專利名稱：：改性心磷脂及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：0003]本公開內(nèi)容涉及改性心磷脂組合物及其用途；尤其涉及將改性心磷脂固定至固體支持物上的方法，以及相關(guān)的免疫分析(如ELISA)和免疫分析裝置(如測(cè)試條，流通裝置或側(cè)流裝置)，所述分析和裝置可以用于，例如，抗類脂抗體的檢測(cè)和/或疾病(如梅毒)的診斷。
背景技術(shù)：
：根據(jù)一些專家，為了篩查和診斷的目的，非密螺旋體試驗(yàn)和密螺旋體試驗(yàn)的組合將進(jìn)一步幫助梅毒檢測(cè)。這是世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization)提倡的方法，密螺旋體感染(TreponemalInfections)，技術(shù)報(bào)告叢書(TechnicalReportSeries)674，日內(nèi)瓦WHO,1982。使用方便、快速、護(hù)理現(xiàn)場(chǎng)的檢驗(yàn)，其能同時(shí)檢測(cè)非密螺旋體和密螺旋體抗體，將有助于解決這一長期存在的需求。發(fā)明概述圖3顯示了含有4條十八碳雙不飽和脂肪酸鏈的例示性心磷脂分子的示意性氧化反應(yīng)。圖示的心磷脂反應(yīng)產(chǎn)物具有1條或4條氧化的脂肪酸側(cè)鏈。實(shí)際上，氧化反應(yīng)產(chǎn)物還包括氧化的心磷脂種類，其中任何兩條或三條脂肪酸鏈被氧化成羧基。00221圖4顯示了用于將氧化的心磷脂與含胺連接分子，如蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的示意性反應(yīng)。在圖示的例子中，連接分子是BSA。0023圖5顯示了用來測(cè)定氧化的心磷脂-BSA偶聯(lián)物(表2中的"制品5")抗原性的斑點(diǎn)印跡分析的數(shù)字圖像。{00241圖6顯示了可以使用本公開方法的側(cè)流裝置的5種不同形式實(shí)施方案的數(shù)字圖像。(A)、(B)和(E)中所示的裝置實(shí)施方案裝配得使其各自可以浸入或部分浸沒在樣品或含有樣品的溶液中。(C)和(D)中所示的裝置實(shí)施方案裝配成接納一定體積的滴入進(jìn)樣口的樣品(或含有樣品的溶液)。0025圖7是側(cè)流裝置的一種形式實(shí)施方案的透視圖，其中去掉了部分外殼，以顯示該裝置的基本組件及其相互關(guān)系。00261圖8顯示了氧化的心磷脂-卵磷脂混合物的薄層色譜的數(shù)字圖像。(A)未改性心磷脂和未改性卵磷脂在正丁醇中的混合物；(B)氧化的心磷脂/卵磷脂混合物；(C)心磷脂/卵磷脂混合物氧化過后的上層正丁醇相；和(D)心磷脂/卵磷脂混合物氧化過后的下層水相。各樣品的遷移方向用箭頭表示。在一種應(yīng)用中，與多肽載體偶聯(lián)的氧化心磷脂可以用來通過將心磷脂-多肽偶聯(lián)物連接至側(cè)流基體如硝化纖維素條來制造側(cè)流色譜裝置。提供多肽偶聯(lián)的心磷脂的能力使得心磷脂可靠地連接在固體基體上。該基體還可以包括與梅毒密螺旋體抗體反應(yīng)的密螺旋體抗原。同一固體支持物上(或中)心磷脂-多肽偶聯(lián)物和密螺旋體抗原的存在方便地可以在臨床上快速測(cè)試同一生物樣本中的抗脂質(zhì)和抗密螺旋體抗體。00331本文還公開了用于測(cè)定流體樣品中抗類脂抗體的存在和/或量的免疫分析裝置(如側(cè)流或流通裝置)。這些裝置通常包括加樣區(qū)和其中提供了固定的心磷脂-多肽偶聯(lián)物的獨(dú)立的心磷脂俘獲區(qū)，所述偶聯(lián)物對(duì)流動(dòng)相抗類脂抗體具有特異性結(jié)合親和力。加在加樣區(qū)中的任何液體(如流體生物樣品)沿著流徑從加樣區(qū)流向心磷脂俘獲區(qū)。流徑可以延伸至下游的與免疫分析裝置連接的吸收墊，其至少部分起到貝i液器的作用?？梢詸z測(cè)抗類脂抗體和固定的氧化心磷脂之間復(fù)合物的形成，以測(cè)定流體樣品中抗類脂抗體的存在和/或量。用于本文所公開的方法和裝置的一些實(shí)施方案的抗類脂抗體可以是任何起源，但最經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于對(duì)象的血清?？贵w可以是單克隆或多克隆的。只作為舉例，單克隆抗體可以根據(jù)Kohler和Milstein的經(jīng)典方法(Nature256:495-497，1975)或其衍生方法從鼠雜交瘤制備。簡(jiǎn)而言之，小鼠在幾周時(shí)間內(nèi)重復(fù)接種幾微克的所選分析化合物(或其片段)。在一些情況下，使用佐劑或載體分子對(duì)增加分析物在動(dòng)物系統(tǒng)中的免疫原性和/或穩(wěn)定性有益。然后處死小鼠，分離產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞。用聚乙二醇使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，過量未融合的細(xì)胞通過使系統(tǒng)在包含氨基蝶呤的選擇性培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)上生長來破壞。將成功融合的細(xì)胞稀釋，取等份稀釋液置于微量滴定板的孔中，繼續(xù)培養(yǎng)物的生長。產(chǎn)生抗體的克隆通過用免疫分析程序，如最初由Engvall描述的ELISA(Meth.Enzymol.70:419-439,1980)及其衍生方法檢測(cè)孔的上清液中的抗體來鑒別。