專利名稱：：一種整體型固定化pH梯度的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種整體型固定化PH梯度的制備方法及其在等電聚焦分離兩性電解質(zhì)中的應(yīng)用，屬于兩性電解質(zhì)的分離介質(zhì)的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)代蛋白組分離技術(shù)主要是基于二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2DPAGE)及強陽離子交換-反相高效液相色譜(SCXRP-HPLC)，其中后者又稱鳥槍技術(shù)。迄今為止，2DPAGE仍然是最強大的蛋白組分離技術(shù)，但卻伴隨著耗時長、操作難的缺點。固定化pH梯度(IPG)的發(fā)明大大提高了2DPAGE的重現(xiàn)性，并能夠增加上樣量，從而改善靈敏度。用戶可以根據(jù)實際情況靈活選用或調(diào)配制作不同范圍膠條，窄梯度的膠條能顯著提高分辨率，多條覆蓋窄pH范圍的膠條組合起來使用，可以大幅提高顯示的蛋白點數(shù)目。IPG的缺點是一次性使用、機械強度低、只能依靠電流驅(qū)動。在鳥槍技術(shù)中，蛋白質(zhì)混合物先酶解為肽，再經(jīng)液相色譜分離，導(dǎo)致原始蛋白質(zhì)的破壞，使標(biāo)記物的提取最終必須依賴其它方法。近幾年的研究表明，毛細(xì)管電泳技術(shù)有較多優(yōu)勢，包括分辨率高、樣品消耗少、容易自動化等等，因而越來越多地被應(yīng)用于蛋白組學(xué)及生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)研究中。毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)是一種重要的根據(jù)等電點分離肽、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的技術(shù)。早期的等電聚焦實驗之所以往往難以與質(zhì)譜檢測技術(shù)匹配，是因為其中使用了高濃度的載體兩性電解質(zhì)(CAs)。三年前本發(fā)明人報道了一種無須在樣品中添加自由載體兩性電解質(zhì)的毛細(xì)管等電聚焦方法，其中使用了整體型固定化pH梯度技術(shù)，載體兩性電解質(zhì)分子通過共價鍵固定于聚合物表面，但不失其酸堿兩性及緩沖能力。在聚焦時非揮發(fā)性的離子被趕出柱子，而載體兩性電解質(zhì)分子在聚焦完成后并不隨蛋白質(zhì)一起迀移出毛細(xì)管，因此被分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶可以直接導(dǎo)入質(zhì)譜儀進行檢測。為了分離復(fù)雜的生物樣品，發(fā)明人還開發(fā)了窄梯度的整體型固定化pH梯度，其分辨率更高，可以進一步分離在寬整體型固定化PH梯度上不能分開的蛋白質(zhì)譜帶。毛細(xì)管等電聚焦對兩性電解質(zhì)尤其是蛋白質(zhì)及肽具有很高的分辨率。為了在毛細(xì)管中建立適宜的pH梯度，CIEF緩沖溶液中加入較高濃度的CAs，這限制了CIEF的應(yīng)用范圍。使用CAs帶來的問題主要表現(xiàn)在下列幾個方面(1)CAs本身是復(fù)雜混合物，不同批次的產(chǎn)品會有差異，將導(dǎo)致分離重現(xiàn)性降低；(2)自由溶液中CAs建立的pH梯度不夠穩(wěn)定，會發(fā)生負(fù)極漂移現(xiàn)象，漂移使負(fù)極端的梯度平坦化，導(dǎo)致在極端(>9)pH條件下分辨率降低；(3)CAs有強烈的紫外吸收，直接導(dǎo)致短波范圍檢測波長不能使用，這會降低紫外-可見檢測器吸收靈敏度，實驗當(dāng)中往往只能選擇280nm作為檢測波長；(4)質(zhì)譜是蛋白質(zhì)表征和鑒定的重要手段，高濃度兩性電解質(zhì)CAs的使用會增大質(zhì)譜儀噪音，限制了CIEF與質(zhì)譜儀的聯(lián)用；(5)CAs價格昂貴，作為高濃度使用的消耗品會增加實驗成本。在CIEF中，無需CAs而進行聚焦的技術(shù)也曾經(jīng)有過報道，比如流體聚焦(rheoelectrolysis)、電解水、熱致pH梯度、自聚焦(auto-focusing)等，但尚存在梯度不夠穩(wěn)定、分辨率低、所需儀器設(shè)備太復(fù)雜等各種缺點。