專利名稱：一種基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表面等離子共振儀芯片，具體地說，是涉及一種基于聚乙二醇的 表面等離子共振儀芯片，及其制備方法。
背景技術(shù)：
表面等離子共振儀(Surface Plasma Resonance spectroscopy,以下簡(jiǎn)稱SPR)是檢 測(cè)生物分子相互作用的傳感器。由Liedberg等人在1983年提出、并驗(yàn)證了SPR做為 生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的設(shè)想，在他們一系列工作的基礎(chǔ)上，瑞典的Pharmacia 于19卯年向市場(chǎng)推出了第一代商業(yè)化的SPR儀器。目前，SPR己被廣泛應(yīng)用于生物 醫(yī)學(xué)、臨床診斷、新藥開發(fā)(篩選、機(jī)理研究)、司法鑒定、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等領(lǐng) 域的檢測(cè)，是已被科學(xué)界和工業(yè)界廣泛接受的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。與酶標(biāo)法相比，SPR檢 測(cè)法的準(zhǔn)確性更高，可重復(fù)性更高。與使用高壓液相色譜(HPLC)或使用微生物來檢 測(cè)食品中的維他命的方法相比，SPR檢測(cè)法更快更簡(jiǎn)便。總之，同其他方法相比較， SPR檢測(cè)法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高、實(shí)時(shí)和免標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。通常，表面等離子共振儀由光機(jī)電部分和消耗性的芯片兩部分組成，芯片是該系 統(tǒng)的核心。目前占據(jù)了全世界90Q/o以上市場(chǎng)的BIAcore (原Pharmacia)系列SPR，其 為用戶提供了可直接使用的芯片，如圖1所示，該芯片是在一玻璃片基1上依次鍍金 膜層2、自組裝單層膜3、和羧基化的葡聚糖膜層4。當(dāng)偏振光通過耦合的棱鏡以某一 角度照射到該芯片的玻璃上時(shí)， 一方面，玻璃產(chǎn)生反射光；同時(shí)，透射過玻璃的光進(jìn) 入鍍金層，并與金表面產(chǎn)生的表面等離子體波相互作用，在入射光處于某一特定的角 度時(shí)，二者會(huì)產(chǎn)生共振，從而會(huì)造成反射光的強(qiáng)度在該特定的入射角出現(xiàn)最低值。由 于表面等離子波發(fā)生共振的角度同金鍍層表面的折射常數(shù)相關(guān)，而該折射常數(shù)又同金 表面的物質(zhì)相關(guān)，因此通過檢測(cè)反射光強(qiáng)度最低值時(shí)角度的變化，就能間接的檢測(cè)金 膜表面物質(zhì)的變化。當(dāng)將表面等離子共振儀用于檢測(cè)生物分子相互作用的傳感器時(shí)，為了提高SPR的 靈敏度，通常是在金表面通過末端帶羧基的巰基化合物形成自組裝單層膜，然后修飾 上一層基質(zhì)材料——羧基化的葡聚糖膜層，從而增加其比表面積，用以固定更多的信號(hào)分子。如圖2所示的BIAcore系統(tǒng)中SPR的工作原理示意圖，其核心的芯片是一面 鍍金的玻璃片，在金表面上通過修飾的羧基化的葡聚糖膜層，固定一對(duì)能發(fā)生特異作 用的分子的一個(gè)部分(如配體和受體之一)。通過微流輸送系統(tǒng)將含有上述能發(fā)生特 異作用的分子的另一個(gè)部分介質(zhì)輸送到修飾過的金膜表面。當(dāng)介質(zhì)流經(jīng)芯片時(shí)，這對(duì) 能發(fā)生特異作用的分子特異性結(jié)合，使得金膜表面的局部濃度發(fā)生變化，即金表面的 物質(zhì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其折射常數(shù)發(fā)生變化，最終SPR測(cè)量到表面等離子波的共振 角度發(fā)生變化(從共振角I變化到共振角II)。在文獻(xiàn)1: L6負(fù)s， S; Johnsson， B. J. Chem. Soc.