專利名稱：：Crac調(diào)節(jié)劑及其在藥物發(fā)現(xiàn)中的用途的制作方法CRAC調(diào)節(jié)劑及其在藥物發(fā)現(xiàn)中的用途相關(guān)申請交叉引用本申請根據(jù)35USCS119(e)要求獲得2006年4月10日提交的臨時(shí)專利申請60/791,038的權(quán)益，本文引用其內(nèi)容作為參考。關(guān)于政府資助研究或開發(fā)的申明本工作部分地獲得NIH資助5-R37-GM053950(JPK)，R01-AI050200和R01-NS04Q927(RP),R01-GM065360(AF)的支持。
背景技術(shù)：
：受體介導(dǎo)的信號傳遞在不可興奮性細(xì)胞(non-excitablecell)中，特別是在免疫細(xì)胞中，參與細(xì)胞內(nèi)Ca"由于從細(xì)胞內(nèi)4丐池釋放而初升(initialrise)。由此導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)4丐池耗盡，從而誘導(dǎo)Ca"通過釣釋放激活的鉤(CRAC)通道穿過細(xì)胞質(zhì)膜而內(nèi)流(JWPutney，Jr,CellCalcium11611(1990年11月-12月)MHoth，RPennerNature355，353(1992年1月23日)，ABParekh,RPenner,PhysiolRev77901(1997))。這種現(xiàn)象對基因轉(zhuǎn)錄、增殖和細(xì)胞因子釋放等許多生理過程是十分重要的(ABParekh，RPenner,PhysiolRev77,901(1997)，MPartisetietal,JBiolChem269，32327(Dec23,1994),RSLewisAnnuRevImmunol19，497(2001))。在生物物理上，CRAC電流已經(jīng)獲得良好的表征(MHoth,RPenner,Nature355，353(1992年1月23日)，MHoth，RPenner,JPhysiol(Lond)465，359(1993)，AZweifach，RSLewis,ProcNatlAcadSciUSA90,6295(1993))，但是CRAC通道自身以及導(dǎo)致其激活的通路仍然不為人所知。最近，兩個(gè)研究組獨(dú)立地鑒定STIM1是鉤池操縱的釣內(nèi)；危(store-operatedcalciumentry)的一個(gè)基本纟且元(JLiou等人，CurrBiol151235(2005年7月12曰)；JRoos等人，JCellBiol169435(2005年5月9曰))。這種蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞內(nèi)室，有可能是ER的部分。它具有一個(gè)含腔內(nèi)(luminal)EF手基序的單跨膜域，該基序似乎對于其假定的腔內(nèi)Ca"水平ER傳感器的功能是至關(guān)重要的。一旦4丐池耗盡，STIM1重新分布到移動(dòng)并積累在細(xì)胞質(zhì)膜下方的獨(dú)特結(jié)構(gòu)(點(diǎn)(punctae))內(nèi)。關(guān)于STIMI實(shí)際上是否整合到細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)尚有爭議(JI4ou等人，CurrBio115，1235(2005年7月12日)，SLZhang等人，Nature437,902(2005年10月6日)1MASpassova等人，ProcNatlAcadSciUSA103,4040(2006年3月14日))。STIMI是激發(fā)CRAC電流必需的，然而其存在或者甚至其轉(zhuǎn)位是不夠的，因?yàn)閬碜許CID患者的淋巴細(xì)胞具有正常的STIMI水平，但仍然不能激活CRAC通道(SFeske等人,JExpMed202，651(2005年9月5日))。這提示有其他的分子組分參與釣池操縱的Ca"內(nèi)流機(jī)制。發(fā)明概要本發(fā)明涉及鈣釋放激活的Ca2+(CRAC)通道調(diào)節(jié)劑(CRACM)例如CRACM1和CRACM2的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼CRACM的重組核酸的用途。本發(fā)明的一個(gè)方面包括用于確定候選生物活性劑是否能夠調(diào)節(jié)CRACM多肽的離子通道活性的方法。本發(fā)明還包括用于篩選能夠在CRACM多肽影響CRAC通道通透性時(shí)調(diào)節(jié)CRACM多肽活性的試劑的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及調(diào)節(jié)編碼CRACM的核酸的細(xì)胞表達(dá)的方法和組合物。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于篩選與CRACM多肽結(jié)合的候選生物活性劑的方法。在該方法中，使CRACM多肽與候選試劑接觸，并確定該候選試劑是否與該CRACM多肽結(jié)合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了使CRACM多肽與包含兩種或多于兩種候選試劑的文庫接觸，然后確定一種或多種候選試劑與CRACM多肽的結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，CRACM多肽包括具有如圖4所示氨基酸序列的CRACM1或者果蠅CRACM2多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選可調(diào)節(jié)細(xì)胞CRAC活性的生物活性候選試劑的方法。在該實(shí)施方案中，使細(xì)胞與候選試劑接觸，并檢測二價(jià)陽離子通透性的調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，候選試劑增加陽離子通透性。在另外的實(shí)施方案中，候選試劑降低陽離子通透性。優(yōu)選的陽離子是Ca+2。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供用于篩選能夠調(diào)節(jié)CRACM多肽表達(dá)的候選生物活性劑的方法。在該方法中，提供能夠表達(dá)CRACM多肽的重組細(xì)胞。使重組細(xì)胞與候選試劑接觸，并確定候選試劑對CRACM多肽表達(dá)的影響。在一些實(shí)施方案中，候選試劑可以包括小分子、蛋白質(zhì)、多肽或核酸(例如反義核酸)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，確定候選試劑存在時(shí)CRACM多肽的表達(dá)水平，并將所述水平與內(nèi)源CRACM表達(dá)水平進(jìn)行比較。那些調(diào)控CRACM多肽表達(dá)的候選試劑可以在非重組細(xì)胞中進(jìn)行檢驗(yàn)以確定是否重現(xiàn)相同的效果。本發(fā)明還提供了用于抑制CRAC活性的方法，包括使至少一個(gè)細(xì)胞與(l)抑制CRACM表達(dá)的試劑和/或(2)抑制CRACM多肽的試劑接觸。本發(fā)明還涵蓋反義CRACM核酸以及抗-CRACM抗體。附圖簡述圖1描述了作為果蠅中4丐池操縱的Ca"內(nèi)流關(guān)鍵調(diào)節(jié)物的CRACM1和CRACM2的鑒定。在使用自動(dòng)熒光成像讀板儀(FLIPR)(fluorometricimagingplatereader)的初始高通量篩選中測量的果蠅S2R+細(xì)胞內(nèi)的Ca"信號。(A)從CRACM1dsRNA獲得的Fluo-4-AM熒光以相對熒光單位(r.f.u)計(jì)的變化。為RholdsRNA(模擬)和STIM1dsRNA提供了參考跡線(trace)。細(xì)胞被保持在無Ca勺容液中，并暴露于毒胡蘿卜素(2|iM)，隨后添加2mMCa2+。跡線代表初始篩選的兩次獨(dú)立重復(fù)。(B)實(shí)驗(yàn)方案與(A)相同，只是細(xì)胞用CRACM2dsRNA處理。(C)果蠅Kc細(xì)胞中測量的IP3誘導(dǎo)的(20pM)ICRAC的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。在-80mV下測量各個(gè)細(xì)胞的電流，通過其各自的細(xì)胞大小加以標(biāo)準(zhǔn)化，并對時(shí)間進(jìn)行作圖(士標(biāo)準(zhǔn)差)。胞質(zhì)4丐用10mMBAPTA和4mMCaCl2鉗制(clamp)在150nM。跡線相應(yīng)于未處理對照(wt，黑色實(shí)心圓環(huán)，n=10)，RholdsRNA(模擬，空心圓環(huán)，n=8),CRACM1dsRNA(紅色圓環(huán)，n:6)和CRACM2dsRNA(綠色圓環(huán)，n=9)。(D)ICRAC經(jīng)過漏電流差減(leak-subtracted)、標(biāo)準(zhǔn)化和平均的電流-電壓(I/V)數(shù)據(jù)跡線，其中Icrac是在60s時(shí)從典型細(xì)胞中被50ms內(nèi)從-100mV到+100mV的電壓斜線上升(ramp)所激發(fā)的電流中提取的。跡線對應(yīng)于未處理對照(wt,n=9)、CRACM1dsRNA(n=5)和CRACM2dsRNA(n=6)。(E)與圖面(C)相同，只是省略了IP3并用10mMBAPTA將[Ca"]i4甘制在接近0，以誘導(dǎo)凈皮動(dòng)釣池耗盡。跡線對應(yīng)于未處理對照(wt，黑色圓環(huán)，n=4)和CRACM1dsRNA(紅色圓環(huán)，n=3)。(F)ICRAC經(jīng)過漏電流消減(leak-subtracted)、標(biāo)準(zhǔn)化和平均的電流-電壓(I/V)數(shù)據(jù)跡線，其中ICRAC是在200s從典型細(xì)胞中由50ms6內(nèi)從-100mV到+100mV的電壓斜線上升所激發(fā)的電流中提取的。跡線對應(yīng)于從未處理對照(wt，n=4)和CRACM1dsRNA(n=3)獲得的被動(dòng)消耗誘導(dǎo)ICRAC。圖2描述了HEK293和Jurkat細(xì)胞中CRACM1siRNA對4丐池操縱的Ca^內(nèi)流和ICRAC的抑制。(A)左圖來自用兩種不同CRACM1特異性siRNA和一種亂序序列對照感染的HEK293細(xì)胞的CRACM1mRNA的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。循環(huán)數(shù)24、27、30。右圖使用對小核糖體蛋白特異性的引物的RT-PCR陽性對照。循環(huán)數(shù)24、27、30。(B)在HEK293細(xì)胞中，用亂序(對照)和兩種不同CRACM1特異siRNA處理的細(xì)胞內(nèi)的Fura-2-AM熒光測量結(jié)果。細(xì)胞被保持在無Ca^溶液中，并暴露于毒胡蘿卜素(2pM),隨后添加2mMCa"。跡線代表3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(C)實(shí)驗(yàn)方案與(B)相同，只是用Jurkat細(xì)胞。跡線是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均。(D)在HEK293細(xì)胞中測得的IP3誘導(dǎo)(20pM)的ICRAC的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。跡線相應(yīng)于亂序(黑色圓環(huán)，n=13)，CRACM1siRNA-l(紅色圓環(huán)，n=IO)和CRACM1siRNA-2(藍(lán)色圓環(huán)，n=9)。(E)IcRAc經(jīng)過漏電流消減、標(biāo)準(zhǔn)化和平均的電流-電壓(I/V)數(shù)據(jù)跡線，其中Icrac是在60s從典型細(xì)胞內(nèi)由50ms內(nèi)從-100mV到+100mV的電壓斜線上升所激發(fā)的電流中提取的。跡線對應(yīng)于亂序(n=10)、CRACM1siRNA-l(n=8)和CRACM1siRNA-2(n=7)。(F)與圖(D)相同，只是使用Jurkat細(xì)胞。跡線對應(yīng)于亂序(黑色圓環(huán)，n=9)、CRACM1siRNA-l(紅色圓環(huán)，n=8)和CRACM1siRNA-2(藍(lán)色圓環(huán)，n=8)。(G)ICRAC經(jīng)過漏電流消減、標(biāo)準(zhǔn)化和平均的電流-電壓(I/V)數(shù)據(jù)跡線，其中Icrac是在60s從典型細(xì)胞內(nèi)由50ms內(nèi)從-100mV到+100mV的電壓斜線上升所激發(fā)的電流中提取的。跡線對應(yīng)于亂序(n=9)、CRACM1siRNA-l(n=7)和CRACM1siRNA-2(n=8)。圖3描述了CRACM1在HEK293、Jurkat細(xì)胞和RBL-2H3細(xì)胞中的過表達(dá)。(A)通過用抗-myc或抗-HisC端抗體進(jìn)行免疫沉淀并用抗-myc抗體進(jìn)行免疫印跡對HEK293細(xì)胞中CRACM1過表達(dá)的分析。空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的對照免疫沉淀沒有顯示任何條帶。(B)HEK293細(xì)胞中測量的IP3誘導(dǎo)(20^M)的IcRAc的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。各個(gè)細(xì)胞的電流在-80mV下測量，通過其各自的細(xì)胞大小加以標(biāo)準(zhǔn)化，平均，并對時(shí)間進(jìn)行作圖(士標(biāo)準(zhǔn)差)。用10mMBAPTA和4mMCaCl2將胞質(zhì)釣鉗制在150nM。跡線對應(yīng)于空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(對照，黑色圓環(huán)，11=13)和用GFP加CRACM1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(紅色圓環(huán)，n=14)。(C)與圖(B)相同，只是使用Jurkat細(xì)胞。跡線對應(yīng)于空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(對照，黑色圓環(huán)，n=4)和用GFP加CRACM1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(紅色圓環(huán)，n=5)。(D)與圖(B)相同，只是使用RBL-2H3細(xì)胞。跡線對應(yīng)于空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(對照，黑色圓環(huán)，n=9)和用GFP加CRACM1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(紅色圓環(huán)，n=9)。(E)通過共聚焦顯微鏡觀察的CRACM1在HEK293細(xì)胞中的免疫熒光定位。免疫染色分別是在完整細(xì)胞(左圖)和可通透化的細(xì)胞(右圖)中針對CRACMl-flag-N-端(上圖)或CRACMI-myc-C-端(下圖)。(F)與(E)的右下圖一樣，但是為所選細(xì)胞的更高放大倍數(shù)圖，以顯示細(xì)胞質(zhì)膜染色。圖4A是人CRACM1的核酸序列。圖4B是CRACM1的氨基S吏序列。