顯然，與IPG的功效類似，如果將pH梯度固定到柱管中，可以解決CAs帶來的部分問題。1986年Hochstrasser等(參考文獻HochstrasserD.，AugsburgerV.，F(xiàn)unkM.，AppelR.，PellegriniC.，MullerA.F.ImmobilizedpHgradientsincapillarytubesandtwo-dimensionalgelelectrophoresis.Electrophoresis1986，7:505-511)介紹了^■禾中"載體兩性電解質(zhì)一固定化pH梯度"(CA—IPG，carrierampholyte—immobilizedpHgradient)，他們把商品化CAs(LKB)加入聚丙烯酰胺中制成凝膠，并使其在內(nèi)徑為1.5mm的玻璃管中成型，制成的pH梯度分離介質(zhì)用于2DPAGE處理人血清樣品，顯示出一定的效果。然而作者也承認(rèn)，在使用高電壓的情況下該"固定化"梯度有可能從負(fù)極端逸出玻璃管，導(dǎo)致系統(tǒng)短路的危險。Klein等人(參考文獻KleinJ.，HardingG.，KleinE.Anewisoelectricfocusinggelfortwo-dimensionalelectrophoresisconstructedinmicroporoushollowfibermembranes.JProteom.Res.2002，1:41—45)在不浸潤的微孔塑料管中制備IEF膠，利用商品化的CAs(pH310)，可制得4.59.5梯度的分離介質(zhì)。但上述兩種方法只是將CAs引入凝膠，CAs并未通過化學(xué)鍵固定在凝膠上，并且也未將凝膠固定于管壁，因此其穩(wěn)定性并不理想。一種新型的在毛細(xì)管中制備整體柱型固定化pH梯度(M-IPG,monolithicimmobilizedpHgradient)的方法(參考文獻ChunYang,GuijieZhu，WeibingZhang,YukuiZhang"RepeatedlyusableimmobilizedpHgradientinamonolithiccapillarycolumn"Electrophoresis2004，25:1729-1734)通過在整體基質(zhì)表面化學(xué)鍵合CAs的方法實現(xiàn)，制備的材料可以方便地實現(xiàn)蛋白質(zhì)混合物的等電聚焦分離，該方法還可以實現(xiàn)窄梯度的M-IPG(參考文獻GuijieZhu，ChunYang,匕ihuaZhang,WeibingZhang,YukuiZhang"OptimizationofthepreparationofmonolithicimmobilizedpHgradientandamethodtomakenarrowgradients"Talanta2006，70，2-6)。但目前M-IPG的缺點是必須使用商品化的CAs。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種整體型固定化PH梯度的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明針對現(xiàn)有M-IPG的缺點，提供了一種可實現(xiàn)l14任意制定范圍的高分辨率pH梯度的制備方法，以及這種pH梯度在等電聚焦分離兩性電解質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種整體型固定化PH梯度的制備方法為(1)配制一系列由酸、堿以及中性單體組成的具有不同PH值的溶液，每種溶液至少含有3種單體酸性單體AiA2C=CA3A4、堿性單體BiB2C《B3B4、中性單體&&0《&&，其余成分為溶劑、致孔劑、引發(fā)劑中的一種或多種；溶液中單體A"2C《A3A4、BiB2C《B3B4的濃度呈現(xiàn)梯度分布；(2)每一種溶液聚合得到一個pH梯度，多個梯度組合得到寬范圍的pH梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法將pH梯度固定在柱形容器中，即得整體型固定化pH梯度。(原位聚合是指將溶液灌入柱形容器后再聚合的方法，包括分別聚合與同步聚合兩種方式。)