專利名稱：一種膀胱癌檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種膀胱癌的檢測試紙。
技術(shù)背景膀胱移行細胞癌(Bladdertransitional cell carcinoma, BTCC)是我國最 常見惡性腫瘤之一，為男性的第5位，女性的第6 7位。及早地發(fā)現(xiàn)、診斷 膀胱癌對治療和預(yù)后有重要的影響。目前膀胱癌診斷主要依賴于膀胱鏡，但 膀胱鏡檢査是一種侵入性操作，診療過程復(fù)雜、費時費力，費用較高，且病 人痛苦難以耐受，很多病人因為畏懼膀胱鏡檢查而失去了及時診斷、治療的 機會。為此，找到一種簡便、無創(chuàng)，價格低廉且高效的診斷方法迫在眉睫。尿纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)是一種廣為研究的新的膀胱癌腫瘤標(biāo) 記物。研究表明尿液FN作為浸潤性BTCC的診斷指標(biāo)，診斷的靈敏度為 76.47% 100%，特異度為87.22%,診斷正確率為86.96%。目前，尿FN 的臨床檢測主要采用ELISA方法檢測，尚存在以下問題1、采用的ELISA 試劑盒為不同廠家生產(chǎn)，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。2、步驟比較繁瑣，結(jié)果易受操作者技 術(shù)水平等的影響，不確定性因素較多。3、 ELISA方法需要操作者具備一定的 分子生物學(xué)技能，不易在基層醫(yī)院開展。4、曰ISA方法檢測不但要求操作者 具有一定的操作技能還必需酶標(biāo)儀，因此病人無法在家中對自己的病情進行膠體納米金免疫層析方法(Gold immunochromatography assay,GICA)是20世紀90年代興起的一種將膠體金免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的固相膜免疫分析方法。其原理是將特異的抗原或抗體先固定于硝酸纖維膜的某 一區(qū)帶，該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品(如尿液、血液、唾液等)后，由 于毛細管作用，樣品便會帶著膠金墊上的金標(biāo)抗體或抗原沿著硝酸纖維膜向 前移動，當(dāng)移動至固定有抗原或抗體的區(qū)域時，體系中發(fā)生抗原與抗體特異 性結(jié)合反應(yīng)，這一反應(yīng)使膠體金在這一帶聚集而顯示出紫紅色，從而實現(xiàn)特 異性的免疫診斷。由這一技術(shù)開發(fā)出的膠體金檢測試紙已廣泛應(yīng)用于臨床診斷及藥物檢測，其種類包括早孕類檢測試紙(檢測HCG、 LH、 FSH等)、 傳染病檢測試紙(檢測HIV、 HCV、 HBV、 HBsAg等)、毒品、藥物殘留檢測 試紙(檢測嗎啡、可卡因、鴉片、大麻、搖頭丸、瘦肉精等)等。發(fā)明內(nèi)容所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種膀胱癌的檢測試紙，以克服現(xiàn)有 的膀胱癌檢測中診療過程復(fù)雜、費時費力、費用較高，且病情難以自我監(jiān)測 等缺陷。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種膀胱癌檢測試紙，由樣品墊、膠金墊、 硝酸纖維膜、吸水紙和底板組成，在所述的硝酸纖維膜上有尿纖維連接蛋白 一牛血清蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和抗鼠二抗的對照區(qū)，在所述的膠金墊上有金 標(biāo)抗尿纖維連接蛋白抗體，其中，所述的金標(biāo)抗尿纖維連接蛋白抗體為粒徑5 一40nm的膠體。上述的膀胱癌檢測試紙的優(yōu)選方案之一為，所述的金標(biāo)抗尿纖維連接蛋白抗體是以如下方法制備的將100mL 0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸，在 劇烈攪拌下迅速加入0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態(tài)反應(yīng)5-30min 后關(guān)閉熱源即得膠體金溶液，混合抗尿纖維連接蛋白抗體與膠體金溶液并使 其結(jié)合，得到穩(wěn)定的金標(biāo)抗體。上述的膀胱癌檢測試紙的優(yōu)選方案之二為，所述的膠金墊由玻璃纖維和 固定其上的金標(biāo)抗體組成。上述的膀胱癌檢測試紙的優(yōu)選方案之三為，所述的樣品墊為吸水性玻璃 纖維層。上述的膀胱癌檢測試紙的優(yōu)選方案之四為，所述試紙上具有至少一條質(zhì) 控線，其顯色表示試紙有效。