圖5顯示了CRACM1在HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)據(jù)。(A)來自用Flag-CRACM1和CRACM1-Myc-His共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的CRACM1的免疫共沉淀物。泳道2顯示Flag-CRACM1與CRACM1-Myc-His免疫共沉淀。泳道3顯示反向免疫共沉淀，而泳道1和4顯示對照免疫沉淀。(B)在HEK-293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染的Flag-CRACM1和Stiml-Myc-His的免疫共沉淀。全細(xì)胞裂解物用抗-myc抗體(第一泳道)或抗-flag抗體(第二泳道)免疫沉淀，并用抗-myc抗體(上圖)或抗-flag抗體(下圖)印跡。(C)人CRACM1、CRACM2、CRACM3以及來自不同物種(果蠅、小鼠、大鼠和雞)的CRACM1的序列比對，高亮顯示酸性殘基(殘基編號與人CRACM1序列一致)。(D)D110/112A-CRACM1和E106Q-CRACM1突變體與wt-CRACMl的免疫共沉淀。泳道1顯示Dl10/112A-CRACM1-Myc-His可以和Flag-CRACM1免疫共沉淀，泳道3顯示CRACMI-Myc-His可以和Flag-E106Q-CRACM1免疫共沉淀。泳道2和4顯示對照。(E)用Flag-CRACM1、Dl10/112A-CRACMl-Myc曙His、Flag-E190Q-CRACM1和Flag-E106Q-CRACM1轉(zhuǎn)染并分別用抗-myc或抗-flag抗體染色以顯示突變體細(xì)胞定位的HEK293細(xì)胞的共聚焦圖象。圖6顯示了用CRACM1突變體實(shí)施的選擇性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(A)在共過表達(dá)STIM1和野生型CRACM1(黑色圓環(huán)，n=14)和E106D突變體(紅色圓環(huán)，n=9)的HEK293細(xì)胞中測得的、IP3誘導(dǎo)(20iaM)的CRAC電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。各個(gè)細(xì)胞的電流在-80mV測量，對細(xì)胞電容加以標(biāo)準(zhǔn)化，平均，并對時(shí)間進(jìn)行作圖(士標(biāo)準(zhǔn)差)。胞質(zhì)鉤用20mMBAPTA鉗制在接近0。柱形代表無二價(jià)(divalent-free,DVF)溶液的施加。(B)在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行120s時(shí)，從圖A所示典型HEK293細(xì)胞提取的CRAC電流的平均電流-電壓(I/V)關(guān)系。數(shù)據(jù)代表通過在50ms內(nèi)從-100mV到+150mV的電壓斜線上升所激發(fā)的、經(jīng)過漏電流消減的電流，對細(xì)胞電容(pF)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。跡線對應(yīng)于STIM1+wt-CRACMl(wt,n=12)或STIM1+E106Q突變體(n=6)。(C)E106D突變體在-80和+130mV產(chǎn)生的IP3誘導(dǎo)(20iiM)電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。細(xì)胞被暴露于標(biāo)稱的無Ca^外溶液(黑色圓環(huán)，n=6)或無Na+溶液(紅色圓環(huán)，11=6)經(jīng)過黑色柱形所示的時(shí)間。電流分析如圖A。(D)在120s(黑色跡線，n=6)和在無Ca^溶液(藍(lán)色跡線，n=6)或無Na+溶液(紅色跡線，n=6)的施加結(jié)束時(shí)提取的E106D突變體的平均1/V跡線(細(xì)胞與圖C相同)。數(shù)據(jù)分析與圖B相同。(E)在表達(dá)wt-CRACM1(黑色圓環(huán)，n-9)或E106D突變體(紅色圓環(huán)，！1=7)的HEK293中CRAC電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。分析與圖A相同。在黑色柱形所示時(shí)間處，用含有10mMBa^(和0Ca")的外溶液澆蓋(superfuse)細(xì)胞。注意，細(xì)胞用無細(xì)胞外Na+(用TEA+代替)的Ba"澆蓋，以避免Na+電流的污染。(F)在Ba"施加之前(120sn=4)或結(jié)束時(shí)(180s，n=4)從表達(dá)圖E所示E106D突變體的典型HEK293細(xì)胞提取的電流的平均I/V數(shù)據(jù)跡線。分析與圖B相同。(G)E190Q突變體在-80和+130mV產(chǎn)生的IP3誘導(dǎo)(20(iM)的電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。細(xì)胞被暴露于標(biāo)稱的無Ca"外溶液(黑色圓環(huán)，n=7)或無Na+溶液，其中Ca"被Ba"代替(紅色圓環(huán)，n=8)，經(jīng)過柱形所示的時(shí)間。電流分析如圖A。(H)在120s(黑色跡線，n-8)和在10Ba"(紅色跡線，n-8)或無Ca"溶液(藍(lán)色跡線，n=7，細(xì)胞與圖G相同)施加結(jié)束時(shí)提取的E190Q突變體的平均I/V跡線。數(shù)據(jù)分析與圖B相同。圖7表明了使用CRACM1的孔突變體(poremutant)進(jìn)行的選擇性實(shí)驗(yàn)。(A)在共表達(dá)STIM1與wt-CRACMI(黑色圓環(huán)，n=12)或CRACM1的D110/112A突變體(紅色圓環(huán)，n=ll)的HEK293細(xì)胞中測得的IPs誘導(dǎo)(20(iM)的CRAC電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程。各個(gè)細(xì)胞的電流在-80mV和+130mV測量，對細(xì)胞電容加以標(biāo)準(zhǔn)化，取平均值，并對時(shí)間進(jìn)行作圖(士標(biāo)準(zhǔn)差)。胞質(zhì)鉤用20mMBAPTA鉗制在接近O。柱形代表含有10mMCa"并且用TEA+代替Na+的外溶液的施加。(B)wt-CRACM1(黑色跡線，數(shù)據(jù)與圖2A相同)或D110/112A突變體產(chǎn)生的IP3誘導(dǎo)(20|aM)電流的平均時(shí)間過程。將電流對120s標(biāo)準(zhǔn)化從而達(dá)到一致[normalizedtounityat120S](I/I12。s)。表達(dá)D110/112A突變體的細(xì)胞用含有Na+(130mM，n=13)或者不含Na+(TEA+代替，11=5)的標(biāo)稱無€&2+外溶液澆蓋。澆蓋時(shí)間如黑色柱形所示。電流分析與圖A相同。(C)從圖A和B所示的典型HEK293細(xì)胞提取的CRAC電流的平均I/V關(guān)系。數(shù)據(jù)代表了通過在50ms內(nèi)從-100mV到+150mV的電壓斜線變化所激發(fā)的、經(jīng)過漏電流消減，并針對細(xì)胞電容(pF)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的電流。跡線顯示了在含有10mMCa^的無Na+溶液施加結(jié)束(180s)時(shí)的wt-CRACMl表達(dá)細(xì)胞黑色跡線，n=10,放大17倍以適合D100/122A突變體的內(nèi)流電流(inwardcurrents)大?。缓驮谑┘雍姓a+的標(biāo)稱無Ca"溶液之前120s，藍(lán)色跡線，！1=11或期間紅色跡線，11=11提取的D110/112A突變體。(D)在用含有Na+(紅線，數(shù)據(jù)與圖B相同)、K+(黑色圓環(huán)，n=12)或。3+(藍(lán)色圓環(huán)，n=9)的標(biāo)稱無Ca"溶液澆蓋的細(xì)胞中D110/112A突變體產(chǎn)生的IP3誘導(dǎo)(20pM)電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程(I/I120S)。施加時(shí)間如黑色柱形所示。電流分析與圖A相同。(E)wt-CRACMl(黑色圓環(huán)，n:8)或D110/112A突變體(紅色圓環(huán)，n=8)產(chǎn)生的IP3誘導(dǎo)(20pM)電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程(l/1120S)。細(xì)胞用添加了10pMCa^的標(biāo)稱無二價(jià)外溶液澆蓋，如黑色柱形所示。電流分析與圖A相同。(F)wt-CRACMl(黑色圓環(huán)，n:5-14)或D110/112A突變體(紅色圓環(huán)，n=5-8)的異常摩爾分?jǐn)?shù)效應(yīng)(anomalousmolefractioneffect)。將在不同Ca2+濃度下測量的電流大小設(shè)置為相對于10mMCa^獲得的電流幅度的相對值，取平均值，并相對于遞增的細(xì)胞外Ca"濃度作圖。(G)在用無Na+(用TEA+代替以避免Na+電流污染)并且10mMCa"被等摩爾Ba2+(黑色圓環(huán)，n=9)或Sr2+(藍(lán)色圓環(huán)，n=7)代替的外溶液所澆蓋的細(xì)胞中，wt-CRACMl產(chǎn)生的IP3誘導(dǎo)(20pM)電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程(I/I!20s)。電流分析與圖A相同。(H)在用無Na+(用TEA+代替以避免Na+電流污染)并且10mMCa"被等摩爾Ba"(黑色圓環(huán)，n-7或S一+(藍(lán)色圓環(huán)，n=7)代替的外溶液所澆蓋的細(xì)胞中，D110/112A突變體產(chǎn)生的IPs誘導(dǎo)(20pM)電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時(shí)間過程(1/Iuos)。電流分析與圖A相同。(1)wt-CRACMl(黑色，n-5-12)或D110/112A突變體(紅色，n=5-14)的通透性譜。在外部添加交換結(jié)束時(shí)(180s)估計(jì)-80mV條件下的電流，并設(shè)置為相對于添加之前(120s)的電流的相對值，取平均值，并作為剩余電流百分比(。/。)作圖。數(shù)據(jù)按施加條件分類(10mMCa2、10mMBa2+，10mMSr2+,130mMNa+,130mMK+,130mMCs+)。在含標(biāo)準(zhǔn)Mg2+10濃度(2mM)的標(biāo)稱無Ca^溶液中評估單價(jià)導(dǎo)電性。數(shù)據(jù)代表圖A-H的摘要。發(fā)明詳細(xì)說明功能性的CRACM是CRAC通道活性必需的。本發(fā)明的一部分涉及可用于鑒定能結(jié)合CRACM多肽、能通過與CRACM相互作用調(diào)節(jié)CRAC離子通道活性、和能改變細(xì)胞中CRAC多肽表達(dá)的分子的方法。CRACM在果蠅和人中表達(dá)。人們CRACMl在免疫細(xì)胞中表達(dá)。因此，通過與CRACMl蛋白相互作用或者破壞CRACMl表達(dá)來調(diào)節(jié)CRAC通道活性的試劑可以用于調(diào)節(jié)炎癥過程、過敏反應(yīng)和自身免疫性疾病。CRACM2在果蠅中表達(dá)，在人中沒有已知的直系同源物。破壞CRACM2之CRAC通道活性或抑制CRACM2表達(dá)的試劑可以用作殺蟲劑。如本文所述，術(shù)語"CRACM，'是指釣釋放活性Ca^(CRAC)通道調(diào)節(jié)物家族。CRACM多肽通過其氨基酸序列、編碼核酸和性質(zhì)加以定義。本文在圖4B中公開了人CRACMl多肽的序列。果蠅CRACMl和CRACM2的序列可以在線獲得(l)果蠅CRACMl(olfl86-F)http:〃flybase.bio.indiana.edu/bin/asksrs.html%5Bhbs%3D%7BFBgn%20PFgn%7D-all%3AFBgn0041585%5D，和(l)果蠅CRACM2(dpr3)http:〃flybase.bio.indiana.edu/bin/asksrs.html%5Blibs%3D%7BFBgn%20PFgn%7D-all%3AFBgn0053516%5D。術(shù)語"CRACM序列"具體包括天然存在的截短或分泌形式(例如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列或氨基端片段)，天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體?？捎糜诒景l(fā)明方法或者其他目的的CRACM多肽包括與SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段具有至少大約80%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約85°/。氨基酸序列同一性，更加優(yōu)選地至少大約90%氨基酸序列同一性，再優(yōu)選地至少大約95%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的多肽。這類CRACM多肽包括例如如下的多肽，其中在N-或C-端以及在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部區(qū)域有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被取代和/或刪除。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，氨基酸變化可能改變CRACM多肽變異體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置或者改變膜錨定特性。然而，所有CRACM多肽均顯示一種或多種如本文所限定的CRACM多肽的新性質(zhì)。關(guān)于本文所鑒定的CRACM多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性，，的定義是在將序列加以比對，并且，如果需要的話，引入缺口(gap)，以獲得最大百分比序列同一性之后，并且在不將保守取代看作是序列同一性的一部分的前提下，候選序列中與SEQIDNO:2的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。％同一性數(shù)值可以通過WU-BLAST-2(Altschul等人,MethodsinEnzymology,266460-480(1996))產(chǎn)生。而-BLAST畫2使用數(shù)種搜索參數(shù)，其中大部分設(shè)定為默認(rèn)值。可調(diào)節(jié)的參數(shù)設(shè)定為如下數(shù)值重疊跨度(overlapspan)=l,重疊分?jǐn)?shù)=0,125，字閾值(T"ll。HSPS和HSPS2參數(shù)是動(dòng)態(tài)值，由程序本身根據(jù)具體序列的組成和感興趣序列所搜索的具體數(shù)據(jù)庫的組成加以確定；然而可以調(diào)整該數(shù)值以提高靈敏度。％氨基酸序列同一性數(shù)值由比對區(qū)內(nèi)的匹配相同殘基的數(shù)目除以"更長"序列的殘基總數(shù)而確定。"