上述單體A仏2C《A3A4和B!B2C《B3B4的濃度為0.01%80%，&&0《&&的濃度為1%90%;其中基團AhA2、A3、A4至少一個是酸性，其余為H或含ddo的基團；基團B^B2、B3、B4至少一個是堿性，其余為H或含ddo的基團；基團NhN2、N3、N4為H或含ddo的基團從窄的固定化pH梯度得到寬范圍的固定化pH梯度采用下列方法之一或任意組合(l)按單體A"2C《A3A4或BiB2C《B3B4的濃度高低順序排列，將系列溶液依次灌入柱形容器中并各自占領(lǐng)一定長度，系列溶液分別或同步聚合，形成整體型固定化pH梯度，選擇不同溶液組合可得到不同范圍的固定化pH梯度；(2)系列溶液分別聚合，形成系列短的固定化pH梯度，切割成統(tǒng)一形狀后，按單體A"2C《A3A4或BiB2C《B3B4的濃度高低順序裝入柱形容器并固定，即得不同pH值范圍的固定化pH梯度；(3)系列溶液分別聚合，聚合物粉碎后混合，裝入柱形容器并固定。以上所述的酸性單體A"2C《A3A4為不飽和羧酸或其酸酐、鹽類，或者不飽和磺酸或其酸酐、鹽類。具體的說，所述的酸性單體為丙烯酸或其鹽、甲基丙烯酸或其鹽、氰基丙烯酸或其鹽、烏頭酸或其鹽、富馬酸或其鹽、馬來酸或其鹽、山梨酸或其鹽、乙烯基磺酸或其鹽、烯丙基磺酸或其鹽、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸或其鹽中的一種或多種。所述的堿性單體BiB2C《B3B4是不飽和胺類或其鹽。具體的說，所述的堿性單體為乙烯胺、N-甲基亞甲胺、亞乙胺、二甲基丙烯基胺、烯丙基胺、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二烯丙基胺甲基氯化銨、二甲基二丙烯基氯化銨、N，N-二甲基氨基乙基丙烯酸酯甲基氯化銨、N，N-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯甲基氯化銨、異丁烯酰胺丙基三甲基氯化銨中的一種或多種。所述的中性單體NiN2C《N3N4是不飽和酰胺、醇、醚、酯或苯乙烯類；包括丙烯酰胺、取代丙烯酰胺、丙烯酸酯類或其混合物。具體的說，所述的中性單體為丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、雙丙酮丙烯酰胺、N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺、N-羥甲基丙烯酰胺、烯丙基甲基丙烯酸酯、烯丙基脫水甘油基醚、N-甲基-N-乙烯基乙酰胺、異丙基丙烯酰胺、雙丙酮丙烯酰胺、乙烯基甲醚、乙烯基乙醚、乙烯基丙醚、乙烯基正丁醚、乙烯基異丁醚、氯丙烯、丙烯醇、丙烯腈、苯乙烯、二乙烯基苯中的一種或多種。所述的溶劑、致孔劑為水、Qd2—元或多元醇、Cido—元或多元羧酸、聚乙二醇、丙酮、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中的一種或多種的混合物。所述的引發(fā)劑為偶氮類或過氧化物類。具體的說，所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、雙氧水、過氧化苯乙酰或過硫酸鉀。整體型固定化pH梯度制備過程中的聚合反應(yīng)在408(TC水浴鍋中進行，聚合時間548小時。本發(fā)明所述整體型固定化pH梯度的制備方法制備得到的pH梯度在等電聚焦分離兩性電解質(zhì)中的應(yīng)用。具體的講，將整體型固定化PH梯度應(yīng)用于蛋白質(zhì)或多肽的等電聚焦分離、純化。本發(fā)明在實施的過程中，通過調(diào)整酸性單體、堿性單體的比例，可以優(yōu)化固定化pH梯度的pH值范圍，從而實現(xiàn)l14范圍內(nèi)的任意pH梯度。通過調(diào)整酸性單體、堿性單體的濃度，可優(yōu)化固定化PH梯度的緩沖能力及上樣量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法可方便地制備l14之間任意范圍的固定化pH梯度，無須使用兩性電解質(zhì)CAs，操作簡便，成本低，所制得的pH梯度用于等電聚焦分離蛋白質(zhì)、多肽等兩性電解質(zhì)分子，具有梯度穩(wěn)定、分辨率高、可反復(fù)使用、適合于純化制備等特點。圖l是實施例6中采用分別聚合方法制備寬幅pH梯度示意圖。圖2是實施例7中采用同步聚合方法制備寬幅pH梯度示意圖。圖3是實施例10中整體型固定化pH梯度實現(xiàn)等電聚焦分離蛋白質(zhì)混合物的譜帶圖，其中電壓20kv，檢測波長280nm，蛋白質(zhì)濃度均為l.2mg/mL。