專(zhuān)利名稱(chēng)：溴化1-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨及其制備方法與應(yīng)用， 特別是涉及該化合物在含有巰基的化合物的質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
標(biāo)記分析方法(如同位素標(biāo)記、光學(xué)標(biāo)記等)在生化分析中有廣泛的應(yīng)用，該方 法是通過(guò)向無(wú)或低信號(hào)響應(yīng)的物質(zhì)提供響應(yīng)基團(tuán)，使原先無(wú)法或者難于進(jìn)行的分析變 得可能，或者使檢測(cè)信號(hào)加強(qiáng)。而質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)酶解之后產(chǎn)生的肽的混合物進(jìn)行檢測(cè) 是當(dāng)前在蛋白質(zhì)組學(xué)中的最基本的方法。然而，由于肽的大小、疏水性、所帶的電荷 以及其二級(jí)結(jié)構(gòu)等的影響，肽的質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度有很大的差異C&肌2004， 7(5, 4522-4530)。為提高基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜中對(duì)肽的檢測(cè)靈敏度，衍生 方法被廣泛采用。目前的方法主要是通過(guò)向肽分子中引入強(qiáng)堿性基團(tuán)(比如胍基、季 銨鹽、磷酸鹽等)，以提高其離子化水平，從而提高檢測(cè)靈敏度。對(duì)此，人們已經(jīng)發(fā) 展了對(duì)肽中精氨酸、蛋氨酸、N-末端氨基酸等殘基的衍生方法。通常，衍生化不但提 高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)也增加了檢測(cè)的選擇性，從而有助于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究(^朋/. CTzem. 2004， 76, 4550-4557)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠?qū)€基進(jìn)行選擇性反應(yīng)的季銨鹽類(lèi)衍生試劑溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨(MPPTAB)及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨(MPPTAB)，其 結(jié)構(gòu)如式I。<formula>formula see original document page 4</formula>(式I)該溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨的制備方法，其合成路線(xiàn)如下，4其中，步驟a)的反應(yīng)條件為將馬來(lái)酰酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入對(duì)氨基苯 酚，再加入濃硫酸、五氧化二磷，加熱反應(yīng)，得到黃色針狀固體(i)步驟b)的反應(yīng)條件為將黃色針狀固體(i)溶解在呋喃中，攪拌反應(yīng)，得中間 產(chǎn)物(ii);步驟c)的反應(yīng)條件為將中間產(chǎn)物(ii)溶解于DMF中，加入l,3-二溴丙烷和 無(wú)水碳酸鈉，攪拌反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物(iii);步驟d)的反應(yīng)條件為將中間產(chǎn)物(iii)溶于丙酮中，加入三甲胺，于冰水浴中 攪拌反應(yīng)，即得中間產(chǎn)物(iv);步驟e)的反應(yīng)產(chǎn)物為將中間產(chǎn)物(iv)與苯混合，并于60。C加熱3h后，蒸去 苯，得脫保護(hù)的淡黃色產(chǎn)物溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨(v)。本發(fā)明所提供的試劑，是專(zhuān)一的用于含有巰基的肽或者其它小分子(如巰基乙醇) 的衍生試劑；該試劑與這些分子衍生后，獲得了一個(gè)永久性的正電荷，在基質(zhì)輔助激 光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜檢測(cè)中，可顯著提高他們的離子化效率；同時(shí)具有紫外吸收 的芳香疏水性官能團(tuán)的引入也可以改善分析物與基質(zhì)的融合、以及能量的吸收與傳 遞，從而提高它們的檢測(cè)靈敏度。因此，本發(fā)明溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙 基]三甲銨作為含有巰基的化合物的衍生試劑的應(yīng)用，以及，該化合物在含有巰基的化合物的質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明應(yīng)用對(duì)氨基苯酚作橋聯(lián)劑，將馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)與季胺鹽連接，首次合成了一種新的季銨鹽類(lèi)衍生試劑——MPPTAB，該化合物可以用于選擇性的對(duì)含巰基的 化合物如肽，蛋白質(zhì)等進(jìn)行標(biāo)記，并提高其在基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜檢 測(cè)中的靈敏度，特別的是對(duì)不易離子化的強(qiáng)疏水性的肽，效果尤為明顯。