更長"序列是在比對區(qū)內(nèi)具有最多實(shí)際殘基的序列(忽略WU-Blast-2為了使比對得分最大而引入的缺口)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在這里使用的％同一性數(shù)值是利用PILEUP算法產(chǎn)生的。PILEUP用漸進(jìn)逐對比對(progressivepairwisealignments)乂人一組相關(guān)序列產(chǎn)生多序列比對。它還可以繪制一種展示用于產(chǎn)生該比對的聚類關(guān)系的樹。PILEUP使用Feng和DoolittieJMolEvol35351-360(1987)所述之漸進(jìn)比對方法的簡化形式，此方法與Higgins和SharpCABIOS5151-153(1989)描述的相似。有用的PILEUP參數(shù)包括默認(rèn)缺口權(quán)重3.00，默認(rèn)缺口長度權(quán)重0.10,和加權(quán)末端缺口。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，來自人或其他生物體的CRACM多肽可以用寡核苷酸探針或簡并聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列從合適的基因組或cDNA文庫進(jìn)行鑒定和分離。本領(lǐng)域的人員會(huì)理解，具有SEQIDNO1核苷酸序列或其一部分的獨(dú)特的CRACM核酸作為探針或PCR引物序列特別有用。如本領(lǐng)域眾所周知的，優(yōu)選的PCR引物長度為大約15-大約35個(gè)核苦酸，優(yōu)選地大約20-大約30個(gè)核香酸，并且如果需要可以含有肌苷。PCR反應(yīng)的條件是本領(lǐng)域熟知的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，CRACM是"重組蛋白質(zhì)"或"重組多肽，，，其用重組技術(shù)，即通過表達(dá)重組CRACM核酸制備而成。重組蛋白質(zhì)與天然存在的蛋白質(zhì)在至少一種或多種特征上有區(qū)別。例如，可以從蛋白質(zhì)的野生宿主中通常與之相關(guān)的一些或全部蛋白質(zhì)或化合物中分離或純化該蛋白質(zhì)，從而該蛋白質(zhì)是基本上純凈的。例如至少有一些在分離蛋白的天然狀12態(tài)下通常與之相關(guān)的材料將不再伴隨著分離后的蛋白，這部分材料優(yōu)選地占給定樣品中總蛋白重量的至少大約0.5%，更優(yōu)選地至少大約5%?；旧霞儍舻牡鞍踪|(zhì)占總蛋白重量的至少大約75%，優(yōu)選地至少大約80%，更優(yōu)選地至少大約90%，特別優(yōu)選地至少大約95%。該定義包括在某種生物體或宿主細(xì)胞中產(chǎn)生另一種生物體的蛋白質(zhì)?；蛘?，可以通過使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或高表達(dá)載體使蛋白質(zhì)濃度水平提高，從而使蛋白質(zhì)濃度比通常所見的濃度顯著提高?；蛘?，蛋白質(zhì)可以處于在自然條件下不常見的形式，例如添加附加表位或氨基酸取^、添加和刪除，如下文討論的。如本文使用的，"CRACM核酸'，或其語法等價(jià)物是指編碼CRACM多肽的核酸。CRACM核酸顯示與CRACM1和CRACM2的序列同源性，其中同源性通過比較序列或雜交測定加以確定。編碼CRACM多肽的CRACM核酸與圖4A中提出的DNA序列同源。這類CRACM核酸具有優(yōu)選地大于大約75%的同源性，更優(yōu)選地大于大約80%,更優(yōu)選地大于大約85%,最優(yōu)選地大于90%的同源性。在一些實(shí)施方案中，同源性可以高達(dá)大約93%、95%、97%、98%或99%。本文中同源性是指序列相似性或同一性，優(yōu)選地是同一性。一種優(yōu)選的同源性比較是將含有測序差異的序列與已知的CRACM序列的比較。這種同源性將用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定，包括但不僅限于，Smith和Waterman,AdvApplMath2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch,JMolBiol48443(1970)的同源性比對算法，Pearson和Lipman，PNASUSA852444(1988)的搜尋相似性方法，這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(WisconsinGenetics軟件包,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)，Devereux等人，NuclAcidRes12387-395(1984)描述的最佳擬合序列程序，優(yōu)選地用默認(rèn)設(shè)置，或者通過肉眼觀察。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這里使用的。/。同一性數(shù)值用PILEUP算法產(chǎn)生。PILEUP用漸進(jìn)逐對比對從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多序列比對。它還可以繪制顯示用于產(chǎn)生該比對的聚類關(guān)系的樹。PILEUP使用Feng和DoolittleJMolEvol35351-360(1987)的漸進(jìn)比對方法的簡化形式，此方法與Higgsns和SharpCABIOS5151-153(1989)描述的相似。有用的PILEUP參數(shù)包括默認(rèn)缺口權(quán)重3.00,默認(rèn)缺口長度權(quán)重0.10，和加權(quán)末端缺口。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用BLAST算法。BLAST在Altschul等人，JMolBiol.215:403-410，(1990)和Karlin等人，PNASUSA90:5873-5787(1993)中有描述。特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2，從Altschul等人，MethodsinEnzymology,266:460-480(1996)，http〃blast扁stl/edu/blast/README.html獲得。WU-BLAST-2使用數(shù)種搜索參數(shù)，其中大部分設(shè)定為默認(rèn)值?？烧{(diào)整的參數(shù)用如下數(shù)值設(shè)定重疊跨度=1,重疊分?jǐn)?shù)=0.125,字閾值(丁)=11。HSPS和HSPS2參數(shù)是動(dòng)態(tài)值，由程序本身根據(jù)具體序列的組成和感興趣序列所搜索的具體數(shù)據(jù)庫的組成加以確定，但可以調(diào)整所述數(shù)值以提高靈敏度。％氨基酸序列同一性數(shù)值由比對區(qū)內(nèi)的匹配相同殘基的數(shù)目除以"更長，，序列的殘基總數(shù)來確定。"更長，，序列是在比對區(qū)內(nèi)具有最多實(shí)際殘基的序列(忽略WU-Blast-2為了使比對得分最大而引入的缺口)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，"百分比(％)核酸序列同一性"定義為候選序列中與CRACM核苷酸殘基序列相同的核苷酸殘基的百分比。優(yōu)選的方法利用WU-BLAST-2的BLASTN模塊，設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)，重疊跨度和重疊分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為1和0.125。比對可以包括在要比對的序列中引入缺口。此外，對于含有比CRACM1或CRACM2更多或者更少的核苷的序列，可以理解，同源百分比將根據(jù)相對于核苷總數(shù)的同源核苷的數(shù)目加以確定。因此，例如，比本文鑒定的、如下文所討論的序列更短的序列的同源性，將用較短序列中的核苷數(shù)目確定。如上文所述，CRACM核酸還可以用通過雜交研究確定的同源性加以定義。雜交在低嚴(yán)格條件下測量，更優(yōu)選地在中等嚴(yán)格條件下測量，最優(yōu)選地，在高嚴(yán)格條件下測量。由這類同源核酸編碼的蛋白質(zhì)顯示至少一種新的本文定義的CRACM多肽性質(zhì)。因此，例如，在高嚴(yán)格條件下與具有如SEQIDNO1所示序列的核酸雜交的核酸和其互補(bǔ)物被認(rèn)為是CRACM核酸序列，只要它們編碼具有CRACM性質(zhì)的蛋白質(zhì)。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格度"可以容易地由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定，一般是根據(jù)探針長度、洗滌溫度和鹽濃度進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。一般地，較長的探針需要較高的溫度以實(shí)現(xiàn)正確退火，而較短探針需要較低的溫度。雜交一般取決于變性DNA在低于其解鏈溫度的環(huán)境中當(dāng)存在互補(bǔ)鏈時(shí)重新退火的能力。探針與可雜交序列之間的期望同源程度越高，可使用的相對溫度越高。因此，高的相對溫度傾向于使反應(yīng)條件更嚴(yán)格，而較低的溫度使反應(yīng)條件較不嚴(yán)格。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度其他實(shí)例可見Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995),本文引用其全部內(nèi)容作為參考。如這里定義的，"嚴(yán)格條件，，或"高度嚴(yán)格條件"可以如下確定(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如使用50°C的0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1。/。十二烷基磺酸鈉，(2)雜交期間使用變性劑，例如曱酰胺，例如50。/。(v/v)曱酰胺與0.1。/。牛血清白蛋白/0.1。/。Ficoll/0.1。/()聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5和750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，42°C;或者(3)使用50%曱酰胺、5xSSC(0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5xDenhardt's溶液、超聲波處理過的鮭魚精子DNA(50|ig/ml)，0.1%SDS和10%硫酸右旋糖酐，42°C;在42。C的0.2xSSC(NaCl/檸檬酸鈉)和55。C的50%曱酰胺中洗滌，隨后進(jìn)行高嚴(yán)格洗滌，其包含55°C含有EDTA的O.lxSSC。"中等雜交條件，，可以按照Sambrook等人，MolecularCloningALaboratoryManual,NewYorkColdSpringHarborPress,1989戶斤述力口以鑒定，包括使用嚴(yán)格度低于上述的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和%SDS)。中等嚴(yán)格條件的實(shí)例是37。C在如下溶液中過夜溫育，該溶液包括20%曱酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhard，s溶液、10%硫酸右旋糖酐和20mg/ml變性剪切鮭魚精子DNA,隨后用大約37-50。C的1xSSC洗滌濾膜。技術(shù)人員會(huì)知道如何根據(jù)需要調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等，以適應(yīng)各種因素，例如探針長度等。一般地，選擇的嚴(yán)格條件比給定離子強(qiáng)度pH下特定序列的理論熔點(diǎn)(Tm)低5-10。C。Tm是在平衡時(shí)(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)與靶互補(bǔ)的探針有50%與靶序列雜交的溫度(因?yàn)榘行蛄羞^量，在Tm下，達(dá)到平衡時(shí)50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件是這樣的條件，其中在pH7.0-8.3，鹽濃度低于大約1.0M鈉離子，典型地為0.01-1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，溫度對于短探針(例如10-50個(gè)核苷酸)至少為大約30°C,對于長探針(例如大于50個(gè)核苷酸)至少為大約60。C。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如曱酰胺獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用較低嚴(yán)格度的雜交條件，例如本領(lǐng)域已知可以使用中等或低嚴(yán)格度的條件。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格度的其他細(xì)節(jié)參見Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiologyWileyInterscsencePublishers(1995)。如這里定義的，CRACM核酸可以是單鏈或雙鏈(如寫明的)，或者同時(shí)含有單鏈或雙鏈序列組分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，單鏈的描述也定義了另外一條鏈的序列，因此本文描述的序列也包括序列的互補(bǔ)鏈。核酸可以是DNA,基因組和cDNA，RNA或雜合體，其中核酸包含脫氧核糖核酸和核糖核酸的任意組合，和堿基的任意組合，包括尿嘧啶、腺噪呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等。如本文所使用的，術(shù)語"核苦"包括核苷酸和核香，以及核苦酸類似物和修飾的核苷，例如氨基修飾的核苷。此外，"核苷"包括非天然存在的模擬結(jié)構(gòu)。因此，例如，肽核酸的每個(gè)單元一一其分別含有堿基一一在這里被稱作核苷。如本文定義的，CRACM核酸是重組核酸。在本文中，術(shù)語"重組核酸"是指一般通過用聚合酶和內(nèi)切酶的核酸操作最初在體外形成的、通常處于非自然形式的核酸。因此，出于本發(fā)明的目的，線性形式的分離核酸或者理解，一旦制成重組核酸并將其重新引入到宿主細(xì)胞或生物體中，它將進(jìn)行非重組的復(fù)制，即利用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制而非體外操作；然而，這些核酸一旦被重組產(chǎn)生，盡管隨后是非重組復(fù)制的，但出于本發(fā)明的目的，它們?nèi)匀槐豢醋魇侵亟M的。CRACM核酸分子的同源物和等位基因包含在該定義中。CRACM序列可以和存》丈于或者可以在公共數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)或其他私人序列數(shù)據(jù)庫中獲得的其他已知序列進(jìn)行比較和比對。