所選的陽性克隆可以擴(kuò)增，收集其單克隆抗體產(chǎn)物待用。Harlow和Lane(抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies,ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1988)中描述了單克隆抗體產(chǎn)生的詳細(xì)程序。抗原可以刺激動(dòng)物中抗體產(chǎn)生或T細(xì)胞反應(yīng)的化學(xué)或生物化學(xué)化合物、組合物、結(jié)構(gòu)、決定簇、抗原或其部分，包括注射或吸收進(jìn)入動(dòng)物的組合物?？乖c特異性體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物，包括由異種免疫原誘導(dǎo)的那些反應(yīng)。術(shù)語"抗原"包括所有相關(guān)的抗原表位。心磷脂是響應(yīng)疾病狀態(tài)如梅毒密螺旋體感染而形成的抗類脂抗體的一種通常已知的特異性結(jié)合配偶體。天然存在的心磷脂已經(jīng)常規(guī)用于聯(lián)合膽固醇和卵磷脂使用，用于絮凝試驗(yàn),以檢測(cè)例如，梅毒密螺旋體感染患者血清中的抗類脂抗體。俘獲試劑對(duì)以下物質(zhì)具有特異性的未標(biāo)記的特異性結(jié)合配偶體(i)分析物，如在三明治分析中，或(ii)檢測(cè)試劑或分析物，如在競(jìng)爭(zhēng)性分析中，或(iii)輔助特異性結(jié)合配偶體，其本身對(duì)分析物具有特異性，如在間接分析中。本文所用的"輔助特異性結(jié)合配偶體"是與分析物的特異性結(jié)合配偶體結(jié)合的特異性結(jié)合配偶體。例如，輔助特異性結(jié)合配偶體可以包括對(duì)另一個(gè)抗體特異的抗體，例如，山羊抗人抗體。"俘獲區(qū)"是側(cè)流裝置中俘獲試劑被固定的區(qū)域。側(cè)流裝置可以具有一個(gè)以上的俘獲區(qū)，例如，"第一俘獲區(qū)"，"第二俘獲區(qū)"等。通常，第一、第二或其它俘獲區(qū)中將固定不同的俘獲試劑。側(cè)流基體上的多個(gè)俘獲區(qū)可以彼此具有任何取向；例如，第一俘獲區(qū)可以在第二(或其它)俘獲區(qū)的遠(yuǎn)端或近端，反之亦然?；蛘?，第一俘獲區(qū)和第二(或其它)俘獲區(qū)可以彼此垂直取向，這樣，這兩個(gè)(或更多個(gè))俘獲區(qū)便形成了交叉或加號(hào)或其它符號(hào)。0066偶聯(lián)(物)當(dāng)用于動(dòng)詞形式時(shí)，術(shù)語"偶聯(lián)"的意思是一個(gè)分子(例如，氧化的心磷脂)與另一個(gè)分子(例如，蛋白質(zhì))的共價(jià)偶聯(lián)。這種偶聯(lián)可以通過化學(xué)方法、用或不用連接基團(tuán)完成。當(dāng)用于名詞形式時(shí)，術(shù)語"偶聯(lián)物"的意思是通過偶聯(lián)形成的偶聯(lián)分子絡(luò)合物。還原劑任何將來自心磷脂氧化的^-酮基還原成相應(yīng)的/3-羥基而不引起其它氧化心磷脂官能團(tuán)如脂肪酸酯基和/或磷酸酯的大量降解的還原劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從，例如，Larock，ComprehensiveOrganicTransformations(綜合有機(jī)轉(zhuǎn)化)，第二版，NewYork:JohnWiley&Sons,1999的教示中選擇合適的還原劑。還原劑的具體例子包括亞硫酸氫鈉，硫酸二甲酯，氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)，硼氫化鈉(NaBH4)，三乙酰氧基硼氫化鈉(NaBH(OAc)3),嗎啉硼烷，三異丙氧基硼氫化鉀，叔丁胺硼垸，二甲胺硼垸，吡啶硼烷，三乙胺硼垸，三甲胺硼烷。心磷脂是雙磷脂酰甘油(具體為1，3-雙磷脂酰甘油)，如下圖所示，其具有由兩個(gè)磷酸二酯橋連接的三個(gè)甘油分子組成的主鏈<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>心磷脂的外部甘油部分的四個(gè)羥基各自與飽和或不飽和脂肪酸鏈(長度通常為14-18個(gè)碳)酯化。本文所用術(shù)語"心磷脂"包括具有任何脂肪酸側(cè)鏈分布的1，3-雙磷脂酰甘油；條件是至少一條脂肪酸側(cè)鏈含有至少一個(gè)OC雙鍵。因此，心磷脂的四條脂肪酸側(cè)鏈的長度(例如，約14至約25個(gè)碳，約14至約22個(gè)碳，約14至約20個(gè)碳，約14至約18個(gè)碳或約14至約16個(gè)碳)和/或飽和度(例如，完全飽和至含有約6個(gè)雙鍵，完全飽和至含有約4個(gè)雙鍵，或完全飽和至含有約2個(gè)雙鍵)可以獨(dú)立地變化。心磷脂的例示性脂肪酸側(cè)鏈獨(dú)立地包括肉豆蔻酰(14:0);棕櫚酰(16:0);硬脂酰(18:0);油酰(18:1);肉豆蔻油酰(14:1);棕櫚油酰(16:1);巖芹酰(18:1);亞油酰(18:2);亞麻酰(18:3);二十碳烯酰(20:1);花生四烯酰(20:4);芥酰(22:1);DHA(22:6);或神經(jīng)酰(24:1)。—種可用于氧化心磷脂的方法采用了高碘酸根(KV)禾口/或高錳酸根(Mn04—)作為氧化劑。這些氧化劑的鹽包含任何提供電中性化合物的反離子。