專利名稱：：酵母突變體中產(chǎn)生的糖基化多肽及其使用方法酵母突變體中產(chǎn)生的糖基化多肽及其使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求在2005年9月22日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)No.60/719,952的優(yōu)先權(quán)利益，其公開內(nèi)容在本文整體引為參考。關(guān)于聯(lián)邦政府贊助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明在美國(guó)政府支持下進(jìn)行，其國(guó)家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)資助號(hào)為AI51卯3和AI58724。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明可具有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：一些病原體表達(dá)的復(fù)合糖便于病原體逃離宿主的免疫應(yīng)答，并促成諸:i口肺炎鏈3求菌(iS^印tococcMS/mew附ort/"e)、腦膜炎奈瑟菌(7V"'5^nVi膨/"g/ftVfo)、流感嗜血桿菌(/fe附opM附/"/7we"w)、傷寒沙門氏菌(Sa/zw謂Cfl印/^i')和人免疫缺陷病毒("HIV")等生物感染之后的破壞性后遺癥。糖蛋白中的糖富含區(qū)域尤其是弱免疫原性的。導(dǎo)致免疫原性缺乏的因素包括由于糖的微觀不均一性所致的單抗原應(yīng)答的稀釋，以及高免疫原性蛋白質(zhì)表位的空間位阻影響。參閱例如Rudd等，CW,.Tev.祝0c&附.Afo/.5,》/.32:1-100(1997);Woods等，7Va似"祝o/.1:499-501(1994)。另外，病毒常常通過(guò)使用細(xì)胞糖基化機(jī)器來(lái)表達(dá)宿主已經(jīng)耐受的內(nèi)源聚糖來(lái)欺騙宿主免疫系統(tǒng)。糖蛋白，特別是gpl20,在HIV致病性方面的作用例證了復(fù)合糖在激發(fā)保護(hù)性宿主免疫應(yīng)答中的難度和重要性。像所有的病毒一樣，HIV需要細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器，以便在宿主中成功地繁殖其自身。HIV通過(guò)與特定細(xì)胞受體的相互作用進(jìn)入細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)此繁殖需求。具體地，HIV病毒顆粒在早期感染階段通過(guò)其病毒包膜蛋白("Env")與細(xì)胞CD4受體和CCR5細(xì)胞共受體的相互作用，在感染晚期通過(guò)CD4受體-CXCR4共受體復(fù)合物的相互作用進(jìn)入細(xì)胞，通常為T淋巴細(xì)胞。參閱例如P6hlmann等，丄Wra/.75:4664-72(2001);Teunis等，CW/100:587-97(2000)。Env蛋白是稱為gpl20的糖蛋白。在HIV病毒顆粒的表面，三個(gè)gpl20分子與另一細(xì)胞表面蛋白gp41非共價(jià)連接。參閱例如Zolla-Pazner，7V"似"Zev./附附wwo/.4:199-210(2004)。gp41是作為病毒包膜中同源三聚體復(fù)合物存在的跨膜糖蛋白。該gpUO-gp"復(fù)合物形成HIV病毒顆粒上的異源寡聚體刺突，所述病毒顆粒首先結(jié)合CD4/共受體復(fù)合物，隨后發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致病毒融合肽暴露，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。最近的證據(jù)提示有別于CD4/共受體相互作用的第二相互作用對(duì)于HIV傳播和感染也是關(guān)鍵性的，特別是在最早的階段。樹突細(xì)胞(DC),—種高度特異性的抗原呈遞細(xì)胞，是在感染之際被HIV靶向的第一類細(xì)胞。參閱Geijtenbeek等，00:587-97(2000)。粘膜處的DC捕獲、內(nèi)在化HIV并通過(guò)gpl20與DC上的細(xì)胞表面分子即DC-SIGN之間的相互作用將HIV從粘膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)至遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)。DC對(duì)完整病毒的遞送隨后導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞的感染。參閱Bashirova等，/.五jc/7.MW.193:671-78(2001)。換言之，DC-SIGN反式作用以介導(dǎo)HIV對(duì)CD4+細(xì)胞的有效感染。參閱P6hlmann等，/Ww/.75:4664-72(2001)。后來(lái)的研究顯示DC-SIGN也順式作用以促進(jìn)有效的病毒感染。參閱例如Lee等，/.Mw/.75:12028-38(2001)?？紤]到消除受感染細(xì)胞的難度，免疫應(yīng)答可能是最有效的如果被激發(fā)的應(yīng)答阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的話。迄今為止，gpl20的弱免疫原性妨礙了激發(fā)這類保護(hù)性應(yīng)答的嘗試。gpl20含有廣泛的糖基化和高度可變的環(huán)，其間分散著更加保守的、功能受限的區(qū)域，所述區(qū)域起著關(guān)鍵性gpl20表位的物理屏蔽作用，gpl20表位即與來(lái)自能夠阻斷病毒進(jìn)入或中和病毒的抗體的受體/共受體復(fù)合物相互作用的那些表位。參閱例如Garber等，4:397-413(2004)。然而，天然激發(fā)的中和抗體已經(jīng)被鑒定，證實(shí)了有效中和應(yīng)答的潛在可能。參閱例如Burton等，AWwre/附附wio/.5:233-36(2004)。在發(fā)現(xiàn)AIDS25年之后，開發(fā)HIV/AIDS疫苗以誘導(dǎo)抗廣謙HIV-1元代分離株(primaryisolate)的中和抗體仍然是一項(xiàng)具有高度挑戰(zhàn)性的努力。開發(fā)有效疫苗的挑戰(zhàn)性在于合適抗原表位的鑒定，所述表位能夠被免疫原性地呈遞從而激發(fā)宿主中的中和抗體。開發(fā)成功的HIV疫苗的挑戰(zhàn)性還由于元代HIV分離抹的龐雜多樣性而變得復(fù)雜化。參閱例如Gaschen等，^SWwce296:2354-60(2002)。迄今為止，傳統(tǒng)的疫苗設(shè)計(jì)方法在激發(fā)中和抗體應(yīng)答方面尚未被證明成功。在HIV疫苗的約30例臨床試驗(yàn)中，沒(méi)有一例能夠廣譜誘導(dǎo)中和抗體。主要的挑戰(zhàn)性之一在于缺乏適當(dāng)設(shè)計(jì)的抗原，其具有暴露于抗原表面并在大部分或所有的HIV-1亞型中高度保守的中和表位。PantophletR等，J/1wf/i^v/附/m1w0/.24:739-69,2006。迄今為止，僅從HIV-1感染的人類分離出四個(gè)具有廣譜有效中和活性的單克隆抗體(MAb)。DouekDC等，CW/124:677-81(2006)。其中沒(méi)有任何一個(gè)能夠在所有的測(cè)試動(dòng)物物種中復(fù)制。在這四個(gè)MAb中，一個(gè)耙向HIV-1envgpl20的構(gòu)象表位，兩個(gè)識(shí)別gp41,—個(gè)即2G12結(jié)合gpl20上的高甘露糖型糖。HIV感染最早的靶細(xì)胞是樹突細(xì)胞(DC),因此最有效的疫苗是破壞HIV靶向宿主DC的能力的疫苗。gp120的高甘露糖寡糖提供對(duì)于HIV-DC相互作用關(guān)鍵性的表位，從而提供了合適的疫苗靶標(biāo)。高甘露糖寡糖介導(dǎo)DC-SIGN和gpl20之間的相互作用。參閱Geijtenbeek等，CW/100:587-97(2000)。然而，天然存在的gpl20僅表達(dá)約20%的Man8GlcNAc2(Man8)和10%的Man9GlcNAc2(Man9)。參閱Scalan等，/.76:7306-21(2002)。一種藍(lán)細(xì)菌蛋白質(zhì)即藍(lán)藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N，CV-N)與gpl20的高甘露糖寡糖結(jié)合，特異性地識(shí)別Man9GlcNAc2(Man9)上的Manal，2-Man結(jié)構(gòu)和Man8GlcNAc2(Man8)的D1D3異構(gòu)體，并通過(guò)此相互作用充當(dāng)抗HIV的有效殺微生物劑。參閱Bewley等，/.爿附.C7^附.123:3982-902(2001);Sandstrom等，祝oc/ie附.43:13926-31(2004)。另外，天然存在的中和抗體之一特異性地識(shí)別gpl20的Manal，2-Man高甘露糖寡糖簇。參閱Scanlan等，/.Ww/.76:7306-21(2002)。稱為2G12抗體的這種抗體通過(guò)抑制HIV病毒顆粒與DC和CD4+T細(xì)胞的相互作用，有效地中和廣譜的HIV-1元代分離林。參閱例如Trkola等，/Ww/.70:1100-08(1996);Sanders等，/76:7293-305(2002)。作為HIV-1疫苗靶標(biāo)的高甘露糖型聚糖開發(fā)基于糖的HIV疫苗據(jù)認(rèn)為是預(yù)防性疫苗的新方法之一。Wang,CM/TO^rtZV"gZ^avI^ve/.9(2):194-206,2006。若干跡象已經(jīng)證明見于Man8NAcGlc2Dl和D3臂上的末端Manal,2-Man結(jié)構(gòu)(al，2-連接的甘露糖)構(gòu)成gpl20糖蛋白上的新靶標(biāo)，可能誘導(dǎo)有效的中和抗體，抵抗不同林系和亞型的HIV-1。Gpl20上的高甘露糖聚糖為廣譜中和性單抗MAb2G12所識(shí)別。已經(jīng)在嚙齒類中產(chǎn)生并從HIV-1感染的人類分離的抗gpl20的數(shù)百個(gè)Mab中，2G12是唯——個(gè)識(shí)別病毒糖并有效中和廣鐠HIV-1元代分離林的MAb。其通過(guò)抑制HIV-1與DC和CD4+T細(xì)胞的相互作用實(shí)現(xiàn)之。Trkola等，/.70(2):1100-8，1996;Scanlan等，J.76(14):7306畫21，2002;.Sanders等，/76(14):7293-305，2002。2G12的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)被鑒定為HIV-1envgpl20糖蛋白上的高甘露糖型聚糖。更具體地，2G12MAb與來(lái)自至少三個(gè)高甘露糖聚糖的末端al，2-連接的甘露糖殘基簇結(jié)合(Scanlan等，/Wra/.76(14):7306-21，2002);其不識(shí)別其它糖或具有不同末端鏈接(al，3-鏈接的或al，6-鏈接的甘露糖)的甘露糖殘基。高甘露糖聚糖上的Manal，2-Man結(jié)構(gòu)也是有效HIV-1抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)。稱作藍(lán)藻抗病毒蛋白-N(CV-N)的藍(lán)細(xì)菌蛋白質(zhì)能夠滅活多種多樣的HIV-l、HIV-2和SIV實(shí)驗(yàn)室林系和元代分離抹。Boyd等，^wftTw/crMj^"傷C^柳o幼^41(7):1521-30，1997。該蛋白質(zhì)也能夠阻斷HIV-lgpl20與CD4和共受體的相互作用、阻止病毒與細(xì)胞的融合并終止細(xì)胞感染。Esser等，/73(5):4360-71，1999。Dey等，/74(10):4562-9，2000。CV-N的這些有效特性歸因于其以極高親和力結(jié)合gpl20上的高甘露糖寡糖的能力。具體地，此抑制劑識(shí)別Man9GlcNAc2(Man9)上的Manal,2-Man結(jié)構(gòu)和Man8GlcNAc2(Man8)的D1D3異構(gòu)體，但是不識(shí)別其它形式的高甘露糖，包括Man7、Man6和Man5。Bewley等，/爿附C&附123(17):3892-902，2001;Sandstrom等，說(shuō)oc&附/s^v.43(44):13926-139312004。CV-N抑制HIV感染的能力構(gòu)成了能夠結(jié)合這些末端聚糖結(jié)構(gòu)的這類分子的效力論據(jù)。已經(jīng)顯示樹突細(xì)胞通過(guò)DC-SIGN與gpl20上高甘露糖聚糖的相互作用促進(jìn)感染。最近發(fā)現(xiàn)DC是體內(nèi)HIV靶向的第一種細(xì)胞類型。發(fā)現(xiàn)粘膜處的DC捕獲、內(nèi)在化HIV,并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)中它們將完整的病毒遞送給CD4+T淋巴細(xì)胞。Geijtenbeek等，Ce//.100:587-97，2000。發(fā)現(xiàn)所有測(cè)試的HIV-1、HIV-2、SIV和SHIV林系均與DC結(jié)合，DC-SIGN在該過(guò)程中起重要作用。Pohlmann等，/W/.75(10):4664-72,2001。HIV和DC-SIGN之間的相互作用是由gpl20上的高甘露糖聚糖介導(dǎo)的。Geijtenbeek等，CW/.100:587-97,2000。事實(shí)上，合成的高甘露糖寡糖能夠結(jié)合DC-SIGN，并阻止隨后的HIV相互作用。Feinberg等，5Wewce.294(5549):2163-6，2001。HIV-1的gpl20蛋白是重度糖基化的，并含有平均25個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)。其中約半數(shù)被高甘露糖型或雜合型聚糖占據(jù)(Leonard等，/B,WC7^附.265(18):10373-82，1990)，其中高甘露糖聚糖通過(guò)不同的結(jié)合位點(diǎn)與2G12、CV-N和DC-SIGN相互作用。MAb2G12與來(lái)自至少三個(gè)Man9或Man8殘基的Dl臂簇結(jié)合，CV-N以高親和力與來(lái)自單個(gè)Man9和Man8殘基的Dl和D3臂結(jié)合，而DC-SIGN通過(guò)其四聚體結(jié)合若干個(gè)甘露糖殘基?？傊?