專利名稱：黃楊寧、環(huán)維黃楊星d、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿含量的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種儀器分析方法，具體涉及一種用高效液相色譜蒸發(fā)光散射法測定黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿的含量。
背景技術(shù)：
黃楊科植物小葉黃楊Buxus mincrophylla Sieb.et Zucc.var.sinica Rehd.etWils.及其同屬全株植物，經(jīng)提取及常規(guī)精制所得的生物堿總堿，稱為“黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、或黃楊生物堿”，屬于藥用植物的“有效部位”，其含主成分“環(huán)維黃楊星D”含量為60～80％；如果再采用高效液相制備柱技術(shù)分離純化后，其主成分“環(huán)維黃楊星D”含量則上升為90％以上，可改稱為“環(huán)維黃楊星D”，屬于藥用植物的“有效成分”。
“黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿”主成分“環(huán)維黃楊星D”及其“有關(guān)物質(zhì)”，因?yàn)樗鼈兌际巧飰A。所以《中國藥典》2005年版一部所載的方法是測定生物堿的經(jīng)典方法，該方法簡便，但專屬性差，只要是生物堿都能檢測出來，所以得到的結(jié)果是生物堿的總堿，而且這幾個(gè)生物堿有一個(gè)共同的特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)中都沒有共軛雙鍵，所以沒有紫外吸收，這就增加了檢測的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的檢測方法專屬性差的問題，提供一種靈敏度適宜、專屬性強(qiáng)的黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到一種黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿含量的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法，其特征在于其色譜條件中固定相用硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用四氫呋喃-甲醇-乙腈-濃氨水體系，或乙酸乙酯-甲醇-濃氨水體系，或乙酸乙酯-乙腈-濃氨水體系；檢測器采用蒸發(fā)光散射檢測器。
流動(dòng)相體系四氫呋喃-甲醇-乙腈-濃氨水之間的體積比為20～40∶30～70∶5～20∶0.5～5。
流動(dòng)相體系也可采用乙酸乙酯-甲醇-濃氨水，體積比為10～20∶1～5∶0.5～2；或乙酸乙酯-乙腈-濃氨水，體積比為10～20∶1～5∶0.5～2。
流動(dòng)相的流速為0.5～2mL·min-1，柱溫為5～65℃。
蒸發(fā)光散射檢測器中，漂移管溫度為25～150℃，霧化氣體流速為0.5～4L·min-1。
利用高效液相色譜法進(jìn)行物質(zhì)分離測定主要是根據(jù)待測物質(zhì)的理化性質(zhì)確定分離模式。選擇主要的色譜條件色譜柱、流動(dòng)相組成和檢測器類型。本方法利用硅膠柱、特定的流動(dòng)相和檢測器，檢測器是其關(guān)鍵，很好解決了沒有紫外吸收的問題。
本發(fā)明還利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)對(duì)黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿的有關(guān)生物堿進(jìn)行鑒別。
本發(fā)明采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)，靈敏度適宜、專屬性強(qiáng)，能很好地將“黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿”中與主成分“環(huán)維黃楊星D”結(jié)構(gòu)相似的幾種生物堿有效的分開，從而能測定它們各自的含量。同時(shí)，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)對(duì)環(huán)維黃楊星D有關(guān)生物堿進(jìn)行鑒別。


圖1為黃楊寧高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定的色譜圖。
其中編號(hào)為3的峰為環(huán)維黃楊星D，編號(hào)為1、2、4、5的色譜峰為有關(guān)生物堿。
圖2為環(huán)維黃楊星D高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定的色譜圖。
圖3為黃楊寧LC-MS/MS全掃描色譜圖。
圖4為黃楊寧LC-MS/MS全掃描色譜圖放大圖。
圖5為編號(hào)1色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖6為編號(hào)2色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖7為編號(hào)3色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖8為編號(hào)4色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖9為編號(hào)5色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖10為編號(hào)6色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖11為編號(hào)7色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖12為編號(hào)8色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖13為編號(hào)9色譜峰的LC-MS/MS全掃描質(zhì)譜圖。
圖14為編號(hào)1色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖15為編號(hào)2色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖16為編號(hào)3色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖17為編號(hào)4色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖18為編號(hào)5色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖19為編號(hào)6色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖20為編號(hào)7色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖21為編號(hào)8色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖22為編號(hào)9色譜峰的二極質(zhì)譜圖。
圖4～22中，編號(hào)1～9的色譜峰說明見表1。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1色譜柱采用硅膠填料(Lichrospher SiO2，4.6×250mm，5μm)。