分子的特定區(qū)域內(nèi)或者跨全長序列的序列同一性(氨基酸水平或核苦酸水平)可以通過序列比對用計(jì)算機(jī)軟件程序，例如ALIGN、DNAstar、BLAST、BLAST2和INHERIT確定，它們采用各種算法測量同源性，如前文所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如這里所定義的CRACM核酸具有廣泛的應(yīng)用，包括診斷應(yīng)用，其4全測天然存在的CRACM核酸，和篩選應(yīng)用，例如可以產(chǎn)生包含針對CRACM核酸序列之核酸探針的生物芯片。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CRACM核酸序列是較大基因的cDNA片段，也16就是說，它是核酸區(qū)段(segment)。在此語境中的"基因"包括編碼區(qū)、非編碼區(qū)和編碼與非編碼區(qū)的混合物。因此，正如本領(lǐng)域人員會(huì)理解的，利用本文提供的序列，使用本領(lǐng)域熟知的用于克隆較長序列或全長序列的技術(shù)(見前文的Maniatis等人和Ausubel等人，本文明確引用其內(nèi)容作為參考)可以獲得CRACM基因的其他序列。一旦如上文所述鑒定了CRACM核酸，便可將其克隆，并且如果需要，重組其組成部分以形成的完整的CRACM基因。一旦將重組CRACM核酸從其自然來源分離，例如包含在質(zhì)?；蚱渌d體中，或者從中被切離而成為線性核酸片段，其即可進(jìn)一步用作探針，用于從其他多細(xì)胞真核生物體鑒定和分離其他的CRACM核酸，例如其他的編碼區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將如上文所述的編碼CRACM多肽的CRACM核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入到可復(fù)制栽體中用于克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。有多種載體可公共獲得。載體可以采取，例如，質(zhì)粒、粘粒、病毒粒子或噬菌體的形式。可以通過多種程序?qū)⒑线m的核酸序列插入到載體中。一般地，用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入到合適的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)中。載體組件一般包括但不僅限于下列中的一個(gè)或多個(gè)信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。含有一個(gè)或多個(gè)這些組件的合適載體的構(gòu)建利用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。還提供了包含這種載體的宿主細(xì)胞。例如，宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、COS細(xì)胞、從人骨髓分離的細(xì)胞、人脾或腎細(xì)胞、從人心臟組織分離的細(xì)胞、人胰腺細(xì)胞、以及人白細(xì)胞和單核細(xì)胞。更具體的宿主細(xì)胞實(shí)例包括用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚胎腎細(xì)胞系(經(jīng)亞克隆用于懸浮培養(yǎng)生長的293或293細(xì)胞，Graham等人，JGenVirol3659(1977));中國倉鼠卵巢細(xì)胞ADHFR(CHO，Urlaub和Chasm,ProcNatlAcadSciUSA,77:4216(1980》，人胰腺P-細(xì)胞，小鼠滋養(yǎng)細(xì)胞(TM4，Mather,BiolReprod.,23:243-251(1980))，人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75)，人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065)和小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞(MMT060562,ATCCCCL51)。合適宿主細(xì)胞的選擇被認(rèn)為是本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用HEK-293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。進(jìn)一步提供了一種用于產(chǎn)生CRACM多肽的方法，包括在適合表達(dá)CRACM多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，和從細(xì)胞培養(yǎng)物回收CRACM多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用表達(dá)和克隆載體，所述載體通常包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子為組成型或誘導(dǎo)型，與CRACM編碼核酸序列可操作連接以指導(dǎo)mRNA合成。被各種可能的宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子是眾所周知的。CRACMDNA編碼載體在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄優(yōu)選地被誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制，例如從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子，以及從熱激蛋白啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子。可用于本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括hsp70啟動(dòng)子，在單元或雙元系統(tǒng)中使用并受熱激誘導(dǎo)；金屬硫蛋白啟動(dòng)子，受銅或鎘誘導(dǎo)(Bonneton等人，F(xiàn)EBSLett1996380(1-2)33-38),果蠅視蛋白啟動(dòng)子，受果蠅類視黃醇誘導(dǎo)(Picking等人，ExperimentalEyeResearch199765(5)717-27),和四環(huán)素誘導(dǎo)的完全CMV啟動(dòng)子。在提到的所有啟動(dòng)子中，四環(huán)素誘導(dǎo)的完全CMV啟動(dòng)子是最優(yōu)選的。組成型誘導(dǎo)啟動(dòng)子的實(shí)例包括GAL4增強(qiáng)子捕獲系(GAL4enhancertraplines),其中表達(dá)受到特異啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的控制，或者受局部位置效應(yīng)的控制；和來源于大腸桿菌的反式激活響應(yīng)啟動(dòng)子，其可以是組成型或誘導(dǎo)型，取決于其操作連接的啟動(dòng)子的類型。編碼CRACM的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄可以通過將增強(qiáng)子序列插入到載體中加以增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常為10-300bp，其作用于啟動(dòng)子，提高其轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在已知許多來自哺乳動(dòng)物基因的增強(qiáng)子序列(球蛋白、彈性蛋白、白蛋白、cx-胎蛋白和胰島素)。然而，典型地，使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(lateside)(bp100-270)的SV40增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以被剪接到載體CRACM編碼序列的5'或3'—側(cè)的位置上，但是優(yōu)選地位于啟動(dòng)子的5'—側(cè)的位置。CRACM的調(diào)節(jié)本發(fā)明的方法利用CRACM多肽或編碼CRACM多肽的核酸來鑒定與CRACM結(jié)合、調(diào)節(jié)CRAC離子通道的活性、或者改變細(xì)胞中CRACM的表達(dá)的候選生物活性劑。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面提供了用于篩選能夠調(diào)節(jié)CRACM多肽的離子通道活性的候選生物活性劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供表達(dá)CRACM多肽的細(xì)胞的步驟。使該細(xì)胞與候選生物活性劑接觸，并在細(xì)胞與候選生物活性劑的接觸之前和之后確定CRACM多肽的離子通道活性。CRACM多肽的離子通道活性改變指示候選生物活性劑能夠調(diào)節(jié)CRACM多肽的活性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了用于篩選能夠與CRACM結(jié)合的候選生物活性劑的方法。在用于結(jié)合測定的優(yōu)選實(shí)施方案中，CRACM或候選生物活性劑用例如熒光、化學(xué)發(fā)光、化學(xué)劑或放射性信號標(biāo)記，以提供檢測候選生物活性劑與CRACM結(jié)合的手段。標(biāo)記也可以是酶，例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶，其在提供合適的底物時(shí)產(chǎn)生能夠檢測的產(chǎn)物?；蛘?，標(biāo)記可以是標(biāo)記的化合物或小分子，例如酶抑制劑，其結(jié)合酶但不被酶催化或改變。標(biāo)記還可以是模塊(moiety)或化合物，例如附加表位或特異結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白的生物素。對于生物素實(shí)例，鏈霉抗生物素蛋白被如上所述地標(biāo)記，借此提供已結(jié)合的CRACM的可檢測信號。如本領(lǐng)域已知的，在分析之前將未結(jié)合的標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白除去。或者，可以將CRACM固定或者共價(jià)附接于表面并使其與標(biāo)記的候選生物活性劑接觸。或者，可以將候選生物活性劑文庫固定或共價(jià)附接在生物芯片上并使之與標(biāo)記的CRACM接觸。其他可用的程序利用生物芯片并且在本領(lǐng)域是眾所周知的。如本文所使用的，術(shù)語"候選生物活性劑"是指任何與CRACM結(jié)合、調(diào)節(jié)CRACM活性或者改變CRACM在細(xì)胞中的表達(dá)的分子。如本文所述，該分子可以是寡肽、有機(jī)小分子、多糖、多核苷酸或多價(jià)陽離子等。一般地，以不同的試劑濃度對多個(gè)測定混合物平行進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得對不同濃度的差異響應(yīng)。典型地，這些濃度中的一個(gè)用作陰性對照，即零濃度或低于檢測水平。候選試劑包括各種化學(xué)類型，但通常它們是多價(jià)陽離子或有機(jī)分子，或者分子量大于100且小于大約2,500道爾頓(D)的有機(jī)小化合物。優(yōu)選的小分子小于2000或者小于1500或者小于1000或者小于500D。候選試劑包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用必需的官能團(tuán)，特別是氫鍵合，并且典型地包含至少一個(gè)胺、羰基、羥基或羧基基團(tuán)，優(yōu)選地至少兩個(gè)官能化學(xué)基團(tuán)。候選試劑經(jīng)常含有環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或多芳香結(jié)構(gòu)，其被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代。候選試劑還可在生物分子中發(fā)現(xiàn)，這些生物分子包括肽、糖類、脂肪酸、類固醇、噪呤、嘧啶，它們的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。特別優(yōu)選的是肽。候選試劑可從廣泛的來源獲得，包括合成或天然化合物文庫。例如，有大量手段可用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子，包括表達(dá)隨機(jī)化寡核苷酸?；蛘撸梢垣@得或者容易地產(chǎn)生植物或動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物可以通過常規(guī)的化學(xué)、物理或生物化學(xué)方法容易地進(jìn)行修飾。可以對已知的藥理試劑進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，例如酰基化、烷基化(alkylation)、酯化、酰胺化(amidification),以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。候選試劑可以是已知與離子通道蛋白結(jié)合、調(diào)節(jié)離子通道蛋白的活性、或者改變離子通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的生物活性劑。候選試劑也可以是先前未知的與離子通道蛋白結(jié)合、調(diào)節(jié)離子通道蛋白的活性、或者改變離子通道蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的生物活性劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，候選生物活性劑是蛋白質(zhì)。在這里，"蛋白質(zhì)"是指至少兩個(gè)共價(jià)連接的氨基酸，其包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽或肽。蛋白質(zhì)可以由天然存在的氨基酸和肽鍵，或者合成的擬肽(peptidomimetic)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。因此，本文使用的"氨基酸"或"肽殘基"是指天然存在的和合成的氨基酸。例如，為本發(fā)明的目的，瓜氨酸和正亮氨酸(noreleucine)也被看作氨基酸。"氨基酸"還包括亞氨基酸殘基，例如脯氨酸和羥脯氨酸。側(cè)鏈可以處于(R)或(S)構(gòu)型。在優(yōu)選實(shí)施方案中，氨基酸處于(S)或者L構(gòu)型。如果使用非天然存在的側(cè)鏈，則可以使用非氨基酸取代基，例如用于防止或延遲體內(nèi)降解。在優(yōu)選實(shí)施方案中，候選生物活性劑是天然存在的蛋白質(zhì)或天然存在的蛋白質(zhì)的片段。因此，可以使用例如含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物，或者隨機(jī)或定向消化的蛋白細(xì)胞提取物。這樣，可以制備多細(xì)胞真核生物蛋白質(zhì)文庫用于本發(fā)明方法中的篩選。