，這些結(jié)果意味著以高特異性的中和抗體抑制HIV感染早期階段的強(qiáng)可能性，所述抗體針對(duì)見于高甘露糖聚糖的Manal，2-Man結(jié)構(gòu)。主要的挑戰(zhàn)是開發(fā)這樣的抗原，所述抗原嚴(yán)格地含有具有末端al，2-連接的甘露糖結(jié)構(gòu)的高甘露糖，并激發(fā)針對(duì)[能夠與gpl20交叉反應(yīng)的I該表位的免疫原性應(yīng)答。已經(jīng)采用兩種方法構(gòu)建同源HIV-1糖肽，以建立基于糖肽的HIV疫苗。Wang，Cwr.O/;/"."ragZ)&cov.2)eve/.9(2):194-206，2006。這些方法是完全化學(xué)合成帶有雜合型或者高甘露糖型N-聚糖的HIV-1gpl20糖肽，以及構(gòu)建多種HIV-1糖肽的化學(xué)酶(chemoenzymatic)法。參閱Mandal等，^"gemC7^附./wt五d43:2557-2561，2004和Geng等，Jwgdv.C7^附./w,.Et/.43:2562-2565，2004;Singh等，C&附./>汰13:327-330，2003;Wang等，C7^附5/oC7^附.6:1068-1074(2005);Zeng等，/爿附.C7^肌5Vc127:9692-9693，2005;Li等，/C&抓70:99卯-9996，2005。然而，這些合成的糖肽需要在動(dòng)物模型中進(jìn)一步評(píng)價(jià)其免疫原性。發(fā)明概述能夠激發(fā)針對(duì)廣語(yǔ)病毒分離林的中和抗體的有效HIV疫苗是控制HIV流行病的最好希望。不幸的是，主要的障礙持續(xù)妨礙這類疫苗的開發(fā)，所述障礙包括Env糖蛋白的弱免疫原性、病毒抗原的多樣性和免疫逃避。響應(yīng)這些挑戰(zhàn)，本文提供的組合物提供了不同的重組抗原，所述抗原配備有對(duì)于HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞關(guān)鍵的多種復(fù)合糖表位。糖表位的數(shù)量增加，使得這些表位的免疫原性及其在疫苗組合物中激發(fā)中和抗體的相對(duì)效力最大化。例如，本文提供的gpl20表達(dá)基本上均一的帶有末端al-2聚糖的甘露糖寡糖，例如甘露糖-9-N-乙酰葡萄糖胺-2("MaN9GlcNAc2")或Man8GlcNAc。本文還說(shuō)明了制備這種高甘露糖gpl20組合物和使用所得的組合物激發(fā)有效的抗HIV中和抗體應(yīng)答的方法。因此，本文提供了基本上均一的糖基化重組蛋白質(zhì)，其中末端聚糖是13末端al-2聚糖結(jié)構(gòu)。重組蛋白質(zhì)可以如下獲得用編碼蛋白質(zhì)的核苷^列轉(zhuǎn)化酉良酒酵母(Sacc/iflw/MjY^ccev/^V^)變體、發(fā)酵經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并從細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中分離蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是毒力因子。蛋白質(zhì)可以是病毒蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，病毒蛋白質(zhì)是表面蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是人免疫缺陷病毒的gpl20。末端聚糖可以是甘露糖。在一些實(shí)施方案中，聚糖為寡甘露糖。在一些實(shí)施方案中，末端al-2結(jié)構(gòu)位于Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2上，或其組合。本文還提供了制備均一糖基化重組蛋白質(zhì)的方法，其中末端聚糖是末端al-2聚糖結(jié)構(gòu)，所述方法包括a)提供含蛋白質(zhì)編碼核苦酸序列的載體；b)轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)糖基化缺陷型細(xì)胞；c)發(fā)酵經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和d)從細(xì)胞上清液中純化分泌的重組蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列編碼以其天然狀態(tài)糖基化的蛋白質(zhì)。核苷^列可以編碼為毒力因子的蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，核苷酸序列編碼gpl20蛋白。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)帶有大量Man9GlcNAc2或MansGlcNAc2的gpl20。本方法的細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞，如釀酒酵母附M^A或釀酒酵母/7附WJ。載體可以是YEpL，且在一些實(shí)施方案中可以含有GAL1啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，使用His標(biāo)簽純化糖蛋白。本文還提供了制備抗體的方法，所述抗體特異性地結(jié)合包含末端al-2聚糖結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，所述方法包括用有效量的組合物免疫動(dòng)物，所述組合物包含通過(guò)本文公開的方法制備的重組蛋白質(zhì)或本文公開的蛋白質(zhì)。組合物還可以包含佐劑、運(yùn)載體或二者均有。本文提供了通過(guò)本文公開的方法產(chǎn)生的分離的抗體，以及產(chǎn)生所述分離的抗體的雜交瘤。本文還提供了用于激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的受試者抗體的組合物，所述組合物包含分離的糖基化多肽和可藥用的賦形劑，所述多肽包含至少兩個(gè)被抗體2G12識(shí)別的N-連接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50%的N-連接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖為Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其組合。本文還提供了用于激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的I受試者抗體的組合物，所述組合物包含分離自突變真菌[所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl，或破壞了的釀酒酵母基因pmrl同源物基因I的糖基化多肽和可藥用的賦形劑，其中糖基化多肽被抗體2G12識(shí)別。本文還提供了用于激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的受試者抗體的組合物，所述組合物包含分離自突變真菌[所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl，或破壞了的釀酒酵母基因pmrl和miinl同源物基因的糖基化多肽和可藥用的賦形劑，其中糖基化多肽被抗體2G12識(shí)別。本文還提供了用于激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的受試者抗體的組合物，所述組合物包含分離自突變真菌[所述突變真菌具有石皮壞了的酉良酒酵母基因ochl和mnnl或者ochl、mnnl和mnn4，或石皮壞了的酉良酒酵母基因ochl和mnnl或者ochl、mnnl和mnn4同源物基因I的糖基化多肽和可藥用的賦形劑，其中糖基化多肽被抗體2G12識(shí)別。本文還提供了用于制備激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的受試者抗體的組合物的方法，所述方法包括a)發(fā)酵突變真菌，其中所述突變真菌被突變以產(chǎn)生糖基化多肽，其中所述糖基化多肽包含至少兩個(gè)被抗體2G12識(shí)別的N-連接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50%的N-連接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中所述高甘露糖寡糖是Man9GlcNAc2、MansGlcNAc2或其組合；和b)從突變真菌細(xì)胞裂解物或上清液中分離糖基化多肽。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將糖基化多肽與可藥用賦形劑配制的步驟。在一些實(shí)施方案中，突變真菌是具有破壞了的ochl、mnnl和mnn4基因的酉良酒酵母，具有破壞了的ochl和mnnl基因的釀酒酵母，具有破壞了的pmrl和mnnl基因的釀酒酵母，或具有破壞了的ochl基因的巴斯德畢赤酵母CPZc/^Vi/mstoWs)或白色念珠菌本文還提供了用于制備激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的受試者抗體的組合物的方法，所述方法包括a)發(fā)酵突變真菌，其中所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl同源物基因；和b)從突變真菌細(xì)胞中分離被抗體2G12識(shí)別的糖基化多肽。該方法還可包括將糖基化多肽與可藥用賦形劑配制的步驟。在一些實(shí)施方案中，突變真菌是其中pmrl基因破壞了的釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母。在一些實(shí)施方案中，突變真菌已經(jīng)在步驟a)之前用含糖基化多肽編碼核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，糖基化多肽是HIVgpl20或其片段。本文還提供了用于制備激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的受試者抗體的組合物的方法，所述方法包括a)發(fā)酵突變真菌，其中所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl同源物基因；和b)從突變真菌細(xì)胞中分離被抗體2G12識(shí)別的糖基化多肽。該方法還可包括將糖基化多肽與可藥用賦形劑配制的步驟。在一些實(shí)施方案中，突變真菌是其中pmrl和mrnil基因破壞了的釀酒酵母。在一些實(shí)施方案中，突變真菌已經(jīng)在步驟a)之前用含有糖基化多肽編碼核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，糖基化多肽是HIVgpl20或其片段。本文還提供了用于制備激發(fā)[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的]受試者抗體的組合物的方法，所述方法包括a)發(fā)酵突變真菌，其中所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因ochl和mnnl或者ochl、mnnl和mnn4同源物基因；和b)從突變真菌細(xì)胞中分離被抗體2G12識(shí)別的糖基化多肽。該方法還可包括將糖基化多肽與可藥用賦形劑配制的步驟。在一些實(shí)施方案中，突變真菌是ochl、mnnl和mnn4基因破壞了的釀酒酵母，或ochl和mnnl基因破壞了的釀酒酵母。在一些實(shí)施方案中，突變真菌已經(jīng)在步驟a)之前用含有糖基化多肽編碼核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，糖基化多肽是HIVgpl20或其片段。本文還提供了含有多核苷酸的突變真菌細(xì)胞，所述多核苷酸包含gpl20或其包含至少兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的片段的編碼核苷酸序列，其中突變酵母細(xì)胞能夠產(chǎn)生gpl20或其片段，所述片段包含至少兩個(gè)能被抗體2G12識(shí)別的N-連接的高甘露糖寡糖，其中所述高甘露糖寡糖為Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其組合。在一些實(shí)施方案中，突變真菌是ochl、mniil和mim4基因石皮i不了的酉良酒酵母，ochl和miml基因-皮3不了的釀酒酵母，或ochl基因破壞了的巴斯德畢赤酵母或白色念珠菌。在一些實(shí)施方案中，突變真菌是pmrl和mnnl基因破壞了的釀酒酵母。在一些實(shí)施方案中，突變真菌是pmrl基因破壞了的釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母。本文還提供了包舍突變酵母完整細(xì)胞和可藥用賦形劑的組合物，其中所述突變酵母具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl，ochl和mnnl,或ochl、mnnl和mnn4;或破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl,ochl和mnnl,或ochl、mnnl和mnn4同源物基因。本文還提供了用于產(chǎn)生[對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的I受試者抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的任何本文所述的組合物。本文還提供了對(duì)受試者誘導(dǎo)抗病原體(如HIV)的中和抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的任何本文所述的組合物。本文還提供了對(duì)需要的受試者誘導(dǎo)抗病原體的中和抗體的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的藥物組合物，所述組合物包含本文提供的蛋白質(zhì)或通過(guò)本文提供的方法制備的蛋白質(zhì)以及適宜的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括施用佐劑。在具體的實(shí)施方案中，病原體為HIV。本文還提供了對(duì)受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的任何本文所述的組合物。