， Chem. Commun.， 1990， 1526-1528中已經(jīng)證實(shí)了，該共振角度的變化是直接同接 到金表面的分子質(zhì)量成正比的，在BIAcore系統(tǒng)中， 一個(gè)反應(yīng)單位(resonanceunits, 以下簡(jiǎn)稱RU)對(duì)應(yīng)0.0001。最低強(qiáng)度的角度變化。對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)樣品， 一個(gè)RU的 變化相當(dāng)于在芯片表面發(fā)生1 pg/mm2的變化。但是，這類使用羧基化的葡聚糖修飾的芯片的工藝有以下缺點(diǎn)(l)制備芯片時(shí) 的步驟繁多，使得芯片的可控性和重復(fù)性受到影響；(2)在芯片表面固定高分子基質(zhì) 時(shí)使用了傳統(tǒng)的"移植到"("grafting to")策略，使得修飾的羧基化的葡聚糖層的密度 和厚度均受到限制，從而進(jìn)一步影響到所固定的探測(cè)分子；(3)所使用的原料——葡 聚糖水凝膠的來源有限，使得芯片的制造成本較高，并且它的防止蛋白質(zhì)非特異性吸 附的性能也不能達(dá)到最佳；(4)由于使用了葡聚糖水凝膠，功能基團(tuán)的密度和種類受 到限制，衍生難度大；(5)生物信號(hào)分子和基質(zhì)間缺乏連接空間(即缺乏Spacer)， 從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受生物信號(hào)分子的固定形式影響較大。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的表面等離子共振儀芯片的種種缺陷，提供一 種使用了石英晶體微天平(以下簡(jiǎn)稱QCM)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)芯片表面的修飾膜的生長(zhǎng)的方 法，該方法制備的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片的性能在各方面都要優(yōu)于這 類現(xiàn)有的芯片的性能。本發(fā)明的芯片有效地解決了蛋白質(zhì)的非特異性吸附的問題。由 于本發(fā)明的芯片表面的修飾不局限于傳統(tǒng)的羧基化的葡聚糖，使得芯片表面的功能基 團(tuán)的密度和種類不再受到嚴(yán)格的限制；此外，在生物信號(hào)分子的特異性保持、質(zhì)量控 制等方面，本發(fā)明的芯片也具有優(yōu)越的性能。本發(fā)明的芯片的制備方法步驟少，生產(chǎn)成本低，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。該芯片的可深度開發(fā)的潛力更大，通用性更優(yōu)越。本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的-本發(fā)明提供一種基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，如圖3所示，其包括一玻璃片基1和其上的鍍金膜層2，在所述的鍍金膜層上以自組裝的方法引入的引發(fā)劑 層5，以及和引發(fā)劑層結(jié)合(化學(xué)鍵合一表面引發(fā)聚合反應(yīng))的功能化的聚乙二醇層6。所述的引發(fā)劑層為引發(fā)劑溴代異丁酸一o)—巰基十一烷基酯(o)-mercaptoundecyl bromoisobutyrate)和稀釋齊Uco—巰基i"^一烷(co-mercapto-undecanthiol)混合的自組裝 單層，其中，引發(fā)劑溴代異丁酸一co—巰基十一烷基酯所占比例為5—100%，優(yōu)選為 5%， 30%, 45%, 60%和100%;所述的功能化的聚乙二醇層的厚度為3 150納米；所述的功能化的聚乙二醇為寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，其化學(xué)式為 (CH2=CH ) CH3COO (CH2CH20) R其中，n=6， 12，末端R為羥基(—OH)、羧基("COOH)、醛基(—CH0)、氨基(-NH2)、 巰基(-SH)、或氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid，以下簡(jiǎn)稱NTA-鰲合基團(tuán))。