本實(shí)施例中特別優(yōu)選的是多細(xì)胞真核生物蛋白質(zhì)文庫和哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)文庫，其中后者是優(yōu)選的，并且人蛋白質(zhì)是特別優(yōu)選的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，候選生物活性劑是具有大約5個(gè)-大約30個(gè)氨基酸的肽，優(yōu)選地具有大約5個(gè)-大約20個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選地具有大約7個(gè)-大約15個(gè)氨基酸。肽可以是如上文提出的天然存在蛋白質(zhì)的消化物，隨機(jī)肽，或者"偏好性，，隨機(jī)肽。在這里，"隨機(jī)化"或其語法等價(jià)物是指每個(gè)核酸和肽各自基本上由隨機(jī)的核苷酸和氨基酸構(gòu)成。因?yàn)椋@些隨機(jī)肽(或核酸，下文討論)一般是化學(xué)合成的，它們可以在任何位置納入任意核苷酸或氨基酸?？梢栽O(shè)計(jì)該合成過程，以產(chǎn)生隨機(jī)化的蛋白質(zhì)或核酸，從而允許形成在整個(gè)序列長度中可能有的全部或者大多數(shù)組合，因此形成由隨機(jī)化的候選生物活性蛋白劑組成的文庫。在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫是完全隨機(jī)化的，沒有任何序列偏好性或者在任何位置均是恒定的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，文庫是偏好性(biased)的。就是說，序列中的一些位置或者保持恒定，或者從有限數(shù)目的可能性中選擇。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸或氨基酸殘基在限定的類型內(nèi)隨機(jī)化，例如疏水氨基酸、親水殘基、空間偏好性(小或者大)殘基，傾向于形成核酸結(jié)合區(qū)的殘基，形成用于交聯(lián)SH-3結(jié)構(gòu)域之脯氨酸的半胱氨酸，用于磷酸化位點(diǎn)的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或組氨酸等，或者。票呤等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，候選生物活性劑是核酸。如上文一般針對蛋白質(zhì)所述的，核酸候選生物活性劑可以是天然存在的核酸、隨機(jī)核酸或"偏好性"隨機(jī)核酸。例如，可以按照上文關(guān)于蛋白質(zhì)所描述的方式使用原核或真核基因組的消化物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，候選生物活性劑是有機(jī)化學(xué)模塊，其中的許多在文獻(xiàn)中可以獲得。CRACM表達(dá)的調(diào)節(jié)在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義RNA和DNA可以用作體內(nèi)阻斷某些CRACM基因表達(dá)的治療劑。已經(jīng)顯示，短反義寡核苷酸可以被導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制劑的作用，盡管由于細(xì)胞膜對其的攝入有限使其細(xì)胞內(nèi)濃度很低(Zamecnik等人(1986)，ProcNatlAcadSciUSA834143-4146)。反義寡核苦酸可以被修飾以提高其攝入，例如通過用不帶電基團(tuán)替換其帶負(fù)電的磷酸二酯基團(tuán)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，CRACM反義RNA和DNA可用于防止CRACM基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，抑制CRACMmRNA翻譯成蛋白質(zhì)，和阻斷已經(jīng)存在的CRACM蛋白質(zhì)的活性。CRACM基因的下調(diào)或者CRACM蛋白質(zhì)活性的抑制可降低脊推動(dòng)物21體內(nèi)的免疫響應(yīng)。生物活性劑，例如本文描述的生物活性劑，可用于治療炎癥疾病，與疾病或病癥相關(guān)的狀況例如自身免疫性疾病，或者移植物抗宿主病，或者其他相關(guān)自身免疫性疾病，其中免疫響應(yīng)的降低或減少可導(dǎo)致脊推動(dòng)物的狀況的改善(即與疾病或病癥相關(guān)的狀況被預(yù)防、消除或減輕)。生物活性劑還可以用于降低過敏反應(yīng)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了對調(diào)節(jié)CRACM在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平的候選生物活性劑的篩選?？梢阅芡耆种萍?xì)胞內(nèi)CRACM的表達(dá)水平，從而改變細(xì)胞表型的候選生物活性劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以使用能提高CRACM在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從而改變細(xì)胞表型的候選試劑。這些候選試劑的實(shí)例包括反義cDNA和DNA,調(diào)控性結(jié)合蛋白和/或核酸，以及這里描述的可調(diào)節(jié)CRACM編碼核酸轉(zhuǎn)錄或翻譯的任何其他候選生物活性劑。CRAC通道陽離子通透性的調(diào)節(jié)另一個(gè)實(shí)施方案提供了篩選可以調(diào)節(jié)CRAC通道Ca^通透性的候選生物活性劑的方法。CRAC通道的Ca^通透性的調(diào)節(jié)可以通過例如在全細(xì)胞膜片箝測定(cellpatchclampassay)或單通道膜膜片箝測定(single-channelmembranepatchassay)中在存在和不存在候選生物活性劑的條件下測量內(nèi)向電流和外向電流加以確定。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，對單價(jià)陽離子活性的調(diào)節(jié)進(jìn)行監(jiān)視，其作為單價(jià)陽離子電流和/或含CRAC通道細(xì)胞的膜電位的函數(shù)。例如使用膜電位敏感探針檢測膜電位的調(diào)節(jié)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，膜電位敏感探針是熒光探針，例如雙-(l，3-二丁基巴比妥酸)三次曱基OXONOL(DiBAC4(3》(HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals9thedMolecularProbes,本文引用其內(nèi)容作為參考)。使用焚光膜電位敏感探針可以通過監(jiān)測焚光的變化來快速檢測膜電位的改變，熒光的監(jiān)測使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀和熒光分光光度計(jì)，包括使用利用熒光才全觀'J的高通量篩選方法(Alvarez-Barrientos等人,"ApplicationsofFlowCytometrytoClinicalMicrobiology",ClinicalMicrobiologyReviews,13(2)167-195,(2000》。候選試劑對CRAC通道陽離子通透性的調(diào)節(jié)可以通過使表達(dá)CRACM的細(xì)胞與二價(jià)陽離子指示劑接觸來測定，其中該指示劑與陽離子反應(yīng)產(chǎn)生信號。二價(jià)陽離子的胞內(nèi)水平通過檢測在存在和不存在候選生物活性劑的22條件下的指示劑信號加以測量。優(yōu)選的陽離子是€&+2、Ba+2、81>+2和^111+2。優(yōu)選的陽離子是Ca2、盡管也可以使用Mi產(chǎn)并通過其淬滅fura-2熒光的能力進(jìn)行檢測。另一個(gè)實(shí)施方式提供了比較在存在和不存在候選生物活性劑的條件下表達(dá)CRAC和CRACM的細(xì)胞與不表達(dá)CRACM的細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)二價(jià)陽離子的水平。細(xì)胞內(nèi)Ca"水平可以用Ca"特異的指示劑加以檢觀'J。Ca"特異的指示劑包括flira-2,indo-l，rhod-2，fura-4F，fura-5F，fbra-6F和fura-FF,fluo國3，fluo-4，OREGONGREEN488BAPTA，CALCIUMGREEN，X-rhod國l和fbra-red(HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,9thedMolecularProbes)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，同時(shí)測量細(xì)胞內(nèi)Ca"或其他二價(jià)陽離子的水平以及膜電位的改變。在該實(shí)施方案中，使用Ca"特異的指示劑檢測Ca"的水平，使用膜電位敏感探針檢測膜電位的變化。選擇Ca"指示劑和膜電位敏感探針使得指示劑和探針的信號能夠被同時(shí)檢測。例如，指示劑和探針均具有熒光信號，但是每種指示劑的激發(fā)和/或發(fā)射光譜是特異的，從而使來自每種指示劑的信號能夠同時(shí)被;險(xiǎn)測。CRAC通道還可以容許單價(jià)離子(例如Na+)通透，因此，可以利用單價(jià)離子測量與CRACM相互作用的試劑對CRAC通道活性的調(diào)節(jié)。如這里使用的，單價(jià)陽離子指示劑是容易穿透細(xì)胞膜或者適于以其它方式轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)(例如通過脂質(zhì)體等)的分子，并且一旦該分子進(jìn)入細(xì)胞就會(huì)顯示熒光信號或者其他可檢測信號，在與單價(jià)陽離子接觸時(shí)該信號被增強(qiáng)或者淬滅?？捎糜诒景l(fā)明的單價(jià)陽離子指示劑的實(shí)例在下列文獻(xiàn)中提出，Haugland，RPHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals她edMolecularProbes,IncEugene,OR,(2001)，本文？1用其全部內(nèi)容作為參考。CRAC通道必須被細(xì)胞內(nèi)鈣池的耗盡所激活。這可以借助如下的物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，例如釣離子載體，任何產(chǎn)生肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)的受體激動(dòng)劑，合適的Ca^螯合劑例如BAPTA,Ca^泵抑制劑毒胡蘿卜素或任何其他SERCA泵抑制劑(例如毒胡蘿卜素)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，CRAC通道被鈣離子載體激活。鉀離子載體是一種小疏水性分子，其溶解于脂雙層膜內(nèi)，增加對4丐的通透性。4丐離子載體的實(shí)例包括伊屋諾霉素(ionomycin),卡西霉素(calcimycin)AM18入和4-溴卡西霉素A23187(Sigma-Aldrich目錄2004/2005，本文引用其內(nèi)容作為參考)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，CRAC通道的離子通透性在完整細(xì)胞中測量，優(yōu)選地在HEK-293細(xì)胞內(nèi)，其中所述細(xì)胞用包含CRACM編碼核酸和與之可操作連接的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)化。啟動(dòng)子誘導(dǎo)之后，即產(chǎn)生CRACM多肽。在誘導(dǎo)之前測量細(xì)胞內(nèi)離子的內(nèi)源水平，然后與誘導(dǎo)之后測量的細(xì)胞內(nèi)離子水平進(jìn)行比較。CRACM多肽的抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體，其特異結(jié)合CRACM多肽獨(dú)特表位，例如蛋白的獨(dú)特表位?？梢詫@些抗體進(jìn)行測定，不但測定其與CRACM的結(jié)合，還測定其調(diào)節(jié)CRAC通道之CRACM調(diào)節(jié)物的能力?？?CRACM抗體可以包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是技術(shù)人員已知的。多克隆抗體可以在哺乳動(dòng)物中激發(fā)產(chǎn)生，例如通過一次或多次注射免疫劑和(視需要)佐劑。典型地，免疫劑和/或佐劑通過多次皮下或腹腔注射注入哺乳動(dòng)物體內(nèi)。免疫劑可以包括CRACM多肽或其融合蛋白?？梢詫⒚庖邉┡c已知在被免疫哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有免疫原性的蛋白質(zhì)綴合。這類免疫原性蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不僅限于，鑰孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白、和大豆胰蛋白酶抑制劑?？捎玫淖魟?shí)例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰類脂A、合成海藻糖柯立諾麥克酸酯(synthetictrehalosedicorynomycolate))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員無需過多的實(shí)驗(yàn)即可以選擇免疫方案。抗-CRACM多肽抗體可以進(jìn)一步包括單克隆抗體。這些單克隆抗體除了與CRACM多肽結(jié)合之外，還可以被鑒定為調(diào)節(jié)CRACM通道單價(jià)陽離子通透性的生物活性候選試劑。單克隆抗體可以用雜交瘤的方法加以制備，例如在Kohler和MilsteinNature256:495(1975)中所述。在雜交瘤方法中，典型地，用免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其他合適的宿主動(dòng)物，引起產(chǎn)生或者能夠產(chǎn)生特異結(jié)合該免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)月包。免疫劑典型地包含CRACM多肽或其融合蛋白。一般地，如果期望使用人源細(xì)胞，則使用外周血淋巴細(xì)胞("PBL")，如果期望使用非人類哺乳動(dòng)物源細(xì)胞，則使用脾細(xì)胞、腎細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。隨后用合適的融合劑，例如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與永生細(xì)胞系融合從而形成雜交瘤細(xì)胞[Goding,MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)pp59-103]。