本文還提供了對(duì)需要的受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含本文提供的蛋白質(zhì)或通過(guò)本文提供的方法制備的蛋白質(zhì)，以及適宜的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括施用佐劑。在具體的實(shí)施方案中，病原體為HIV。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為gpl20。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含來(lái)自不同HIV林系的多種gpl20蛋白。本文還提供了用于鑒定與N-連接的高甘露糖寡糖特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括檢測(cè)抗體與糖基化多肽(其包含^L抗體2G12識(shí)別的至少兩個(gè)N-連接的高甘露糖寡糖)的結(jié)合，其中糖基化多肽上大于50%的N-連接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其組合。本文還提供了用于鑒定與N-連接的高甘露糖寡糖特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括檢測(cè)抗體與突變真菌中產(chǎn)生的糖蛋白的結(jié)合，所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl或破壞了的釀酒酵母基因pmrl同源物基因，其中糖蛋白被抗體2G12識(shí)別。本文還提供了用于鑒定與N-連接的高甘露糖寡糖特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括檢測(cè)抗體與突變真菌中產(chǎn)生的糖基化多肽的結(jié)合，所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl或破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl同源物基因，其中糖蛋白被抗體2G12識(shí)別。本文還提供了用于鑒定與N-連接的高甘露糖寡糖特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括檢測(cè)抗體與突變真菌中產(chǎn)生的糖基化多肽的結(jié)合，所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因ochl和mnnl或者ochl、mnnl和mnn4，或石皮i不了的酉良酒酵母基因ochl和miml或者ochl、miml和mnn4同源物基因，其中糖蛋白被抗體2G12識(shí)別。在一些實(shí)施方案中，抗體存在于HIV感染受試者的血清中。在一些實(shí)施方案中，糖基化多肽存在于突變辨母細(xì)胞裂解物中。本文還提供了鑒定用于HIV傳染的中和性單克隆抗體的方法，所述方法包括a)將第一細(xì)胞與第二細(xì)胞接觸，其中所述第一細(xì)胞表達(dá)樹突細(xì)胞特異性的C型凝集素(DC-SIGN)，所述第二細(xì)胞表達(dá)CD4+和CCR5+，b)將第一和第二細(xì)胞與傳染性病毒顆粒共培養(yǎng)；c)將共培養(yǎng)物與通過(guò)權(quán)利要求20的方法制備的候選抗體接觸；和d)測(cè)定相對(duì)傳染性，其中中和抗體降低或消除傳染性病毒顆粒對(duì)第二細(xì)胞相對(duì)傳染性。附圖的簡(jiǎn)短說(shuō)明圖1闡述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高甘露糖的結(jié)構(gòu)和加工。左邊的方框顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER中聚糖從前體到Man8的加工。主要帶有Man8的蛋白質(zhì)隨之被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體進(jìn)行進(jìn)一步加工(右上方框，以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例)。當(dāng)阻斷ER到高爾基體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[例如通過(guò)酵母中Pmrl基因突變時(shí)，這些聚糖不會(huì)被進(jìn)一步加工，得到僅含有Man8和Man9形式聚糖的糖蛋白(右下)。圖2顯示酵母中HIVgpl20糖蛋白的表達(dá)。A:d/7附r/中來(lái)自3個(gè)HIV-1林系的gpl20蛋白的表達(dá)被半乳糖誘導(dǎo)指定天數(shù)。用2G12檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)。B:純化的HIVYU2gpl20。第1道顯示濃縮的酵母培養(yǎng)基，第2道是透析和離心之后，第3道和第4道分別是GNL和凝膠過(guò)濾之后的200ng和400ng，第5道和第6道是在293T細(xì)胞中產(chǎn)生的200ng和400ngHIVYU2gpl20。圖3顯示酵母中產(chǎn)生的gpl20蛋白的EndoH消化測(cè)定。對(duì)用于MS/MS分析的相同批次的純化gpl20蛋白進(jìn)行EndoH消化。然后通過(guò)SDS-PAGE將未消化的和消化的蛋白質(zhì)分離，接著進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色。第2道是200ng未消化的，第3道是400ng消化的，笫4道是來(lái)自酵母中表達(dá)的HIVSF2的非糖基化gp120。圖4顯示抗甘露糖的抗體。(A)在笫0周用含有CFA的200ng酵母聚糖(Zymosan)A免疫兩只兔子，并在第2周、第4周和之后每4周用含有不完全弗氏佐劑("IFA")的100網(wǎng)抗原加強(qiáng)。在第5周和每次加強(qiáng)后1周收集免疫血清。在用酵母聚糖和酵母甘露聚糖包被的微孔板中使用ELISA—式兩份測(cè)試抗體。顯示了來(lái)自兩只兔子的平均抗體效價(jià)。(B)抗甘露糖的抗體與一些測(cè)試的gpl20糖蛋白具有反應(yīng)性。微孔板用5jig/ml的gpl20蛋白包被。(C)該圖顯示來(lái)自YU2抹系的gpl20蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞中的抗原性的比較，通過(guò)抗甘露聚糖酶抗體測(cè)試。圖5顯示BSA-Man9綴合物的分析。BSA-Man9綴合物用10%SDS-PAGE凝膠分析，接著進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色。第1道是未綴合的BSA，第2道是BSA-SMCC,第3道是BSA-SMCC-Man9。圖6A顯示DC-SIGNECD重組蛋白的表達(dá)和純化。DC-SIGNECD重組蛋白的表達(dá)和純化。于25°C、不存在(第2道)及存在IPTG(第3道)時(shí)在大腸桿菌中表達(dá)ECD蛋白4小時(shí)。分離包涵體(第4道)，并使用Ni-NTA柱純化來(lái)自不溶性級(jí)分的重新折疊的蛋白質(zhì)(第5道)。在12%SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)，并用考馬斯藍(lán)染色。6B顯示4吏用DC-SIGN和抗gpl20多克隆抗體包被的微孔板的ELISA。使用YU2林系的HIV-1gpl20結(jié)合包被蛋白。圖7顯示DC-SIGNMab的顯影。使用純化的DC-SIGNECD蛋白免疫Balb/c小鼠。使用具有良好抗體應(yīng)答的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。ELISA篩選培養(yǎng)物上清液后，對(duì)來(lái)自陽(yáng)性孔的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和亞克隆。使用蛋白質(zhì)印跡(Westernblots)篩選來(lái)自單克隆孔的上清液。每個(gè)單獨(dú)的泳道表示獨(dú)立的克隆。圖8顯示中和實(shí)驗(yàn)。使用由攜帶pHXB2gpl60的假病毒感染的LuSIV細(xì)胞系測(cè)試兩個(gè)多克隆(P)抗體的中和活性。使用三種公知的中和MAb(M)作為陽(yáng)性對(duì)照。每種抗體檢測(cè)四種劑量(50、25、12.5和6.25fig/ml)。圖9顯示N-連接的寡糖的結(jié)構(gòu)和加工。圖9A顯示ER中MNS1對(duì)聚糖從Man9GlcNAc2到Man8GlcNAc2的加工。主要帶有Man8GlcNAc2形式高甘露糖核心的蛋白質(zhì)隨之被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體進(jìn)行進(jìn)一步加工。圖9B下框顯示超級(jí)糖基化(superglycosylation)，這是主要(粗箭頭)的途徑。圖9B右上才匡顯示核心上添加a1，3-Man，這是次要途徑(細(xì)箭頭)。當(dāng)Ochl、Mnnl和Mnn4基因均被缺失時(shí)，MansGlcNAc2核心上不能添加任何糖，得到幾乎均質(zhì)的Man8GlcNAc2型聚糖(圖9C)。圖10顯示使用Western印跡在酵母突變體菌4朱中篩選2G12交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)。A:用HIV-1MAb2G12篩選來(lái)自多種突變體菌林的酵母培養(yǎng)基(波利門科學(xué)生物免疫研究有限公司PolymunScientificInc.ForschungGmbH)。用丙酮(ethetone)沉淀培養(yǎng)基中的分泌蛋白質(zhì)，并上樣至4-20%的梯度SDS-PAGE凝膠上。用2G12探測(cè)所述印跡，隨后與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG孵育。用ECL顯影信號(hào)并將其曝光于X射線膠片。B:來(lái)自相同設(shè)置的酵母突變體抹系細(xì)胞裂解物用HIV-1gpl20糖蛋白的對(duì)照篩選。圖11顯示在A/7/wr/酵母細(xì)胞中誘導(dǎo)2G12交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)。A.在指定的時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)用gpl20轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。用丙酮(ethetone)沉淀培養(yǎng)基中的分泌蛋白質(zhì)，并上樣至4-20。/。的梯度SDS-PAGE凝膠上。用2G12探測(cè)所述印跡，隨后與HRP-抗人IgG孵育。用ECL顯影信號(hào)并將其曝光于X射線膠片。B.如A中所述，用2G12檢測(cè)來(lái)自未轉(zhuǎn)化的(第1-3道)和用gpl20轉(zhuǎn)化的(第4-6道)A/wiW細(xì)胞的培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。圖12顯示2G12反應(yīng)性糖蛋白的純化和鑒定。使用GNL凝集素親和層析部分地純化約100kDa的蛋白質(zhì)(命名為YplOO)。培養(yǎng)基與結(jié)合了瓊脂糖的GNL孵育16小時(shí)。將起始材料(第l道)、流出液(第2道)、洗滌液(第3-6道)和洗脫液(第7-11道)的樣品上樣至4_20%SDS-PAGE凝膠上。用MAb2G12探測(cè)轉(zhuǎn)移的膜上的蛋白質(zhì)。圖13顯示2G12反應(yīng)性糖蛋白的鑒定。對(duì)IOOkDa條帶中的蛋白質(zhì)進(jìn)行凝膠內(nèi)消化。抽提消化的肽，并使用納米LC-MS/MS分析。在帶有納米電噴射源的質(zhì)語(yǔ)公司(Micromass)Q-Tof即雜種四極/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析。用ProteinLynx軟件(沃特斯公司W(wǎng)aters)加工原始文件并提交給MASCOT搜索。在釀酒酵母中具有登錄號(hào)NP—010340和45,749Da質(zhì)量的酵母蛋白質(zhì)PST1(SEQIDNO:l)中總計(jì)鑒定了6個(gè)肽。N端的粗體字母是鑒定的信號(hào)傳導(dǎo)肽。C端的粗體字母是鑒定的GPI錨定信號(hào)。單下劃線標(biāo)出通過(guò)質(zhì)譜法鑒定的肽。高亮顯示字母是潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。圖14顯示2D凝膠對(duì)2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)的確認(rèn)。A.部分純化的Yp100蛋白質(zhì)通過(guò)2D凝膠分離，并進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色(A)、以2G12MAb和在兔中產(chǎn)生的針對(duì)合成肽的抗PST1多克隆抗體進(jìn)行Western印跡(B)。盡管來(lái)自酵母的部分純化的Ypl00蛋白有其它酵母糖蛋白雜質(zhì)，但是它們中沒(méi)有一個(gè)和PST1具有相似的PI。圖15顯示2G12交叉反應(yīng)性的蛋白質(zhì)PST1的聚糖分析。A.用EndoH消化部分純化的Yp100蛋白，將未消化的(第2、4和6道)和消化的(第3、5和7道)蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE凝膠分離并進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色(第1-3道)、以抗PST1多克隆抗體(第4和5道)和MAb2G12(第6和7道)進(jìn)行Western印跡。之后與HPR標(biāo)記的第二抗體ECL孵育并曝光于X射線膠片。圖16顯示在/7wW和/wi"J雙突變體中PST1與2G12的交叉反應(yīng)性。制備來(lái)自5個(gè)不同雙突變體菌株的細(xì)胞裂解物，并在4-20%梯度SDS-PAGE上分離。用MAb2G12探測(cè)印跡，然后與HPR標(biāo)記的第二抗體ECL孵育并曝光于X射線膠片。圖17顯示雙突變體中PST1的上調(diào)和移行。A.酵母細(xì)胞裂解物中的PST1。在4-20%梯度SDS-PAGE上分離來(lái)自不同菌抹的細(xì)胞裂解物。