圖4是實施例ll中寬pH梯度和窄pH梯度等電聚焦實驗的比較圖譜。具體實施例方式通過以下實施例可進一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。選擇2-丙烯酰氨基2-甲基丙烷磺酸(AMPS，2-acrylamido-2-methylpropylsulfonicacid)作為酸性單體，N，N-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DEAEMA，N，N-DiethylaminoethylMethacrylate)為堿性單體，丙烯酰胺(AA)與N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)為中性單體，溶劑是水及四氫呋喃(THF)，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN，azobisisobutyronitrile)。具體配方見表l。配制一系列酸、堿以及中性單體組成的具有不同pH值的溶液。表l系列溶液組成序<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例l:稱(量)取表1中序號122所示的藥品，分別置于22個1L容量瓶中，在冰水浴中充分?jǐn)嚢柚瞥扇芤海瑑τ谝?(TC冰箱中，需要時用移液管取出所需分量使用。該系列溶液能夠建立pH值2ll之間的pH梯度。聚合反應(yīng)在6(TC水浴鍋中進行，聚合時間548小時。實施例2:與實施例l相比本實施例在保持中性單體、引發(fā)劑的濃度不變的情況下，所用酸、堿性單體的濃度不同。通過提高表l中序號l、2、3中AMPS的用量，使其分別達到20、18、16克，從而使pH范圍在低pH方向擴展到pH二l;通過提高表1中序號20、21、22中DEAEMA的用量，使其分別達到230、270、300克，從而使pH范圍在高pH方向擴展到pH二14。同時，聚合反應(yīng)溫度及時間保持不變。實施例3:與實施例l、2相比本實施例使用不同的酸性單體(如乙烯基磺酸或乙烯基磺酸鈉)、堿性單體(如乙烯胺)，同時，聚合反應(yīng)溫度及時間保持不變，從而實現(xiàn)pH二l14之間的梯度。實施例4:與實施例l、2、3相比本實施例使用不同的中性單體(如丙烯醇)，同時，聚合反應(yīng)溫度及時間保持不變，從而實現(xiàn)pH=114之間的梯度。實施例5:與實施例l、2、3、4相比本實施例使用不同的溶劑/致孔劑(水和聚乙二醇)，同時，聚合反應(yīng)溫度及時間保持不變，從而實現(xiàn)pH二l14之間的梯度。實施例6:采用分別聚合的方法，實現(xiàn)寬幅度的pH梯度。內(nèi)徑為IOO微米的石英毛細(xì)管分別用O.5mol/LHC1、0.5mol/LNaOH、甲醇各沖洗10分鐘，置于氣相色譜爐中，在氮氣流下7(TC干燥30分鐘，灌入50%(v/v)的3-甲基丙烯酸丙酯基三甲氧基硅烷(y-MAPS)甲醇溶液，用硅膠將兩端封閉，室溫下放置24小時，用甲醇將未反應(yīng)的Y-MAPS沖洗干凈，氮氣吹干。截取30cm經(jīng)過上述處理的毛細(xì)管，灌入長度為10cm的序號3(表l)溶液[見圖l(A)]，封閉兩端，6(TC水浴鍋中進行反應(yīng)24小時。用10毫升50%(v/v)甲醇水溶液沖洗，在氮氣流下6(TC干燥30分鐘。灌入長度為10cm的序號2(表l)溶液，使之接觸序號3溶液形成的聚合物[見圖1(B)]，重復(fù)聚合、沖洗步驟。最后灌入長度為10cm的序號l(表l)溶液，使之接觸序號2溶液形成的聚合物[見圖1(C)]，再次重復(fù)聚合、沖洗步驟，得到pH值24的整體型固定化pH梯度，如圖1所示。實施例7:與實施例6不同之處在于采用同步聚合方法實現(xiàn)寬幅度的pH梯度。同時在毛細(xì)管中灌入長度均為10cm的序號3、2、1(表l)溶液，使之相互接觸，并只封閉毛細(xì)管一端，以免聚合后出現(xiàn)斷裂。聚合、沖洗步驟同實施例6，最后得到pH值24的整體型固定化pH梯度(見圖2)。實施例8:與實施例6、7相比本實施例是在3支10毫升試管中分別加入序號3、2、1(表l)溶液，置于6(TC水浴鍋中聚合548小時后，取出分別截取長度為3cm的聚合物，按順序裝入一根10cm長玻璃管中，兩端用硅膠密封固定，得到pH值24的整體型固定化pH梯度。