高碘酸根通常為高碘酸鹽，如NaI04或HI04(高碘酸)的形式，高錳酸根通常為鹽的形式(如鈉或鉀鹽)，例如KMn04。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，Nal04和KMn04被用作氧化劑。為實(shí)施該氧化方法，將獲自任何來源的心磷脂加入到將基本溶解心磷脂的任何溶劑中。鑒于心磷脂的疏水性，優(yōu)選使用極性有機(jī)溶劑，如正丁醇，乙醇，甲醇，丙醇，丙酮，二甲基甲酰胺或乙醚。其它非極性有機(jī)溶劑可以用于使心磷脂混懸，如氯仿；然而，這些非極性有機(jī)溶劑較少使用，因?yàn)檠趸磻?yīng)的其它組分(如下文所述)在這些溶劑中不如例如極性有機(jī)溶劑或含水溶劑可溶。氧化反應(yīng)混合物可以在任何不阻止反應(yīng)發(fā)生的溫度下發(fā)生。類似地，反應(yīng)可以進(jìn)行足以導(dǎo)致心磷脂的至少一條脂肪酸側(cè)鏈氧化降解的任何時(shí)間量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的那樣，反應(yīng)時(shí)間將取決于數(shù)種變量，包括反應(yīng)溫度，溶劑類型和反應(yīng)物及產(chǎn)物濃度，這些變量每個(gè)都可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地進(jìn)行優(yōu)化。在一個(gè)實(shí)施例中，氧化反應(yīng)發(fā)生在室溫，并進(jìn)行了至少24-48小時(shí)。本文中氧化心磷脂的供應(yīng)提供了至少一個(gè)以其它方式在天然存在或合成心磷脂中不能得到的反應(yīng)性羧基。因此，氧化心磷脂可以通過本領(lǐng)域已知和/或本文所述的任何方法，經(jīng)氧化產(chǎn)生的反應(yīng)性基團(tuán)與連接分子相連。這種連接可以用或不用其它連接基團(tuán)。有許多不同方法可以用于產(chǎn)生氧化心磷脂與連接分子間的連接。00117圖4示意性顯示了用于連接氧化心磷脂和含胺連接分子(例如，蛋白質(zhì)，如BSA，合成蛋白質(zhì)MAPS，IgY，鏈霉親和素，親和素或KLH)的一個(gè)例示性方法。圖4中的反應(yīng)說明，如本文所述通過心磷脂的脂肪酸側(cè)鏈的氧化裂解產(chǎn)生的羧基可以用EDC聯(lián)合NHS(或Sulfo-NHS，如圖4所示)修飾成胺反應(yīng)性NHS酯。氧化心磷脂NHS酯然后與連接分子如圖4中所示BSA中存在的胺基反應(yīng)，在氧化心磷脂與連接分子間形成酰胺鍵。將氧化心磷脂或氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物固定在固相上的適宜方法包括離子、疏水、共價(jià)相互作用等。固相(參見，例如，章節(jié)II)可以就其固有的吸引和固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物的能力進(jìn)行選擇。或者，固相可以具備某種因素，該因素具有吸引和固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物的能力。該因素可以包括，例如，相對(duì)于氧化心磷脂或氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物帶有相反電荷的荷電物質(zhì)，或者，例如，相對(duì)于和氧化心磷脂或氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物偶聯(lián)的荷電物質(zhì)帶有相反電荷的荷電物質(zhì)。再或者，該因素可以是任何特異性結(jié)合配偶體，例如，親和素或鏈霉親和素，其固定在固相上，并且通過特異性結(jié)合反應(yīng)具有固定氧化心磷脂或氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物例如生物素化氧化心磷脂的能力。00120j在本文中方法和裝置的一些實(shí)施方案中，氧化心磷脂或氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物可以作檢測(cè)試劑用，因此將與標(biāo)記偶聯(lián)?？梢酝ㄟ^分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法檢測(cè)的任何分子或組合物都可以作為標(biāo)記使用。標(biāo)記的例子，包括酶、膠體金顆粒、有色乳膠顆?，F(xiàn)已公開(美國專利No.4,275,149;4,313,734;4,373,932;和4,954,452，其各自引入本文作為參考)?？捎脴?biāo)記的其它例子包括但不限于輔因子，配體，化學(xué)發(fā)光或熒光劑，吸附蛋白質(zhì)的銀顆粒，吸附蛋白質(zhì)的鐵顆粒，吸附蛋白質(zhì)的銅顆粒，吸附蛋白質(zhì)的硒顆粒，吸附蛋白質(zhì)的硫顆粒，吸附蛋白質(zhì)的碲顆粒，吸附蛋白質(zhì)的碳顆粒和蛋白偶聯(lián)染料囊?，F(xiàn)有許多市場(chǎng)上可買到的側(cè)流型檢驗(yàn)和專利公開方法，用于大分析物(MW大于1,000道爾頓)的檢測(cè)。美國專利No.5,229,073描述了用于測(cè)量血漿脂蛋白水平的半定量競(jìng)爭(zhēng)性側(cè)流免疫分析法。該方法采用多個(gè)含有固定抗體的俘獲區(qū)或線，以結(jié)合標(biāo)記和游離脂蛋白，給出半定量結(jié)果。