使用Western印跡以抗PST1多克隆抗體分析野生型和突變體中PST1表達(dá)的水平。第1道，野生型；笫2道，zT附miJ;第3道，Jod7;第4道，Ap/m7;第5道，Ap附r/和d柳ww/雙突變體。上圖顯示僅在/ww7和附w"7雙突變體中檢測(cè)到PST1。下圖顯示在所有5個(gè)菌林都可檢測(cè)到另一糖基化蛋白質(zhì)GP38。B,酵母細(xì)胞培養(yǎng)基中的PST1。將來(lái)自不同菌林的酵母細(xì)胞在富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，并用丙酮沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。使用Western印跡以抗PST1抗體(上圖)和抗GP38(下圖)檢測(cè)蛋白質(zhì)分泌水平。圖18顯示在雙突變體中PST1上al，3-Man和al，2-Man的分析。通過(guò)Western印跡，使用抗a1,3連接的甘露糖的多克隆抗體和2G12，檢測(cè)來(lái)自pmrl單突變體(第1道)和pmrl+mnnl雙突變體(第2道)的酵母細(xì)胞培養(yǎng)基的末端a1，3-Man和al,2-Man。使用ochl單突變體和純化的PST1作為對(duì)照。用丙酮沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，并上樣至4-20%SDS-PAGE梯度凝膠上。印跡在硝酸纖維素上以后，膜分別用所示的2G12MAb和兔抗al，3Man抗體或抗PST1抗體探測(cè)，接著是山羊抗人IgG-HRP和山羊抗兔IgG畫HRPo圖19顯示通過(guò)免疫印跡在雙突變體中驗(yàn)證2G12交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)。離心來(lái)自雙突變體的培養(yǎng)上清液并棄去沉淀。上清液(第1道)用瓊脂糖預(yù)先清洗(第2道)。然后將樣品與MAb2G12在4'C孵育16小時(shí)。將免疫復(fù)合物與蛋白質(zhì)A瓊脂糖于室溫孵育1小時(shí)。短暫離心樣品并使用上清液作為流出液(第3道)。結(jié)合了蛋白質(zhì)A-瓊脂糖的免疫復(fù)合物洗滌兩次(第4道和第5道)。結(jié)合的蛋白質(zhì)用SDS樣品緩沖液洗脫(第6道)。然后在4-20%梯度凝膠上分離樣品，并用抗PCT1多克隆抗體對(duì)其進(jìn)行探測(cè)。圖20顯示18個(gè)物種間的PST1同源物基因。使用PST1(NP—010340)和ECM33(NP—009634)的蛋白質(zhì)序列從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的HomoloGene(同源基因)數(shù)據(jù)庫(kù)(版本50.1)搜索同源物基因。HomoloGene是用于在若干個(gè)完整測(cè)序的真核基因組的注釋基因中自動(dòng)檢測(cè)同源物的系統(tǒng)。目前，HomoloGene數(shù)據(jù)庫(kù)含有來(lái)自18個(gè)物種的165,820個(gè)HomoloGene群。通過(guò)在NCBI主頁(yè)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)上輸入蛋白質(zhì)參照序列(RefSeq)號(hào)獲得目的HomoloGene。通過(guò)clustalw程序進(jìn)行HomoloGene的多重比對(duì)。PST1和三個(gè)同源物基因(粟酒裂殖酵母(S.pombe)和棉假嚢酵母(E.gossypii)的蛋白質(zhì)得自HomeloGene數(shù)據(jù)庫(kù)搜索；來(lái)自光滑假絲酵母(Candidaglabrata)的蛋白質(zhì)使用抗NCBInr序列數(shù)據(jù)庫(kù)的blastp搜索獲得)。圖21顯示使用PCR分析雙突變體和三突變體。三突變體單倍體基因型的篩選和驗(yàn)證。圖A顯示用PCR篩選推定的三突變體的1.5%瓊脂糖凝膠，對(duì)Amnn4基因型(上圖)使用MNN4A和KanB引物(預(yù)期大小為609bp)，對(duì)Aochl基因型(下圖)使用OCH1A和KanB引物(697bp)。第1道含有單倍體克隆2-2。第2道含有單倍體克隆2-3。第3道含有單倍體克隆2-4。第4道含有單倍體克隆2-5。圖B顯示用PCR驗(yàn)證三突變體單倍體克隆2-5和2-6(分別為上圖和下圖)的Amnnl、Amnn4和Aochl基因型的1.5%瓊脂糖凝膠。每個(gè)泳道含有所示的不同PCR引物對(duì)。內(nèi)部ORF特異引物(MNN1B、MNN4B、OCHIB、MNN1C、MNN4C和OCHIC)和上游或下游引物(MNN1A、MNN4A、OCHIA、MNN1D、MNN4D和OCHID)組合，如果ORF缺失，則沒(méi)有PCR產(chǎn)物。第1道是MNN1A+MNN1B。第2道是MNN4A+MNN4B。第。3道是OCH1A+OCHIB。第4道是MNN1C十MNN1D。第5道是MNN4C+MNN4D。笫6道是OCH1C+OCHID。相反，上游或下游引物和內(nèi)部KanMX特異引物(KanB和KanC)組合，存在缺失時(shí)也有PCR產(chǎn)物。第7道是MNNlA+KanB(預(yù)期大小是591bp)。第8道是MNN1D+KanC(944bp)。第9道是MNN4D+KanC(931bp)。第10道是OCH1D+KanC(854bp)。圖22顯示全細(xì)胞ELISA。使用ELISA檢測(cè)2G12和al，3-連接的甘露糖抗體抗全細(xì)胞酵母的特異性。將INVScl(二倍體)和AmnnlAmnn4Aochl-DIP酵母在PBS中稀釋至5.0x107細(xì)胞/ml，并用于包被ELISA平板。在50mM的碳酸鹽緩沖液中將SF162gpl20和野生型酵母甘露聚糖稀釋至5照/ml。使用10jig/ml的2G12和抗a1,3-甘露糖進(jìn)行捕獲，以封閉緩沖液進(jìn)行三倍的系列稀釋。圖A顯示抗a1，3抗體對(duì)野生型細(xì)胞和甘露聚糖具有高親和力，三突變體顯示低親和力，而SF162顯示無(wú)結(jié)合。相反，圖B顯示三突變體細(xì)胞和SF162gpl20對(duì)2G12抗體分別具有中度和高度的親和力，該2G12抗體特異于末端al，2-連接的甘露糖殘基。野生型細(xì)胞和甘露聚糖均顯示不與2G12結(jié)合。該實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行，上方OD45。讀數(shù)表示平均值。圖23顯示三突變體細(xì)胞中al，3-Man反應(yīng)性的喪失。使用抗a1,3連接的甘露糖免疫血清和抗酵母聚糖抗體進(jìn)行三突變體和野生型酵母的免疫熒光。對(duì)數(shù)期的AmnnlAmnn4Aochl-DIP細(xì)胞(圖A、C)和INVScI細(xì)胞(圖B、D)用4%的多聚曱醛固定，并轉(zhuǎn)移至多聚賴氨酸包被的玻片上。細(xì)胞與0.5%SDS—起孵育，并用1:500稀釋的al，3-連接的甘露糖抗血清(圖A、B)和10ng/ml純化的抗酵母聚糖(圖C、D)染色，隨后是AlexaFluor568綴合的山羊抗兔IgG。圖24顯示三突變體細(xì)胞中末端al,2-Man的暴露。使用2G12和抗酵母聚糖進(jìn)行三突變體和野生型酵母的免疫焚光。對(duì)數(shù)期的AmnnlAmnn4Aochl-DIP細(xì)胞(圖A、B和C)和INVScI細(xì)胞(圖D、E和F)用4%的多聚甲醛固定，并轉(zhuǎn)移至多聚賴氨酸包被的玻片上。細(xì)胞與0.5%SDS—起孵育，并分別用100ng/ml的2G12(圖A、D)和10ng/ml兔抗酵母聚糖(圖B、E)染色，隨后是AlexaFluor568綴合的山羊抗兔IgG。圖C和F顯示抗體的共定位。圖25顯示酵母突變體的糖蛋白上al，2-Man和al，3-Man的分析。對(duì)所有酵母突變體的糖蛋白使用2G12和al,3-連接的甘露糖抗血清進(jìn)行24Western印跡。將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解，并以2.4ng/道上樣至4-20。/。SDS-PAGE梯度凝膠上。印跡至硝酸纖維素上之后，膜分別用2G12MAb或al,3Man抗血清探測(cè)，隨后是山羊抗人IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP。第1道含有INVScl野生型裂解物。第2道含有Amnnl裂解物。第3道是Aochl裂解物。第4道含有Amnn4裂解物。第5道含有AmnnlAmnn4裂解物。第6道含有AmnnlAochl裂解物。第7道含有AmnnlAmnn4Aochl裂解物。有至少四種蛋白質(zhì)與見于AmnnlAochl和AmnnlAochlAmnn4細(xì)胞裂解物中的2G12強(qiáng)結(jié)合(左道)。相反，僅WT(野生型)酵母和無(wú)Amnnl基因型的突變體顯示結(jié)合特異于al，3-連接的甘露糖的抗血清(右道)。圖26顯示所有分離的三突變體中2G12的反應(yīng)性。對(duì)六個(gè)酵母三突變體克隆使用2G12進(jìn)行Western印跡。將對(duì)數(shù)期的酵母三突變體克隆在SDS上樣緩沖液中進(jìn)行粗裂解，并上樣至4-20%SDS-PAGE梯度凝膠上。印跡在硝酸纖維素上后，膜用1jig/ml的2G12探測(cè)，隨后是山羊抗人IgG-HRP。第1道含有單倍體克隆1-2。第2道含有單倍體克隆1-3。第3道含有單倍體克隆2-2。第4道含有單倍體克隆2-4。第5道含有單倍體克隆2-5。第6道含有單倍體克隆2-6。有至少四種蛋白質(zhì)與見于各三突變體單倍體克隆中的2G12強(qiáng)結(jié)合。圖27顯示酵母三突變體細(xì)胞中均質(zhì)的Man8形式高甘露糖。三突變酵母裂解物的MALDI-TOF質(zhì)鐠。將對(duì)數(shù)期的AmnnlAmim4Aochl-DIP細(xì)胞勻漿，進(jìn)行脂質(zhì)抽提，并用PNGaseF消化得到的裂解物。高曱基化(permethylation)后通過(guò)Maldi-TOF質(zhì)鐠法構(gòu)建N-聚糖譜。代表多于卯％的總聚糖的主峰是Man8GlcNAc2，同時(shí)有代表Man5GlcNAc2和Man9GlcNAc2的兩個(gè)次峰。圖28顯示從三突變酵母的細(xì)胞裂解物中部分純化和分離的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。在圖A中，2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位使用差速離心評(píng)估。對(duì)數(shù)期的AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞在蔗糖裂解液中使用玻璃珠裂解。去除未裂解的細(xì)胞和大聚集體后，蛋白質(zhì)被分為兩種級(jí)分22,000g上清液(第1道)和22,000g沉淀(笫2道)。將該沉淀級(jí)分重溶于1.0%TritonX-100中，并分離為兩種另外的級(jí)分Triton可溶性沉淀(笫3道)和Triton不溶性沉淀(第4道)。所有的泳道表示使用1ng/ml2G12的Western印跡。在圖B中，使用ConA瓊脂糖部分純化2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。將來(lái)自AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞的Triton可溶性級(jí)分(第1道)與ConA瓊脂糖珠孵育，并收集流出液(第2道)。用結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗滌(第3道)后，用0.5M甲基甘露型吡喃糖苷(第4、5道)或2mMEDTA+1.0%SDS(第6道)洗脫蛋白質(zhì)。所有的泳道表示使用1ng/ml2G12的Western印跡。在圖C中，使用2D電泳分離2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。來(lái)自ConA純化的洗脫級(jí)分(圖B,笫4-6道)在英駿公司(Invitrogen)IPGZOOM4-7IPG膠條上電泳，然后使用4-12%的IPGZOOM系統(tǒng)進(jìn)行大小分離。使用1jig/ml的2G12通過(guò)Western印跡染色一條凝膠。從Sypro寶石紅蛋白(ruby)凝膠上切下通過(guò)Western印跡顯示陽(yáng)性信號(hào)的兩個(gè)大印斑，用胰蛋白酶消化，并在質(zhì)譜/>司(Micromass)Q-Tof2上通過(guò)納米LC/MS/MS分析進(jìn)行肽鑒定。使用MS/MS在上方印斑中鑒定到三個(gè)糖蛋白(ECM33、Gasl和Gas5)，而下方印斑有單個(gè)糖蛋白(YJLnic)。圖29顯示在三突變酵母培養(yǎng)基中表達(dá)和部分純化2G12反應(yīng)性糖蛋白。在圖A中，通過(guò)將來(lái)自對(duì)數(shù)期INVScl和AmnnlAmnn4Aochl酵母的100jd培養(yǎng)上清液在-8(TC與兩倍體積冰凍的丙酮孵育30分鐘，進(jìn)行丙酮沉淀。將得到的沉淀物重懸于10jil的SDS樣品緩沖液中，并上樣至4-20%SDS-PAGE梯度凝膠上。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素后，用2照/ml的2G12探測(cè)蛋白質(zhì)。三突變酵母有至少四個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)2G12MAb具強(qiáng)反應(yīng)性(第2道)，而野生型酵母上清液顯示無(wú)信號(hào)(第1道)。在圖B中，使用ConA瓊脂糖部分純化2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。將來(lái)自對(duì)數(shù)期AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞的培養(yǎng)上清液(第1道)直接與ConA瓊脂糖珠孵育。收集流出液(笫2道)并用結(jié)合緩沖液洗滌珠子(第3道)。通過(guò)用SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸ConA珠來(lái)洗脫結(jié)合的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)(第4道)。