻88XHat高半胱氨酸誘導(dǎo)的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力誘導(dǎo)的，(SEQIDNO:1520)HERPUD1泛素樣結(jié)構(gòu)域成員1Hs-1463937E-7987.41768.481Mm，51IE-I5091.46392.9711.247上調(diào)200780022890.4轉(zhuǎn)溢也被56/126到<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>實(shí)施例7.在具有高細(xì)胞生長(zhǎng)率的細(xì)胞中差異表達(dá)的基因表13和14提供了鑒定為在具有高細(xì)胞生長(zhǎng)率的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸的總結(jié)。對(duì)每個(gè)核酸，提供了合格者名錄、符號(hào)和名稱，還有在具有高最大細(xì)胞生產(chǎn)力的細(xì)胞中核酸是上調(diào)還是下調(diào)。對(duì)于在Unigene數(shù)據(jù)庫中有人或小鼠同源物的核酸，表中提供了UnigeneID號(hào)和比較相關(guān)的統(tǒng)計(jì)，包括e值、CHO序列和Unigene數(shù)據(jù)庫錄入間的序列同一性百分?jǐn)?shù)、及覆蓋率百分?jǐn)?shù)("％QC")。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>實(shí)施例8,在具有高峰值細(xì)胞密度的細(xì)胞中差異表達(dá)的基因表15、16和17中提供了鑒定為在具有高峰值細(xì)胞密度的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸的總結(jié)。對(duì)每個(gè)核酸，提供了合格者名錄、符號(hào)和名稱，還有在具有較高最大細(xì)胞生產(chǎn)力的細(xì)胞中核酸是上調(diào)還是下調(diào)。對(duì)于在Unigene數(shù)據(jù)庫中有人或小鼠同源性的核酸，表提供了UnigeneID號(hào)和比4交相關(guān)的統(tǒng)計(jì)，包括e值、CHO序列和Unigene數(shù)據(jù)庫錄入間的序列同一性百分?jǐn)?shù)、及覆蓋率百分?jǐn)?shù)("％QC")。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>小鼠Unigeie變化方向(測(cè)合格者名錄符號(hào)名稱人UnigeneIDe值%ID%QCIDe值%ID%QC試相對(duì)于對(duì)照)WA畫3I2Kat5爭(zhēng)膜蛋白帶EGF樣和二卵泡抑(SEQ〖DNO:1650)TMEFF1素樣結(jié)枸域1Hs.336224犯-9391.0781100MnU309827E-8689.963100下調(diào)WA麗3I2Lat溶解栽體家族7(陽離子氨基(SEQIDNO:1651)SLC7A5酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，y+系統(tǒng))，成員5Hs.5137979.00E-071002.2523Mm.27943I.00E-07923.7538上調(diào)WA麗3I2Tat色原體同源物5(HP1a聚合酶，(SEQIDNO:1652)CBX5果蠅)Hs.3492831E-14291.863572.023Mm.2620591E-16894.75172.023上調(diào)WAN013I3Pat(SEQIDN071653)C細(xì)LG《丐調(diào)節(jié)配體Hs.529846IE-14786.702199.296麵A1E-17288.61298.944上調(diào)WAN013I61at(SEQIDNO:1654)Nppb利尿鈉肽前體B類Hs.219140Mm.27405E-3088.28123.146下調(diào)WA麗3I6Cat溶解載體家族16(單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)(SEQIDNO:1655)SLC16A1蛋白)，成員1Hs.752312E-2684.47212.697Mm駕61E-11087.2430.284上調(diào)WAN013I6Exat(SE(J〖DNO:1656)GSTP1谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶氨基甲酰磷酸合成酶2，天門Hs.5238361E-12981.990585.889#N/A087.57788.467下調(diào)WAN013I6Jsat冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，及二氫乳(SEQIDNO:lS57)CAD清酸酶Hs.37701009U55299.461Mm.305535093.50299.461上調(diào)WAN013I6PxatATP結(jié)合盒，亞家族B(SEQIDNO:1^58)ABCB1(MDR/TAP)，成員1Hs.4,33087.710428.592Mm.146649089.77133.646下調(diào)W扁13I8B一at醛酮還原酶家;j美1，成員A4(SEQIDNO:1659)Akrla4(乙醛還原酶)Hs.474584091.537199.314Mm.30085091.7199.314下調(diào)WA薩3I8Vat(SEQIDNO:1660)核仁素Hs.79110IE-HI卯.058567.059Mm.1543781E-13793.27567.059上調(diào)WAN013I8Xat熱休克60kDa蛋白1(伴侶蛋(SEQIDNO:,)HSPD1白)Hs.1136840卯.30899.775Mm.1777093.38899.775上調(diào)WAN013I9Fat(SEQIDNO:1662)HSPA9B熱休克蛋白9AHs.1842333E-2992.23318.693Mm.2094192E-7244.828上調(diào)WAN01319Gat溶解載體家族3(二堿性和中(SEQIDNO:1663)SLC3A2性氨基酸運(yùn)輸激活子)，成員2Hs.5027691E-10584.854438細(xì)Mm.4114088.59658.98上調(diào)WAN013I9Zat(SEQIDNO:1664)GNAS鳥噪呤核苷結(jié)合蛋白，a刺激Hs.125898Mm.125770094.40341.104下調(diào)<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>1.5倍上調(diào)<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>實(shí)施例9.具有持續(xù)高細(xì)胞活力的細(xì)胞中差異表達(dá)的基因Bcl-xL是細(xì)胞死亡的強(qiáng)大抑制因子。過表達(dá)Bcl-xL的細(xì)胞顯示了持續(xù)高細(xì)胞活力。表18和19總結(jié)了在過表達(dá)Bcl-xL的細(xì)胞中差異表達(dá)為至少1.2倍的核酸。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣樣品進(jìn)行比較。表18總結(jié)了在第5天差異表達(dá)至少1.2倍的核酸。表19總結(jié)了在笫5天之后的階段差異表達(dá)至少1.2倍的核酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>實(shí)施例10.平臺(tái)分析根據(jù)平臺(tái)方法分類分析了當(dāng)培養(yǎng)于分批補(bǔ)料培養(yǎng)物時(shí)具有期望代謝表型的四種細(xì)胞系。就是說，在分批補(bǔ)料培養(yǎng)晚期細(xì)胞系維持高活力并消耗乳酸和氨。對(duì)于在分批補(bǔ)料培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的每種細(xì)胞系收集多個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品。用ANOVA分析研究各細(xì)胞系各時(shí)間點(diǎn)的樣品來監(jiān)測(cè)在培養(yǎng)期間的基因表達(dá)的變化。比較來自各細(xì)胞系的基因列表，并鑒定出那些在所有4種細(xì)胞系中共有的基因。表20列出了例示性的核酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>實(shí)施例11.乾標(biāo)-驗(yàn)證s說A^t通過使用本領(lǐng)域已知的方法過表達(dá)抑制相關(guān)基因表達(dá)的核酸驗(yàn)證了差異表達(dá)的基因及蛋白質(zhì)影響細(xì)胞表型的能力。下面描述了基于干擾RNA構(gòu)建體的例示性方法。通常，測(cè)序作為siRNA介導(dǎo)的基因敲低候選物的靶標(biāo)并證實(shí)序列。優(yōu)選(盡管不必要)利用全長(zhǎng)cDNA序列信息以便于siRNA設(shè)計(jì)。作為基因敲低候選物的靶序列與公共或?qū)＠麛?shù)據(jù)庫可得的基因序列相比較(例如BLAST搜索)。在靶基因內(nèi)與其他已知序列重疊(例如同源的16-17個(gè)連續(xù)堿基對(duì))的序列一般不適于做特異性siRNA介導(dǎo)的基因敲低的靶標(biāo)。例如，可以使用在安全網(wǎng)絡(luò)連接上的在線設(shè)計(jì)工具例如在Ambion網(wǎng)站師D:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfmder.html)上可用的工具來設(shè)計(jì)siRNA?？蛇x地，還可以自Ambion(其應(yīng)用Cenix算法來設(shè)計(jì)有效的siRNA)索取定制的siRNA。標(biāo)準(zhǔn)的siRNA通常是5nmol、退火并在板中具有標(biāo)準(zhǔn)純度的形式。當(dāng)收到合成的siRNA時(shí)，依照制造商提供的指導(dǎo)來制備siRNA并儲(chǔ)存在適宜的溫度(-20。C)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。通常待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天預(yù)傳代來保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。通常，使用siRNA分批補(bǔ)料測(cè)定。轉(zhuǎn)染的例示性材料、條件和方法如下轉(zhuǎn)染(第0天)每個(gè)離心管(50ml)100fiLRl2uLTransit-TKO轉(zhuǎn)染試劑(Minis)10jiL10fiMsiRNA2mLle5細(xì)胞/mL，于AS1培養(yǎng)基中97轉(zhuǎn)染之后37C:72hrs31。C:96hrs加入AQ3，在笫3天(D3)在第1天(Dl)、第3天(D3)、第7天(D7)取樣W^老浮脊襲對(duì)于各實(shí)驗(yàn)，使用1mL總體積的100,000個(gè)細(xì)胞(如3C7細(xì)胞)和50nMsiRNA。為制備用于3份反應(yīng)的混合物，混合150jiLRl和70jiLMinisTKO試劑并在室溫醉育10分鐘。加入15fiL10siRNA并在室溫孵育混合物10分鐘。向3個(gè)孔中分別轉(zhuǎn)入57.3jiL混合物。加入942.7fiLR5CD1(含100,000個(gè)細(xì)胞)板在37。C搖床上孵育72小時(shí)。庠心f^/7A^脊染對(duì)于各實(shí)驗(yàn)，使用imL總體積的100,000個(gè)細(xì)胞(如3C7細(xì)胞)。