1、環(huán)維黃楊星D及其有關(guān)生物堿含量測定色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性固定相用硅膠為填充劑；四氫呋喃-甲醇-乙腈-濃氨水(體積比為32∶50∶13∶3)為流動(dòng)相；流速1mL·min-1；柱溫30℃；蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)漂移管溫度70℃，霧化氣體(N2)流速1.5L·min-1；供試品溶液色譜圖中，環(huán)維黃楊星D峰與其它生物堿峰均應(yīng)達(dá)基線分離；理論塔板數(shù)按環(huán)維黃楊星D峰計(jì)算，應(yīng)不低于1000。
對(duì)照品系列溶液的配置(高濃度)分別取環(huán)維黃楊星D對(duì)照品約5，6，8mg，精密稱定，以流動(dòng)相為溶劑，配置成濃度為500，600，800μg·mL-1的系列溶液。取600，800μg·mL-1的系列溶液，分別稀釋成300，400μg·mL-1。
對(duì)照品系列溶液的配置(低濃度)將上述配置好的500，600μg·mL-1的系列溶液，以流動(dòng)相為溶劑，依次稀釋成5，10，20，40，50，60μg·mL-1的系列溶液。
供試品溶液配置取“黃楊寧”約6mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，并用流動(dòng)相稀釋至刻度10mL，搖勻，即得。
供試品中環(huán)維黃楊星D及其有關(guān)生物堿的含量測定取高濃度對(duì)照品系列溶液20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測量環(huán)維黃楊星D峰面積，其峰面積對(duì)應(yīng)濃度以對(duì)數(shù)關(guān)系求得高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，供環(huán)維黃楊星D含量測定使用；同樣，取低濃度對(duì)照品系列溶液20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測量環(huán)維黃楊星D峰面積，其峰面積對(duì)應(yīng)濃度以對(duì)數(shù)關(guān)系求得低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，供環(huán)維黃楊星D有關(guān)生物堿含量測定使用。
取供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測量環(huán)維黃楊星D峰面積，代入高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得含量為85.89％；色譜圖中，其有關(guān)生物堿(峰編號(hào)分別為1、2、4、5)的峰面積，依次代入低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得含量分別為3.61％，8.65％，0.80％，0.93％，環(huán)維黃楊星D有關(guān)生物堿總含量為13.99％。
2、環(huán)維黃楊星D有關(guān)生物堿的鑒別色譜條件固定相用硅膠為填充劑；四氫呋喃-甲醇-乙腈-濃氨水(體積比為32∶50∶13∶3)為流動(dòng)相；流速1mL·min-1；柱溫30℃。
質(zhì)譜條件電噴霧離子化正離子檢測，噴口電壓5000V，霧化氣壓35psi，輔助氣壓力5psi，毛細(xì)管溫度350℃，碰撞氣氬氣壓力1.5mTorr，碰撞能量33eV。
對(duì)黃楊寧LC-MS/MS全掃描的質(zhì)量范圍為300～600，并對(duì)其中測到的9個(gè)色譜峰加以碰撞能量，觀察產(chǎn)生的子離子。對(duì)于這九個(gè)色譜峰可能代表的有關(guān)生物堿名稱，及其產(chǎn)生的特征子離子分別列于表1。
表1九個(gè)色譜峰的特征子離子及可能代表的有關(guān)生物堿

實(shí)施例2除流動(dòng)相體系改為體積比為15∶3∶2的乙酸乙酯-甲醇-濃氨水，流動(dòng)相的流速為0.6mL·min-1，柱溫為25℃，蒸發(fā)光散射檢測器中漂移管溫度為65℃，霧化氣體流速為1.7L·min-1外，其他同實(shí)施例1。得到的色譜圖中，其有關(guān)生物堿(峰編號(hào)分別為1、2、4、5)的峰面積，依次代入低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得含量分別為3.63％，8.69％，0.82％，0.91％，環(huán)維黃楊星D有關(guān)生物堿總含量為14.05％。
實(shí)施例3除流動(dòng)相體系改為體積比為16∶3∶3.5的乙酸乙酯-乙腈-濃氨水，流動(dòng)相的流速為1.6mL·min-1，柱溫為36℃，蒸發(fā)光散射檢測器中漂移管溫度為75℃，霧化氣體流速為1.3L·min-1外，其他同實(shí)施例1。得到的色譜圖中，其有關(guān)生物堿(峰編號(hào)分別為1、2、4、5)的峰面積，依次代入低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得含量分別為3.60％，8.63％，0.83％，0.95％，環(huán)維黃楊星D有關(guān)生物堿總含量為14.01％。
權(quán)利要求
1.一種黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿含量的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法，其特征在于其色譜條件中固定相用硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用四氫呋喃-甲醇-乙腈-濃氨水體系，或乙酸乙酯-甲醇-濃氨水體系，或乙酸乙酯-乙腈-濃氨水體系；檢測器采用蒸發(fā)光散射檢測器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿含量的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法，其特征在于流動(dòng)相體系采用體積比為20～40∶30～70∶5～20∶0.5～5的四氫呋喃-甲醇-乙腈-濃氨水，或體積比為10～20∶1～5∶0.5～5的乙酸乙酯-甲醇-濃氨水，或體積比為10～20∶1～5∶0.5～5的乙酸乙酯-乙腈-濃氨水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿含量的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法，其特征在于流動(dòng)相的流速為0.5～2mL·min-1，柱溫為5～65℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿含量的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法，其特征在于蒸發(fā)光散射檢測器中，漂移管溫度為25～150℃，霧化氣體流速為0.5～4L·min-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿及其有關(guān)生物堿含量的高效液相色譜蒸發(fā)光散射測定法，其色譜條件中固定相用硅膠為填充劑；流動(dòng)相采用四氫呋喃－甲醇－乙腈－濃氨水體系，或乙酸乙酯－甲醇－濃氨水體系，或乙酸乙酯－乙腈－濃氨水體系；檢測器采用蒸發(fā)光散射檢測器。本發(fā)明采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)，靈敏度適宜、專屬性強(qiáng)，能很好地將“黃楊寧、環(huán)維黃楊星D、黃楊生物堿”中與主成分“環(huán)維黃楊星D”結(jié)構(gòu)相似的幾種生物堿有效的分開，從而能測定它們各自的含量。同時(shí)，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)環(huán)維黃楊星D有關(guān)生物堿進(jìn)行鑒別。
文檔編號(hào)G01N30/60GK101042378SQ20071002160
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者杭太俊, 張正行, 張夢, 翁靜艷, 李丹, 袁厚亮 申請人:杭太俊, 張正行, 張夢, 翁靜艷, 李丹, 袁厚亮