專利名稱：一種溫莪術(shù)油提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥溫莪術(shù)油提取物及其制備方法和用途，特別涉及一種含有倍半萜類成分的溫莪術(shù)油提取物及其在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
溫莪術(shù)為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，習(xí)稱“溫莪術(shù)”。溫莪術(shù)藥材、溫莪術(shù)油及溫莪術(shù)油的注射液為中國(guó)藥典收載品種，溫莪術(shù)油是一種經(jīng)臨床證明療效確切的抗病毒、抗癌藥(中國(guó)藥典2005版)。中國(guó)藥典收載的溫莪術(shù)油一直是采用水蒸氣蒸餾法提取，傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝由于加熱時(shí)間長(zhǎng)，加熱溫度高，使得到的莪術(shù)油含雜質(zhì)多，特別是活性成分主要為含氧環(huán)狀倍半烯萜類化合物，它們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間高熱條件下易發(fā)生轉(zhuǎn)化，影響了莪術(shù)油的臨床療效和制劑穩(wěn)定性。例如溫莪術(shù)油抗癌主成分-呋喃二烯(Furanodiene，又名蓬莪術(shù)環(huán)二烯，分子式C15H20O)在100℃或100℃以上長(zhǎng)時(shí)間加熱過(guò)程中易發(fā)生周環(huán)化發(fā)應(yīng)，生成莪術(shù)烯(6-甲二叉甲基-4，5，6，7-四氫-3，6-二甲基-5異丙烯基-反式-苯并呋喃)。莪術(shù)烯經(jīng)家兔肌肉刺激性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，莪術(shù)烯會(huì)產(chǎn)生一定的刺激性作用。此外，由于溫莪術(shù)中含有較多的淀粉粒，在長(zhǎng)時(shí)間的加熱蒸餾過(guò)程中易與水蒸氣、揮發(fā)油一起被蒸出，造成提取的揮發(fā)油中含有大量的泡沫，油水易形成乳濁液，難于分層，使得質(zhì)量不穩(wěn)定，存在熱源不過(guò)關(guān)等問(wèn)題，給揮發(fā)油的精制帶來(lái)難度。因此提供一種質(zhì)量穩(wěn)定、無(wú)刺激性的溫莪術(shù)油提取物具有深遠(yuǎn)的臨床意義。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種溫莪術(shù)油提取物，該提取物主要含有倍半萜類組分，其中呋喃二烯+吉馬酮+莪術(shù)二酮在總油中的含量≥50％。
本發(fā)明提供了一種溫莪術(shù)油提取物的制備方法。
本發(fā)明提供了一種溫莪術(shù)油提取物的檢測(cè)方法。
本發(fā)明提供了溫莪術(shù)油提取物在制備治療宮頸癌、喉癌、白血病、腦膠質(zhì)瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌的藥物中的用途。
本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油提取物采用CO2超臨界萃取方法制備將莪術(shù)藥材粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，萃取壓力為5～18Mpa，萃取溫度20～55℃，分離釜I、II的壓力為7～30Mpa，分離溫度45～70℃，CO2的流量為20～100kg/h，萃取時(shí)間2～8h。
本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油提取物的檢測(cè)方法為選用HPLC法和TLC法分離分析溫莪術(shù)油中的有效成分及進(jìn)行指紋圖譜的研究，目的是由高效液相色譜法(HPLC)和薄層色譜法(TLC)代替氣相色譜法(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分離分析溫莪術(shù)油的成分，避免了氣相色譜法(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)中進(jìn)樣室和色譜柱的高溫對(duì)溫莪術(shù)油有效成分的破壞，而影響溫莪術(shù)油成分的真實(shí)性。
本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油提取物中倍半萜類成分不受破壞，提高了提取率，質(zhì)量穩(wěn)定，不含莪術(shù)烯(6-甲叉亞甲基-4，5，6，7-四氫-3，6-二甲基-5異丙烯基-反式-苯并呋喃)，無(wú)刺激性，且其在抗宮頸癌、喉癌、白血病、腦膠質(zhì)瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌中的效果顯著。



圖1為檢測(cè)方法2中對(duì)照品的色譜圖。
圖2為制備例1得到的提取物的色譜圖。

具體實(shí)施例方式 制備例1 取溫莪術(shù)藥材1.5kg，粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到萃取釜(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產(chǎn)HA221-50-06型超臨界CO2萃取裝置)中，選擇萃取壓力18Mpa，萃取溫度為55℃；分離釜I壓力12Mpa，溫度為55℃，分離釜II壓力為7Mpa，溫度為45℃；CO2流量為80～100kg/h，萃取時(shí)間2h，得到油210g，萃取率為14.0％。經(jīng)高效液相色譜法分離分析(分析條件見(jiàn)檢測(cè)方法2選用HPLC法定性定量分析莪術(shù)油中的有效成分及有關(guān)物質(zhì))，檢測(cè)結(jié)果為呋喃二烯含量為31.3％，吉馬酮(牻牛兒酮)含量為15.5％，莪術(shù)二酮含量為11.7％，色譜圖見(jiàn)圖2。
制備例2 取溫莪術(shù)藥材1.5kg，粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產(chǎn)HA221-50-06型超臨界CO2萃取裝置)中，選擇17Mpa為超臨界CO2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為50℃；分離釜I壓力10Mpa，溫度為50℃，分離釜II壓力為7.5Mpa，溫度為60℃；CO2流量為25kg/h，萃取2.5h，得到莪術(shù)油198g，萃取率達(dá)到13.2％，其中呋喃二烯在溫莪術(shù)油中的含量為33.8％，吉馬酮(牻牛兒酮)含量為14.1％，莪術(shù)二酮含量為12.6％。