對(duì)每份轉(zhuǎn)染，混合100nLRl和2nLMirusTKO試劑，并在室溫孵育10分鐘。加入10pL10jiMsiRNA并在室溫孵育混合物15分鐘，偶爾混合。向各離心管中轉(zhuǎn)入1.9mL培養(yǎng)物。向各離心管內(nèi)加入siRNA混合物(112HL)。先在37。C孵育培養(yǎng)物，在第3天改變溫度到31°C?？焖僬袷?約250RPM)離心管培養(yǎng)物。在第l、3和7天取樣。在第7天終止培養(yǎng)。每一塊板上都包括生長(zhǎng)和生產(chǎn)力對(duì)照。例示性的生產(chǎn)力對(duì)照是DHFR(雙順反子mRNA選擇性標(biāo)記)。以DHFRsiRNA處理可重復(fù)地降低了CM-FcIGEN(抗體生產(chǎn)對(duì)照)中的抗體量。例示性的生長(zhǎng)對(duì)照是CHOI(驅(qū)動(dòng)蛋白)(見Matuliene等(2002)Mol.Cell.Biol.13:1832-45)(通過，以CHOI處理觀察到大約20-30%的生長(zhǎng)抑制)。還納入了其他標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，例如無siRNA處理(只有轉(zhuǎn)染試劑)和非尋靶siRNA處理(非特異性siRNA)。然后對(duì)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(例如，在96孔細(xì)胞計(jì)數(shù)器中)以評(píng)估生長(zhǎng)，和例如在自動(dòng)化96孔滴度測(cè)定中來評(píng)估生產(chǎn)力。由此驗(yàn)證了經(jīng)單獨(dú)98或組合調(diào)節(jié)足以改變有益細(xì)胞表型的基因，并且能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系單獨(dú)或組合地設(shè)計(jì)此類變化，以改變其特性。表21顯示了用于驗(yàn)證目的的模式細(xì)胞系及它們的特征。圖143-146總結(jié)了以離心管形式評(píng)價(jià)的3C7細(xì)胞系中的一些靶基因。評(píng)價(jià)的靶基因包括DM9(WAN013I8K)，如上文所述鑒定為在具有升高的生長(zhǎng)率的細(xì)胞中上升；EIF4B，如上文所述鑒定為在具有升高的生長(zhǎng)率的細(xì)胞中上升；HSP27(HSPB1)，如上文所述鑒定為在具有升高生長(zhǎng)率的細(xì)胞中上升；MCP1(CCL2)，如上文所述鑒定為在具有高細(xì)胞密度的細(xì)胞中降低；NAAT1(SLC1A4)，如上文所述鑒定為具有升高的生長(zhǎng)率的細(xì)胞中降低；MMD1(芊果酸脫氫酶)，如上文所述鑒定為在具有高最大細(xì)胞生產(chǎn)力的細(xì)胞中降低；MATF-4(ATF-4)，如上文所述鑒定為在具有高細(xì)胞密度的細(xì)胞中上升；及SCoA連接酶(suclg2),如上文所述鑒定為在具有高細(xì)胞密度的細(xì)胞中上升。如圖143所示，對(duì)于鑒定為在具有升高生長(zhǎng)率細(xì)胞中上升的基因，抑制所述基因?qū)е铝讼鄬?duì)于對(duì)照的生長(zhǎng)抑制。如圖144所示，細(xì)胞生產(chǎn)力一般不會(huì)受到對(duì)等的影響。表21.細(xì)胞系和其特征<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>通過使用本領(lǐng)域已知的方法過表達(dá)編碼相關(guān)基因表達(dá)的核酸確證了差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)影響細(xì)胞表型的能力。下面描述了例示性的方法。例如，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將過表達(dá)特定靶標(biāo)的核酸引入到CHO細(xì)胞中，接著監(jiān)測(cè)過表達(dá)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)力的影響。圖147和148說明了24孔方式的例示性方案。一般使用生長(zhǎng)和生產(chǎn)力對(duì)照進(jìn)行過表達(dá)測(cè)定。例如，在此實(shí)驗(yàn)中所使用的的陽性生長(zhǎng)/活力對(duì)照包括Ha-Ras和Bcl-xL。使用的陰性生長(zhǎng)對(duì)照包括p27。其他適合的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力對(duì)照為本領(lǐng)域公知，且能用于過表達(dá)測(cè)定。還納入了額外的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照如無核酸對(duì)照(只有轉(zhuǎn)染試劑)。如表22所示，克隆耙基因和對(duì)照基因到pExpressl載體內(nèi)并引入不同的模式細(xì)胞系中。表22.用于分析的細(xì)胞系及其特征克隆特征1.18中間水平5C10中間水平DE-6中間水平DD畫ll中間水平1.14HCGR，持續(xù)高活力、非持續(xù)高Qp、非低NH4、非高細(xì)胞密度2.8高最大Qp、持續(xù)高Qp3B12高最大Qp、持續(xù)高Qp、高細(xì)胞密度、低乳酸DA-4非HCGR、非高細(xì)胞密度5B5非持續(xù)高Qp、非低乳酸2B6非高細(xì)胞密度、非高最大Qp使用24孔方式以區(qū)分不同基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)不同細(xì)胞系的表型效應(yīng)。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)力進(jìn)行了測(cè)定。圖149-151圖解了例示性結(jié)果。