在免疫分析裝置的應(yīng)用中要考慮的另一個(gè)共同特征是檢測(cè)分析物(如抗類脂抗體)與俘獲試劑(如氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物)間復(fù)合物的形成的方法。檢測(cè)劑(也稱作檢測(cè)試劑)為該目的服務(wù)。檢測(cè)劑可以整合入免疫分析裝置(例如，如下文所述包括在偶聯(lián)墊中)，或者可以從外源加入到裝置中。00143檢測(cè)劑可以是單一試劑或共同為檢測(cè)目的服務(wù)的系列試劑。在一些情況下，檢測(cè)試劑是分析物特異性的標(biāo)記結(jié)合配偶體(如，用于抗體分析物的金偶聯(lián)蛋白A，或用于人抗體分析物的金-標(biāo)記抗人Ab(Fc)，或用于抗類脂抗體分析物的金-標(biāo)記氧化心磷脂)。在其它情況下，檢測(cè)試劑共同包括分析物特異性的未標(biāo)記第一結(jié)合配偶體和所述第一結(jié)合配偶體特異性的標(biāo)記第二結(jié)合配偶體等。在各種情況下，檢測(cè)試劑特異性檢測(cè)分析物-俘獲試劑復(fù)合物的結(jié)合分析物，因此，檢測(cè)試劑優(yōu)選基本上不與俘獲試劑或位于分析物俘獲區(qū)的其它組分結(jié)合或反應(yīng)。這種檢測(cè)劑的非特異性結(jié)合或反應(yīng)可以提供假陽性結(jié)果。任選地，檢測(cè)試劑可以特異性識(shí)別存在于第二俘獲區(qū)的陽性對(duì)照分子(如標(biāo)記蛋白A檢測(cè)劑、或標(biāo)記蛋白G檢測(cè)劑、或標(biāo)記抗人Ab(Fc)的非特異性人IgG)。B.流通裝置的構(gòu)造和設(shè)計(jì)在流通裝置的操作中，將流體樣品(如體液樣品)置于與膜接觸。通常，流通裝置還包括接收和暫時(shí)保留所需體積的流體樣品的加樣區(qū)(或貯器)。樣品通過膜基質(zhì)。在該過程中，樣品中的分析物(如抗類脂抗體)可以特異性地結(jié)合固定的俘獲試劑(如氧化心磷脂-連接分子復(fù)合物)。當(dāng)需要檢測(cè)分析物-俘獲試劑復(fù)合物時(shí)，可以加入檢測(cè)試劑(如標(biāo)記蛋白A，標(biāo)記蛋白G，標(biāo)記抗人IgG或標(biāo)記心磷脂)和樣品，或者可以在加樣后加入含有檢測(cè)試劑的溶液。如果分析物被俘獲試劑特異性結(jié)合，則在膜表面上可以觀察到可歸因于特定檢測(cè)試劑的視覺表現(xiàn)。在該過程的任何時(shí)間，例如，在加樣后和/或在加入檢測(cè)試劑后，都可以加入任選的洗滌步驟。C.側(cè)流裝置的構(gòu)造和設(shè)計(jì)側(cè)流裝置具有很多種同樣為本領(lǐng)域所公知的物理形式。支持和/或容納功能關(guān)系正確的側(cè)流裝置的基本組件的任何物理形式均包括在本公開內(nèi)容中。圖7顯示了側(cè)流裝置的幾個(gè)實(shí)施例。這些實(shí)施例表現(xiàn)了一些可用于側(cè)流裝置的構(gòu)造的物理實(shí)施方案。樣品墊(如圖8中的樣品墊14)是側(cè)流裝置的任選部件，其最初接收樣品，并起到從樣品中除去微粒的作用。在可用來構(gòu)建樣品墊的各種材料(見表l)中，如果較大的床體積(例如，250/d/cm2)是特定應(yīng)用的因素，則纖維素樣品墊是有益的。樣品墊可以用一種或多種釋放劑處理，如緩沖劑、鹽、蛋白質(zhì)、洗滌劑和表面活性劑。這些釋放劑對(duì)例如，促進(jìn)偶聯(lián)物墊成分的再溶解，以及阻斷側(cè)流裝置的其它組件如硝化纖維素膜中的非特異性結(jié)合位點(diǎn)有用。代表性釋放劑包括，例如，海藻糖或葡萄糖(1%-5%)，PVP或PVA(0.5%-2%)，吐溫20或TritonX-100(0.1%-1%)，酪蛋白(1%-2°/0)，SDS(0.02%-5%)和PEG(0,02%-5%)。2.膜和施加溶液00156前面已經(jīng)討論過了可用于側(cè)流裝置的膜的類型(如硝化纖維素，尼龍和PVDF)以及對(duì)將俘獲試劑加入這些膜的考慮。3.偶聯(lián)物墊001571偶聯(lián)物墊(如圖8中的偶聯(lián)物墊20)尤其起到容納檢測(cè)試劑的作用。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑可以從例如，顯色劑瓶外加，在這種情況下，側(cè)流裝置不需要包含偶聯(lián)物墊(參見，例如，美國專利No.4,740,468)。完成心磷脂氧化后，在不斷攪棒下通過加入80mg亞硫酸氫鈉的200yl蒸餾水，停止NaKVKMn04反應(yīng)混合物反應(yīng)。然后有色混合物變成無色(比較圖1B和圖1C)。停止反應(yīng)的混合物以1000Xg離心5min。離心后，可見兩相(圖1D)。001781任選地，將上清正丁醇相置于蒸發(fā)圓底燒瓶中，并在真空下干燥?；蛘?，正丁醇相用10mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)或其它緩沖液透析，將醇溶劑置換成適于其中含有氧化心磷脂的下一個(gè)計(jì)劃應(yīng)用的溶液，例如，在免疫色譜分析中使用，或者，例如，與連接分子偶聯(lián)。如圖2所示，正如泳道A中距離原點(diǎn)最遠(yuǎn)的黑斑所表明的那樣，未改性心磷脂主要遷移至TLC測(cè)試條的頂端。如章節(jié)IV中所述，心磷脂天然包括分子的異質(zhì)群體。