專利名稱：增加谷胱甘肽的物質(zhì)的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
01本發(fā)明涉及篩選可成為神經(jīng)變性疾病，惡性腫瘤，感染病等
多種疾病治療藥的有效成分的、增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽量的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
已知若實(shí)驗(yàn)性地使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽減少，則引起神經(jīng) 變性(非專利文獻(xiàn)2)。即使在實(shí)際的疾病中，已知在神經(jīng)變性疾病(帕 金森病，阿爾茨海默病等)，惡性腫瘤，感染病等多種疾病中谷胱甘肽 減少，人們預(yù)想并希望如果有使谷胱甘肽增加的治療藥會(huì)非常有用(非 專利文獻(xiàn)3-6)。但是，現(xiàn)在并不存在這種治療藥。已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜中表達(dá)的EAAC1 (易刺激的氨基酸載體 -l，excitory amino acid carrier-l)是將谷氨酸攝入到細(xì)胞內(nèi)的蛋 白質(zhì)(谷氨酸輸送蛋白質(zhì))，然而已知其作為谷氨酸輸送蛋白質(zhì)的能力 低，其它蛋白質(zhì)(GLT-1，GLAST)作為谷氨酸輸送蛋白質(zhì)十分重要(非專 利文獻(xiàn)7-8)。然后，發(fā)現(xiàn)EAAC1不僅具有輸送谷氨酸還具有輸送包括 半胱氨酸在內(nèi)的其它氨基酸的能力(非專利文獻(xiàn)9-11)。
05而且，最近發(fā)現(xiàn)E A AC 1是用于維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽量所必需 的蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)12)。因此推想EAAC1具有輸送谷胱甘肽的構(gòu)成 氨基酸-谷氨酸和半胱氨酸的能力而對此有貢獻(xiàn)。通過與對照細(xì)胞的結(jié)果比較，將使細(xì)胞產(chǎn)生顯著低的 GTRAP3-18mRM表達(dá)量的待測物質(zhì)鑒定為目的物質(zhì)(使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘 肽增加的物質(zhì))。而且，通過寡核苷酸探針用放射性同位素(RI)法或非RI法標(biāo) 識(shí)，但優(yōu)選使用非RI法。作為非RI法，可以例舉熒光標(biāo)識(shí)法，生物 素標(biāo)識(shí)法，化學(xué)發(fā)光法等，但優(yōu)選使用熒光標(biāo)識(shí)法。作為焚光物質(zhì)， 可以適當(dāng)選擇可以和寡核苷酸的堿基部分結(jié)合的物質(zhì)來使用，可以使 用花青色素(例如Cy DyeTM系列的Cy3， Cy5等)，若丹明6G試劑，N-乙酰氧基-W-乙酰氨基芴(AAF)， AAIF(AAF的碘衍生物)等。而且，作 為標(biāo)識(shí)法，可以適當(dāng)選擇本領(lǐng)域公知的方法(例如隨機(jī)引物法，Nick 翻譯法，通過PCR進(jìn)行的DM擴(kuò)增，標(biāo)識(shí)/加尾法，體外轉(zhuǎn)錄法等)來 使用。例如，可以通過在HRF寡核普酸中導(dǎo)入官能團(tuán)(例如脂肪族伯氨 基，SH基等)，在這種官能團(tuán)上結(jié)合前述標(biāo)記，制成標(biāo)識(shí)化寡核苷酸 探針。使用的引物組可以基于公知的GTRAP3-18cDNA序列，采用市 售的軟件例如Oligo TM[National Bioscience Inc.(美國)制〗， GENETYX[軟件開發(fā)(林)(日本)制]等設(shè)計(jì)，經(jīng)合成'純化各個(gè)步驟制備。通過在HEK293細(xì)胞中瞬間導(dǎo)入GTRAP3-18的反義寡核苷酸， 可以使細(xì)胞內(nèi)的GTRAP3-18量減少(
圖1)。接著，通過 ThioGlo-l (Calbiochem公司)測定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽量。通過western 印跡法確認(rèn)了 GTRAP3-18量的增加。使用導(dǎo)入了有義寡核苷酸的細(xì)胞 作為對照組。另一方面， 一旦使甲基-環(huán)糊精(Me卩CD)作用于HEK293 細(xì)胞，則通過western印跡法確i人了 GTRAP3-18量比對照組有所增加 (圖1)。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽量與對照組相比，顯著減少(圖2)。
391此結(jié)果顯示，通過使GTRAP3-18量增大，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽量減少。
40j根據(jù)以上結(jié)果，確認(rèn)了以細(xì)胞內(nèi)GTRAP3-18量的變化(或者 GTRAP3-18的功能變化)作為指標(biāo)，可以探尋可以使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽量 增加的物質(zhì)。
實(shí)施例2在小鼠的腦室中施用針對GTRAP3-18的siRNA(10 |i g/h) 。 1周 后，在海馬細(xì)胞中，GTRAP3-18量與施加對照(緩沖液)時(shí)相比，顯著減 少(圖3)。同樣，測定在小鼠腦室內(nèi)施用針對EAAC1的siRM時(shí)的海馬 細(xì)胞中的EAAC1量，確i/v了 EAAC1量通過該siRNA顯著減少(圖4)。
421然后，這樣一來，測定使GTRAP3-18量和EAAC1量減少的 海馬細(xì)胞中谷胱甘肽的量。即，將從海馬組織中獲得的提取液與含有 EDTA(乙二胺四乙酸)，GSH還原酶，DTNB(5，5， -二碌"代雙-硝基苯曱 酸)，NADPH的反應(yīng)溶液混合后，測定412nm的吸光度。用GSH標(biāo)準(zhǔn)溶 液的吸光度求出濃度后，用組織重量補(bǔ)正。
[431其結(jié)果示于圖5,在使EAAC1量減少的小鼠海馬細(xì)胞中谷胱 甘肽量比對照中少，在使GTRAP3-18量減少的小鼠海馬細(xì)胞中谷胱甘
肽量相對于對照顯著增加。
[44j另一方面，若在小鼠腦室中施用甲基-p-環(huán)糊精(MePCD)， 則海馬細(xì)胞中的GTRAP3-18量比對照組有所增加(圖6)，而此時(shí)，海 馬細(xì)胞中谷胱甘肽量相較于對照組顯著減少(圖7)。
根據(jù)以上結(jié)果，確認(rèn)了，即使以動(dòng)物個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞作為對象，通 過以對于GTRAP3-18表達(dá)的效果作為指標(biāo)，也可以篩選使谷胱甘肽量增 加的物質(zhì)。
權(quán)利要求
1、一種篩選使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽量增加的物質(zhì)的方法，其特征在于使待測物質(zhì)與表達(dá)GTRAP3-18蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸，將使GTRAP3-18蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少、或抑制GTRAP3-18蛋白質(zhì)功能的物質(zhì)鑒定為目的物質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，所述細(xì)胞是動(dòng)物個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于篩選使谷胱甘肽增加的治療藥的有效成分的物質(zhì)的方法，該方法是神經(jīng)變性疾病，惡性腫瘤，感染病等疾病的治療方法。該方法中，使待測物質(zhì)與表達(dá)GTRAP3-18蛋白質(zhì)的細(xì)胞相接觸，將使GTRAP3-18蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少或者抑制GTRAP3-18蛋白質(zhì)功能的物質(zhì)鑒定為目的物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N33/15GK101421419SQ20078001309
公開日2009年4月29日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月2日
發(fā)明者中木敏夫, 渡部正彥, 青山晃治 申請人:學(xué)校法人帝京大學(xué)