發(fā)現(xiàn)結(jié)果通常具有代表性并可重復(fù)。在表23中總結(jié)了例示性的過表達(dá)結(jié)果。表23.過表達(dá)分析的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>NA=未測(cè)或結(jié)果待定(***)強(qiáng)烈地增加或減少(**)增加或減少_(*)適度增加或減少實(shí)施例13.基于證實(shí)的靶基因來工程化細(xì)胞系以改進(jìn)細(xì)胞表型使用經(jīng)證實(shí)的靶基因來影響細(xì)胞表型，特別是以增加和有效生產(chǎn)重組轉(zhuǎn)基因、增加細(xì)胞生長(zhǎng)率、高峰值細(xì)胞密度、持續(xù)高細(xì)胞活力、高最大細(xì)胞生產(chǎn)力、持續(xù)高細(xì)胞生產(chǎn)力、低氨產(chǎn)量和低乳酸產(chǎn)量等為特征的表型。上文例如表2-20和表24-30公開了例示性的靶基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>WAN0OSD6R_at(SEQIDNO:1604)TMED4跨膜emp24含蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域4Hs.5隨5IE"II9173.7Mm.254495IE-1409286.6下調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；未知功能WAN008DMI_at(SEQIDNO:1610)ACSL5跌基輔酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員5Hs.U6388596.6卿A09099—6上調(diào)脂生物合成；脂肪酸降解WAN008DWJat(SEQIDNO:USP1類似于泛素特異性蛋白酶1Hs.3508609397Mm.37,09496-5上調(diào)去泛素化酶WA,8e5l一at溶解栽體家族i(中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋(sb:qmNo:l619)slc1a5白)，成員5Hs.5154948E-428445.6Mm.10561e-11588s3.3上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白WAN008E9N—at(SEQIDMO:〖620)KLHL7Kelch樣7(杲繩)Hs.3纖lIE-1508999.4Mm.27376809389.1下調(diào)未知功能WAN008EBP—at(SEQIDNO:r621)Sqstml隔離體i應(yīng)蛋白fO^^/"e/rf-/flfc(^病，Hs-529靴09397.8Mm.4082809397.8下調(diào)泛素相關(guān)蛋白質(zhì)股卿犯仍a.(7w歸'flnStra"他/sS"c/ww&《/"祭合癥，WAN008ELE—at/VM>及命&家^關(guān)弒癥J9E-458734.8M肌糾州57.2T調(diào)(SEQIDNO:〖626)PSATI磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1Hs.4942617E-279316.2Mm.2899365E-708858.2上調(diào)絲氨酸生物合成WAN008EM4—atARHGAP1(SEQIDNO:1627)8RhoGTP酶激活蛋白IS化1098597-9Mm.3564961E-14788100下調(diào)未知功能WAN008EOB_at(SEQIDNO:1629)NOLI核仁蛋白1，120kDaHs.5343348E-489042.5Mm.29203IE-I208792.2上調(diào)細(xì)胞周期進(jìn)行WAN008ERI_at(SEQIDNO:632)FNBP3形成素結(jié)合蛋白3Hs.2987354E-819798.9Mm.2574742E-9499100下調(diào)mRNA前體加工WANOO犯RP一at(SEQEDNO:r634)皮屑蛋白樣IHs.374191IE-458792.8Mm.326柳1E-688994下調(diào)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控()WAN00犯UO一at(SEQIDNO:1635)LPL脂蛋白酯酶Hs.圓782E-828874.1Mm.15141E-U39274J下調(diào)甘油醋代謝在新測(cè)試中同源物，但在WAN008F1P—x_at多數(shù)情況下+/-，并且這(SEQIDNO:1^37)NA1U65A-A01,A下調(diào)些沒有任何同源性WAN013HW0—x—at顯示為線粒體的多順反(SEQIDNO:l^fO)NA包括WAN008CO310600D-F02的聚簇#N/A#N/A上調(diào)mRNA!!!WAN013HXS丄at(SEQIDNO:l&O)E〖F4A2真核翻譯起始因子4A，同工酶2Hs478553IE-15596100Mm.2600841E-I55%100下調(diào)翻譯起始WAN013IlU一x—at(SEQrDNO「lf48)NA包括WAN008BLL11233C-H10的聚簇#N/A2E-05927.71WA1E-05927.71上調(diào)WAN01312T_at色原體同源物5(HPIalpha同源物，(SEQIDNO:1652)CBX5果蠅JHs.3492S31E-1429272Mm262059iE-1689572上調(diào)染色質(zhì)結(jié)合WAN013I6J—s—at氨基甲酰4l酸合成酶2,天門冬氨酸轉(zhuǎn)(SEQIDNO:1^57)CAD氨甲酰酶，及二氫乳清酸酶Hs.37701009199.5Mm.30553509499.5上調(diào)嘧啶生物合成WAN013I8X—at(SEQIDNO:l66i)HSPD1熱休克60kDa蛋白1(伴侶蛋白)Hs.1136840卯99.8Mm.177709399