使用1ng/ml的2G12通過(guò)Western印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)。使用MS/MS從第4道所示的2G12沉淀物的等分式樣中鑒定了兩種糖蛋白(ECM33和GP38)。圖30顯示2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)的免疫沉淀。用2G12對(duì)三突變體細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基進(jìn)行免疫沉淀，并用針對(duì)所鑒定的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行印跡。來(lái)自AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞(第1道)的細(xì)胞裂解物(圖A)和培養(yǎng)基(圖B)通過(guò)與蛋白質(zhì)A-瓊脂糖4B—起孵育來(lái)進(jìn)4亍預(yù)清洗。向樣品中添加2G12，孵育1小時(shí)，然后是蛋白質(zhì)A-瓊脂糖。未結(jié)合的蛋白質(zhì)作為上清液去除(第2道)并用PBS洗滌(笫3道)。通過(guò)用40jillxSDS樣品緩沖液煮沸來(lái)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)(第4道)。將所有的樣品上樣至4-20。/。梯度SDS-PAGE凝膠上，印跡，并使用抗ECM33、抗gp38、抗YJL171C、抗Gasl和抗PST1進(jìn)行Western分析。圖31顯示不同基因的突變體中糖蛋白的移行。將酵母細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期并收集細(xì)胞和培養(yǎng)基。細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解，并以2.4照/道上樣至4-20%SDS-PAGE梯度凝膠上。用丙酮沉淀培養(yǎng)基并將蛋白質(zhì)也上樣至4-20%SDS-PAGE梯度凝膠上。笫1道為WT。第2道為Amnnl。第3道為Aochl。第4道為Amnn4。第5道為Amnnlmnn4。第6道為AmnnlAochl。第7道為AmnnlAmnn4Aochl。印跡在硝酸纖維素上以后，用抗ECM3^上圖)或抗GP:3S(下圖)探測(cè)膜，接著是山羊抗兔IgG-HRP。圖32顯示在用三突變酵母細(xì)胞免疫的兔中產(chǎn)生的抗al，2-連接的甘露糖的抗體分析。用來(lái)自野生型(WT)和三突變體(TM)釀酒酵母的全細(xì)胞免疫兔子。用5ng/ml的在293T細(xì)胞中產(chǎn)生的JRFL菌林HIV-1gpl20包被微孔板。免疫血清稀釋至1:500并用2G12檢測(cè)抗al，2-Man的抗體。圖33顯示PST1中潛在N-連接和O-連接糖基化位點(diǎn)的分析。圖A顯示前體的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。N末端的粗體字母是鑒定的信號(hào)肽。C末端的粗體字母是鑒定的GPI錨定信號(hào)。單下劃線標(biāo)出通過(guò)質(zhì)譜鑒定的肽，而雙下劃線標(biāo)出在相同或不同質(zhì)謙分析中鑒定了兩次的肽。高亮顯示的字母是潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。圖B顯示使用公開網(wǎng)站http:〃www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麥技術(shù)大學(xué)(TechnicalUniversityofDenmark)的生物學(xué)序列分析中心(CBS)開發(fā)的軟件NetOGlyc3.1分析O-連接的糖基化位點(diǎn)。JuleniusK.，A.M0lgaard,R.Gupta和S.Brunak.Prediction,conservationanalysisandstructuralcharacterizationofmammalianmucin畫typeO-glycosylationsites.Glycobiology，15:153-164，2005。圖34顯示ECM33的潛在的N-連接和O-連接糖基化位點(diǎn)分析。圖A顯示前體的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。N末端的粗體字母是鑒定的信號(hào)肽。C末端的粗體字是鑒定的GPI錨定信號(hào)。單下劃線標(biāo)出通過(guò)質(zhì)i普鑒定的肽，而雙下劃線標(biāo)出在相同或不同質(zhì)謙分析中鑒定了兩次的肽。高亮顯示的字母是潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。圖B顯示使用公開網(wǎng)站析中心(CBS)開發(fā)的軟件NetOGlyc3.1分析O-連接的糖基化位點(diǎn)。圖35顯示分析GP38的潛在的N-連接和O-連接糖基化位點(diǎn)。圖A顯示前體的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。N末端的粗體字母是鑒定的信號(hào)肽。C末端的粗體字是鑒定的GPI錨定信號(hào)。單下劃線標(biāo)出通過(guò)質(zhì)譜鑒定的肽,而雙下劃線標(biāo)出在相同或不同質(zhì)譜分析中鑒定了兩次的肽。高亮顯示的字母是潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。圖B顯示使用公開網(wǎng)站http:〃www.ebs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麥技術(shù)大學(xué)的生物學(xué)序列^析中心(CBS)開發(fā)的軟件NetOGlyc3.1分析O-連接的糖基化位點(diǎn)。圖36顯示分析YJL171c的潛在的N-連接和O-連接的糖基化位點(diǎn)。圖A顯示前體的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。N末端的粗體字母是經(jīng)鑒定的信號(hào)肽。C末端的粗體字是經(jīng)鑒定的GPI錨定信號(hào)。單下劃線標(biāo)出通過(guò)質(zhì)譜鑒定的肽，而雙下劃線標(biāo)出在相同或不同質(zhì)譜分析中鑒定了兩次的肽。高亮顯示的字母是潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。圖B顯示使用公開網(wǎng)站析中心(CBS)開發(fā)的軟件NetOGlyc3.1分析O-連接的糖基化位點(diǎn)。圖37顯示分析Gasl的潛在的N-連接和O-連接糖基化位點(diǎn)。圖A顯示前體的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。N末端的粗體字母是鑒定的信號(hào)肽。C末端的粗體字是鑒定的GPI錨定信號(hào)。單下劃線標(biāo)出通過(guò)質(zhì)i普鑒定的肽，而雙下劃線標(biāo)出在相同或不同質(zhì)譜分析中鑒定了兩次的肽。高亮顯示的字母是潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。圖B顯示使用公開網(wǎng)站http:〃www.cbs.dtu.dk/services/netodyc中由丹麥技術(shù)大學(xué)的生物學(xué)序列分析中心(CBS)開發(fā)的軟件NetOGlyc3.1分析O-連接的糖基化位點(diǎn)。圖38顯示分析Gas5的潛在的N-連接和O-連接糖基化位點(diǎn)。圖A顯示前體的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。N末端的粗體字母是鑒定的信號(hào)肽。C末端的粗體字是鑒定的GPI錨定信號(hào)。單下劃線標(biāo)出通過(guò)質(zhì)譜鑒定的肽，而雙下劃線標(biāo)出在相同或不同質(zhì)譜分析中鑒定了兩次的肽。高亮顯示的字母是潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。圖B顯示使用公開網(wǎng)站http:〃www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麥技術(shù)大學(xué)的生物學(xué)序列分析中心(CBS)開發(fā)的軟件NetOGlyc3.1分析O-連接的糖基化位點(diǎn)。圖39顯示在三突變酵母中克隆和表達(dá)gp120。圖A顯示在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳的酵母轉(zhuǎn)化抹上的菌落PCR結(jié)果。從-ura/葡萄糖平板上挑取以YU2-gpl20或JRPL-gp120轉(zhuǎn)化的四個(gè)不同的AmnnlAmnn4Aochl酵母克隆，并用PCR主混合物(PCRmastermix)賻育。所述PCR混合物含有用于pJRFL-gp120驗(yàn)證的引物MFal-Kpn-5和JRFL-Xba-3，以及用于pYU2-gp120驗(yàn)證的引物MFal-Kpn-5和YU2-Xba-3。JRFL和YU2轉(zhuǎn)化林預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小分別為1724kB和1697kB。圖B顯示4吏用抗gpl20-IIIB(懷羅斯塔特有限公司VirostatInc.)檢測(cè)gpl20。通過(guò)在-ura/半乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)誘導(dǎo)每種質(zhì)粒(JRFL-gp120和YU2-gpl20)的一個(gè)AmnnlAmnn4Aochl轉(zhuǎn)化林進(jìn)行g(shù)pl20表達(dá)。在四個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)第0、3、6和9天收集培養(yǎng)基樣品。用丙酮沉淀蛋白質(zhì)，在4-20%SDS-PAGE凝膠上電泳，并使用抗gpl20-IIIB檢測(cè)。圖C顯示使用抗gpl20-YU2檢測(cè)gpl20。相同的Amnnl△mnn4Aochl轉(zhuǎn)化林i秀導(dǎo)所示的天數(shù)。用丙酮沉淀蛋白質(zhì)，在^:20o/oSDS-PAGE凝膠上電泳，并使用抗gpl加-YU2檢觀寸。通過(guò)兩種抗gpl20檢測(cè)的得到的蛋白質(zhì)顯示在110kDa處的清晰條帶，在第6天和第9天最佳表達(dá)。圖40顯示用2G12檢測(cè)表達(dá)的gpl20。通過(guò)在-ura/半乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)來(lái)資導(dǎo)每種質(zhì)粒(JRFL-gp120和YU2-gpl20)的一個(gè)AmimlAmnn4Aochl轉(zhuǎn)化林進(jìn)行g(shù)pl20表達(dá)，未轉(zhuǎn)化的AmnnlAmnn4Aochl的一個(gè)克隆在SC/半乳糖上培養(yǎng)。如圖所示，在第3、6和9天收集培養(yǎng)基樣品。蛋白質(zhì)用丙酮沉淀，在4-20%SDS-PAGE凝膠上電泳，并使用2G12檢測(cè)。這些gpl20糖蛋白對(duì)于JR-FL和YU-2gpl20而言分別具有96.4和99.6kDa的預(yù)測(cè)分實(shí)施本發(fā)明的方式CV-N和2G12抑制HIV感染的能力提示激發(fā)應(yīng)答Man9、Man8或兩者的中和抗體能夠提供抗HIV傳染的有效免疫力。然而迄今尚無(wú)提供具有特定糖基化模式的gpl20抗原的可再現(xiàn)手段。因此，本文提供的重組高甘露糖gpl20組合物提供了抗HIV感染的保護(hù)性免疫力的有力誘導(dǎo)劑。為清楚公開而非限制起見，本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明分為以下各小節(jié)。A.定義除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。本文提到的所有專利、公開的專利申請(qǐng)和其它出版物以及來(lái)自GenBank和其它數(shù)據(jù)庫(kù)的序列作為參考以其整體并入本文。如果該小節(jié)中公開的定義與作為參考并入本文的專利、公開的專利申請(qǐng)和其它出版物以及來(lái)自GenBank和其它數(shù)據(jù)庫(kù)的序列中公開的定義相反或以其它方式不一致，則在該小節(jié)中公開的定義優(yōu)先于作為參考并入本文的定義。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)因詳細(xì)說(shuō)明和權(quán)利要求書而顯而易見。本文使用術(shù)語(yǔ)"一種"或"一個(gè)"表示"至少一種"或"一個(gè)或多個(gè)"。本文使用術(shù)語(yǔ)"佐劑"是指添加到免疫原性物質(zhì)中時(shí)，非特異性地促進(jìn)或增強(qiáng)接觸混合物的受體宿主對(duì)所述物質(zhì)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑可包括例如水包油乳劑、油包水乳劑、明礬(例如氫氧化鋁/磷酸鋁)、脂質(zhì)體和微粒。例示性的佐劑包括，但不限于角蓳烯混合物(SAF-I)、胞壁肽、皂香衍生物、分枝桿菌細(xì)胞壁制品、單磷酰脂質(zhì)A、分枝菌酸衍生物、非離子30嵌段共聚物表面活性劑、QuilA、霍亂毒素B亞基、聚磷腈(polyphosphazene)及衍生物、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)和細(xì)胞因子。參閱例如Vogel等，/附附wwo/og/c"/v4《mwifc，VACCINES69-79(Plotkin等編，第4版，Saunders(2004))。對(duì)于獸醫(yī)用途和在動(dòng)物中生產(chǎn)抗體而言，也可以使用(完全和不完全的)弗氏佐劑的促有絲分裂成分。本文使用"AIDS"是指HIV感染的癥狀期，并包括獲得性免疫缺陷綜合征(通常稱為AIDS)和AIDS相關(guān)復(fù)合征("ARC")。參閱例如Kilby等，7V,Mm//r&too;好/K-7Z^^se，TEXTBOOKOFAIDSMEDICINE49-58(Merrigan等編，Williams&Wilkins,第2版，1999)。AIDS的免疫和臨床表現(xiàn)為本領(lǐng)域公知，并包括例如機(jī)會(huì)性感染和免疫缺陷導(dǎo)致的癌癥。