制備例3 取溫莪術(shù)藥材1.5kg，粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產(chǎn)HA221-50-06型超臨界CO2萃取裝置)中，選擇15Mpa為超臨界CO2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為55℃；分離釜I壓力12Mpa，溫度為50℃，分離釜II壓力為8Mpa，溫度為63℃；CO2流量為25kg/h，萃取2.5h，得到莪術(shù)油191g，萃取率達(dá)到12.7％，其中呋喃二烯在溫莪術(shù)油中的含量為30.4％，吉馬酮(牻牛兒酮)含量為15.1％，莪術(shù)二酮含量為12.7％。
制備例4.溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 將5.0g溫莪術(shù)油提取物、100g注射用大豆油、12g注射用蛋黃磷脂、0.02g維生素E混合均勻后，置60℃恒溫水浴攪拌至澄清油溶液；將2g泊洛沙姆188、22.5g注射用甘油溶解分散在800ml注射用水中，加熱至60℃為水相；將上述油溶液與水相按一定比例置組織搗碎機(jī)中，分次以8000～10000rpm高速攪拌，制成初乳劑；然后迅速降溫后，調(diào)整pH值8～9，用注射用水使乳劑成1000ml；再經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)勻化后，用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，灌封，即得100支乳劑(每支含溫莪術(shù)油提取物50mg/10ml)。
試驗(yàn)例1溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3的作用(體外篩選，MTT法)。
1、材料 溫莪術(shù)油提取物按制備例1方法制備；水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油(自提，依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版1部莪術(shù)油項(xiàng)下提取工藝制得)。
實(shí)驗(yàn)瘤株體外培養(yǎng)細(xì)胞人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。
2.方法進(jìn)行體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT活細(xì)胞染色法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3各株體外培養(yǎng)細(xì)胞(貼壁細(xì)胞用消化液消化)，臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，其中HL-60和SGC-7901用新鮮RPMI1640培養(yǎng)液，PC3用新鮮DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加細(xì)胞懸液200μL(每孔約2×104個(gè))。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中將HL-60培養(yǎng)1h后，SGC-7901、PC3培養(yǎng)24h后加藥處理。2種溫莪術(shù)油以DMSO為溶劑；以滅菌的生理鹽水為溶劑，配制成5檔劑量組，試藥組每孔加試液0.4μL，組每孔加試液2μL，空白對(duì)照組不加任何試液，每檔樣品設(shè)三復(fù)孔。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入8μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后每孔加入100μL DMSO，置搖床搖勻至結(jié)晶全部溶解，選用Synergy HT酶聯(lián)儀于570～630nm處測(cè)各孔吸光度值，將各加試液孔均值(T)與對(duì)照孔值(C)比較，以下列公式計(jì)算出各濃度組的百分抑制率[IC％＝(1-T/C)×100％]，并以此計(jì)算樣品的回歸方程，再求出各樣品的IC50值。該試驗(yàn)重復(fù)3次以上，重復(fù)性 良好。結(jié)果見(jiàn)表1 表1數(shù)據(jù)說(shuō)明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3的體外增殖抑制作用明顯高于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油。結(jié)果還表明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60體外增殖抑制作用最強(qiáng)。見(jiàn)表1 表1 溫莪術(shù)油提取物體外抗癌的IC50值(MTT法) 腫瘤細(xì)胞類型 分組 回歸方程 相關(guān)系數(shù) IC50 (Y) (r) (μg/ml) 白血病細(xì)胞(HL-60) 溫莪術(shù)油提取物 -1.587+20.447lnx 0.983612.47 7.5733+18.828lnx 0.99559.52 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油 -2.574+15.263lnx 0.989831.33 1-5.492+17.214lnx0.996825.12 前列腺癌(PC3) 溫莪術(shù)油提取物 -20.152+24.689lnx0.993817.14 -21.377+23.887lnx0.986819.85 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油 -15.236+20.562lnx0.995923.87 -18.894+20.457lnx0.994829.01 胃癌(SGC-7901) 溫莪術(shù)油提取物 -31.783+26.489lnx0.978521.92 -8.763+20.116lnx 0.986218.56 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油 -40.259+22.481lnx0.988955.41 -42.351+25.459nx 0.989437.62 試驗(yàn)例2溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60、人宮頸癌Hela、人喉癌Hep-2的作用(體外篩選，SRB法)。
1、材料溫莪術(shù)油提取物按制備例1方法制備；水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油(自提，依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版1部莪術(shù)油項(xiàng)下提取工藝制得)； 實(shí)驗(yàn)瘤株體外培養(yǎng)細(xì)胞人早幼粒白血病HL-60、人宮頸癌Hela、人喉癌Hep-2細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。