圖1為溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨(MPPTAB)的合成路線(xiàn)圖；圖2為MPPTAB的核磁譜圖；圖3為MPPTAB與巰基化合物的衍生反應(yīng)的圖示；圖4為高效液相色譜監(jiān)測(cè)的衍生條件的優(yōu)化；圖5為含巰基的不同的肽與其衍生后等量混合后的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨的合成 本發(fā)明所提供的溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨由三部分構(gòu)成， 其結(jié)構(gòu)式如式I所示首先是馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，它可對(duì)肽中半胱氨酸殘基的巰基進(jìn)行 選擇性標(biāo)記；中間為疏水性的芳香橋聯(lián)基團(tuán)，與肽衍生后可增強(qiáng)衍生產(chǎn)物的疏水性， 從而易于和基質(zhì)融合，有利于能量的吸收和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)；最后是季銨鹽 基團(tuán)，它的功用是在質(zhì)譜中提供一個(gè)永久性的陽(yáng)離子，有利于在陽(yáng)離子模式下對(duì)分析 物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨的合成路線(xiàn)如圖l所示(a-e 為不同反應(yīng)步驟，i-v為各步驟所得到的產(chǎn)物)，可按如下步驟進(jìn)行a.(i)的合成將馬來(lái)酰酐(1.96克)溶解于約10毫升新蒸餾制得的N,N-二甲 基甲酰胺(DMF)中，再加入約等摩爾量的對(duì)氨基苯酚，溶液變?yōu)辄S色。在20。C左 右攪拌反應(yīng)2小時(shí)；之后，通過(guò)滴液漏斗，在約45分鐘內(nèi)向反應(yīng)液中滴加含有約0.25 毫升濃硫酸、2克五氧化二磷的DMF溶液(約20毫升)，并加熱(約70 。C)攪拌 反應(yīng)2小時(shí)，溶液顏色變?yōu)樽霞t色。然后，將反應(yīng)液倒入碎冰中終止反應(yīng)，再加入大 量水(約800毫升)稀釋。接著，用乙酸乙酯萃取，并用水洗滌有機(jī)相。有機(jī)相經(jīng)硫 酸鈉干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去其中的溶劑，殘?jiān)卯惐歼M(jìn)行重結(jié)晶，得黃色針狀 固體(i)。b. 馬來(lái)酰亞胺中雙鍵的保護(hù)將(i)溶解在新蒸餾制得的呋喃中，得橙黃色溶 液，并在常溫下攪拌反應(yīng)48小時(shí)。之后，過(guò)濾反應(yīng)液中析出的白色沉淀，干燥，得產(chǎn)物(ii)。c. 將(ii)溶解在新蒸餾制得的DMF中，加入約5倍摩爾量的1，3-二溴丙垸和 約10倍量的無(wú)水碳酸鈉。于20 。C左右攪拌反應(yīng)約24小時(shí)，反應(yīng)體系呈淡紫色；之 后加水溶解稀釋?zhuān)靡宜嵋阴ポ腿?，將有機(jī)相水洗后用硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量液體，用硅膠柱對(duì)此殘留液體進(jìn)行分離。洗脫液為乙酸乙酯石油醚(1: 2至1: 3，比例越小分離效果越好，但耗時(shí)長(zhǎng))的混合液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去其中的溶劑，得(iii)。d. 將(iii)溶于丙酮中，加入5倍摩爾量的三甲胺(33%)的甲醇溶液。于冰水 浴中攪拌反應(yīng)48小時(shí)，得淡黃色沉淀。過(guò)濾、并用冷丙酮洗滌，干燥后即得(iv)。e. 將(iv)與苯混合并于60。C下加熱約3小時(shí)。然后，蒸去苯，殘?jiān)眉状贾亟Y(jié)晶，得脫保護(hù)的淡黃色產(chǎn)物(v)，并對(duì)其進(jìn)行核磁(見(jiàn)圖2)和高分辨質(zhì)譜表征。'H雨R: S 7.24 (d, 2H), 7.08 (d 2H), 6.96 (d 2H), 4.17 (t, 2H), 3.53 (m, 2H), 3.15 (s, 9H)， 2,29 (t, 2H)。高分辨質(zhì)譜(p-SIMS-Gly, Bruker Daltonics. Inc. APEX II. FT-ICRMS): C16H21N203, 計(jì)算值289.15466;測(cè)定值289.1548。實(shí)施例2、溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨對(duì)含有巰基的肽的衍生 化作用應(yīng)用本發(fā)明溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨(MPPTAB)對(duì)含有 巰基的化合物進(jìn)行標(biāo)記的衍生反應(yīng)如圖3所示，該反應(yīng)在約37 。C，約20 mmol/L的 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(也可以在HEPES緩沖溶液)緩沖溶液(pH約7.4)中進(jìn) 行；在反應(yīng)中，巰基與馬來(lái)酰亞胺的雙鍵反應(yīng)生成硫醚。通過(guò)反相高效液相色譜優(yōu)化了反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)在約37。C下，肽與衍生試劑的摩 爾比為l: 3的條件下，反應(yīng)約2小時(shí)即可以進(jìn)行完全(在同樣的色譜檢測(cè)條件下， 產(chǎn)物的峰面積不再增加)，見(jiàn)圖4。圖中橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為紫外吸收；圖 中所示色譜圖a，谷胱甘肽；b，衍生試劑(MPPTAB) ; c到f分別是當(dāng)肽對(duì)衍生試劑反應(yīng)的摩爾比為l: 1.5， 1: 3， 1: 5， 1: IO時(shí)的色譜圖。譜圖中各色譜峰分別 為谷胱甘肽(1)，衍生產(chǎn)物(2)，未知物(3)，衍生試劑(4)。實(shí)施例3、質(zhì)譜信號(hào)提高實(shí)驗(yàn)所有質(zhì)譜分析都在BmkerBIFLEX III MALDI-TOF MS上進(jìn)行，該質(zhì)譜儀配有氮 激光源(337 mn)。