本文使用術(shù)語(yǔ)"抗體，，是指來(lái)自一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白基因的、以其為模型的或基本由其編碼的任何形式的肽或多肽或其片段，其能夠特異性結(jié)合抗原或表位。參閱例如FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(W.E.Paul編，第5版，Lippincott，Williams&Wilkins(2003));CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(Coligan等編，JohnWiley&Sons,最新版本)；ANTIBODYENGINEERING:APRACTICALAPPROACH(J.McCafferty等編，OxfordUniversityPress1996)?？贵w片段的實(shí)例是保持結(jié)合抗原的片段，并包括Fab、Fab，、F(ab，)2、Fd和Fv片段；雙體(diabody);線性抗體；單鏈抗體分子，例如scFv和V冊(cè)；微型抗體(minibody);納米抗體(nanobody);以及由抗體片段形成的多特異性抗體。通常，結(jié)合片段或衍生物保持其結(jié)合活性的至少50%。優(yōu)選地，結(jié)合片段或衍生物保持其生物活性的至少60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%?？贵w或其抗原結(jié)合片段可含有保守氨基酸取代，所述取代不顯著改變其結(jié)合和/或生物活性。因此，術(shù)語(yǔ)"抗體"以最廣泛的含義4吏用，并特別涵蓋單克隆(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆、多特異性(例如雙特異性)、雜綴合物、嵌合、人源化、人、鼠及合成抗體，以及特異性結(jié)合期望抗原并顯示期望結(jié)合和/或生物活性的抗體片段。術(shù)語(yǔ)"抗原"是指被抗體特異識(shí)別和結(jié)合的任何分子。在生物中激發(fā)免疫應(yīng)答(如生物中產(chǎn)生特異性抗體所證明的那樣)的抗原被稱作"免疫原"?？乖蛎庖咴斜豢贵w結(jié)合的特異性部分稱作"結(jié)合表位"或"表位"。當(dāng)抗體選擇性地結(jié)合抗原從而將其與其它抗原區(qū)分開時(shí)，抗體對(duì)該特定抗原是特異性的。優(yōu)選抗體缺乏對(duì)無(wú)關(guān)抗原的顯著結(jié)合。本文使用術(shù)語(yǔ)"表達(dá)盒"是指能夠影響宿主中結(jié)構(gòu)基因(即蛋白質(zhì)如本文提供的抗體的編碼序歹'j)表達(dá)的核苦酸序列，所述宿主與這類序列相容。表達(dá)盒包括至少一個(gè)與多肽編碼序列有效連接的啟動(dòng)子；和任選的其它序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。本文使用術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"包括所有能夠在細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物或植物細(xì)胞)中驅(qū)動(dòng)編碼序列轉(zhuǎn)錄的序列。因此，本發(fā)明構(gòu)建體中使用的啟動(dòng)子包括順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件和參與調(diào)控或調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)間和/或速率的調(diào)控序列。例如，啟動(dòng)子可以是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件，包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制起點(diǎn)、染色體整合序列、5'和3，非翻譯區(qū)或內(nèi)含子序列。啟動(dòng)子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。也可以使用對(duì)于影響表達(dá)是必需的或有幫助的其它因子，例如增強(qiáng)子。如們是順式作用的。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列例如增強(qiáng)子不需要與編碼序列(其轉(zhuǎn)錄被所述增強(qiáng)子增強(qiáng))相鄰或位置靠得很近。表達(dá)盒還包括質(zhì)粒、表達(dá)載體、重組病毒、任何形式重組的"棵DNA"栽體等等。術(shù)語(yǔ)"分離的"包括從其初始環(huán)境(例如，天然存在時(shí)的天然環(huán)境)中取出的物質(zhì)。例如，分離的多核苷酸或多肽是從天然體系中一些或所有共存物質(zhì)中分離的多核苷酸或多肽。這類多核苷酸可以是載體的部分和/或這類多核苷酸或多肽可以是組合物的部分并且仍然是分離的，因?yàn)檫@類載體或組合物不是其天然環(huán)境的部分。短語(yǔ)"核酸"或"核酸序列"包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其中任一的片段，基因組或合成來(lái)源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA),其可以是單鏈的或雙鏈的，編碼本發(fā)明的抗體或其生物活性片段。該術(shù)語(yǔ)包括含有天然核苷酸已知類似物的核酸，即寡核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還包括具有合成主鏈的核酸樣結(jié)構(gòu)。參閱例如Mata，7bjdco/.々p/.J。A"f7mw^/.144:189-97(1997);Strauss-Soukup，J/oc/^附/s^v36:8692-98(1997);和Samstag，Jwri5^ws^7V"c/e/cJ"V/Z)rgZ)ev6:153-56(1996)。"重組"多肽或蛋白質(zhì)是指通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)；例如由編碼期望多肽或蛋白質(zhì)的外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生。參閱例如CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausebel等編，JohnWiley&Sons,最新版本)。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"寡肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)，，在本文可互換使用，表示任何長(zhǎng)度的氨基酸多聚物。所述多聚物可以是線性的或分枝的，其可包含經(jīng)修飾的氨基酸，且其可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語(yǔ)還包括已被天然或干預(yù)修飾的氨基酸多聚物；例如二硫鍵的形成、糖基化、脂質(zhì)化、?；?、磷酸化，或任何其它操作或修飾，如與標(biāo)記成分綴合。還包括在該定義中的是例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。應(yīng)當(dāng)理解因?yàn)楸景l(fā)明的多肽是以抗體為基礎(chǔ)的，所以所述多肽可以作為單鏈或結(jié)合的鏈存在。術(shù)語(yǔ)"同源物"用于表示來(lái)自一個(gè)物種的基因或基因產(chǎn)物，其與來(lái)自另一物種的基因具有相同的共同起源和功能。例如，釀酒酵母pmrl基因的真菌同源物基因是指這樣的真菌基因，所述真菌基因與釀酒酵母的pmrl基因具有相同的共同起源，并編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)。"載體"包括能夠感染、轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)或永久轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的核酸。應(yīng)當(dāng)理解載體可以是棵核酸，或與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)復(fù)合的核酸。載體任選地包含病毒或細(xì)菌核酸和/或蛋白質(zhì)和/或膜(例如細(xì)胞膜、病毒脂質(zhì)包膜等)。本文使用術(shù)語(yǔ)"協(xié)同作用"是指一種物質(zhì)提高另一種物質(zhì)抗病原體效應(yīng)或中和效應(yīng)的能力。因此，協(xié)同活性包括但不限于一起使用兩種物質(zhì)時(shí)生物效應(yīng)提高(例如更為有效或更為持久)，而在單獨(dú)使用所述物質(zhì)時(shí)未觀察到所述效應(yīng)；施用單一物質(zhì)所不能達(dá)到的更有效的生物效應(yīng)，例如消除多類毒性；或者為實(shí)現(xiàn)單一物質(zhì)觀察到的效應(yīng)所需施用的物質(zhì)量減少。術(shù)語(yǔ)"病原體"是指誘導(dǎo)或激發(fā)不期望的癥狀或疾病狀態(tài)的任何生物。病原體可以是細(xì)菌、病毒或真菌。本文使用術(shù)語(yǔ)"受試者"包括人以及其它動(dòng)物物種，例如犬、貓、牛、豬、嚙齒動(dòng)物等等。開業(yè)醫(yī)師將會(huì)理解受試者具有本發(fā)明抗體靶向的病原體或疾病o本文使用術(shù)語(yǔ)"改善、治療或預(yù)防"包括與感染或其它病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的延緩、將要發(fā)生或預(yù)期會(huì)發(fā)生的癥狀嚴(yán)重性的降低、或這類癥狀的完全消除。這些術(shù)語(yǔ)還包括改善現(xiàn)存的病原體相關(guān)癥狀、減少疾病持續(xù)時(shí)間、預(yù)防額外的癥狀、改善或預(yù)防嚴(yán)重的后遺癥、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)死亡事件，以及減少或預(yù)防病原體傳播。因此，該術(shù)語(yǔ)表示賦予具有病原體或有可能接觸這類病原體的受試者的有益結(jié)果。具體地，改善、治療或預(yù)防包括例如預(yù)防接觸HIV的個(gè)體的初始感染；減少HIV感染個(gè)體的病毒負(fù)荷；延長(zhǎng)HIV感染的無(wú)癥狀期；提高患AIDS個(gè)體的整體健康或生命質(zhì)量；以及延長(zhǎng)患AIDS個(gè)體的預(yù)期壽命。臨床醫(yī)師能夠?qū)⒚庖咝Чc患者治療前的狀況比較，或與未治療患者的預(yù)期狀況比較，以確定治療在抑制AIDS方面是否有效。本文使用術(shù)語(yǔ)"有效量"足以部分或完全地抑制或預(yù)防病原體傳播、組織損傷或受試者體內(nèi)或身體上與毒力因子作用相關(guān)的其它癥狀，或預(yù)防或減少這類癥狀的進(jìn)一步發(fā)展。對(duì)于有效成分單獨(dú)施用的個(gè)體，有效劑量是指該成分單獨(dú)所需的劑量。對(duì)于活性劑組合，有效劑量是指產(chǎn)生治療效果的活性成分的組合量，無(wú)論組合施用、序慣施用或同時(shí)施用。術(shù)語(yǔ)"治療有效用量"和"有效量"可互換使用。本文使用術(shù)語(yǔ)"生物活性劑，，是指任何合成的或天然存在的化合物，其增強(qiáng)或介導(dǎo)期望的生物效應(yīng)以減少或消除特定生物的傳染性或致病性。生物活性劑包括例如藥劑，如化療藥物、殺微生物藥物、抗病毒藥物、毒素、細(xì)胞因子、配體、抗體或它們的一些組合。本文使用"阻止有效相互作用(productiveinteraction)"是指與沒(méi)有抗體或其生物活性片段時(shí)可能發(fā)生的量相比，相互作用的量被減少?？梢酝ㄟ^(guò)任何手段減少或阻止相互作用，包括但不限于掩蔽或改變毒力因子上的相互作用區(qū)域，以及改變毒力因子的表達(dá)、聚集、構(gòu)型或締合狀態(tài)。本文使用術(shù)語(yǔ)"治療"是指出于治愈、治療、緩和、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、改進(jìn)或影響疾病或病癥的目的，對(duì)受試者應(yīng)用或施用治療劑，或?qū)?lái)自受試者的分離的組織或細(xì)胞系應(yīng)用或施用治療劑，所述受試者患有疾病或病癥、具有疾病或病癥的癥狀或具有疾病或病癥易感體質(zhì)。B.組合物本文提供了均一糖基化的重組蛋白，其中末端糖是末端al-2-甘露糖結(jié)構(gòu)。重組蛋白可以這樣獲得用編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列轉(zhuǎn)化釀酒酵母變體、發(fā)酵轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并從細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中分離蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是毒力因子。蛋白質(zhì)可以是病毒蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，病毒蛋白質(zhì)是表面蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是人免疫缺陷病毒的gpl20。在一些實(shí)施方案中，聚糖是寡甘露糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，末端al-2-甘露糖結(jié)構(gòu)位于Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2上。本文公開的組合物中可以使用任何合適的毒力因子。毒力因子是介導(dǎo)或參與微生物在在合適條件下在宿主生物中引起疾病的能力的任何糖蛋白。例如，毒力因子可以是粘附因子、外殼蛋白、侵入因子、莢膜、外毒素或內(nèi)毒素。表達(dá)糖蛋白毒力因子的例示性生物包括但不限于慢病毒(例如HIV)、埃博拉病毒、革蘭氏陰性細(xì)菌(例如空腸彎曲菌(CVmi/^/Macterm〕、大腸彎曲菌(C謂/^/o6tf""、腦膜炎奈瑟菌(A^/s^mV、幽門蟲累才干菌(J^e,/c。