本發(fā)明提供一種上述基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片的制備方法，該方法 使用石英晶體微天平來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)芯片表面各層膜的生長(zhǎng)，包括如下的步驟l)采用自組裝單層技術(shù)，將市售的表面鍍金的玻璃片清洗后立即浸入含有引發(fā)劑 和稀釋劑的乙醇溶液中，24小時(shí)后，該玻璃片的金膜層上接上表面的分布密度為5— 100%密度的引發(fā)劑單分子層；具體步驟按照文獻(xiàn)3: Ma, H.; Wells， M.; Bebees， T.; Chilkoti, A.; Adv. Funct. Mater. 2006，中報(bào)道的方法將金表面用UV/Ozone清洗機(jī)進(jìn)行臭氧紫外線清洗，除去表面雜 質(zhì)；清洗后立即浸入含有引發(fā)劑和稀釋劑的乙醇溶液中，引發(fā)劑的巰基和金反應(yīng)，24 小時(shí)后即可得到覆蓋了 5—100%的密度的引發(fā)劑的自組裝單層的芯片，將此芯片置入 石英晶體微天平的傳感器腔室中，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)15分鐘；所述的含有引發(fā)劑和稀釋劑的乙醇溶液中，所述的引發(fā)劑為溴代異丁酸一ro—巰基 十一烷基酯，所述的稀釋劑為co—巰基十一烷，引發(fā)劑和稀釋劑的摩爾比為1: 9—0， 二者在乙醇溶液中的總濃度為1毫摩爾；因?yàn)楹袔€基的引發(fā)劑和稀釋劑的反應(yīng)活性不同，所以其在乙醇溶液中的混合比 例不同于其在表面上的密度，需通過表面化學(xué)分析儀(XPS)，按照文獻(xiàn)3中公開的方法測(cè)出；在本技術(shù)方案中，引發(fā)劑和稀釋劑的摩爾比為1: 9時(shí)，對(duì)應(yīng)的引發(fā)劑在表面密度為5%;引發(fā)劑和稀釋劑的摩爾比為l: l時(shí)，對(duì)應(yīng)的引發(fā)劑在表面密度為30%;引發(fā)劑和稀釋劑的摩爾比為1: 0.4時(shí)，對(duì)應(yīng)的引發(fā)劑在表面密度為45%;引發(fā)劑和稀 釋劑的摩爾比為l: 0.25時(shí)，對(duì)應(yīng)的引發(fā)劑在表面密度為60%;引發(fā)劑和稀釋劑的摩 爾比為l: 0時(shí)，對(duì)應(yīng)的引發(fā)劑在表面密度為100%;2) 通入只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液0到10分鐘，QCM達(dá)到穩(wěn) 定的起始基線；然后以70mLh"速度通入含催化量的催化劑的完全反應(yīng)液，2分鐘完 全反應(yīng)液進(jìn)入完全后，將完全反應(yīng)液流速降到20mLh"，在2(TC反應(yīng)；將完全反應(yīng)液 切換為不完全反應(yīng)液，終止反應(yīng)；取出芯片，測(cè)量功能化的聚乙二醇層的膜厚；重復(fù) 步驟2)，做出頻率變化(AF)—膜厚(7Tn'dbe^)線性對(duì)應(yīng)的曲線，并計(jì)算出其斜率的 k值；3) 根據(jù)步驟2)計(jì)算出其斜率的k值，和下式確定所需膜厚所對(duì)應(yīng)的頻率變化AF式中n是泛音數(shù)(Overtone number), n=3， k=0.0609，厚度為橢圓偏振儀數(shù)據(jù)模 型擬和得到的，Poly(OEGMA)采用Cauchy模型，(An, Bn)為(1.46, 0.01)，樣品厚度 值為三個(gè)位置測(cè)量值的平均，報(bào)道結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；通入只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液O到IO分鐘，QCM達(dá)到穩(wěn)定的起始基線；然后以70mLh"速度通入含催化量的催化劑的完全反應(yīng)液，l一2分鐘完全反應(yīng)液進(jìn)入完全后，將完全反應(yīng)液流速降到3mL h'1，在20'C反應(yīng)至所需膜厚所對(duì)應(yīng)的頻率變化AF;將完全反應(yīng)液切換為不完全反應(yīng)液，終止反應(yīng)；取出芯片，得到本發(fā)明的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片。