2.方法進(jìn)行體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(SRB法)。
采用SRB法測(cè)定上述2種溫莪術(shù)油對(duì)3種人癌細(xì)胞增殖的體外抑制作用。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60、Hela、Hep-2的人癌細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，HL-60用新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度都為3.0×105cell/mL，Hela、Hep-2用新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度都為1.0×105cell/mL以每孔100μL接種于96孔板內(nèi)。在37℃、體積分?jǐn)?shù)5％的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后加藥處理。2種溫莪術(shù)油提取物以DMSO-乙醇(體積比1:1)為溶劑，配制成5檔劑量組，每孔加藥100μL，每檔樣品設(shè)三復(fù)孔，以不接種細(xì)胞只加培養(yǎng)液的為空白對(duì)照。藥物處理細(xì)胞48h后，細(xì)胞HL-60每孔各加入50μL、4℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80％的三氯醋酸，使其最終達(dá)到體積分?jǐn)?shù)為16％。細(xì)胞Hela、Hep-2每孔各加入50μL，4℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)50％的三氯醋酸，使其最終達(dá)到體積分?jǐn)?shù)為10％。4℃冰箱固定細(xì)胞1h后，倒掉固定液，用去離子水沖洗96孔板5遍，空氣干燥。經(jīng)三氯醋酸固定后的細(xì)胞加入體積分?jǐn)?shù)0.4％的SRB(磺酰羅丹明B)，每孔50μL，室溫染色30min。用體積分?jǐn)?shù)1％的醋酸沖洗96孔板5遍，空氣干燥。最后加入10mmol.L-1Tris堿，每孔150μL，在微量振蕩器上振蕩15min，直至染料全部溶解，利用酶標(biāo)儀在540nm處測(cè)每孔溶液的吸光度值(A值)、空白孔吸光度值。
將各加試液孔均值(T)與對(duì)照孔值(C)比較，以下列公式計(jì)算出各濃度組的百分抑制率[IC％＝(1-T/C)×100％]。并以此計(jì)算樣品的回歸方程，再求出各樣品的IC50值。該試驗(yàn)重復(fù)3次以上，重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2數(shù)據(jù)表明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人喉癌Hep-2、人宮頸癌Hela、人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞的體外增殖抑制作用明顯高于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油。表2數(shù)據(jù)結(jié)果還表明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞的體外增殖抑制作用強(qiáng)于人宮頸癌Hela細(xì)胞，強(qiáng)于人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞。且MTT法和SRB法試驗(yàn)結(jié)果都證實(shí)溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞有明顯體外增殖抑制作用。
表2 溫莪術(shù)油提取物體外抗癌的IC50值(SRB法) 回歸方程 相關(guān)系數(shù)IC50 腫瘤細(xì)胞類型分組 (Y) (r) (μg/ml) 溫莪術(shù)油提取物 8.9903+34.631lnx 0.9888 3.26 32.919+14.323lnx 0.9869 3.30 Hep-2 -10.254+18.569lnx 0.9852 25.66 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油 -15.264+19.521lnx 0.9878 28.31 溫莪術(shù)油提取物 7.2854+27.343lnx 0.9869 8.13 1.2256+26.441lnx 0.9923 6.94 Hela -18.882+19.526lnx 0.9854 33.82 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油 -17.564+18.487lnx 0.9915 38.66 溫莪術(shù)油提取物 -11.688+21.911lnx 0.9869 16.70 10.404+15.726lnx 0.9911 12.40 HL-60 -14.254+16.5611nx 0.9945 48.42 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油 - 19.265+18.592lnx0.9926 41.49 試驗(yàn)例3溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞荷瘤裸鼠模型、小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤模型的生長(zhǎng)抑制作用。
1藥品溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的制備見(jiàn)制備例4。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑(依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版2部莪術(shù)油注射液項(xiàng)下制備工藝制得)。
2動(dòng)物BALB/c2nu裸鼠40只，購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，5～6周齡，雌雄各半，體重平均(21.27±0.80)g。無(wú)特定病原體條件飼養(yǎng)，保持一定濕度、溫度(25～28℃)。所用食物、水、飼養(yǎng)籠和墊料均經(jīng)高壓消毒。昆明小鼠由山東綠葉制藥有限責(zé)任公司動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SYXK(魯)20030020)體重18～20g。雌雄皆可，每批實(shí)驗(yàn)使用同一性別。動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)組、參照組及陰性對(duì)照組昆明小鼠均各為10只。