信號(hào)采集在反射式陽(yáng)離子模式下進(jìn)行，加速電壓為19千伏特，反射電壓為20千伏；采用oc-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)做基質(zhì)(采用其它極性強(qiáng)的基 質(zhì)，信號(hào)會(huì)減弱或無(wú)所需信號(hào))；其飽和溶液用乙腈/水(含0.1%三氟乙酸)為2: 1 (v/v)的混合液配制，稀釋一倍后對(duì)結(jié)果沒(méi)有明顯的影響。取3nL的樣品和3fiL的 基質(zhì)溶液混合均勻后，取0.5pL點(diǎn)靶，室溫干燥后分析。所有的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)比都是取等摩爾濃度的肽溶液和其衍生產(chǎn)物的溶液等 體積混合；對(duì)未衍生的肽，為了保證其與衍生的肽有相同的背景，其溶液的配制方法 和衍生反應(yīng)的一樣，只是不含有衍生試劑。在進(jìn)行衍生反應(yīng)體系中，反應(yīng)結(jié)束后加入 100倍于衍生試劑的量的p-巰基乙醇，用以消除過(guò)量的衍生試劑在混合時(shí)與肽繼續(xù)反 應(yīng)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，選擇了四種肽進(jìn)行試驗(yàn)谷胱甘肽， GPVEDAITAAIGRVAC, CLLLGGTMV， LCMFVPGYT。將上述四種肽衍生化之后， 在加入等量的肽混合，混合后的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5，圖中a為L(zhǎng)CMFVPGYT， b為 CLLLGGTMV， c為谷胱甘肽，d為GPVEDAITAAIGRVAC。結(jié)果顯示，各肽的衍生 產(chǎn)物與未進(jìn)行衍生的肽相比，谷胱甘肽(c)信號(hào)增強(qiáng)了 4.7倍，GPVEDAITAAIGRVAC (d)提高了 3.3倍；而對(duì)不含有易質(zhì)子化基團(tuán)的肽LCMFVPGYT(a)和CLLLGGTMV (b)，質(zhì)譜圖中可以看到，在同樣的條件下，它們的信號(hào)提高了大約100多倍。這 一結(jié)果與它們的檢測(cè)限的改善結(jié)果是一致的，這就排除了離子抑制的干擾，說(shuō)明此衍 生試劑的設(shè)計(jì)合成是非常成功的。究其機(jī)理，可能是衍生反應(yīng)在含有半胱氨酸殘基的 肽中引入了一個(gè)永久性的正電荷，提高了其在質(zhì)譜檢測(cè)中的離子化效率，而導(dǎo)致檢測(cè) 信號(hào)的增強(qiáng)；特別的是對(duì)不易離子化的強(qiáng)疏水性的肽，效果尤為明顯。
權(quán)利要求
1. 式I結(jié)構(gòu)的溴化1-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨。
2.
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟a)的反應(yīng)條件為將馬來(lái)酰酐溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入對(duì)氨基苯 酚，再加入濃硫酸、五氧化二磷，加熱反應(yīng)，得到黃色針狀固體(i);步驟b)的反應(yīng)條件為將黃色針狀固體(i)溶解在呋喃中，攪拌反應(yīng)，得中間 產(chǎn)物(ii);步驟c)的反應(yīng)條件為將中間產(chǎn)物(ii)溶解于DMF中，加入l，3-二溴丙垸和 無(wú)水碳酸鈉，攪拌反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物(iii);步驟d)的反應(yīng)條件為將中間產(chǎn)物(iii)溶于丙酮中，加入三甲胺，于冰水浴中攪拌反應(yīng)，即得中間產(chǎn)物(iv);步驟e)的反應(yīng)產(chǎn)物為將中間產(chǎn)物(iv)與苯混合，并于60。C加熱3h后，蒸去 苯，得脫保護(hù)的淡黃色產(chǎn)物溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨(v)。
4、 權(quán)利要求1所述溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨作為含有巰基 的化合物的衍生試劑的應(yīng)用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯 氧基)丙基]三甲銨與含有巰基的化合物的摩爾比為3: 1。
6、 權(quán)利要求1所述溴化l-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨在含有巰基的 化合物的質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了溴化1-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的溴化1-[3-(4-馬來(lái)酰亞胺基苯氧基)丙基]三甲銨(MPPTAB)，其結(jié)構(gòu)如式I。本發(fā)明應(yīng)用對(duì)氨基苯酚作橋聯(lián)劑，將馬來(lái)酰亞胺官能團(tuán)與季胺鹽連接，首次合成了一種新的季銨鹽類(lèi)衍生試劑——MPPTAB，該化合物可以用于選擇性的對(duì)含巰基的化合物如肽，蛋白質(zhì)等進(jìn)行標(biāo)記，并提高其在基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜檢測(cè)中的靈敏度，特別的是對(duì)不易離子化的強(qiáng)疏水性的肽，效果尤為明顯。
文檔編號(hào)G01N30/02GK101274909SQ20071006481
公開(kāi)日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2007年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月27日
發(fā)明者軍 李, 熊少祥, 馬會(huì)民 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所