所述的單體為寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，其化學(xué)式為(CH2=CH) CH:,C00(CH2CH20) CH2R，其中，n=6， 12，末端R為羥基(—OH)、羧基(-COOH)、醛基(一CHO)、氨基(-NH2)、巰基(-SH)、或NTA-鰲合基團(tuán)。本發(fā)明采用了公認(rèn)的、最佳的防止蛋白質(zhì)非特異性吸附的聚乙二醇為高分子基質(zhì) 材料來代替現(xiàn)有的SPR芯片中的修飾層，同時(shí)使用了石英晶體微天平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)膜的生 長(zhǎng)。這些措施使得本發(fā)明提供的芯片具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)聚乙二醇基質(zhì)的防止非特異性吸附的能力優(yōu)于葡聚糖基質(zhì)。在復(fù)雜的溶液體系下，如牛血清、細(xì)胞破碎液、體液等，聚乙二醇基質(zhì)的非特異性吸附為零(即儀器 的探測(cè)極限)。例如，在通過牛血清時(shí)，葡聚糖基質(zhì)有200以上的RU變化，而聚乙二 醇基質(zhì)則沒有。(2) 聚乙二醇基質(zhì)比葡聚糖基質(zhì)更易功能化。實(shí)現(xiàn)了如羥基(一OH)、羧基 (《OOH)、醛基(一CHO)、氨基(-NH2)、巰基(-SH)、 NTA等功能基團(tuán)的固定。(3) 相同厚度下，聚乙二醇基質(zhì)比葡聚糖基質(zhì)的功能團(tuán)密度高，提高了 SPR的 靈敏度。(4) 功能基團(tuán)的密度可輕易的通過改變單體的比例進(jìn)行調(diào)控。(5) 通過QCM監(jiān)測(cè)，可在較大的范圍內(nèi)精確的控制聚乙二醇基質(zhì)膜的厚度(3 150納米)。


圖l是BIAcore系列SPR的芯片結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1玻璃片基，2鍍金膜層，3 自組裝單層膜，4羧基化的葡聚糖膜層；圖2是BIAcore系列SPR的工作原理示意圖；圖3是本發(fā)明的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1 玻璃片基，2鍍金膜層，5引發(fā)劑層，6聚乙二醇層。圖4為頻率變化(A"—膜厚(rWchm)線性對(duì)應(yīng)圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明使用的引發(fā)劑溴代異丁酸一co —巰基十一垸基酯co-mercaptoundecyl bromoisobutyrate ，功能化的寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯((CH2=CH ) CH3COO(CH2CH20)n CH2R， n-6， 12，末端R為羥基(一OH)、羧基(~COOH)、醛 基(一CHO)、氨基(-NH2)、巰基(-SH)、 NTA〕均購自杭州東偉生物技術(shù)有限公司。本發(fā)明中所用的表面鍍金的玻璃片(規(guī)格為10 x 10 x 0.5 mm3，表面鍍50納米的 金)購自杭州東偉生物技術(shù)有限公司。本發(fā)明中使用的UV/Ozone清洗機(jī)為BioForce Nanosciences， IA， USA。石英晶體 微天平為Q-Sense E4傳感器，Q-Sense, Gothenburg, Sweden。本發(fā)明中膜厚由M-2000V型分光橢圓偏振測(cè)量?jī)x(J.A.WoollamCo.，Inc)測(cè)暈， 測(cè)量角度為65°, 70°和75°,測(cè)量波長(zhǎng)為400 nm到800 nm。