3瘤源喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2、小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。
4劑量設(shè)置 人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞荷瘤裸鼠模型溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100(qd)、50(qd)和10(qd)mg/kg。參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100(qd)mg/kg。
小鼠宮頸癌U14模型溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100(qd)、50(qd)、10(qd)和50(bid)mg/kg。參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100(qd)mg/kg。
5給藥方案人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞荷瘤裸鼠模型以劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔100、50和10mg/kg注射給藥，每3天腹腔給藥1次，共給藥8次。強(qiáng)化給藥分別采用劑量設(shè)置的溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的中劑量靜脈輸注輸液小鼠腹腔注射給藥，每3天腹腔給藥，每天2次，共給藥16次。以劑量設(shè)置參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔注射100mg/kg注射給藥，每3天腹腔給藥1次，共給藥8次。
小鼠宮頸癌U14模型以劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔100、50和10mg/kg注射給藥，每天1次，連續(xù)9d，共給藥9次。強(qiáng)化給藥分別采用劑量設(shè)置的的中劑量靜脈輸注輸液小鼠腹腔注射給藥，每天2次，連續(xù)9d，共給藥18次。參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100(qd)mg/kg。以劑量設(shè)置參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔注射100mg/kg注射給藥，每3天腹腔給藥1次，共給藥8次。
6實(shí)驗(yàn)對(duì)照陰性對(duì)照給與實(shí)驗(yàn)組高劑量等體積等濃度的相應(yīng)溶劑，給藥方案均為小鼠腹腔注射途徑，每天1次，連續(xù)10d。
7實(shí)驗(yàn)方法 取體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的喉癌Hep-2細(xì)胞，每只裸鼠于右耳后下皮下種植1×109/L喉癌Hep-2細(xì)胞懸液0.2ml使之生長(zhǎng)，建立喉癌裸鼠動(dòng)物模型。觀察接種部位液體吸收、腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程及裸鼠狀況，待腫瘤生長(zhǎng)25d，至直徑>1cm時(shí)進(jìn)行治療。8組動(dòng)物每3天腹腔給藥1次，并稱量鼠重，重新調(diào)整給藥劑量。分別于1、4、7、10、13、16、19和22d給藥。停藥后3d，處死裸鼠，離腫瘤，稱量瘤重和鼠重抑瘤率。
無(wú)菌抽取傳代第8天的宮頸癌U14小鼠的腹水，以無(wú)菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞數(shù)在8×106個(gè)/ml，于每鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2ml，24小時(shí)后，腹腔注射給藥，每天一次，連續(xù)給藥9天，停藥后24h稱重，處死小鼠，分離瘤塊，計(jì)算出抑瘤率。以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率 抑瘤率％＝(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100％。
8結(jié)果 (1)人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2模型的抑制率 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑輸液樣品的劑量分別為100mg/kg、50mg/kg及10mg/kg，試驗(yàn)抑制率結(jié)果分別為55.23、50.35，41.85、43.22，20.14、22.53％；溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量50mg/kg強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)抑制率結(jié)果分別為60.59、62.82％。詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。(2)小鼠宮頸癌U14模型的抑制率 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑輸液樣品的劑量分別為100mg/kg ip×9qd、50mg/kg ip×9qd及30mg/kg ip×9qd，試驗(yàn)抑制率結(jié)果為41.55、40.55，33.68、28.61，21.51、22.99％；溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量50mg/kg iv×9bid強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)結(jié)果分別為46.39、47.02％。詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。
溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)人喉癌Hep-2裸鼠及小鼠宮頸癌U14兩個(gè)模型試驗(yàn)顯示溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑具有良好的抗腫瘤作用，三個(gè)治療劑量間具有量效關(guān)系，采用同劑量但不同給藥方案時(shí)，每天兩次腹腔給藥較一次腹腔給藥效果好，甚至超過(guò)高劑量組。其在劑量100mg/kg的抗腫瘤效果是同劑量參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的2倍，要明顯強(qiáng)于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的抗腫瘤效果。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑在劑量100mg/kg時(shí)近似于無(wú)效。
表3 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)人喉癌裸鼠模型的療效試驗(yàn) 樣品劑量 動(dòng)物數(shù)(只) 瘤重 抑制率 mg/kg/d 始/終 X±SD(g)％ 陰性對(duì)照組 相應(yīng)溶劑 10/10 1.855±0.157 10/10 1.987±0.143 10/10 0.830±.042*** 55.23 100 10/10 0.986±0.051***50.35 10/10 1.079±0.062***41.85 50 10/10 1.128±0.088***43.22 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 10/10 1.481±0.095***20.14 10 10/10 1.539±0.142***22.53 10/10 0.731±0.053***60.59 50 10/10 0.739±0.041***62.82 參照組10/10 1.336±0.101***27.98 100 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 10/10 1.356±0.081***31.76 ***P值<0.01與陰性對(duì)照組相比 表4 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠U14宮頸癌實(shí)體瘤型的療效試驗(yàn) 樣品 劑量給藥方案 動(dòng)物數(shù)(只) 瘤重抑制率mg/kg/d始/終 X±SD(g) ％ 陰性對(duì)照組 相應(yīng)溶劑 ip×9qd 10/10 3.381±0.424 10/10 3.567±0.98 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 100 ip×9qd 10/10 1.976±0.203*** 41.55 10/10 2.121±0.315*** 40.5550ip×9qd 10/10 2.242±0.425*** 33.68 10/10 2.546±0.241*** 28.6110ip×9qd 10/10 2.654±0.451*** 21.51 10/10 2.747±0.561*** 22.9950ip×9bid 10/10 1.813±0.078*** 46.39 10/10 1.890±0.065*** 47.02 參照組 100 ip×9qd 10/102.559±0.126*** 24.31 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑10/102.642±0.213*** 25.93 ***P值<0.01與陰性對(duì)照組相比 試驗(yàn)例4溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)顱內(nèi)接種的小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤G-422及B16小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移的抗腫瘤療效。
1藥品溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的制備見(jiàn)制備例4，水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑(依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版2部莪術(shù)油注射液項(xiàng)下制備工藝制得) 2動(dòng)物C57BL/6小鼠、昆明小鼠由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)滬動(dòng)合證字第107號(hào)。體重18～20g。雌雄皆可，每批實(shí)驗(yàn)使用同一性別。動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)組及參照組昆明小鼠均各為10只、陰性對(duì)照組20只。
3瘤源G-422小鼠腦瘤模型、B16小鼠黑色素瘤模型由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。
4劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40和20mg/kg。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40mg/kg。
5給藥方案以劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾靜脈40和20mg/kg注射給藥，每天1次，連續(xù)10d，共給藥10次。強(qiáng)化給藥分別采用劑量設(shè)置的溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的低劑量靜脈輸注輸液小鼠尾靜脈注射給藥，每天2次，連續(xù)10d，共給藥20次。參照水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾靜脈40mg/kg注射給藥，每天1次，連續(xù)10d，共給藥10次。
6實(shí)驗(yàn)對(duì)照陰性對(duì)照給與實(shí)驗(yàn)組高劑量等體積等濃度的相應(yīng)溶劑，給藥方案均為小鼠尾靜脈途徑，每天1次，連續(xù)10d。
7實(shí)驗(yàn)方法顱內(nèi)接種動(dòng)物腫瘤模型取生長(zhǎng)旺盛的小鼠G-422瘤源，無(wú)菌條件下勻漿法制備成約3～4×107/mL均漿，于昆明小鼠顱內(nèi)接種0.05mL/鼠，分組，接種24h后開(kāi)始靜脈給藥治療。B16小鼠黑色素瘤模型取體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞，從C57BL/6小鼠尾靜脈接種5×104個(gè)細(xì)胞。G-422觀察荷瘤小鼠30天內(nèi)的存活率，與陰性對(duì)照組比較，計(jì)算腫瘤抑制率；B16試驗(yàn)三周后取各組動(dòng)物的肺臟，檢查肺克隆數(shù)。