實施例9:與實施例6、7、8相比本實施例是在3支10毫升試管中分別加入序號3、2、1(表l)溶液，置于6(TC水浴鍋中聚合548小時，取出聚合物研磨成粉并混合，將得到的粉末混合物裝入一根10cm長玻璃管中，兩端用硅膠密封固定，得到pH值24的整體型固定化pH梯度。實施例10:向制得的整體型固定化pH梯度(pH310)毛細(xì)管柱中注入蛋白質(zhì)樣品，兩端分別置于30mmol/L的H3P04及20mmol/L的NaOH中，在20kv電壓下聚焦10分鐘后，將NaOH換成O.1mol/L的NaCl，聚焦蛋白質(zhì)區(qū)帶開始迀移。圖3為6個蛋白質(zhì)的聚焦譜帶。峰歸屬1cytochromec;2lentillectinI;3humancarbonicanhydrase;4bovinecarbonicanhydrase;5P-lactoglobulineB;6phycocyanin。實施例ll:本發(fā)明方法可方便地制備寬幅度或窄幅度的固定化PH梯度。窄幅度的pH梯度比寬幅度pH梯度有較高的分辨率。圖4是相同樣品(雞蛋清蛋白質(zhì)溶液)在寬pH梯度(310)和窄pH梯度(48)中聚焦的比較圖譜。窄pH梯度(圖4下)中出現(xiàn)的峰數(shù)目比寬pH梯度(圖4上)多，顯示出明顯的分辨率優(yōu)勢。電泳實驗操作同前述實施例10。權(quán)利要求1.一種整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于(1)配制一系列由酸、堿以及中性單體組成的具有不同pH值的溶液，每種溶液至少含有3種單體酸性單體A1A2C＝CA3A4、堿性單體B1B2C＝CB3B4、中性單體N1N2C＝CN3N4，其余成分為溶劑、致孔劑、引發(fā)劑中的一種或多種；溶液中單體A1A2C＝CA3A4、B1B2C＝CB3B4的濃度呈現(xiàn)梯度分布；(2)每一種溶液聚合得到一個pH梯度，多個梯度組合得到寬范圍的pH梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法將pH梯度固定在柱形容器中，即得整體型固定化pH梯度。2.按照權(quán)利要求l所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于:單體A1A2C《A3A4和B1B2C《B3B4的濃度為0.01%80%，NlN2C《N3N4的濃度為P/。90。/。；其中基團A1、A2、A3、A4至少一個是酸性，其余為H或含C1C10的基團；基團B1、B2、B3、B4至少一個是堿性，其余為H或含C1C10的基團；基團N1、N2、N3、N4為H或含C1C10的基團。3.按照權(quán)利要求l所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于:從窄的固定化pH梯度得到寬范圍的固定化pH梯度采用下列方法之一或任意組合(l)按單體A1A2C《A3A4或B1B2C《B3B4的濃度高低順序排列，將系列溶液依次灌入柱形容器中并各自占領(lǐng)一定長度，系列溶液分別或同步聚合，形成整體型固定化PH梯度，選擇不同溶液組合可得到不同范圍的固定化pH梯度；(2)系列溶液分別聚合，形成系列短的固定化pH梯度，切割成統(tǒng)一形狀后，按單體A1A2C《A3A4或B1B2C《B3B4的濃度高低順序裝入柱形容器并固定，即得不同pH值范圍的固定化pH梯度；(3)系列溶液分別聚合，聚合物粉碎后混合，裝入柱形容器并固定。4.按照權(quán)利要求l或2所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于所述的酸性單體A1A2C《A3A4為不飽和羧酸或其酸酐、鹽類，或者不飽和磺酸或其酸酐、鹽類o5.按照權(quán)利要求4所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于:所述的酸性單體為丙烯酸或其鹽、甲基丙烯酸或其鹽、氰基丙烯酸或其鹽、烏頭酸或其鹽、富馬酸或其鹽、馬來酸或其鹽、山梨酸或其鹽、乙烯基磺酸或其鹽、烯丙基磺酸或其鹽、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸或其鹽中的一種或多種。6.按照權(quán)利要求l或2所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于所述的堿性單體B1B2C《B3B4是不飽和胺類或其鹽。