永生細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是源自嚙齒動(dòng)物、牛和人的骨髓瘤細(xì)胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可以在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基優(yōu)選地含有一種或多種可抑制未融合的永生細(xì)胞的生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤培養(yǎng)基中典型地包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶("HAT培養(yǎng)基")，這些底物可阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長。優(yōu)選的永生細(xì)胞系是能高效融合，支持所選的抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定高表達(dá)抗體，并且對培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞系。更優(yōu)選的永生細(xì)胞系是鼠的骨髓瘤細(xì)胞系，其能夠從例如SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，California和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Maryland)獲得。人骨髓瘤和小鼠-人異源異源骨髓瘤細(xì)胞系也有報(bào)道用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor,JImmunol,1333001(1984)，Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekkerInc，NewYork,(1987)pp51-63]。然后可以對培養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基進(jìn)行測定，看是否存在定向針對CRACM多肽的單克隆抗體。優(yōu)選地，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或者通過體外結(jié)合測定，例如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)加以確定。這些技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和性可以通過例如Munson和Pollard,AnalBiochem,107:220(1980)的Scatchard分析加以確定。鑒定出期望的雜交瘤細(xì)胞之后，可以對克隆通過有限稀釋程序進(jìn)行亞克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法加以培養(yǎng)[Goding，上文]。用于本目的的合適培養(yǎng)基包括例如Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基和RPM1-1640培養(yǎng)基?；蛘撸s交瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)生長成為哺乳動(dòng)物的腹水。由亞克隆分泌的單克隆抗體可以通過常規(guī)的免疫球蛋白純化程序從培養(yǎng)基或腹水液中分離或純化，例如蛋白A-Sepharose、輕基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色i普。單克隆抗體還可以通過重組DNA方法制備，如美國專利No4,816,567中公開的。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA可以容易地用常規(guī)程序(例如使用能夠特異結(jié)合鼠抗體重鏈和輕鏈編碼基因的寡核苷酸探針)進(jìn)行分離和測序。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞是這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，即可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，例如原本不會(huì)產(chǎn)生免疫球蛋白的猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的合成。DNA也可以被修飾，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列取代同源鼠序歹'J[美國專利第4,816,567號,Morrison等，見前文]或者通過將非免疫5求蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價(jià)連接于免疫球蛋白編碼序列。這種非免疫球蛋白多肽可以取代本發(fā)明抗體的恒定域，或者可以取代本發(fā)明抗體中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域，從而產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體?？?CRACM多肽抗體可以進(jìn)一步包括單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，一種方法涉及重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)過修飾的重鏈。重鏈一般在Fc區(qū)的任意位點(diǎn)被截?cái)?，從而阻止重鏈相互交?lián)?；蛘?，有關(guān)的半胱氨酸殘基被另一種氨基酸殘基取代或者被刪除，從而阻止交聯(lián)。體外方法也適用于制備單價(jià)抗體?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)消化抗體以產(chǎn)生其片段，尤其是Fab片段?？?CRACM多肽抗體可以進(jìn)一步包括人源化抗體或人抗體。非人類(例如鼠)抗體的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv，F(xiàn)ab,Fab',F(ab')2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，其含有最少的源自于非人類免疫球蛋白的序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中接受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被取代為具有期望特異親和性和能力的、來自非人類物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人類殘基代替。人源化抗體還可以包括在受體抗體或引入的CDR或框架序列中均不存在的殘基。一般地，人源化抗體包括基本上全部的至少一個(gè)(或者典型地兩個(gè))可變域，其中CDR區(qū)的全部或基本上全部對應(yīng)于非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且FR區(qū)的全部或者基本上全部是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體優(yōu)選地還包括至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)[Jones等人Nature,321522-525(1986)，Riechmann等人，Nature,332323-329(1988)，和PrestasCurrOpStructBiol,2593-596(1992)]。使非人類抗體人源化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。一般地，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人類來源引入的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基通常被稱作"導(dǎo)入的"(imported)殘基，其通常取自"導(dǎo)入的"可變域。人源化可以基本上按照Winter及其合作者的方法實(shí)施[Jones等人，Nature,321:522-525(1986)，Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988),Verhoeyen等人，Science239:1534-1536(1988)],用嚙齒類動(dòng)物的CDR序列替代人抗體的相應(yīng)序列。因此，這類"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國專利No4,816,567)，其中遠(yuǎn)小于完整人類可變區(qū)的部分被來自非人類物種的相應(yīng)序列代替。在實(shí)踐中，人源化抗體典型地是如下的人類抗體，其中一些CDR殘基，可能還有一些FR殘基，被來自嚙齒類動(dòng)物抗體類似位點(diǎn)的殘基代替。人抗體還可以用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)加以產(chǎn)生，包括噬菌體展示庫[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol"227381(1991),Marks等人，JMol.Biol.222581(1991)]。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p77(1985)和Boerneretal，JImmunol147(1)86-95(1991))。類似地，人抗體可以通過將人免疫球蛋白座位引入到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中加以制備，其中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的內(nèi)源免疫球蛋白基因被部分或完全失活。在刺激(challenge)后，即可觀察到人抗體產(chǎn)生，其在所有方面均與在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗體非常相似，包括基因重排、組裝和抗體庫(repertoire)。這種方法在下列專利中有描述，例如美國專利第5，545，807、5,545,806、5,569,825、5,625，126、5，633,425、5,661，016號，以及在如下科學(xué)出版物中有描述，Marks等人，BioTechnology10,779-783(1992)，Lonberg等人，Nature368:856-859(1994)，Morrison,Nature368:812-13(1994);Fishwild等人，NatureBiotechnology14，845-51(1996),Neuberger，NatureBiotechnology14:826(1996)，Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。抗-CRACM多肽抗體可以進(jìn)一步包括異源偶聯(lián)抗體(heteroconjugateantibodies)。異源偶聯(lián)抗體包括兩個(gè)共價(jià)連接的抗體。例如，有人提出這些抗體使免疫系統(tǒng)靶向非期望的細(xì)胞[美國專利第4,676,980號],有人提出它們可用于治療HIV感染[WO91/00360,WO92/200373,EP03089]。本文考慮抗體可以用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法在體外加以制備，包括涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可以用二硫鍵交換反應(yīng)或者通過形成硫醚鍵構(gòu)建免疫毒素。用于本目的的合適試劑的實(shí)例包括亞氨基硫羥酸鹽或酯(iminothiolate)和曱基-4-巰基丁亞酰胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)，以及在例如美國專利No4,676,980/>開的那些。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗-CRACM多肽抗體具有多種用途。例如，抗-CRACM多肽抗體可以用于CRACM多肽的診斷測定，例如4企測其在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)。本領(lǐng)域已知的各種診斷測定技術(shù)均可采用，例如竟?fàn)幗Y(jié)合測定、直接或間接夾心測定和在同質(zhì)或異質(zhì)相中進(jìn)行的免疫沉淀測定[Zola,MonoclonalAntibodiesAManualofTechniques,CRCPress,Inc.(1987)pp147-158]。診斷測定中使用的抗體可以用可檢測模塊(detectablemoiety)進(jìn)行標(biāo)記?？刹牌鬁y才莫塊應(yīng)當(dāng)能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測的信號。例如，可檢測基團(tuán)可以是放射性同位素，例如SH,14C，32P,35S，或125I，熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，例如熒光素異硫氰酸酯、羅丹明或螢光素，或者酶，例如堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。任何本領(lǐng)域已知的用于使抗體與可檢測模塊偶聯(lián)的方法均可采用，包括在下列文獻(xiàn)中描述的，Hunter等人，Nature,144:945(1962),David等人，Biochemistry,13:1014(1974)，Pain等人，JImmunolMeth.，40:219(1981),和Nygren,J.HistochemandCytochem.30:407(1982)。進(jìn)一步，CRACM抗體可以用于本發(fā)明的方法中，以篩選其調(diào)節(jié)CRAC通道對單價(jià)陽離子的通透性的能力。CRAC通道與疾病大量的疾病，包括但不僅限于，免疫缺陷疾病、神經(jīng)疾病和心血管疾病，與CRAC通道的突變有關(guān)。例如，已經(jīng)報(bào)道了一種遺傳缺陷，其中在CRAC通道關(guān)鍵組分中發(fā)生的突變導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞機(jī)能失常和嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)(Partiseti等人，JBiolChem(1994)269:32327-35,Feske等人，Nature(2006)441:179-85)。在對這些疾病和其他CRAC相關(guān)疾病的研究、診斷和治療的一個(gè)強(qiáng)有力工具就是鑒定下述物質(zhì)的能力(l)在這些疾病狀態(tài)中CRAC活性背后的CRAC通道同系物，和(2)可調(diào)節(jié)這些CRAC通道的^式劑。下面的實(shí)施例用于舉例說明本發(fā)明的組合物和方法，但對要求保護(hù)的本發(fā)明沒有任何限制意義。實(shí)施例實(shí)施例1用于鑒定CRAC通道編碼基因的基因組篩選為了鑒定編碼CRAC通道或其他參與其調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的基因，在果蠅S2R+細(xì)胞中進(jìn)行了高通量全基因組RNA干擾(RNAi)篩選。