按下列公式求出荷瘤宿主的生命延長(zhǎng)率 生命延長(zhǎng)率(％)＝[(對(duì)照組平均生存天數(shù)-給藥組平均生存天數(shù))/對(duì)照組平均生存天數(shù)]×100％依據(jù)各組腫瘤平均集落數(shù)，按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率 腫瘤抑制率(％)＝[(對(duì)照組平均集落數(shù)-給藥組平均集落數(shù))/對(duì)照組平均集落數(shù)]×100％ 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用X2檢驗(yàn)。
結(jié)果 顱內(nèi)接種的小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤G422對(duì)荷瘤宿主的生命延長(zhǎng)率溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑高劑量40mg/kg iv×10qd及低劑量20mg/kg iv×10qd試驗(yàn)結(jié)果為53.61、55.99，48.45、50.83％；溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量20mg/kg iv×10bid強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)結(jié)果為58.06％。詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。
B16小鼠黑色素瘤試驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型的腫瘤抑制率溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的高劑量40mg/kg iv×10qd及低劑量20mg/kg iv×10qd試驗(yàn)結(jié)果為43.93、40.99，36.76、39.83％；溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量20mg/kg iv×10bid強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)結(jié)果為48.06％。詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。
溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)顱內(nèi)接種的小鼠G-422腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(腦內(nèi)接種)及B16小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移兩個(gè)模型試驗(yàn)結(jié)果顯示溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑具有良好的抗腫瘤作用，其中對(duì)原位接種的腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤效果更為顯著，顯示本品有通過(guò)血腦屏障的特點(diǎn)，兩個(gè)治療劑量間具有量效關(guān)系。采用同劑量但不同給藥方案時(shí)，每天兩次靜脈給藥較一次靜脈給藥效果好，甚至超過(guò)高劑量組。其中溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)顱內(nèi)接種的小鼠G-422腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抗腫瘤效果在劑量40mg/kg/d的抗腫瘤效果是參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的2倍，表明其要明顯強(qiáng)于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的抗腫瘤效果。
表5 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)G-422小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的療效試驗(yàn) 劑量 動(dòng)物數(shù) 平均生存時(shí)間生命延長(zhǎng)率 樣品給藥方案 mg/kg 始/終(只) X±SD(天)％ 陰性對(duì)照組 相應(yīng)溶劑 iv×10qd20/0 9.71±2.2 iv×10qd20/0 9.68±2.2 10/0 14.9±3.1***53.61 40 iv×10qd 10/0 15.1±2.9***55.99 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 10/10 14.4±2.3***48.45 iv×10qd 20 10/0 14.6±1.8***50.83 iv×10bid 10/0 15.3±3.7***58.06 參照組 10/10 12.62±1.3*** 29.97 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 40 iv×10qd 10/10 11.86±1.8*** 22.52 ***P值<0.01與陰性對(duì)照組相比 表6 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠黑色素瘤B16實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移療效試驗(yàn) 劑量動(dòng)物數(shù)(只) 肺克隆數(shù) 抑制率 樣品 給藥方案 mg/kg/d 始/終 X±SD(個(gè)) ％ iv×10qd 20/20 48.5±11.3 陰性對(duì)照組 相應(yīng)溶劑 iv×10qd 20/20 49.6±12.2 10/10 27.2±3.1*** 43.93 40 iv×10qd 10/10 29.3±2.7*** 40.99 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 10/10 30.7±23***36.76 iv×10qd 20 10/10 29.8±1.8*** 39.83 iv×10bid 10/10 25.8±3.4*** 48.06 參照組 10/10 28.4±2.2*** 41.44 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 40 iv×10qd 10/10 30.5±3.0*** 38.51 ***P值<0.01與陰性對(duì)照組相比 試驗(yàn)例5溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑注射液對(duì)移植性P388白血病小鼠移植性和艾氏腹水癌(EAC)的體內(nèi)抗腫瘤療效。