.8上調(diào)分子伴侶WAN013I9Z—at(SEQIDNO:1664)GNAS烏嗜呤核苷結(jié)合蛋白alpha刺激性Hs.125898Mm.12577009441.1下調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)WANOI3I9F_at(SEQIDNO:1662)HSPA犯熱休克蛋白9AHs掘2333E-299218.7Mm.2094192E-729144-8上調(diào)細(xì)月包增殖小鼠合格者名錄符號(hào)名稱人UnigeneIDe值%QCUnigeneIDe值%1D%QCFC功能gi|34853001Uaplll推測(cè)的類似于UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸酶卜樣1Mm.33797-2.22<formula>formulaseeoriginaldocumentpage104</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage106</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>此頁無內(nèi)容表26.高度優(yōu)先考慮基因列表3<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>表29.LLP2+4測(cè)試特異性1.2倍上調(diào)<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞工程方法修飾靶基因來實(shí)現(xiàn)期望的細(xì)胞表型。如上文所討論的那樣，通過干擾RNA、傳統(tǒng)基因敲除或過表達(dá)方法修飾靶基因來獲得期望的CHO細(xì)胞表型。通常，使用敲除方法或用過表達(dá)構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法來改造修飾的CHO細(xì)胞系。其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ诟攀霾糠钟兴懻?，并為本領(lǐng)域所公知。本發(fā)明前述內(nèi)容提供了舉例說明和描述，但并非旨在窮舉或?qū)⒈景l(fā)明精確局限為所公開的內(nèi)容?？梢园凑丈鲜鼋虒?dǎo)進(jìn)行修改和變動(dòng)，或可以通過實(shí)施本發(fā)明而實(shí)現(xiàn)。因而，應(yīng)指出本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書及其等同方案限定。引入作為參考在本申請(qǐng)中引述的所有序列登錄號(hào)、出版物和專利文獻(xiàn)為了所有的目的以其整體引入作為參考，就如同每一單獨(dú)出版物或?qū)＠墨I(xiàn)的內(nèi)容分別在此引入一樣。13權(quán)利要求1.用于鑒定調(diào)控或指示細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)表型的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括生成來自測(cè)試細(xì)胞系樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)譜；將蛋白質(zhì)表達(dá)譜和來自對(duì)照細(xì)胞系的對(duì)照譜相比較；和基于比較鑒定一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中測(cè)試細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)表型與對(duì)照細(xì)胞系不同，并且一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠調(diào)控或指示細(xì)胞培養(yǎng)表型。2.權(quán)利要求l的方法，其中細(xì)胞系是中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。3.權(quán)利要求l的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)表型是細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞生產(chǎn)力、峰值細(xì)胞密度、持續(xù)細(xì)胞活力、氨生產(chǎn)或消耗速率或乳酸生產(chǎn)或消耗速率。4.權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)表型是最大細(xì)胞生產(chǎn)力。5.權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)表型是持續(xù)細(xì)胞活力。6.權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)表型是峰值細(xì)胞密度。7.權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)表型是細(xì)胞生長(zhǎng)速率。8.權(quán)利要求l的方法，其中通過熒光二維差異凝膠電泳生成蛋白質(zhì)表達(dá)謙。9.用于改進(jìn)細(xì)胞系的方法，所述方法包括上調(diào)依照權(quán)利要求l的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。10.用于改進(jìn)細(xì)胞系的方法，所述方法包括通過過表達(dá)來上調(diào)依照權(quán)利要求1的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。11.