7.按照權(quán)利要求6所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于:所述的堿性單體為乙烯胺、N-甲基亞甲胺、亞乙胺、二甲基丙烯基胺、烯丙基胺、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二烯丙基胺甲基氯化銨、二甲基二丙烯基氯化銨、N，N-二甲基氨基乙基丙烯酸酯甲基氯化銨、N，N-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯甲基氯化銨、異丁烯酰胺丙基三甲基氯化銨中的一種或多種。8.按照權(quán)利要求l或2所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于所述的中性單體N1N2C《N3N4是不飽和酰胺、醇、醚、酯或苯乙烯類。9.按照權(quán)利要求8所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于:所述的中性單體為丙烯酰胺、取代丙烯酰胺、丙烯酸酯類或其混合物。10.按照權(quán)利要求9所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于所述的中性單體為丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、雙丙酮丙烯酰胺、N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺、N-羥甲基丙烯酰胺、烯丙基甲基丙烯酸酯、烯丙基脫水甘油基醚、N-甲基-N-乙烯基乙酰胺、異丙基丙烯酰胺、雙丙酮丙烯酰胺、乙烯基甲醚、乙烯基乙醚、乙烯基丙醚、乙烯基正丁醚、乙烯基異丁醚、氯丙烯、丙烯醇、丙烯腈、苯乙烯、二乙烯基苯中的一種或多種。11.按照權(quán)利要求1所述整體型固定化PH梯度的制備方法，其特征在于所述的溶劑和/或致孔劑為水、C1C12—元或多元醇、C1C10—元或多元羧酸、聚乙二醇、丙酮、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中的一種或多種的混合物。12.按照權(quán)利要求l所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于所述的引發(fā)劑為偶氮類或過氧化物類。13.按照權(quán)利要求12所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、雙氧水、過氧化苯乙?；蜻^硫酸鉀。14.按照權(quán)利要求l或3所述整體型固定化pH梯度的制備方法，其特征在于所述的聚合反應(yīng)在408(TC水浴鍋中進行，聚合時間548小時。15.一種采用如權(quán)利要求l14中任一項所述整體型固定化pH梯度的制備方法制備得到的整體型固定化pH梯度的應(yīng)用，其特征在于將整體型固定化pH梯度應(yīng)用于等電聚焦分離兩性電解質(zhì)。16.按照權(quán)利要求15所述整體型固定化pH梯度的應(yīng)用，其特征在于將整體型固定化pH梯度應(yīng)用于蛋白質(zhì)或多肽的等電聚焦分離、純化。全文摘要本發(fā)明公開了一種整體型固定化pH梯度的制備方法及其應(yīng)用，其制備方法為先配制一系列由酸、堿以及中性單體組成的具有不同pH值的溶液，每一種溶液聚合得到一個pH梯度，多個梯度組合得到寬范圍的pH梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法將pH梯度固定在柱形容器中，即得整體型固定化pH梯度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法可方便地制備1～14之間任意范圍的固定化pH梯度，無須使用商品兩性電解質(zhì)，操作簡便，成本低，所制得的pH梯度用于等電聚焦分離蛋白質(zhì)、多肽等兩性電解質(zhì)，具有梯度穩(wěn)定、分辨率高、可反復(fù)使用、適合于純化制備等特點。文檔編號G01N27/447GK101294930SQ200710200538公開日2008年10月29日申請日期2007年4月27日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者春楊申請人:春楊