實(shí)施例1、制備100%引發(fā)劑密度的100%羧基功能化的聚乙二醇基質(zhì)的表面等離子共振儀芯片按照文獻(xiàn)3: Ma， H.; Wells， M.; Bebees， T.; Chilkoti， A.; Adv. Funct. Mater. 2006，中報(bào) 道的方法，采用自組裝單層技術(shù)，將市售的表面鍍金的玻璃片的金表面用UV/Ozone 清洗機(jī)進(jìn)行臭氧紫外線清洗，除去表面雜質(zhì)；清洗后立即浸入含有濃度為1毫摩爾溴 代異丁酸一co—巰基十一烷基酯的乙醇溶液中，引發(fā)劑的巰基和金反應(yīng)，24小時(shí)后即 可得到覆蓋了 100%引發(fā)劑自組裝單層的芯片。將儲(chǔ)液池、石英晶體微天平的傳感器腔室和蠕動(dòng)泵依次用管路連通，將上述芯片 置入石英晶體微天平的傳感器腔室中，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)15分鐘。同時(shí)準(zhǔn)備好只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液(以下簡(jiǎn)稱IRM)和含 催化量的催化劑的完全反應(yīng)液(以下簡(jiǎn)稱CRM)。 IRM按照下述比例配置而成水和 甲醇的混合液(15mL，水和甲醇的體積比為1: 2),和單體一羧酸化的寡聚乙二醇甲 基丙烯酸酯((CH2=CH) CH3COO(CH2CH20)12CH2COOH) (8mmo1， 0.35M)，并保存 在惰性氣體中；CRM為在IRM的基礎(chǔ)上加入催化劑，CuBr(36mg， 0.25 mmol)和聯(lián) 吡啶(78mg， 0.5mmo1)配置而成，呈暗紅色液體，保存在惰性氣體中。IRM和CRM 使用前均先通氮?dú)獬?5分鐘。將IRM裝入儲(chǔ)液池，開動(dòng)蠕動(dòng)泵，使得IRM進(jìn)入石英晶體微天平的傳感器腔室 中，0到10分鐘后QCM達(dá)到穩(wěn)定的起始基線；然后以70 mL h—1速度通入CRM， 2 分鐘CRM進(jìn)入完全，將CRM流速降到3mLh"，在2(TC反應(yīng)；將CRM切換為IRM， 終止反應(yīng)；取出芯片，用甲醇，去離子水清洗，在氮?dú)饬飨麓蹈?，使用橢圓偏振儀測(cè) 量分析功能化的聚乙二醇層的膜厚(rWcfo7ew)。重復(fù)上述步驟，在不同的反應(yīng)時(shí)間1、 2、 4、 8、 12、 16小時(shí)終止反應(yīng)，做出頻率變化(A"—膜厚(7TH'ane^)線性對(duì)應(yīng)的 曲線，如圖4所示，并計(jì)算出其斜率的k值為0.0643。當(dāng)需要得到25nm寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯聚合膜時(shí)，可根據(jù)k值及下式，計(jì)算出 所需膜厚所對(duì)應(yīng)的頻率變化AF為389 Hz。式中n是泛音數(shù)(Overtone number), n=3， k=0.0643，厚度為橢圓偏振儀數(shù)蹈模 型擬和得到的，Poly(OEGMA)采用Cauchy模型，(An, Bn)為(1.46, 0.01)，樣品厚度 值為三個(gè)位置測(cè)量值的平均，報(bào)道結(jié)果為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差；重新通入只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液0到10分鐘，QCM達(dá)到 穩(wěn)定的起始基線；然后以70mLh"速度通入含催化量的催化劑的完全反應(yīng)液，2分鐘 完全反應(yīng)液進(jìn)入完全后，將完全反應(yīng)液流速降到20mLh'1，在20'C反應(yīng)至QCM傳感 器腔室中觀測(cè)到AF為389Hz時(shí)，將完全反應(yīng)液切換為不完全反應(yīng)液，終止反應(yīng)；取 出芯片，得到本發(fā)明的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其功能化的聚乙二醇 層的膜厚為25nm，引發(fā)劑的密度為100%，膜的羧基化密度為100%。