用于改進(jìn)細(xì)胞系的方法，所述方法包括下調(diào)依照權(quán)利要求1的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述方法包括通過RNA干擾來下調(diào)依照權(quán)利要求1的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。13.用于改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生產(chǎn)力的方法，所述方法包括上調(diào)依照權(quán)利要求1的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。14.用于改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生產(chǎn)力的方法，所述方法包括下調(diào)依照權(quán)利要求1的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。15.用于改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生產(chǎn)力的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)選自表2、3、9、10、11和12的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。16.用于改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生產(chǎn)力的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)依照權(quán)利要求4的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。17.用于改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)選自表4、5、6、13、14、27和28的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。18.用于改進(jìn)細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)依照權(quán)利要求7的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。19.用于增加細(xì)胞系的峰值細(xì)胞密度的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)選自表8、15、16和17的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。20.用于增加細(xì)胞系的峰值細(xì)胞密度的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)依照權(quán)利要求6的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。21.用于增加細(xì)胞系的持續(xù)細(xì)胞活力的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)選自表7、18和19的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。22.用于增加細(xì)胞系的持續(xù)細(xì)胞活力的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)依照權(quán)利要求5的方法所鑒定的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)。23.用于改進(jìn)細(xì)胞系的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)選自表20、24、25和26的一個(gè)或多個(gè)基因。24.用于調(diào)節(jié)細(xì)胞系中乳酸生產(chǎn)或消耗速率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)選自表29和30的一個(gè)或多個(gè)基因。25.用于改進(jìn)細(xì)胞系的方法，所述方法包括上調(diào)或下調(diào)至少兩種基因或蛋白質(zhì)，其中第一基因或蛋白質(zhì)影響第一細(xì)胞培養(yǎng)表型，而第二個(gè)基因或蛋白質(zhì)影響不同的第二細(xì)胞培養(yǎng)表型，其中細(xì)胞培養(yǎng)表型選自細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞生產(chǎn)力、峰值細(xì)胞密度、持續(xù)細(xì)胞活力、氨生產(chǎn)或消耗速率、或乳酸生產(chǎn)或消耗速率。26.權(quán)利要求M的方法，還包括上調(diào)或下調(diào)影響不同于第一和第二細(xì)胞培養(yǎng)表型的第三細(xì)胞培養(yǎng)表型的第三基因或蛋白質(zhì)。27.評(píng)估細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)表型的方法，所述方法包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中依照權(quán)利要求i所鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；和將表達(dá)水平和參照水平相比較，其中比較指示細(xì)胞培養(yǎng)表型。28.