由于亞油酸占心磷脂的脂肪酸側(cè)鏈的約卯％，因此圖2泳道A中的黑斑可能代表主要含亞油酸的心磷脂分子(以及密切相關(guān)的心磷脂形式)。較少表現(xiàn)的心磷脂形式很可能具有不同遷移率，并可以解釋在遷移的方向上泳道A中觀察到的輕微污跡。100180如前所示，心磷脂的氧化氧化了烯烴，裂解了脂肪酸側(cè)鏈，并向一條或多條脂肪酸側(cè)鏈中引入了羧基。氧化心磷脂中存在的羧基與TLC測(cè)試條的氧化硅基質(zhì)的相互作用更強(qiáng)，這阻礙了氧化心磷脂形式沿測(cè)試條的遷移。因此，在氧化心磷脂制品(見圖2，泳道B和D1)中，遷移方向上的污跡變得更顯著(比較泳道A與泳道B和D1)。此外，脂肪酸側(cè)鏈的氧化裂解產(chǎn)生了烷基羧化物，其在這些條件下在TLC測(cè)試條上具有的遷移率很小。如圖2的泳道B和D2所示，認(rèn)為與原點(diǎn)同延的白斑(由于染料排斥)代表羧化物。如本實(shí)施例中所述進(jìn)行心磷脂氧化后，心磷脂的氧化形式主要存在于正丁醇相(在圖2，泳道Dl中顯示)中，而烷基羧化物則主要存在于水相(見圖2，泳道D2)。00181如通過與梅毒血清的反應(yīng)性(參見，例如，實(shí)施例4)判斷的那樣，上層正丁醇相("醇相")(見圖2，泳道Dl)含有氧化心磷脂種類，而下層水相(見圖2，泳道D2)根據(jù)TLC結(jié)果，被認(rèn)為主要含有丙二酸和己酸副產(chǎn)物的混合物。實(shí)施例2氧化心磷脂的活化和與連接分子的偶聯(lián)100182]本實(shí)施例說明了用EDC和NHS使氧化心磷脂與BSA或KLH偶聯(lián)的幾種方法。A.方法一如前所述，在實(shí)施例1的條件下進(jìn)行的氧化氧化了烯烴，裂解了脂肪酸側(cè)鏈，并向心磷脂和卵磷脂的一條或多條脂肪酸側(cè)鏈中引入了羧基。氧化的分子中存在的羧基與TLC條的氧化硅基體的相互作用更強(qiáng)，這阻礙了氧化形式沿條的遷移。因此，在心磷脂和卵磷脂的氧化混合物中，觀察到了遷移方向上的顯著污跡(見圖8，泳道B和C)。此外，脂肪酸側(cè)鏈的氧化裂解產(chǎn)生了垸基羧化物，其在這些條件下在TLC條上的遷移率很小。如圖8的泳道D明顯看出，羧化物被認(rèn)為由與原點(diǎn)同延的白斑(由于染料排斥)所代表。如本實(shí)施例中所述心磷脂/卵磷脂混合物氧化后，心磷脂的氧化形式主要存在于正丁醇相(在圖8，泳道C中顯示)中，而垸基羧化物則主要存在于水相(見圖8，泳道D)。A.氧化心磷脂/卵磷脂混合物的BSA和KLH偶聯(lián)物00219如實(shí)施例2的方法3所述，將心磷脂和卵磷脂的氧化混合物與BSA或KLH偶聯(lián)。表5中描述了BSA-或KLH-偶聯(lián)的心磷脂/卵磷脂制品。表5.心磷脂/卵磷脂混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表5.心磷脂/卵磷脂混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>B.氧化的心磷脂/卵磷脂混合物的RPR抑制試驗(yàn)從被認(rèn)為處于產(chǎn)生血清水平的抗類脂抗體的病癥風(fēng)險(xiǎn)下的人類對(duì)象收集全血。這些病癥包括，例如，梅毒密螺旋體感染(即，梅毒)或狼瘡。通過本領(lǐng)域公知方法，從全血分離血清。用例如，生理鹽水或其它不使其變性或以其它方式影響血清中存在的抗類脂抗體的特異性結(jié)合或以其它方式干擾所述方法的溶液稀釋血清。[00226將血清樣品加到含有移動(dòng)或可移動(dòng)的標(biāo)記的氧化心磷脂-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測(cè)試劑的硝化纖維素條上。該偶聯(lián)物可以是，例如，金標(biāo)記的氧化心磷脂-BSA，或金標(biāo)記的氧化心磷脂-KLH偶聯(lián)物，或氧化心磷脂和氧化卵磷脂的金標(biāo)記的BSA偶聯(lián)混合物，或氧化心磷脂和氧化卵磷脂的金標(biāo)記的KLH偶聯(lián)混合物。[00227血清樣品中存在的抗類脂抗體將與檢測(cè)試劑的心磷脂結(jié)合，并流向(如通過毛細(xì)作用，或通過側(cè)流力)硝化纖維素條中固定了蛋白A或抗人抗體俘獲試劑的部分。與心磷脂檢測(cè)試劑復(fù)合的抗類脂抗體將被蛋白A或抗人抗體俘獲試劑俘獲。以這種方式累積檢測(cè)試劑復(fù)合物將導(dǎo)致硝化纖維素上在固定了俘獲試劑的區(qū)域中出現(xiàn)可檢測(cè)的信號(hào)(例如，可見信號(hào))。00228所述可檢測(cè)信號(hào)的出現(xiàn)表明血清樣品中存在抗類脂抗體，并可用于某些病癥如梅毒或狼瘡的診斷。實(shí)施例10用酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)人血清中的抗類脂抗體00229本實(shí)施例證明了人血清中存在的抗類脂抗體可以用固定在用于迸行酶聯(lián)免疫分析的微量滴定板中的、與BSA或KLH偶聯(lián)的氧化心磷脂作為俘獲試劑進(jìn)行檢測(cè)。BSA和KLH的替代物包括合成蛋白MAPS，IgY，鏈霉親和素和親和素。將96孔微量滴定板的孔用100pl(10貼/ml)含有10(xg/ml氧化心磷脂-BSA或氧化心磷脂-KLH復(fù)合物的溶液包被。令溶液在37°C干燥過夜。然后各孔用至少200川1%酪蛋白的Tris磷酸鹽緩沖鹽水(TPBS)溶液(pH7.2)在室溫下阻斷2h。各孔用200[ilTPBS洗滌一次。