實(shí)施例2、使用實(shí)施例1制得的芯片進(jìn)行SPR檢測(cè)在BIAcore3000儀器中，使用本方法實(shí)施例1中得到的芯片。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序， 首先流過磷酸鹽緩沖液(PBS buffer, pH = 7.4)，得到基線。由于本方法得到的膜密度 更高，表現(xiàn)為RU達(dá)到30000 40000。 一般葡聚糖芯片的RU僅為15000。然后通過 N-hydroxysuccinimide (NHS， N —羥基丁二酰亞胺，O.lmM)和l-[3<dimethylamino)-propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC， 1 - (3 — 二甲氨基丙基)一3 —乙基碳二 亞胺鹽酸鹽，0.1mM)的混合溶液30分鐘，使羧基活化，最后通過牛血清蛋白(BSA)。 由于本方法得到COOH的密度更高，表現(xiàn)為能連接更多的BSA，相同的條件下(蛋白 濃度、溫度、時(shí)間等)，由于連接BSA得到的RU達(dá)到2000，同葡聚糖的200有一個(gè) 十倍的增加。實(shí)施例3、使用本發(fā)明的方法制備45%引發(fā)劑密度的60%氨基功能化的聚乙二醇基質(zhì) 按照文獻(xiàn)3: Ma， H.; Wells， M.; Bebees， T.; Chilkoti, A.; Adv. Funct. Mater. 2006，中報(bào) 道的方法，采用自組裝單層技術(shù)，將市售的表面鍍金的玻璃片的金表面用UV/Ozone 清洗機(jī)進(jìn)行臭氧紫外線清洗，除去表面雜質(zhì)；清洗后立即浸入含有總濃度為1毫摩爾 的溴代異丁酸一co—巰基十一烷基酯和to—巰基十一烷(稀釋劑)的二元混合的乙醇溶 液中，其中引發(fā)劑溴代異丁酸一co—巰基十一烷基酯與稀釋劑co—巰基十一烷的摩爾比 為1: 0.4，巰基和金反應(yīng)，24小時(shí)后即可得到覆蓋了 45%引發(fā)劑自組裝單層的芯片(溶 液中兩個(gè)巰基化合的比例同最終表面上的兩個(gè)巰基化合物的比例是不一樣的，可以通 過表面化學(xué)分析儀(XPS)得出，如文獻(xiàn)3中公開的方法)。將儲(chǔ)液池、石英晶體微天平的傳感器腔室和蠕動(dòng)泵依次用管路連通，將上述芯片 置入石英晶體微天平的傳感器腔室中，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)15分鐘。同時(shí)準(zhǔn)備好只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液(以下簡(jiǎn)稱IRM)和含 催化量的催化劑的完全反應(yīng)液(以下簡(jiǎn)稱CRM)。 IRM按照下述比例配置而成水和甲醇的混合液(15mL，水和甲醇的體積比為1: 2)，和單體一氨酸化的寡聚乙二醇甲 基丙烯酸酯((CH2=CH) CH3COO(CH2CH20)12CH2NH2) (4mmo1， 0.17M)和甲基化的寡 聚乙二醇甲基丙烯酸酯((CH2=CH) CH3COO(CH2CH20)12CH3)(4mmol， 0.17M)的3: 2混合液，并保存在惰性氣體中；CRM為在IRM的基礎(chǔ)上加入催化劑，CuBr(36mg， 0.25mmo1)和聯(lián)吡啶(78 mg， 0.5 mmol)，， 配置而成，呈暗紅色液體，保存在惰性 氣體中。IRM和CRM使用前均先通氮?dú)獬?5分鐘。將IRM裝入儲(chǔ)液池，開動(dòng)蠕動(dòng)泵，使得IRM進(jìn)入石英晶體微天平的傳感器腔室 中，0到10分鐘后QCM達(dá)到穩(wěn)定的起始基線；然展以70 mL h"速度通入CRM， 2 分鐘CRM進(jìn)入完全，將CRM流速降到20 mL h"，在2(TC反應(yīng)；將CRM切換為IM， 終止反應(yīng)；取出芯片，用甲醇，去離子水清洗，在氮?dú)饬飨麓蹈?，使用橢圓偏振儀測(cè) 量分析功能化的聚乙二醇層的膜厚(7T2tokn^f)。重復(fù)上述步驟，在不同的反應(yīng)時(shí)間1、 2、 4、 8、 12、 16小時(shí)終止反應(yīng)，做出頻率變化(A"—膜厚(rWc/t"e^)線性對(duì)應(yīng)的 曲線，并計(jì)算出其斜率的k值為0.0615。