1藥品溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的制備按制備例4。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑(依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版2部莪術(shù)油注射液項(xiàng)下制備工藝制得)。
2動(dòng)物昆明小鼠由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)滬動(dòng)合證字第107號(hào)。體重18～20g。DBA/2小鼠，19±2g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)中科動(dòng)005號(hào))。雌雄皆可，每批實(shí)驗(yàn)使用同一性別。動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)組及參照組昆明小鼠均各為10只、陰性對(duì)照組20只。
3瘤源小鼠P388白血病瘤株模型和艾氏腹水癌瘤(EAC)模型由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。
4劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40和20mg/kg。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40mg/kg。
5給藥方案以劑量設(shè)置的溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑和水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑于接種后的24h、72h、120h小鼠腹腔40和20mg/kg給藥，共給藥3次。
6實(shí)驗(yàn)對(duì)照陰性對(duì)照給與實(shí)驗(yàn)組高劑量等體積的生理鹽水，給藥方案均為小鼠腹腔途徑，每天1次，連續(xù)3d。
7實(shí)驗(yàn)方法 小鼠P388白血病瘤株模型取腹水生長(zhǎng)旺盛的P388白血病小鼠，以艾氏腹水癌瘤EAC模型相同的方法，無(wú)菌條件下抽取腹水，用生理鹽水1∶10稀釋后，接種于DBA/2小鼠，每只小鼠腹腔接種0.2mL。于接種后24，72，120h腹腔注射給藥3次。求得各組的平均生存天數(shù)，與陰性對(duì)照組比較，求出生命延長(zhǎng)率。
艾氏腹水癌瘤EAC模型取健康狀況良好，傳代第7天的EAC荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，新潔爾滅浸泡消毒，無(wú)菌條件下抽取腹水，按1∶4加入無(wú)菌生理鹽水制成細(xì)胞懸液，每只小鼠腹腔接種0.2mL[細(xì)胞數(shù)為(1～5)×106]。接種后，動(dòng)物隨機(jī)分組，每組10只，共分4組，于接種后的24h、72h、120h按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥。停藥后觀察小鼠的存活情況，求得各組的平均生存天數(shù)，與陰性對(duì)照組比較，按下列公式求出生命延長(zhǎng)率 生命延長(zhǎng)率(％)＝[(對(duì)照組平均生存天數(shù)-給藥組平均生存天數(shù))/對(duì)照組平均生存天數(shù)]×100％ 8結(jié)果 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠移植性腫瘤P388白血病模型試驗(yàn)顯示使P388小鼠生存期顯著延長(zhǎng)，其平均存活時(shí)間和生命延長(zhǎng)率與陰性對(duì)照組比較有顯著差異，見(jiàn)表7。其在劑量40mg/kg/d的抗腫瘤效果是參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的5倍，要明顯強(qiáng)于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的抗腫瘤效果。
溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠移植性艾氏腹水癌瘤(EAC)模型試驗(yàn)顯示使EAC小鼠生存期顯著延長(zhǎng)，其平均存活時(shí)間和生命延長(zhǎng)率與陰性對(duì)照組比較有顯著差異，見(jiàn)表8。
表7 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠P388白血病的療效試驗(yàn)劑量動(dòng)物數(shù)平均生存時(shí)間 生命延長(zhǎng)率 樣品 mg/kg 始/終(只) X±SD(天) ％ 20/20 11.1±1.5 陰性對(duì)照組相應(yīng)溶劑 20/20 10.4±2.5 10/10 16.5±1.9*** 48.65 40 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 10/10 15.6±2.2*** 50.00 20 10/10 12.6±1.5*** 13.51 10/10 13.1±1.6*** 25.96 參照組 10/10 12.1±1.0*** 9.01 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 40 10/10 11.1±1.4***6.73 ***P值<0.01與陰性對(duì)照組相比 表8 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)艾氏腹水癌瘤EAC的療效試驗(yàn) 樣品 劑量 動(dòng)物數(shù) 平均生存時(shí)間 生命延長(zhǎng)率 mg/kg 始/終(只)X±SD(天) ％陰性對(duì)照組相應(yīng)溶劑 20/0 9.8±2.320/0 10.8±2.0 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑40 10/8 33.3±11.2*** 239.8010/8 30.6±13.2*** 183.33 20 10/8 20.4±13.5*** 108.1610/8 22.1±10.8*** 104.63 參照組 40 10/8 28.9±9.5***194.9 水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑 10/8 26.4±10.2*** 144.4 ***P值<0.01與陰性對(duì)照組相比 檢測(cè)方法1選用薄層色譜法(TLC法)分離分析溫莪術(shù)油中的成分 TLC溫莪術(shù)油中主要成分的分離分析 TLC條件硅膠層析，展開(kāi)劑為正己烷-乙酸乙酯(91)；顯色劑為10％的硫酸乙醇溶液； 對(duì)照品 吉馬酮(牻牛兒酮)由黑龍江省藥品檢驗(yàn)所提供； 莪術(shù)醇由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)100185-200405； 莪術(shù)二酮、呋喃二烯、莪術(shù)烯自提，純度均大于98％，由有機(jī)波譜和單晶X-衍射確證結(jié)構(gòu)和構(gòu)型。