然后，將100jil用1%酪蛋白TPBS1:20、1:40、1:80或1:160稀釋的人血清(對(duì)照或來自梅毒感染個(gè)體)加入各孔。微量滴定板在室溫孵育60min;然后用200idTBST洗滌3次。在室溫下向各孔中加入100(il用1%酪蛋白TPBS以l:3000稀釋的、與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人抗體45min。用TPBS洗滌微量滴定板3次，然后每孔加入100^TMB底物。在HRP存在下，TMB底物變色。加入2M硫酸，停止HRP酶-底物反應(yīng)。分光光度法在450nm處讀出各孔中溶液。[00230如表7和8所示，人梅毒血清("反應(yīng)性")中存在的抗類脂抗體與固定在微量滴定板的孔中的氧化心磷脂-BSA或-KLH復(fù)合物結(jié)合。然而，對(duì)照("非反應(yīng)性")血清與同樣的固定抗原卻無明顯結(jié)合。表7.用氧化心磷脂-BSA抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>各數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)(結(jié)果已顯示)。RPR試驗(yàn)測(cè)得該數(shù)據(jù)組所用梅毒血清具有1:64的滴度。Table8.用氧化心磷脂-BSA抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>_Table8.用氧化心磷脂-BSA抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析_各數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)(結(jié)果已顯示)。RPR試驗(yàn)測(cè)得該數(shù)據(jù)組所用梅毒血清具有1:128的滴度。00231盡管本公幵內(nèi)容已重點(diǎn)對(duì)特定實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，顯而易見的是可以使用特定實(shí)施方案的變體，并打算本公開內(nèi)容可以以本文具體描述之外的方式實(shí)施。與本發(fā)明的具體方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├Y(jié)合進(jìn)行描述的特征、特性、化合物、化學(xué)部分或例子應(yīng)理解為適用于本發(fā)明的任何其它方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?。因此，本公開內(nèi)容包括所附權(quán)利要求書限定的本公開內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)涵蓋的所有修改。權(quán)利要求1.與抗類脂抗體具有免疫反應(yīng)性、并且能結(jié)合蛋白質(zhì)以連接至基體上的氧化心磷脂的制備方法，其中心磷脂包括中心甘油部分和脂肪酸側(cè)鏈，該方法包括使心磷脂與高碘酸鹽和高錳酸鹽反應(yīng)，以氧化心磷脂的脂肪酸側(cè)鏈，從而在一條或多條側(cè)鏈上提供末端羧基；在心磷脂與高碘酸鹽和高錳酸鹽反應(yīng)后，向心磷脂懸浮液中加入還原劑，以淬滅心磷脂的氧化和將中心甘油部分中形成的β-酮還原成β-羥基，從而保留中心甘油部分的免疫原性；以及活化氧化心磷脂的羧基，使蛋白質(zhì)載體與至少一個(gè)羧基共價(jià)連接。2.權(quán)利要求l的方法，其中心磷脂的反應(yīng)發(fā)生在醇溶劑中。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中心磷脂的反應(yīng)發(fā)生在氬氣氛中。4.權(quán)利要求2的方法，其中醇是正丁醇、乙醇、丙醇或甲醇中的一種或多種。5.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的方法，其中活化羧基包括使氧化心磷脂與碳二亞胺反應(yīng)。6.權(quán)利要求5的方法，其中碳二亞胺包括l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。7.權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的方法，其中在心磷脂與高錳酸鹽反應(yīng)之前心磷脂與高碘酸鹽反應(yīng)。8.利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中高碘酸鹽是偏高碘酸鈉，并且高錳酸鹽是高錳酸鉀。9.權(quán)利要求8的方法，其中偏高碘酸鈉與心磷脂的摩爾比為約4:1至約5:1。10.權(quán)利要求8的方法，其中高錳酸鉀與心磷脂的摩爾比為約0.5:1至約1:1。11.權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)的方法，其中還原劑是亞硫酸氫鈉。12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，還包括在加入還原劑后分離水相和醇相，以及從醇相中回收氧化的心磷脂。13.權(quán)利要求l-12任一項(xiàng)的方法，還包括使蛋白質(zhì)與至少一個(gè)活化的羧基共價(jià)連接，以提供心磷脂-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。