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種膀胱癌檢測試紙的制備方法，依次包 括如下步驟1) 將100mL 0.01 %的HAuCI4溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入 0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態(tài)反應(yīng)5-30min后關(guān)閉熱源即 得膠體金溶液；2) 混合抗尿纖維連接蛋白抗體與膠體金溶液并使其結(jié)合，得到穩(wěn)定的金 標(biāo)抗體；3) 將金標(biāo)抗體固定在玻璃纖維上，制成膠金墊；4) 將樣品墊、聚酯膜、膠金墊、硝酸纖維層和吸水紙，依次重疊相連粘 貼在底板上，組裝成檢測試紙。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng) 用，即將液體樣品滴于所述的試紙樣品墊一側(cè)，通過抗原與抗體特異性結(jié)合 反應(yīng)，使膠體金聚集而顯色，從而實現(xiàn)結(jié)果判斷。'上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng)用的優(yōu)選方案之一為，所述試紙的檢測限低于200ug/L尿纖維連接蛋白。上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng)用的優(yōu)選方案之二為，所述試紙上 具有至少一條質(zhì)控線，其顯色表示試紙有效。上述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng)用的優(yōu)選方案之三為，所述液體樣 品為尿液。本發(fā)明可以通過如下方式實現(xiàn)，也可以使用同樣效果的類似方式 所述的試紙由吸尿玻璃纖維層(樣品墊)、聚酯膜層、固定有金標(biāo)抗體的 玻璃纖維層(膠金墊)、硝酸纖維膜層(NC膜)和吸水紙層，按從左到右的順序 依次重疊相連粘貼在底板上組裝而成(如圖1所示)。金標(biāo)抗體為膠體金顆粒與抗FN抗體結(jié)合的復(fù)合物；硝酸纖維膜上標(biāo)記有T線(測試線)和C線(質(zhì) 控線)，T線為FN—BSA偶聯(lián)物，C線為包被的抗鼠的二抗。待病人的尿樣 滴加后，若T線顯色，C線也顯色，得到的結(jié)果為陰性，表明病人無患有膀 胱癌的可能。若T線不顯色，C線顯色，得到的結(jié)果為陽性，表明病人可能 患有膀胱癌。若質(zhì)控線(C線)不顯色，表示試紙失效(如圖2所示)。有益效果本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術(shù)設(shè)計、開發(fā)一種用于檢測病人尿樣中FN 含量的試紙，為膀胱癌的臨床診斷提供可靠的依據(jù)。膠體金免疫層析檢測法不僅具有快速、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、操作簡便、無需任何儀器 設(shè)備，而且結(jié)果判斷直觀可靠、容易被基層單位人員掌握，同時也方便病人 對病情的自我監(jiān)測。本發(fā)明在膀胱癌的檢測中采用膠體金免疫層析技術(shù)，只需要病人的幾滴尿液，就可檢驗出病人的FN的含量是否超標(biāo)，為膀胱癌的診 斷提供可靠的依據(jù)，有望成為診斷膀胱癌的新方法。


圖1為膀胱癌檢測試紙結(jié)構(gòu)示意圖 圖2為膀胱癌檢測試紙檢測示意圖 圖3為膠體金的TEM圖具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授 的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形 式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下列實施例中未注朋具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分 子標(biāo)記操作手冊或臨床檢測操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。實施例11、采用經(jīng)典的Frens法制備粒徑為5—40nm的膠體金溶液:將100mL0.01 %的HAuCl4溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態(tài)反應(yīng)5-30min后關(guān)閉熱源，即得亮紅色透明膠體。2、 選擇適當(dāng)?shù)膒H值(6—10)，使抗體與膠體金牢固地結(jié)合，制備得到穩(wěn)定 的金標(biāo)抗體。3、 將金標(biāo)抗體噴點在玻璃纖維上，制備出膠金墊。然后在硝酸纖維膜(NC 膜)的一側(cè)噴點FN—BSA偶聯(lián)物和抗鼠的二抗，分別作為T線和C線。4、 將樣品墊(長度為35mm)、膠金墊(長度為10mm)、 NC膜(長度為 25mm)和吸水紙(長度為20mm)按照從左到右的順序組裝在底板上， 并用切刀切割成寬為4mm的試紙條。試紙檢測方法1、 取50ul的待測樣本加在試紙條的加樣區(qū)；2、 在10min后記觀察記錄檢測結(jié)果。20min后觀察的結(jié)果無效。 檢測結(jié)果的判斷1、 陽性結(jié)果僅在試紙條的質(zhì)控線上出現(xiàn)一條紫紅色條帶。2、 陰性結(jié)果在試紙條的測試線和質(zhì)控線位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。3、 無效結(jié)果在試紙條的質(zhì)控線上未出現(xiàn)紫紅色條帶。