通過用自動(dòng)熒光成像分析儀(FLIPR，MolecularDevices)在384孔微孔板內(nèi)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)[Ca2+]i測定，對~23，000個(gè)基因的敲低作用進(jìn)行了測試，其中對響應(yīng)于常用的SERCA抑制劑毒胡蘿卜素的[Ca2+]i變化進(jìn)行測量。將S2R+細(xì)胞分加到含dsRNA(0.25嗎/孔)的384孔板中，細(xì)胞處于10pi無血清Schneider培養(yǎng)基(Invitrogen)中，并溫育40min。40min后，用30fil含10%血清的Schneider培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，并溫育3天。第3天，向細(xì)胞加載溶于果蠅鹽水(Drosophilasaline)的Ca2+指示劑Fluo-4-AM，歷時(shí)lhr。洗滌細(xì)胞，并重新懸浮在含0.1mMEGTA的無Ca^果蠅鹽水中。首先對每個(gè)孔進(jìn)行成像以確定基線熒光，歷時(shí)lmin。然后用2pM毒胡蘿卜素刺激細(xì)胞，并用5min的時(shí)間測量由此所致的、因ER池耗空而發(fā)生的Ca"釋放。然后向緩沖液中補(bǔ)充2mMCaCl2，并再用5min時(shí)間記錄由此所致的鈞內(nèi)流。全部63塊板均含有針對幼'm7和的dsRNA的作為陽性對照，且含有針對G尸戶和i/w7的dsRNA的作為陰性對照。對整個(gè)文庫進(jìn)行一式二樣的篩選。為了計(jì)算每種不同dsRNA對Ca"內(nèi)流的抑制，將用陽性對照幼V^dsRNA所見的抑制設(shè)定為100,將用陰性對照所見的抑制設(shè)定為0。然后計(jì)算每個(gè)板上其余380個(gè)基因所見的相對于對照的百分比抑制。對于總共27個(gè)可重現(xiàn)地抑制釣內(nèi)流的基因，進(jìn)一步在第二次篩選中利用單細(xì)胞膜片箝測定進(jìn)行評估。以高度密封的全細(xì)月包i殳置(tight畫sealwhole-cellconfiguration),在21-25°C的溫度條件下進(jìn)行片-鉗實(shí)驗(yàn)。使用EPC-9(HEKA)獲取高分辨率的電流記錄值。持續(xù)時(shí)間50ms、范圍從-100到+100mV的電壓斜線上升(voltageramp)是利用0mV的保持電位(holdingpotential)、0.5Hz的頻率(rate)、100-300秒鐘的周期施加的。將所有的電壓對10mV的液體接界電位(liquidjunction29potential)進(jìn)行校正。電流以2.9kHz進(jìn)行濾波，并以100ps間隔使之?dāng)?shù)字化。確定電容電流，并在每次電壓斜線上升前進(jìn)行校正。在-80mV從各個(gè)斜線上升電流記錄中提取電流幅度，估計(jì)兩種電流的低分辨率時(shí)間發(fā)展(extractingthecurrentamplitudeat-80mVfromindividualrampcurrentrecordsassessedthelow-resolutiontemporaldevelopmentofbothcurrents)。經(jīng)過求平均的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)誤差用n次測定的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差給出(如果適用的話)。標(biāo)準(zhǔn)外部溶液如下(mM):120NaCl、2.8KC1、10CsCl、2MgCl2、10CaCl2、10HEPES、NaOH調(diào)節(jié)至pH72,300mOsm。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)部溶液如下(mM):120Cs-谷氨酸鹽、8NaCl、10CsBAPTA、4CaCl2、3MgCl2、IOHEPES、0.02IP3、用CsOH調(diào)節(jié)至pH72,300mOsm。對于一些實(shí)驗(yàn)，用10mMCsBAPTA將[Ca"]i緩沖為0。對于被動(dòng)耗減(passive-depletion)實(shí)驗(yàn)，在沒有IPs和鈣的存在下向內(nèi)部溶液添加CsBAPTA。在一些細(xì)胞中，用寬嘴玻璃吸管施加lO(iM依屋諾霉素3s。從第二次膜片箝篩選，鑒定了2種對于CRAC通道功能至關(guān)重要的新基因，即CRACMl(在果蠅中由0///S6F編碼，在人類中由FZJ"W6編碼)和CRACM2(在果蠅中由4r3編碼，在人類中無直向同源物)。圖1A和IB顯示了在第一次篩選中從對應(yīng)于這兩個(gè)基因的孔獲得的實(shí)時(shí)[Ca21成像數(shù)據(jù)。圖中顯示了由CRACMl和CRACM2dsRNA介導(dǎo)的4丐內(nèi)流抑制與陰性對照Rhol和陽性對照Ww/的比較。圖1C和ID分別顯示了肌醇1，4,5-三磷酸(IP3)-介導(dǎo)的CRAC電流發(fā)展的時(shí)間過程(用-80mV下的標(biāo)準(zhǔn)化電流幅度評估)和果蠅Kc細(xì)胞中的特征性I/V關(guān)系。未處理的對照野生型(wt)以及用模擬處理的細(xì)胞都響應(yīng)于IPr介導(dǎo)的釣池耗盡而激發(fā)出Icrac典型的內(nèi)向調(diào)整性Ca^電流，其也存在于果蠅中。與之相反，在用針對CRACMl和CRACM2的dsRNA處理的細(xì)胞中，CRAC電流基本上消失了。在一些針對CRACMl的實(shí)驗(yàn)中，我們還在膜片吸管中所含的20jxMIP3的上面胞外施加依屋諾霉素以保證鈣池完全耗盡，但這也未能誘導(dǎo)ICRAC(n=4,數(shù)據(jù)未顯示)。與上面描述的藉由IP3和依屋諾霉素進(jìn)行的主動(dòng)鈣池耗盡方案一樣，當(dāng)用Ca"螯合劑BAPTA誘導(dǎo),皮動(dòng)鉤池耗盡時(shí)，也沒有CRAC電流(圖IE和F)。因?yàn)榕cCRACM2不同，CRACMl在基因P丄J"466中具有人類直向同源物，所以我們決定對這一蛋白質(zhì)進(jìn)行表征，并想證實(shí)該基因的功能在物種間是保守的，并且參與鈣池操縱的Ca"內(nèi)流。為此，我們在人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)和人T細(xì)胞(Jurkat)中使用siRNA介導(dǎo)的人CRACM1沉默。選擇了兩條CRACM1特異性siRNA序列和一條對照亂序序列，并將之克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER.retro(Oligoengine)中。用噤呤霉素選擇siRNA感染細(xì)胞，并用于Ca"+成像和電生理分析。CRACM1信息的選擇性敲低通過半定量RT-PCR分析加以確認(rèn)(圖2A)。圖2B顯示了在HEK293細(xì)胞中由siRNA介導(dǎo)的、對響應(yīng)毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的4丐池耗盡的Ca"內(nèi)流的抑制。兩條CRACM1特異性siRNA序列在HEK293細(xì)胞中均顯示對響應(yīng)毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的4丐池耗盡的Ca"內(nèi)流具有60-70%的抑制(圖2B),而不影響4丐釋放瞬變。圖2D和2E顯示了從siRNA-處理的HEK293細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)IP3灌注獲得的膜片箝記錄，證實(shí)CRAC電流幾乎完全被抑制。在Jurkat細(xì)胞中，siRNA介導(dǎo)的Ca"信號抑制接近20%(圖2C)，不如HEK293細(xì)胞中顯著。然而，Jurkat細(xì)胞中的ICRAC可被這兩條siRNA序列有效降低(圖2F和2G)。實(shí)施例2:在細(xì)胞系中過表達(dá)CRACM1將全長人CRACM1與C端myc-His標(biāo)簽對框(inframe)克隆到pcDNA/4TO/myc-His質(zhì)粒(Invitrogen)中。將全長基因與C端myc-His標(biāo)簽一起重新擴(kuò)增，并亞克隆到MIGW綠色熒光蛋白(GFP)逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)，用于在不同細(xì)胞系中過表達(dá)。用表達(dá)CRACM1+GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HEK293、Jurkat和RBL-2H3纟田月包，并通過IP隨后用抗-myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western印跡來確認(rèn)蛋白的過表達(dá)(圖3A)。在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)CRACM1蛋白不影響毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的鉤內(nèi)流(數(shù)據(jù)未顯示)。類似地，在HEK293(圖3B)或Jurkat細(xì)胞(圖3C)也沒有檢測到CRAC電流幅度有高出對照水平的顯著增力口，僅在RBL細(xì)胞(圖3D)中有微弱的增加。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，CRACM1盡管是CRAC激活必需的，但是其自身不會(huì)產(chǎn)生顯著增大的CRAC電流。實(shí)施例3:CRACM1的定位CRACM1是一種跨膜蛋白，參與釣池操縱的Ca"內(nèi)流，我們想知道它是定位于ER(象STIM1那樣)還是細(xì)胞質(zhì)膜。為了解決這個(gè)問題，在其每一個(gè)末端分別對CRACM1加標(biāo)簽，并將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞。24小時(shí)后，免疫熒光共聚焦分析顯示在表達(dá)任一構(gòu)建體的完整細(xì)胞中都沒有染色，表明兩種標(biāo)簽均在細(xì)胞內(nèi)。將細(xì)胞通透化之后，兩種構(gòu)建體均可被熒光抗體清晰地檢測到，顯示主要是細(xì)胞質(zhì)膜的外周被染色(圖3E和3F)。這些數(shù)據(jù)與人們提出的CRACMl結(jié)構(gòu)(proposedstructure)吻合良好，該結(jié)構(gòu)含有4個(gè)預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)末端均朝向胞漿?？傊?，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，CRACM1對于經(jīng)由CRAC通道的4丐池操縱的Ca2+內(nèi)流至關(guān)重要。盡管CRACM1過表達(dá)不改變CRAC電流的大小，但是該蛋白的細(xì)胞質(zhì)膜定位和多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的存在均指示CRACM1在《丐池操縱的4丐內(nèi)流中發(fā)揮更直接的作用。根據(jù)我們的結(jié)果，但并非意圖將本發(fā)明限制于這些機(jī)制，可以預(yù)見到CRACM1的許多可能的功能。首先，CRACM1自身可以發(fā)揮CRAC通道的功能。在這個(gè)情境下，CRACM1過表達(dá)細(xì)胞中CRAC電流未改變可能是由于CRAC通道激活的上游限制因子(例如STIM1)造成的。其次，CRACM1可能是某種多聚體通道復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，在這種情況下，其他的亞基可能成為限制性因素并阻止CRACM1過表達(dá)產(chǎn)生大的CRAC電流。最后，CRACM1自身可能不是CRAC通道的必需分子組分，而是充當(dāng)細(xì)胞質(zhì)膜受體或停泊蛋白，可能是針對STIM1或其他最終導(dǎo)致CRAC通道激活和4丐池操縱的Ca"內(nèi)流的信號傳導(dǎo)機(jī)制中尚未鑒定的組分的細(xì)胞質(zhì)膜受體或停泊蛋白。實(shí)施例4:CRACM1與其自身結(jié)合形成CRAC通道復(fù)合體因?yàn)樵S多離子通道多聚化形成有功能的離子孔，我們通過在HEK293細(xì)胞中共過表達(dá)CRACM1蛋白的兩個(gè)帶不同標(biāo)簽的版本，并進(jìn)行交互的免疫共沉淀試驗(yàn)，隨后用相關(guān)抗標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡，來檢驗(yàn)CRACM1多聚化的傾向。圖5顯示了CRACM1的各個(gè)標(biāo)簽版本彼此免疫共沉淀，表明CRACM1自身確實(shí)可以多聚體化。因?yàn)镾TIM1在4丐池耗盡后移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì)膜，它可能與CRACM1相互作用。我們通過在HEK293細(xì)胞中共過表達(dá)帶不同標(biāo)簽的CRACM1和STIM1,并進(jìn)行交互的免疫共沉淀試驗(yàn)，隨后用相關(guān)抗標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫印跡，對這個(gè)觀點(diǎn)進(jìn)行了檢驗(yàn)。如圖5B所示，兩種蛋白免疫共沉淀，提示它們彼此結(jié)合。我們分析了CRACM1的一級序列，鑒定了兩個(gè)谷氨酸殘基，TM1中的E106和TM3中的E190,它們兩個(gè)對于CRACM1及其同源體CRACM2/CRACM3(Orai2/Orai3)以及在多個(gè)物種中均是高度保守的(見圖5C)。此外，連接TM1和TM2結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)含有數(shù)個(gè)帶負(fù)電的天冬氨酸殘基(DllO,D112和D114)，它們可以潛在地作為Ca2—結(jié)合位點(diǎn)。我們構(gòu)建了多個(gè)CRACM1突變體，其中對這些殘基進(jìn)行了修飾，以檢測它們在CRAC通道孔的形成和提供對Ca^的高選擇性中的作用。免疫共沉淀證實(shí)，這些突變體蛋白保留了多聚體化的能力(圖5D),并且共聚焦顯微鏡顯示它們正確靶向細(xì)胞質(zhì)膜(圖5E)。然后，我們在穩(wěn)定過表達(dá)STIM1的HEK293細(xì)胞中過表達(dá)這些突變體蛋白質(zhì)，并通過全細(xì)胞膜片箝記錄對它們進(jìn)行電生理分析，在全細(xì)胞膜片箝記錄中我們通過DV介導(dǎo)的Ca^池耗盡誘導(dǎo)CRAC電流。實(shí)施例5:CRACM1的跨膜結(jié)構(gòu)域1和3形成Ca^-選擇離子通道孔產(chǎn)生了CRACM的一個(gè)點(diǎn)突變體，其中TM1106位的谷氨酸殘基被變成谷氨酰胺殘基(E106Q)。當(dāng)被轉(zhuǎn)染進(jìn)入STIM1過表達(dá)的HEK293細(xì)胞內(nèi)時(shí)，該突變體在fura-2熒光測量中抑制毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的Ca^內(nèi)流(數(shù)據(jù)未顯示)，并且膜片箝記錄證實(shí)，該突變體不僅不能象wt-CRACMl那樣產(chǎn)生大的CRAC電流(圖6A和B),而且導(dǎo)致通常在STMI過表達(dá)細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中見到的小內(nèi)源CRAC電流(~0.5pA/pF)被完全抑制。