評(píng)估細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)表型的方法，所述方法包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中指示細(xì)胞培養(yǎng)表型的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記，其中所述標(biāo)記從由選自圖7到138的肽、選自表2到8的蛋白質(zhì)、及選自表9到20和24到30的基因的基因表達(dá)產(chǎn)物組成的組中選擇。29.具有改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)表型的工程細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)依照權(quán)利要求1所鑒定的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。30.具有改進(jìn)的細(xì)胞生產(chǎn)力的工程細(xì)胞系，包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表2、3、9、10、11和12的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。31.權(quán)利要求30的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。32.權(quán)利要求30的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。33.具有改進(jìn)的細(xì)胞生長(zhǎng)速率的工程細(xì)胞系，包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表4、5、6、13、14、27和28的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。34.權(quán)利要求33的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。35.權(quán)利要求33的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。36.具有改進(jìn)的峰值細(xì)胞密度的工程細(xì)胞系，包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表8、15、16和17的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。37.權(quán)利要求36的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。38.權(quán)利要求36的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。39.具有改進(jìn)的持續(xù)細(xì)胞活力的工程細(xì)胞系，包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表7、18和19的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。40.杈利要求39的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。41.權(quán)利要求39的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。42.具有調(diào)節(jié)的乳酸生產(chǎn)或消耗的工程細(xì)胞系，所述工程細(xì)胞系包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表29和30的一個(gè)或多個(gè)基因的工程構(gòu)建體。43.權(quán)利要求42的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。44.權(quán)利要求42的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。45.改進(jìn)的細(xì)胞系，其包含工程細(xì)胞群，各工程細(xì)胞包含上調(diào)或下調(diào)選自表20、24、25和26的一個(gè)或多個(gè)基因或蛋白質(zhì)的工程構(gòu)建體。46.權(quán)利要求45的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是過表達(dá)構(gòu)建體。47.權(quán)利要求45的工程細(xì)胞系，其中工程構(gòu)建體是干擾RNA構(gòu)建體。48.用于表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括步驟向權(quán)利要求29的工程細(xì)胞系中引入編碼目的蛋白質(zhì)的核酸；和收獲目的蛋白質(zhì)。49.分離或重組的核酸，其包含選自表9、13和15的CHO序列。50.分離或重組的蛋白質(zhì)，其包含選自表2和4的CHO序列。全文摘要本發(fā)明提供了通過表達(dá)譜分析來系統(tǒng)鑒定最大化蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌的基因和蛋白質(zhì)及相關(guān)通路的方法。本發(fā)明還提供了操縱所鑒定的基因和蛋白質(zhì)來工程化改進(jìn)的細(xì)胞系的方法。文檔編號(hào)G01N33/50GK101479601SQ200780022890公開日2009年7月8日申請(qǐng)日期2007年4月21日優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日發(fā)明者D·L·迪尼諾,K·M·麥卡錫,K·安德森,K·科佩欽斯基,M·S·西納科雷,M·倫納德,M·克萊因斯,M·邁維勒,N·巴龍,P·加梅爾,P·杜蘭,P·米萊蒂,T·沙勒布瓦申請(qǐng)人:惠氏公司;都柏林城市大學(xué)