權(quán)利要求
1.一種膀胱癌檢測試紙，由樣品墊、膠金墊、硝酸纖維膜、吸水紙和底板組成，在所述的硝酸纖維膜上有尿纖維連接蛋白-牛血清蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和抗鼠二抗的對照區(qū)，在所述的膠金墊上有金標(biāo)抗尿纖維連接蛋白抗體，其中，所述的金標(biāo)抗尿纖維連接蛋白抗體為粒徑5-40nm的膠體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特征在于，所述的金標(biāo)抗尿纖 維連接蛋白抗體是以如下方法制備的將100mL0.01X的HAuCl4溶液加 熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入0.5-5mL的檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態(tài) 反應(yīng)5-30min后關(guān)閉熱源即得膠體金溶液，混合抗尿纖維連接蛋白抗體與 膠體金溶液并使其結(jié)合，得到穩(wěn)定的金標(biāo)抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特征在于，所述的膠金墊由玻 璃纖維和固定其上的金標(biāo)抗體組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特征在于，所述的樣品墊為吸 水性玻璃纖維層。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱癌檢測試紙，其特征在于，所述試紙上具有至 少一條質(zhì)控線，其顯色表示試紙有效。
6. —種膀胱癌檢測試紙的制備方法，依次包括如下步驟1) 將100mL 0.01 %的HAuCI4溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入 0.5-5mL的擰檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態(tài)反應(yīng)5-30min后關(guān)閉熱源即 得膠體金溶液；2) 混合抗尿纖維連接蛋白抗體與膠體金溶液并使其結(jié)合，得到穩(wěn)定的金 標(biāo)抗體；3) 將金標(biāo)抗體固定在玻璃纖維上，制成膠金墊；4) 將樣品墊、聚酯膜、膠金墊、硝酸纖維層和吸水紙，依次重疊相連粘 貼在底板上，組裝成檢測試紙。
7. 權(quán)利要求1所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng)用，即將液體樣品滴于所 述的試紙樣品墊一側(cè)，通過抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，使膠體金聚集而 顯色，從而實現(xiàn)結(jié)果判斷。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng)用，其特征在于，所 述試紙的檢測限低于200ug/L尿纖維連接蛋白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng)用，其特征在于，所 述試紙上具有至少一條質(zhì)控線，其顯色表示試紙有效。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的膀胱癌檢測試紙在檢測中的應(yīng)用，其特征在于，所述液體樣品為尿液o
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膀胱癌檢測試紙，由樣品墊、膠金墊、硝酸纖維膜、吸水紙和底板組成，在所述的硝酸纖維膜上有尿纖維連接蛋白—牛血清蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和抗鼠二抗的對照區(qū)，在所述的膠金墊上有金標(biāo)抗尿纖維連接蛋白抗體，其中，所述的金標(biāo)抗尿纖維連接蛋白抗體為粒徑5-40nm的膠體。具有快速、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、操作簡便、無需任何儀器設(shè)備的特點，結(jié)果判斷直觀可靠、易于掌握，適用于對膀胱癌疾病的診斷及病情的自我監(jiān)測。
文檔編號G01N33/574GK101221179SQ20071017313
公開日2008年7月16日 申請日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者周海清, 沈周俊, 沈鶴柏 申請人:上海柏匯申生物科技有限公司