當(dāng)需要得到35nm寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯聚合膜時(shí)，可根據(jù)k值及下式，計(jì)算出 所需膜厚所對(duì)應(yīng)的頻率變化AF為569Hz。式中n是泛音數(shù)(Overtone number), n=3， k=0.0615，厚度為橢圓偏振儀數(shù)據(jù)模 型擬和得到的，Poly(OEGMA)采用Cauchy模型，(An， Bn)為(1.46， 0.01)，樣品厚度 值為三個(gè)位置測(cè)量值的平均，報(bào)道結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；重新通入只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液0到10分鐘，QCM達(dá)到 穩(wěn)定的起始基線；然后以70mLh"速度通入含催化量的催化劑的完全反應(yīng)液，2分鐘 完全反應(yīng)液進(jìn)入完全后，將完全反應(yīng)液流速降到20mLh"，在20'C反應(yīng)至QCM傳感 器腔室中觀測(cè)到AF為569Hz時(shí)，將完全反應(yīng)液切換為不完全反應(yīng)液，終止反應(yīng)；取 出芯片，得到本發(fā)明的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其功能化的聚乙二醇 層的膜厚為35nm，引發(fā)劑的密度為45%，膜的胺基化密度為60%。
權(quán)利要求
1. 一種基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其包括一玻璃片基和其上的鍍金膜層，其特征在于在所述的鍍金膜層上以自組裝的方法引入的引發(fā)劑層，以及和引發(fā)劑層結(jié)合的功能化的聚乙二醇層；所述的引發(fā)劑層為溴代異丁酸-ω-巰基十一烷基酯和ω-巰基十一烷混合的自組裝單層，其中，溴代異丁酸-ω-巰基十一烷基酯所占比例為5-100％；所述的功能化的聚乙二醇層的厚度為3～150納米；所述的功能化的聚乙二醇為寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，其化學(xué)式為(CH2＝CH)CH3COO(CH2CH2O)nR其中，n＝6，12，末端R為-OH、-COOH、-CHO、-NH2、-SH、或氮川三乙酸。
2、 如權(quán)利要求l所述的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其特征在于所 述的溴代異丁酸一0)—巰基十一烷基酯所占比例為5%。
3、 如權(quán)利要求l所述的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其特征在于所 述的溴代異丁酸一co—巰基十一烷基酯所占比例為30%。
4、 如權(quán)利要求l所述的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其特征在于所 述的溴代異丁酸一co—巰基十一烷基酯所占比例為45%。
5、 如權(quán)利要求l所述的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其特征在于所述的溴代異丁酸一co-巰基十一烷基酯所占比例為60%。
6、 如權(quán)利要求l所述的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，其特征在于所述的溴代異丁酸一co—巰基十一烷基酯所占比例為100%。