供試品制備例1、2、3中的溫莪術(shù)油作為待測(cè)樣品； 結(jié)果顯示，制備例1、2、3中的溫莪術(shù)油均含有吉馬酮(牻牛兒酮)、莪術(shù)二酮、呋喃二烯、莪術(shù)醇等成分，基本不含有莪術(shù)烯。
檢測(cè)方法2選用HPLC法定性定量分析溫莪術(shù)油中的有效組分及有關(guān)物質(zhì) 儀器美國(guó)Agilent 1100型HPLC儀 色譜條件Discovery C18HPLC Column25cm×4.6mm×5um；流動(dòng)相乙腈-水(7525)或甲醇-水(90:10)； 檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；柱溫室溫20～30℃；流速1ml/min；進(jìn)樣量20ul。
供試品制備例1中的溫莪術(shù)油作為檢測(cè)樣品； 對(duì)照品 吉馬酮(牻牛兒酮)由黑龍江省藥品檢驗(yàn)所提供； 莪術(shù)醇由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供； β-欖香烯由大連醫(yī)藥科學(xué)研究所提供； 莪術(shù)二酮、呋喃二烯、莪術(shù)烯自提，純度均大于98％，由有機(jī)波譜和單晶X-衍射確證結(jié)構(gòu)和構(gòu)型； 結(jié)果顯示6個(gè)對(duì)照品在上述色譜條件下(流動(dòng)相為甲醇-水(90:10))所得色譜圖中的色譜峰從左到右分別為莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、莪術(shù)烯、呋喃二烯和β-欖香烯(見(jiàn)圖1)，且6個(gè)對(duì)照品可達(dá)到完全分離，分離度均大于1.5；其中對(duì)制備例1中溫莪術(shù)油檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖權(quán)利要求
1.一種溫莪術(shù)油提取物，該提取物主要含有倍半萜類組分，其中呋喃二烯+吉馬酮+莪術(shù)二酮在總油中的含量≥50％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取物，其中呋喃二烯含量為31.3％，吉馬酮含量為15.5％，莪術(shù)二酮含量為11.7％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取物，其中呋喃二烯含量為33.8％，吉馬酮含量為14.1％，莪術(shù)二酮含量為12.6％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取物，其中呋喃二烯含量為30.4％，吉馬酮含量為15.1％，莪術(shù)二酮含量為12.7％。
5.一種溫莪術(shù)油提取物的制備方法，將莪術(shù)藥材粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，萃取壓力為5～18Mpa，萃取溫度20～55℃，分離釜I、II的壓力為7～30Mpa，分離溫度45～70℃，CO2的流量為20～100kg/h，萃取時(shí)間2～8h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，取溫莪術(shù)藥材1.5kg，粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到萃取釜中，選擇萃取壓力18Mpa，萃取溫度為55℃；分離釜I壓力12Mpa，溫度為55℃，分離釜II壓力為7Mpa，溫度為45℃；CO2流量為80～100kg/h，萃取時(shí)間2h，得到油210g，萃取率為14.0％。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，取溫莪術(shù)藥材1.5kg，粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，選擇17Mpa為超臨界CO2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為50℃；分離釜I壓力10Mpa，溫度為50℃，分離釜II壓力為7.5Mpa，溫度為60℃；CO2流量為25kg/h，萃取2.5h，得到莪術(shù)油198g，萃取率達(dá)到13.2％，
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，取溫莪術(shù)藥材1.5kg，粉碎成20～40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，選擇15Mpa為超臨界CO2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為55℃；分離釜I壓力12Mpa，溫度為50℃，分離釜II壓力為8Mpa，溫度為63℃；CO2流量為25kg/h，萃取2.5h，得到莪術(shù)油191g，萃取率達(dá)到12.7％。
9.一種溫莪術(shù)油提取物的檢測(cè)方法，選用HPLC法和TLC法分離分析溫莪術(shù)油中的有效成分及進(jìn)行指紋圖譜的研究。
10.溫莪術(shù)油提取物在制備治療宮頸癌、喉癌、白血病、腦膠質(zhì)瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溫莪術(shù)油提取物及其制備、檢測(cè)方法和用途。具體地涉及溫莪術(shù)油提取物采用CO2超臨界萃取方法制備。本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油質(zhì)量穩(wěn)定、可控，無(wú)刺激性，基本不含有莪術(shù)烯，同時(shí)有效成分提取完全，制備簡(jiǎn)單。本發(fā)明提供了溫莪術(shù)油在制備治療抗癌藥物中的用途。
文檔編號(hào)G01N30/02GK101433691SQ20071012890
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日
發(fā)明者孫秀燕 申請(qǐng)人:煙臺(tái)大學(xué)