6fl"er/y;/o/7)、大腸埃希氏菌(^Esc/rer/c/r/ac,、流感嗜血桿菌(/^附o/M附/"y/weww)、銅綠假單胞菌CP^油附卯crs、結(jié)核分枝桿菌(7Vfj;coA"cter/",mAccm/。5^)、牛分枝軒菌(A/j;co^"mVzAovis)、伯氏疏蟲累旋體(必o/tCVi、披衣菌(C7t/"附j(luò);flfZfls//;.)和S'J血鏈球菌(5yre/7tococcM51/7flrflSflwgti/s))。蛋白質(zhì)毒力因子的糖基化可以是N-連接的或O-連接的。聚糖是由彼此通過(guò)糖苷鍵連接的多于約五個(gè)單糖殘基組成的多糖。代表性的聚糖包括甘露糖。蛋白質(zhì)毒力因子基本均一的糖基化是指單一糖型(gycoform)的糖基4匕大于70%、80%、90%或100%。一方面，本文提供的組合物是以Man9GlcNAc2、MansGlcNAc2或其一些組合基本均一地糖基化的gpl20，其具有末端al-2-Man結(jié)構(gòu)。本文使用術(shù)語(yǔ)"基本均一地"是指gpl20上的聚糖大于70%是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其一些組合。在具體的實(shí)施方案中，本文提供的糖基化gpl20組合物具有大于90%的Maii9GlcNAc2或Man8GlcNAc2,優(yōu)選地具有100%的Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2。術(shù)語(yǔ)"高甘露糖"是指不含其它種類末端糖的具有5到9個(gè)甘露糖殘基的聚糖。參閱例如圖1。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面和血清糖蛋白很少含有末端甘露糖殘基。參閱例如Weis等，/附附朋0/及ev.163:19-34(1998)。哺乳動(dòng)物糖蛋白主要含復(fù)合型寡糖，帶有很少的Man5或Man6;而HIV-1gpl20蛋白含更大量的Man7-9，意味著HIV-1病毒和人糖蛋白上的高甘露糖在質(zhì)和量上的顯著差異。參閱例如Scanlan等，JMVW.76:7306-21(2002);Cutalo等，/爿/wAffl^5^e"ra附.15:1545-55(2000)。本文還提供了包含分離的糖基化多肽和可藥用賦形劑的組合物，所述糖基化多肽含有至少兩種被抗體2G12識(shí)別的N-連接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50%的N-連接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖為Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其組合。本文還提供了包含從突變真菌中分離的糖基化多肽的組合物，所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl或破壞了的釀酒酵母基因pmrl的同源物基因，其中糖基化多肽被抗體2G12識(shí)別。本文還提供了包含從突變真菌中分離的糖基化多肽的組合物，所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl，或破壞了的釀酒酵母基因pmrl和mnnl的同源物基因，其中糖基化多肽凈皮抗體2G12識(shí)別。本文還提供了包含從突變真菌中分離的糖基化多肽的組合物，所述突變真菌具有破壞了的釀酒酵母基因0Chl、mnnl和/或mnn4，或破壞了的釀酒酵母基因ochl、mnnl和/或mnn4的同源物基因，其中糖基化多肽被抗體2G12識(shí)別。糖基化多肽可包含至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)或至少十個(gè)N-連接的高甘露糖寡糖。糖基化多肽可以是真菌(例如酵母)或非真菌的糖蛋白或其片段。例如，糖基化多肽是釀酒酵母的PAT1、ECM33、Gasl、Gas5、GP38或YJL171c,或任一這些蛋白質(zhì)的同源物。糖基化多肽可以是毒力因子。在一些實(shí)施方案中，糖基化多肽是病毒蛋白質(zhì)或其片段。在一些實(shí)施方案中，糖基化多肽是HIVgpl20或其片段。在一些實(shí)施方案中，糖肽上至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95。/oN-連接的聚糖是Man9GlcNAc2、MansGlcNAc2或其組合。本發(fā)明的組合物排除Wang,O^r.Z)r"gZ)/s"v.Z)eve/.9(2):194-206，2006;Mandal等，jfig，.Oi綴43:2557-2561，2004;Geng等，爿Mgew.C7^附.43:2562-2565，2004;Singh等，AfW.C/^附.Ze汰13:327-330，2003;Wang等，C7^附5"Oie附.6:1068-1074(2005);Zeng等，/爿附.C7^附.5W.127:9692-9693，2005以及Li等，JOrg.Chem.70:9990-9996，2005中描述的任何糖基化多肽。本文還提供了包含突變酵母全細(xì)胞和可藥用賦形劑的組合物，其中突變酵母具有^5皮壞了的釀酒酵母基因pmrl和miml，ochl和mnnl，或ochl、mnnl和mnn4，或者石皮壞了的酉良酒酵母基因pmrl和mnnl，ochl和mnnl，或ochl、mnnl和mnn4的同源物基因。酵母全細(xì)胞可以是活細(xì)胞或死細(xì)胞。組合物可用于治療性或預(yù)防性疫苗(例如用于HIV疫苗)。本文所述的組合物包含可藥用的賦形劑?？梢允褂脙龈芍苿┗蛩匀芤盒问降娜蝆f可可藥用的運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(及e附z'"gto":77^5WewceaJjPAfl/7M"c3;第20版(2000)LippincottWilliamsandWilkins,編輯K.E.Hoover)?？山邮艿倪\(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在劑量和濃度上對(duì)于接收者是無(wú)毒的，并可包含緩沖液如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化苯曱烴銨；氯化節(jié)乙氧銨；苯酚、丁基或節(jié)基醇；對(duì)羥苯曱酸烷基酯如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑如EDTA;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如tweentm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。在一些實(shí)施方案中，可藥用賦形劑為佐劑。包含佐劑的組合物可以用作疫苗。本文還提供了制備均一糖基化重組蛋白質(zhì)的方法，其中末端聚糖為末端al-2-Man結(jié)構(gòu)，所述方法包括a)提供包含蛋白質(zhì)編碼核苷酸序列的載體；b)轉(zhuǎn)化具有蛋白質(zhì)糖基化缺陷的細(xì)胞；c)發(fā)酵轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和d)從細(xì)胞上清液中純化所分泌的重組蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列編碼以其天然狀態(tài)凈皮糖基化的蛋白質(zhì)。核苷酸序列可以編碼屬于毒力因子的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，突變的細(xì)胞表達(dá)具有大量Man9GlcNAc2或MansGlcNAc2的糖蛋白。在具體的實(shí)施方案中，核苷酸序列編碼gp120蛋白。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)具有大量Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2的gpl20蛋白。本方法的細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞如釀酒酵母附附U或釀酒酵母/7附W丄載體可以是YepL，且在一些實(shí)施方案中可以包含GAL1啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，使用His標(biāo)簽純化糖蛋白。本文還提供了通過(guò)發(fā)酵突變真菌制備本文所述任何組合物的方法，其中所述突變真菌被突變以產(chǎn)生糖基化多肽；分離或純化糖基化多肽；并將多肽與可藥用賦形劑組合以形成組合物。包含全酵母細(xì)胞的組合物可以通過(guò)發(fā)酵突變酵母制備；制備全酵母細(xì)胞與可藥用賦形劑以形成組合物?？墒褂萌魏魏线m的細(xì)胞。優(yōu)選細(xì)胞具有這樣的缺陷允許截短或以其它方式調(diào)控聚糖的典型胞內(nèi)加工。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是真菌細(xì)胞(例如酵母或霉菌細(xì)胞)。在具體的實(shí)施方案中，細(xì)胞是酵母細(xì)胞。參閱例如美國(guó)專利No.5，919，651;5,705,616。分泌的酵母蛋白質(zhì)的外部鏈糖基化是高(或長(zhǎng))甘露糖型寡糖鏈。因此，酵母生產(chǎn)提供了異源蛋白質(zhì)，其中此酵母特異性的外部鏈糖基化為高甘露糖型，這有時(shí)被稱作"高糖基化"。簡(jiǎn)言之，酵母蛋白質(zhì)的O-糖苷糖結(jié)構(gòu)由1-5個(gè)甘露糖殘基的未分枝的甘露糖鏈組成。O-糖基化始于ER(笫一個(gè)甘露糖殘基的轉(zhuǎn)移)，并在高爾基體中完成。N-糖基化始于N-乙酰葡萄糖胺核心單位，甘露糖和葡萄糖在脂質(zhì)運(yùn)載體中間體上堆積，隨后被轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的天冬酰胺(Asn)殘基上。結(jié)合了蛋白質(zhì)的核心單位隨之在特定的葡萄糖和甘露糖殘基處切割，接著是高爾基體中多糖的延長(zhǎng)，導(dǎo)致"外部鏈"糖基化?？墒褂迷S多酵母菌林產(chǎn)生本文提供的組合物。通常使用釀酒酵母細(xì)胞，但是巴斯德畢赤酵母和粟酒裂殖酵母的細(xì)胞也是可商業(yè)獲得用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的。參閱例長(zhǎng)口Tuite等，五;c/7/r5^/rtgC7oweJGWiesAeleasts1iSflcc/rwo附j(luò)^s1ccev/wWflwd尸/c/r/fl/m加/is1，PROTEINEXPRESSION:APRACTICALAPPROACH61-100(Higgins等編，OxfordUniversityPress1999);Hitzeman等，Af"/rMfe五"矽附".185:421-440(1990);Barr等，F(xiàn)flc"Vie5:卯隱101(1987);Liu等，C/z".D/flgM.丄fl6./附w"wo/.5:592-94(1998)。Mnslp或Pmrlp缺陷的酵母菌林是有用的。Msnlp是位于ER中的al，2甘露糖苷酶,在ER中它通過(guò)去除al，2連接的甘露糖中心臂將Man9切短為Man8單異構(gòu)體。因此，釀酒酵母manslp突變體菌林Mw^Li產(chǎn)生僅以Man9糖基化的蛋白質(zhì)。Pmrlp蛋白是對(duì)Ca—從ER到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)非常重要的鈣依賴型ATP酶。參閱Herscovics,5/ocA/附.5&/7/ijw.1426:275-85(1999);Camirand等，丄加o/.C7^m.266:15120-27(1991)。釀酒酵母pmrlp突變菌林/7附rU分泌僅由Man8組成的糖蛋白，Man8在ER中由甘露糖苷酶I從Man9切短而來(lái)。參閱例如Harmsen等，125:115-23(1993)。不過(guò)，在N-糖基化方面具有合適缺陷的任何菌林都可用于生產(chǎn)本文提供的組合物。參閱例如美國(guó)專利No:5,705,616、5,798,226。具有釀酒酵母、白色念珠菌和巴斯德畢赤酵母的破壞了的pmrl基因，破壞了的pmrl和mnnl基因，破壞了的ochl基因，與mnnl、mnsl和mnn4基因中一種或多種組合的破壞了的ochl基因，破壞了的ochl和mnnl基因，或破壞了的ochl、mnnl和mnn4基因的酵母菌林，或具有破壞了的同源物基因的其它酵母菌林，也可用于生產(chǎn)糖基化多肽或全酵母細(xì)月包組合物。產(chǎn)生突變真菌細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的實(shí)施例提供了產(chǎn)生多種突變酵母細(xì)胞的細(xì)節(jié)。參閱例如Chiba等，/.祝o/.C7^附.273:26298-26304,1998;Rudolph等，CW/58:133-145，1989;Nakanishi畫Shindo等，/BMOre附.268:26338-26345，1993?？墒褂萌魏魏线m的載體轉(zhuǎn)染突變體細(xì)胞產(chǎn)生重組糖基化多肽。酵母細(xì)胞通常使用基于質(zhì)粒的載體。載體可以是自主復(fù)制的多拷貝質(zhì)粒(例如Yep或YRp)，自主復(fù)制的單拷貝質(zhì)粒(例如YCp)，或整合型(通常是單拷貝的)質(zhì)粒(例如YIp)。參閱例如(第13.4單元)，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausebel等編，JohnWiley&Sons,最新版本)。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是YEpL或pYES2-CT?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的任何啟動(dòng)子。對(duì)于酵母細(xì)胞而言，可獲得天然的和經(jīng)改造的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子包括但不限于戶GX、G"y!P、3^7、04"、AD/T2、戶朋5、C陋、MFcJ、77^、/MZ、04/y04丄、GL4P/ADi^、CTC7/(7/五和尸GAZ4及E。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為04ZJ。