14.權(quán)利要求13的方法，其中共價(jià)連接蛋白質(zhì)包括連接牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或親和素。15.權(quán)利要求5的方法，其中活化羧基還包括在羧基與EDC反應(yīng)后，使羧基與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)。16.權(quán)利要求13的方法，其中共價(jià)連接蛋白質(zhì)包括通過使氧化心磷脂與碳二亞胺和然后與NHS反應(yīng)以提供產(chǎn)物來活化羧基，然后使該產(chǎn)物與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。17.權(quán)利要求16的方法，其中蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白(BSA)，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或親和素。18.與抗類脂抗體具有免疫反應(yīng)性、并且能結(jié)合蛋白質(zhì)以連接至基體上的氧化心磷脂的制備方法，其中心磷脂包括中心甘油部分和脂肪酸側(cè)鏈，該方法包括使心磷脂與偏高碘酸鈉和高錳酸鉀在正丁醇溶劑中于氬氣氛下反應(yīng)，以氧化心磷脂，并在一條或多條脂肪酸側(cè)鏈上提供末端羧基；在心磷脂與偏高碘酸鈉和高錳酸鉀反應(yīng)后，向心磷脂懸浮液中加入亞硫酸氫鈉水溶液，以淬滅心磷脂的氧化和將中心甘油部分中形成的/5-酮還原成0-羥基，從而保留中心甘油部分的免疫原性；以及活化氧化心磷脂的末端羧基，使蛋白質(zhì)載體與至少一個(gè)羧基共價(jià)連接，其中活化羧基包括使氧化心磷脂與EDC和然后與NHS反應(yīng)；和使蛋白質(zhì)與一個(gè)或多個(gè)活化羧基偶聯(lián)。19.制造側(cè)流裝置的方法，包括向側(cè)流基體連接通過權(quán)利要求13的方法制備的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。20.權(quán)利要求19的方法，還包括向側(cè)流基體連接與梅毒密螺旋體抗體反應(yīng)的密螺旋體抗原。21.權(quán)利要求19或20的方法，其中基體是硝化纖維素基體。22.制造側(cè)流裝置的方法，包括向側(cè)流基體連接通過權(quán)利要求18的方法制備的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。23.權(quán)利要求22的方法，還包括向側(cè)流基體連接與梅毒密螺旋體抗體反應(yīng)的密螺旋體抗原。24.權(quán)利要求22或23的方法，其中基體是硝化纖維素基體。25.通過權(quán)利要求19-24任一項(xiàng)的方法制造的側(cè)流裝置。26.用于測(cè)定流體樣品中抗類脂抗體的存在和/或量的側(cè)流裝置，包括加樣區(qū)；和心磷脂俘獲區(qū)，包括對(duì)抗類脂抗體具有結(jié)合親和力的固定的氧化心磷脂；其中加在加樣區(qū)中施加的液體以從加樣區(qū)流向心磷脂俘獲區(qū)的流動(dòng)方向流動(dòng)，并且抗類脂抗體和固定的氧化心磷脂間的復(fù)合物的形成是能被檢測(cè)的，以確定流體樣品中抗類脂抗體的存在和/或量。27.權(quán)利要求26的側(cè)流裝置，還包括在從加樣區(qū)到心磷脂俘獲區(qū)的流動(dòng)通道中的偶聯(lián)物墊，其中偶聯(lián)物墊包括移動(dòng)或可移動(dòng)的檢測(cè)試劑。28.權(quán)利要求27的側(cè)流裝置，其中固定的氧化心磷脂的制備方法包括在保留心磷脂的抗原性的同時(shí)，使心磷脂與高碘酸鹽和高錳酸鹽反應(yīng)，以氧化心磷脂的脂肪酸側(cè)鏈；在心磷脂與高碘酸鹽和高錳酸鹽反應(yīng)后，向心磷脂懸浮液中加入還原劑；和活化氧化心磷脂的羧基，使蛋白質(zhì)載體與至少一個(gè)羧基共價(jià)連接；然后共價(jià)連接蛋白質(zhì)載體。29.權(quán)利要求28的裝置，其中檢測(cè)試劑包括標(biāo)記的氧化心磷脂。30.權(quán)利要求29的裝置，其中標(biāo)記的氧化心磷脂包括標(biāo)記，其中標(biāo)記包括酶、膠體金顆粒、有色乳膠顆粒、吸附蛋白質(zhì)的銀顆粒、吸附蛋白質(zhì)的鐵顆粒、吸附蛋白質(zhì)的銅顆粒、吸附蛋白質(zhì)的硒顆粒、吸附蛋白質(zhì)的硫顆粒、吸附蛋白質(zhì)的碲顆粒、吸附蛋白質(zhì)的碳顆?；虻鞍着悸?lián)染料囊中的一種或多種。31.權(quán)利要求26的裝置，其中固定的氧化心磷脂根據(jù)權(quán)利要求18的方法制備。32.權(quán)利要求26的裝置，還包括在始自加樣區(qū)的流動(dòng)通道中的密螺旋體俘獲區(qū)，所述密螺旋體俘獲區(qū)包括對(duì)抗梅毒密螺旋體抗體具有結(jié)合親和力的固定的密螺旋體抗原。33.權(quán)利要求32的裝置，還包括在加樣區(qū)至密螺旋體俘獲區(qū)的流動(dòng)通道中的偶聯(lián)物墊，其中所述偶聯(lián)物墊包括密螺旋體抗原的移動(dòng)或可移動(dòng)的檢測(cè)試劑。34.權(quán)利要求33的裝置，其中偶聯(lián)物墊還包括心磷脂的移動(dòng)或可移動(dòng)的檢測(cè)試劑。35.