甚至在暴露于無二價(jià)離子溶液時(shí)(此時(shí)在wt-CRACMl中可產(chǎn)生大的單價(jià)電流)，也不能產(chǎn)生較大的內(nèi)向電流(圖6A)。因?yàn)橥蛔凅w不影響CRACM1多聚體化的能力(圖5D)或者其向細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(圖5E),所以E106Q突變體發(fā)揮顯性負(fù)相(dominantnegative)蛋白的作用，其能夠形成正常的CRACM1復(fù)合體，甚至可以和內(nèi)源CRACM1共組裝，但是不能提供允許Ca"或Na+離子通透的孔。通過將谷氨酸變?yōu)樘於彼釟埢?E106D)產(chǎn)生電荷保守(charge-conserving)突變體。該突變體在HV介導(dǎo)的4丐池耗盡之后顯示出與wt-CRACMl相似地被激活的膜電流，但是平均而言電流較小(-8±1pA/pF,n=12對-30士6pA/pF,n二14,參考6A和C)。這些突變CRACM1通道的選擇性也與wt-CRACMl顯著不同，使典型的內(nèi)向整流性電流-電壓關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)橥庀蛘餍裕⑹蛊浞崔D(zhuǎn)電位從遠(yuǎn)正電壓向0mV移動(dòng)(參考圖6B和D)。顯著的外向電流流過CRAC通道，其發(fā)展與內(nèi)向電流的時(shí)間過程完全相同，并且可能由主要的細(xì)胞內(nèi)陽離子Cs+所攜載。一旦除去細(xì)胞外Ca2、該電流便會(huì)由于內(nèi)向電流大幅增加和外向電流的微小增加而反轉(zhuǎn)為內(nèi)向整流。應(yīng)當(dāng)注意，這些效應(yīng)是通過簡單地除去Ca"同時(shí)保持存在2mMMg2f獲得的，這種操作通常防止任何單價(jià)離子內(nèi)向或外向電流通過wt-CRACMl通道。一旦除去Ca^內(nèi)向電流大幅增加提示，在存在Ca"離子時(shí)，該通道仍然向內(nèi)傳導(dǎo)Ca^離子，并防止大幅的Na+流動(dòng)。我們通過如下的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推論，其中我們將細(xì)胞外Ca^保持在10mM,并用不能通透的丁￡八+替換細(xì)胞外Na+。這使內(nèi)向電流減少50°/。(圖6C和D),而殘余的內(nèi)向電流由Ca^離子攜載，外向電流由主要的細(xì)胞內(nèi)Cs+離子攜載。額外的離子取代實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該突變體的選擇性改變不僅限于單價(jià)陽離子，還影響B(tài)a^離子的相關(guān)通透性。圖6E和6F顯示了用Ba^等摩爾取代Ca"僅使內(nèi)向電流微小降低，這與wt-CRACMl通道形成顯著對比，在wt-CRACM1通道中，相同的離子取代使內(nèi)向電流減少90%。因此，E106D突變體與wt相比具有顯著提高的Ba"通透。因此，該E106殘基是使CRAC通道具有高Ca^選擇性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組元，并且明確證實(shí)，CRACM1確實(shí)是CRAC通道的孔形成亞單位。序列分析在TM3中顯示了另一個(gè)酸性且?guī)ж?fù)電荷的殘基(E190)，其在CRACM蛋白中同樣是高度保守的。我們構(gòu)建了突變體，其中我們用谷氨酰胺殘基代替該谷氨酸(E190Q突變體)。當(dāng)在表達(dá)STIM1的HEK293細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)該突變體在IPr誘導(dǎo)的鉤池耗盡后被正常激活并產(chǎn)生內(nèi)向電流，該電流主要由Ca"攜載，因?yàn)槌ゼ?xì)胞外Ca2+(同時(shí)保持2mMMg2+)使內(nèi)向電流減少大約70%(圖6G)。殘余的Na+電流比wt-CRACMl中大，提示對Ca"優(yōu)先于Na+的選擇性降低。然而，與E106D突變體明顯不同的是，內(nèi)向電流沒有增加。有趣的是，通過E190Q突變體的外向電流與E106D突變體相比更加明顯并且更有線性(圖6H),提示Cs+的單價(jià)外向通透在該突變體中被顯著提高。對E190Q突變體的Ba^通透性進(jìn)行了研究，該通透性在wt-CRACMl中非常低，但在E106D突變體中被顯著提高。用Ba"代替Ca2—導(dǎo)致內(nèi)向電流幾乎完全消失，在Ba"下僅剩余5%的內(nèi)向電流(圖6G)。因此E190Q突變體保持高的Ca"優(yōu)先于Ba"的選擇性，與wt-CRACMl相似。實(shí)施例6:CRACM1的第一細(xì)胞外環(huán)有助于孔選擇性在與關(guān)4定E106殘基毗鄰處，在CRACM1的第一細(xì)胞外環(huán)中存在3個(gè)緊密間隔的天冬氨酸殘基(D110/112/114),它們可能參與協(xié)調(diào)在通道外口的Ca"結(jié)合。通過將最保守的IIO和112位帶負(fù)電的天冬氨酸殘基變成丙氨酸(D110/112A突變)產(chǎn)生了雙突變體。將該突變體的主要細(xì)胞質(zhì)膜定位以及其多聚體化的潛力與wt-CRACMl相似(圖5D和E)。D110/112A突變體產(chǎn)生的CRAC電流與wt通道產(chǎn)生的電流以相似的時(shí)間過程激活(圖7A)。兩種構(gòu)建體在-80mV的內(nèi)向電流也非常相似，然而，突變體在+130mV顯示與wt通道不同且高得多的外向電流。wt和突變體構(gòu)建體的電流-電壓關(guān)系更加詳細(xì)地表現(xiàn)了這些特征(圖7C)。因此，在負(fù)電壓下，兩種構(gòu)建體顯示相似的內(nèi)向整流電流，而在比+80mV更正的電壓下，D110/112A突變體會(huì)通過顯著更大的外向電流。圖3A還證明，在用TEA+代替Na+而除去細(xì)胞外Na+并保持10mMCa^作為唯一的電荷載體時(shí)，wt和突變體通道的內(nèi)向電流大體上不受影響。這提示當(dāng)細(xì)胞外存在10mMCa"時(shí)，兩種構(gòu)建體保持Ca2+相對于Na+流入的高選4奪性。然而，因?yàn)閱蝺r(jià)陽離子的外流運(yùn)動(dòng)在D110/112A突變體中被提高，所以通過除去細(xì)胞外Ca"的離子替換實(shí)驗(yàn)測量低細(xì)胞外Ca"下的單價(jià)內(nèi)向電流。當(dāng)除去Ca2+,同時(shí)保持130mMNa+和2mMMg"時(shí)，wtCRAC電流被基本上消除(圖7B),證明剩余的Mg"完全阻止了單價(jià)Na+通透。對比地，D110/112A突變體對內(nèi)向電流的抑制沒有那么徹底，提示與wt中相比Ca2+的缺失允許更多的Na+通透。當(dāng)用TEA+代替細(xì)胞外Na+時(shí)，殘余的Na+內(nèi)向電流被完全阻止(圖7B)。其他的實(shí)驗(yàn)顯示，在向內(nèi)的方向上，D110/112A突變體還允許有限的K+離子通透，但是Cs+的通透可以忽略(圖7D)。因此，TM結(jié)構(gòu)域1和2之間的環(huán)中的天冬氨酸殘基對CRACM1通道的選擇性譜有貢獻(xiàn)，這種貢獻(xiàn)可能是通過協(xié)調(diào)Ca^與通道外口的結(jié)合，借此幫助區(qū)分Ca"離子和單價(jià)陽離子，但本發(fā)明不受這種機(jī)制的限制。根據(jù)上面的結(jié)果可以預(yù)期，D110/112A突變體調(diào)整二價(jià)離子與單價(jià)離子通透的相互作用，這表現(xiàn)為wtCRAC通道對細(xì)胞外Ca^的劑量響應(yīng)曲線，具有特征性的異常分?jǐn)?shù)行為(圖7F)。因此在完全沒有細(xì)胞外二價(jià)離子(標(biāo)稱無二價(jià)離子溶液+10mMEDTA)時(shí)，CRAC通道能發(fā)生顯著的Na+滲透。然而，將細(xì)胞僅暴露于標(biāo)稱無二價(jià)離子但無EDTA的溶液(無Ca2+，并且Mg估計(jì)為1iiM)或者添加10pMCa^時(shí)，即可實(shí)際上消除wt-CRACMl通道中的內(nèi)向電流(圖7E)。隨著Ca"增加到毫摩爾范圍，由于選擇性Ca"通透，CRAC電流再次增加。低Ca、農(nóng)度對Na+滲透的抑制效應(yīng)可以被Ca^與第一細(xì)胞外環(huán)內(nèi)的天冬氨酸殘基的結(jié)合所介導(dǎo)。事實(shí)上，即使在細(xì)胞外存在10■,1/Tr^。2+Fkfm1n/11OA由亦乂太nkA貧盆AAdn*、:右？企勞了廣RAri閨道的異常摩爾分?jǐn)?shù)行為(圖7F)。在更高的Ca"濃度下，電流行為再次與wt相似，成為Ca"選擇性。對突變體對于二價(jià)陽離子的選擇性進(jìn)行了測量。當(dāng)用等摩爾的Ba"或Sr"替換細(xì)胞外Ca"時(shí)，wt-CRACMl電流顯著低于Ca"攜載的電流，總計(jì)<10%(圖7G)。圖7H顯示，D110/112A突變體僅產(chǎn)生很少的Ba"或S,電流增加，表明該突變體大體保留了對二價(jià)陽離子的相對選擇性。圖7I中的柱狀圖總結(jié)了wt和D110/112ACRACM1通道中二價(jià)和單價(jià)陽離子攜載的內(nèi)向電流的相對大小，證明二價(jià)離子通透性相似，但特別是對Na+的通透性顯著提高。綜上所述，本研究的結(jié)果證明，CRACM1蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)形成多亞基離子通道復(fù)合體，在那里它們可以在Ca"池耗盡后被激活，可能是通過與STIMI相互作用而激活。CRACM1的通道孔對Ca^離子有高選擇性，這是由于在TM1和TM3中存在關(guān)鍵的谷氨酸殘基(E106和E190),以及在位于連接TM1和TM2的細(xì)胞外環(huán)內(nèi)的Ca^結(jié)合基序中存在天冬氨酸殘基(D110和D112)。這些關(guān)鍵殘基的任一的突變均會(huì)提高單價(jià)陽離子相對于Ca"的通透，從而改變CRAC通道選擇性，這提供了明確的證據(jù)證明CRACM1具有CRAC通道孔。3權(quán)利要求1.用于篩選能夠調(diào)節(jié)CRACM多肽活性的候選生物活性劑的方法，該方法包括a)提供細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)CRACM多肽，b)使該細(xì)胞與候選生物活性劑接觸，和c)測量CRACM多肽的表達(dá)或離子通道活性，其中與不存在所述候選生物活性劑時(shí)的該CRACM多肽的表達(dá)或離子通道活性相比，該CRACM多肽的表達(dá)或離子通道活性改變表明該候選生物活性劑能夠調(diào)節(jié)該CRACM多肽的活性。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述離子通道活性包括鈣池操縱的鈣內(nèi)流。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述CRACM多肽是CRACMl多肽。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述CRACM多肽是CRACM2多肽。5.用于篩選能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的二價(jià)陽離子通透性的候選生物活性劑的方法，該方法包4舌a)使表達(dá)CRACM的細(xì)胞與候選試劑接觸，和b)檢測候選試劑是否調(diào)節(jié)細(xì)胞的二價(jià)陽離子通透性。6.權(quán)利要求5的方法，其中與候選試劑的接觸增加細(xì)胞的二價(jià)陽離子通透性。7.權(quán)利要求5的方法，其中與候選試劑的接觸減少細(xì)胞的二價(jià)陽離子通透性。8.權(quán)利要求5的方法，其中二價(jià)陽離子選自由Ca+2、Ba+2、81"+2和1^11+2構(gòu)成的組。9.用于篩選能夠與CRACM多肽結(jié)合的生物活性劑的方法，包括a)提供重組細(xì)胞，其包含表達(dá)CRACM多肽的重組核酸，b)使重組細(xì)胞與候選試劑接觸，和c)檢測細(xì)胞Ca+2通透性的調(diào)節(jié)，其中Ca"通透性的調(diào)節(jié)表明候選生物活性劑能夠與CRACM多肽結(jié)合。10.權(quán)利要求l的方法，其中候選試劑增加Ca"通透性。11.權(quán)利要求ll的方法，其中候選試劑減少Ca+s通透性。12.權(quán)利要求9的方法，其中所述CRACM是CRACMl。13.權(quán)利要求9的方法，其中所述CRACM是CRACM2。14.用于篩選能夠與CRACM多肽結(jié)合的候選生物活性劑的方法，該方法包括a)使CRACM多肽與候選試劑接觸，和b)確定候選試劑與CRACM多肽的結(jié)合。15.權(quán)利要求14的方法，其中用兩種或多于兩種候選試劑的文庫與CRACM多肽接觸。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述CRACM多肽是CRACMl多肽。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述CRACM多肽是CRACM2多肽。18.用于抑制CRAC活性的方法，包括使至少一個(gè)細(xì)胞與抑制CRACM表達(dá)的試劑接觸。19.用于抑制CRAC活性的方法，包括使至少一個(gè)細(xì)胞與抑制CRACM多肽之CRAC活性的試劑接觸。20.權(quán)利要求18或19的方法，其中CRACM是CRACMl或CRACM2。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述試劑是反義CRACMl核酸。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述試劑是反義CRACM2核酸。23.權(quán)利要求20的方法，其中所述試劑是抗-CRACl抗體。24.權(quán)利要求20的方法，其中所述試劑是抗-CRAC2抗體。全文摘要本發(fā)明涉及鈣釋放活化的Ca+2(CRAC)通道(CRACM)，如CRACM1和CRACM2，用于鑒定能夠調(diào)節(jié)鈣池操縱的鈣內(nèi)流(storeopertatedcalciumentry)和CRAC通道活性的生物活性劑的用途。本發(fā)明還涉及編碼CRACM的重組核酸的用途。本發(fā)明的一個(gè)方面包括用于測定候選生物活性劑與CRACM多肽的結(jié)合，以及用于測定CRACM多肽影響CRAC通道通透性時(shí)CRACM多肽的調(diào)節(jié)的方法。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)編碼CRACM的核酸的細(xì)胞表達(dá)的方法和組合物。文檔編號G01N33/68GK101467046SQ200780021612公開日2009年6月24日申請日期2007年4月10日優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日發(fā)明者安德烈亞·弗萊格,莫妮卡·維格,萊因霍爾德·彭納,讓-皮埃爾·基內(nèi)特申請人:皇后醫(yī)學(xué)中心;貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心