7、 一種權(quán)利要求1所述的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片的制備方法，該方法使用石英晶體微天平來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)芯片表面各層膜的生長(zhǎng)，包括如下的步驟l)采用自組裝單層技術(shù)，將市售的表面鍍金的玻璃片清洗后立即浸入含有引發(fā)劑和稀釋劑的乙醇溶液中，24小時(shí)后，該玻璃片的金膜層上接上5—100%密度的引發(fā)劑單分子層；所述的引發(fā)劑為溴代異丁酸一co—巰基+—烷基酯，所述的稀釋劑為co—巰基+—烷，引發(fā)劑和稀釋劑的摩爾比為1: 9一0， 二者在乙醇溶液中的總濃度為l毫摩爾；2) 通入只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液O到IO分鐘，QCM達(dá)到穩(wěn) 定的起始基線；然后以70mLh"速度通入含催化量的催化劑的完全反應(yīng)液，2分鐘完 全反應(yīng)液進(jìn)入完全后，將完全反應(yīng)液流速降到20mLh"，在2(TC反應(yīng)；將完全反應(yīng)液 切換為不完全反應(yīng)液，終止反應(yīng)；取出芯片，測(cè)量功能化的聚乙二醇層的膜厚；重復(fù) 步驟2)，做出頻率變化(A。一膜厚線性對(duì)應(yīng)的曲線，并計(jì)算出其斜率的 k值；3) 根據(jù)步驟2)計(jì)算出其斜率的k值，和下式確定所需膜厚所對(duì)應(yīng)的頻率變化AF式中n是泛音數(shù)，n=3， k = 0.0643，厚度為橢圓偏振儀數(shù)據(jù)模型擬和得到的， Poly(OEGMA)采用Cauchy模型，(An, Bn)為(1.46， 0.01),樣品厚度值為三個(gè)位置測(cè) 量值的平均，報(bào)道結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；通入只含溶液和單體，不含催化劑的不完全反應(yīng)液O到IO分鐘，QCM達(dá)到穩(wěn)定 的起始基線；然后以70mLh"速度通入含催化量的催化劑的完全反應(yīng)液，2分鐘完全 反應(yīng)液進(jìn)入完全后，將完全反應(yīng)液流速降到20mLh'1，在2(TC反應(yīng)至所需膜厚所對(duì)應(yīng) 的頻率變化AF;將完全反應(yīng)液切換為不完全反應(yīng)液，終止反應(yīng)；取出芯片，得到本發(fā) 明的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片。
8、如權(quán)利要求7所述的基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片的制備方法，其特 征在于所述的單體為寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，其化學(xué)式為(CH2=CH) CH3COO(CH2CH20)nR， 其中，n =6， 12，末端R為一OH、 ~COOH、 一CHO、 -NH2、 -SH、或氮川三乙酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種一種基于聚乙二醇的表面等離子共振儀芯片，及其制備方法。該芯片其包括一玻璃片基和其上的鍍金膜層，在所述的鍍金膜層上以自組裝的方法引入的引發(fā)劑層，以及和引發(fā)劑層結(jié)合的功能化的聚乙二醇層。本發(fā)明使用了石英晶體微天平來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)芯片表面的膜的生長(zhǎng)。本發(fā)明的芯片有效地解決了蛋白質(zhì)的非特異性吸附的問題。由于本發(fā)明的芯片表面的修飾不局限于傳統(tǒng)的羧基化的葡聚糖，使得芯片表面的功能集團(tuán)的密度和種類不再受到嚴(yán)格的限制；此外，在生物信號(hào)分子的特異性保持、質(zhì)量控制等方面，本發(fā)明的芯片也具有優(yōu)越的性能。本發(fā)明的芯片的制備方法步驟少，生產(chǎn)成本低，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。該芯片的可深度開發(fā)的潛力更大，通用性更優(yōu)越。
文檔編號(hào)G01N21/55GK101261226SQ20071006425
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2007年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日
發(fā)明者馬雄明 申請(qǐng)人:北京宏榮博曼生物科技有限責(zé)任公司