通過分析來自對(duì)象的生物樣品診斷梅毒的方法，包括將生物樣品施加到權(quán)利要求27的裝置中；和在俘獲區(qū)檢測(cè)抗類脂抗體、氧化心磷脂和檢測(cè)試劑間復(fù)合物的形成，其中對(duì)俘獲區(qū)中復(fù)合物形成的檢測(cè)檢測(cè)了樣品中的抗類脂抗體。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述裝置還包括在加樣區(qū)至心磷脂俘獲區(qū)的流動(dòng)通道中的偶聯(lián)物墊，其中偶聯(lián)物墊包括心磷脂的移動(dòng)或可移動(dòng)的檢測(cè)試劑，并且檢測(cè)復(fù)合物的形成包括檢測(cè)包含移動(dòng)或可移動(dòng)的檢測(cè)試劑的復(fù)合物的形成。37.權(quán)利要求35或36的方法，其中固定的氧化心磷脂通過心磷脂與高碘酸鹽和高錳酸鹽反應(yīng)，使心磷脂氧化，活化氧化心磷脂的羧基使蛋白質(zhì)載體與至少一個(gè)羧基共價(jià)連接，然后共價(jià)連接蛋白質(zhì)載體而制得。38.權(quán)利要求36的方法，其中檢測(cè)試劑包括標(biāo)記的氧化心磷脂。39.權(quán)利要求38的方法，其中標(biāo)記的氧化心磷脂包括標(biāo)記，其中標(biāo)記包括酶、膠體金顆粒、有色乳膠顆粒、吸附蛋白質(zhì)的銀顆粒、吸附蛋白質(zhì)的鐵顆粒、吸附蛋白質(zhì)的銅顆粒、吸附蛋白質(zhì)的硒顆粒、吸附蛋白質(zhì)的硫顆粒、吸附蛋白質(zhì)的碲顆粒、吸附蛋白質(zhì)的碳顆粒或蛋白偶聯(lián)染料囊中的一種或多種。40.權(quán)利要求38的方法，其中固定的氧化心磷脂根據(jù)權(quán)利要求18的方法制備。41.權(quán)利要求35的方法，其中所述裝置還包括在始自加樣區(qū)的流動(dòng)通道中的密螺旋體俘獲區(qū)，所述密螺旋體俘獲區(qū)包括對(duì)抗梅毒密螺旋體抗體具有結(jié)合親和力的固定的密螺旋體抗原，并且檢測(cè)復(fù)合物的形成還包括檢測(cè)俘獲區(qū)中抗梅毒密螺旋體抗體、固定的密螺旋體抗原和檢測(cè)試劑間復(fù)合物的形成。42.用于同時(shí)檢測(cè)流體樣品中密螺旋體抗體和抗類脂抗體的存在和/或量的裝置，包括加樣區(qū)；包括至少一種移動(dòng)或可移動(dòng)的檢測(cè)試劑的偶聯(lián)物墊；包括對(duì)抗類脂抗體具有結(jié)合親和力的固定的氧化心磷脂的第一俘獲區(qū)；禾口包括對(duì)密螺旋體抗體具有結(jié)合親和力的第二固定結(jié)合配偶體的第二俘獲區(qū)；其中置于加樣區(qū)上的液體從加樣區(qū)經(jīng)偶聯(lián)物墊向第一和第二俘獲區(qū)的流動(dòng)方向流動(dòng)，并且，第一俘獲區(qū)中抗類脂抗體、氧化心磷脂和至少一種檢測(cè)試劑間的第一復(fù)合物的形成確定了流體樣品中抗類脂抗體的存在和/或量，而第二俘獲區(qū)中密螺旋體抗體、第二固定結(jié)合配偶體和至少一種檢測(cè)試劑間的第二復(fù)合物的形成確定了流體樣品中密螺旋體抗體的存在和/或量。43.診斷患者梅毒的方法，包括將生物樣品施加到權(quán)利要求42的裝置的加樣區(qū)，使生物樣品以流過偶聯(lián)物墊并流過第一及第二俘獲區(qū)的流動(dòng)方向流動(dòng)；檢測(cè)第一俘獲區(qū)中抗類脂抗體、氧化心磷脂和至少一種檢測(cè)試劑間的第一復(fù)合物的形成；和檢測(cè)第二俘獲區(qū)中密螺旋體抗體、第二固定結(jié)合配偶體和至少一種檢測(cè)試劑間的第二復(fù)合物的形成；其中對(duì)第一復(fù)合物和第二復(fù)合物的形成的檢測(cè)診斷了患者的梅毒。44.權(quán)利要求43的方法，其中加到加樣區(qū)的生物樣品是人的血樣。45.權(quán)利要求44的方法，其中加到加樣區(qū)的人的血樣是全血或血清。46.用于診斷梅毒的試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求27的裝置，將生物樣品施加到加樣區(qū)和解釋試驗(yàn)結(jié)果的說明書。47.通過分析來自對(duì)象的生物樣品來診斷狼瘡的方法，包括將生物樣品施加到權(quán)利要求27的裝置；和檢測(cè)俘獲區(qū)中抗類脂抗體、氧化心磷脂和檢測(cè)試劑間的復(fù)合物的形成，其中對(duì)俘獲區(qū)中復(fù)合物的形成的檢測(cè)檢測(cè)了樣品中的抗類脂抗體。全文摘要本發(fā)明描述了用于檢測(cè)抗類脂抗體和診斷疾病例如梅毒的組合物、方法和裝置。尤其是描述了氧化心磷脂，其可以與各種各樣的連接分子如BSA、KLH、生物素、合成蛋白質(zhì)MAPS、IgY、鏈霉親和素或親和素偶聯(lián)。這種氧化心磷脂，單獨(dú)或與一種或多種連接分子復(fù)合，在例如，用于側(cè)流裝置時(shí)，可用來檢測(cè)對(duì)象的抗類脂抗體。還描述了可以檢測(cè)抗類脂抗體和可以共同檢測(cè)生物樣品中的非密螺旋體和密螺旋體抗體的側(cè)流裝置。文檔編號(hào)G01N33/571GK101360997SQ200680051254公開日2009年2月4日申請(qǐng)日期2006年11月17日優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日發(fā)明者王慧英,阿諾德·R·卡斯特羅申請(qǐng)人:美國政府健康及人類服務(wù)部，疾病控制和預(yù)防中心