參閱例如美國(guó)專利No.5,139,936。載體也可以包括其它序列，例如復(fù)制起點(diǎn)和用。于純化異源毒力因子如gpl20的多種標(biāo)簽序列。用毒力因子編碼載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)發(fā)酵。對(duì)酵母而言，細(xì)胞可以使用醋酸鋰、原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化或電穿孔來(lái)轉(zhuǎn)化，接著是標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵。參閱例如FeflW(第13單元)，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausebel等編，JohnWiley&Sons,最新版本)。例示性的毒力因子包括但不限于gpl20、埃博拉病毒包膜蛋白、或其它糖基化的病毒包膜蛋白或病毒蛋白質(zhì)。參閱例如美國(guó)專利No.6,630,144;6，713，069。一方面，任何合適的gpl20核苷酸序列都可以用于本文提供的組合物中。gpl20分子由60kD的多肽核心組成，被N-連接的糖基化廣泛修飾從而其表觀分子量升至120kD。參閱例如Zolla-Pazner等，7Va似,e及ev./附w"wo/.4:199-209(2004)。Gpl20的氨基酸序列含有被五個(gè)高變結(jié)構(gòu)域隔開的五個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域。gpl20—級(jí)序列中18個(gè)半胱氨酸殘基的位置，和gpl20序列中約24個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)中13個(gè)的位置普遍見于所有的gpl20。參閱Modrow等，/.Wn/.61:570-78(1987)。高變的結(jié)構(gòu)域含有廣泛的氨基酸取代、插入和缺失。這些結(jié)構(gòu)域中的序列變異導(dǎo)致來(lái)自多種病毒分離林的gpl20分子之間高達(dá)30%的總體序列變異性。參閱例如Gaschen等，Sde"ce296:2354-60(2002)。盡管如此，gpl20序列維持病毒與病毒受體CD4和DC-SIGN結(jié)合的能力。例示性的序列包括但不限于這些文獻(xiàn)中公開的序列Ratner等，A^/"廳313:227(1985);Muesing等，7Vfl/""313:450-58(1985);McCutchan等，爿/DSi仏〃M/fi做及"wv/r"^s8:1887-95(1992);Gurgo等，164:531-36(1988);和HIVSEQUENCECOMPENDIUM1987-PRESENT(Myers等編，TheoreticalBiologyandBiophysicsGroup,LosAlamosNationalLaboratory,LosAlamos,NM)。也可使用來(lái)自新分離菌林的序列。參閱例如Ou等，Sdewce256:1165-71(1992);Zhang等，J/ZXS5:675-81(1991);和Wolinsky,255:1134-37(1992)。可以使用任何合適的純化和糖基化分析方法用于本文提供的糖基化多肽(例如均一糖基化的)。例如，來(lái)自重組gpl20的熒光標(biāo)記的N-聚糖的NP-HPLC使用外葡糖苷酶消化與HPLC用于鑒定多種形式的聚糖。參閱例如Scalan等，/.MVW76:7306-21(2002)?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析、ELISA或Western印跡使用聚糖特異性抗體如2G12抗體來(lái)確定表達(dá)水平。其它例示性的方法包括基于凝集素的實(shí)驗(yàn)、火箭親合電脈(rocketaffinoelectropheresis)、雙向電泳、焚光輔助糖電泳(FACE)、毛細(xì)管電泳、核磁共振、質(zhì)譜法、氣液色鐠-質(zhì)譜(GLC/MS)、快原子轟擊(FAB)和電噴射離子化(ESI)。參閱例如Brooks等，F(xiàn)UNCTIONAL&MOLECULARGLYCOBIOLOGY(BIOSScientificPublishersLtd2002)。41本文提供的糖基化多肽(例如均一糖基化的蛋白質(zhì))也可以用于檢測(cè)針對(duì)病原體(例如HIV)的中和抗體存在的測(cè)定中。在這類測(cè)定中，蛋白質(zhì)通常用適用于測(cè)定的多種標(biāo)記之一標(biāo)記。這些標(biāo)記已在專利和技術(shù)文獻(xiàn)中廣泛報(bào)導(dǎo)，并包括放射性核素、熒光劑、酶、酶底物、顆粒、小分子等等。無(wú)需使用毒力因子的野生型蛋白質(zhì)血清型，因?yàn)榭商砑?、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，只要保留有關(guān)的結(jié)合特性、糖基化位點(diǎn)和其它有關(guān)的免疫學(xué)特性即可。因此，至少90%的，通常至少95%的，更通常至少99%的氨基酸將是正確的氨基酸并在正確的序列中。通常，任何改變將會(huì)位于N端，此處可有0到5個(gè)氨基酸差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的均一糖基化的gpl20顯示這樣的構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位激發(fā)能夠中和HIV-1元代分離林的高度中和性抗體。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的蛋白質(zhì)能夠激發(fā)這樣的抗體，所述抗體中和兩個(gè)或多個(gè)不同進(jìn)化枝的元代分離林(例如進(jìn)化枝A、B、C、D和E中的兩個(gè)或多個(gè))。中和作用如本文所7>開的那樣測(cè)定。本發(fā)明提供包含本文所述任何組合物(例如均一糖基化的蛋白質(zhì))的試料。Ip、'、，、、、、，>本文特特別提供了包含一個(gè)或多個(gè)容器的區(qū)室試劑盒，其中第一個(gè)容器含有通過(guò)本發(fā)明方法改造的一種或多種抗體，且一個(gè)或多個(gè)其它容器含有以下的一種或多種洗滌劑、施用組合物所必需的或能夠檢測(cè)特異于組合物的抗體存在的試劑。容器可以是玻璃、塑料或塑性條帶或紙制條帶。檢測(cè)劑的種類包括標(biāo)記的第二抗體、其它標(biāo)記的第二結(jié)合劑，或者在第一抗體被標(biāo)記的情況下，包括能夠與所述標(biāo)記抗體反應(yīng)的酶試劑或抗體結(jié)合試劑。有助于或使我們能夠?qū)嵤┻@類方法的輔助材料可包括在本文提供的試劑盒內(nèi)。C.使用糖基化多肽或全突變酵母細(xì)胞的疫苗本文提供了對(duì)受試者誘導(dǎo)抗病原體(例如HIV)的中和抗體的方法，包括給受試者施用有效量的任何本文所述的組合物。本文提供了對(duì)需要的受試者誘導(dǎo)抗病原體的中和抗體的方法，所述方法包括施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含均一糖基化的重組蛋白質(zhì)其中末端聚糖為末端al-2聚糖結(jié)構(gòu)、或通過(guò)制備均一糖基化的重組蛋白質(zhì)的方法制備的蛋白質(zhì)[其中聚糖為具有末端al-2聚糖結(jié)構(gòu)的寡甘露糖I和合適的賦形劑，所述方法包括a)提供包含蛋白質(zhì)編碼核苷酸序列的載體；b)轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)糖基化有缺陷的細(xì)胞；c)發(fā)酵轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和d)如本文所公開的那樣從細(xì)胞清液中純化被分泌的重組蛋白質(zhì)。所述方法還可包括施用佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，病原體為HIV。在具體的實(shí)施方案中，均一糖基化的重組蛋白質(zhì)為Man9GlcNAc2gpl20或Man8GlcNAc2gp亂本文還提供了對(duì)受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的(例如HIV-1誘導(dǎo)的)疾病的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的任何本文所述組合物。本文還提供了對(duì)需要的受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含均一糖基化的重組蛋白質(zhì)[其中末端聚糖為末端al-2聚糖結(jié)構(gòu)I或通過(guò)制備均一糖基化的重組蛋白質(zhì)的方法制備的蛋白質(zhì)[其中聚糖為具有(xl-2聚糖結(jié)構(gòu)的寡甘露糖和合適的賦形劑，所述方法包括a)提供包含蛋白質(zhì)編碼核苷酸序列的載體；b)轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)糖基化有缺陷的細(xì)胞；c)發(fā)酵轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和d)如本文所公開的那樣從細(xì)胞上清液中純化被分泌的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括施用佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，病原體為HIV。在具體的實(shí)施方案中，均一糖基化的重組蛋白質(zhì)是Man9GlcNAc2gpl20或Man8GlcNAc2gpl20。在一些實(shí)施方案中，本文提供的藥物組合物還包含來(lái)自不同HIV菌林的多種gpl20蛋白。本發(fā)明的疫苗組合物可以通過(guò)臨床指定的任何途徑被施用，例如通過(guò)應(yīng)用于粘膜表面，包括但不限于鼻內(nèi)、口服、眼內(nèi)、經(jīng)腸胃、直腸、陰道、或泌尿生殖途徑?；蛘咭部梢允褂媚c胃外施用模式，例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)經(jīng)皮或經(jīng)粘膜施用。典型地，抗HIV感染的疫苗保護(hù)誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答、系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，或二者均有。適用于施用的途徑可包括腸胃外或非腸胃外途徑，包括但不限于皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)口、粘膜或鼻內(nèi)施用。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何合適方法配制，并可含有任何合適并兼容的稀釋劑、運(yùn)載體、防腐劑、藥物賦形劑或其它成分。參閱例如REMINGTON:THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY,第20版(Gennaro等編，UniversityofSciences2000)。用于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)粘膜(例如鼻內(nèi)、直腸、陰道、口腔)、經(jīng)皮、皮下施用或任何其它施用途徑的合適的藥物運(yùn)載體是本領(lǐng)域^^知的，并考慮用于本發(fā)明。參閱例如Robinson等編，VACCINEPROTOCOLS,第2版(HumanaPress2003);Powell等編，VACCINEDESIGN:THESUBUNITANDADJUVANTAPPROACH(PlenumPress1995);Plotkin等編，VACCINES,第4版(Saunders2004);美國(guó)專利No.4,235,877;4,372,945和4,474/757。合適的配方(其可包含佐劑)可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。所施用的疫苗量取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員所確定的具體的疫苗抗原和使用的任何佐劑、施用的方式和頻率、受體的年齡和體重，以及所期望的效果(例如預(yù)防和/或治療)。疫苗劑量中蛋白質(zhì)的量選擇為這樣的用量其誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答而無(wú)一般疫苗顯著有害的副作用。這樣的用量會(huì)根據(jù)釆用的特定免疫原而變化。通常期望每份劑量包含lng至100mg的蛋白質(zhì)，有時(shí)在2-200ng，其它情況下為4-40pg。特定疫苗的最佳量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究確定，這包括觀察受試者的抗體效價(jià)和其它應(yīng)答。當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員確定需要時(shí)，可重復(fù)施用。在許多情況下，會(huì)期望多次施用疫苗，通常不超過(guò)六次疫苗接種，更通常不超過(guò)四次疫苗接種，優(yōu)選一次或多次，通常為約三次疫苗接種。疫苗接種通常會(huì)以從2周到12周的間隔，更通常從3周到5周的間隔，在1到5年的間隔進(jìn)行任選的周期性免疫加強(qiáng)。免疫接種的過(guò)程可以用病原體的抗體(例如HIVgpl20抗體)測(cè)試跟蹤。本發(fā)明的活性疫苗可以單獨(dú)使用或與生物活性劑組合使用，所述生物活性劑包括但不限于其它毒力因子、減毒或失效形式的病毒或佐劑。這樣的其它制劑可以經(jīng)由相同或直接的施用途徑同時(shí)施用或序慣施用。在一些實(shí)施方案中，被施用的蛋白質(zhì)來(lái)自相同或相關(guān)病原體的不同血清型。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性劑與本文提供的糖基化的蛋白質(zhì)協(xié)同作用，以刺激抗病原體的有效免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，本文提供的糖基化蛋白質(zhì)(例如均一糖基化的重組蛋白質(zhì))與佐劑一起施用。在用于本發(fā)明的疫苗配制方面，優(yōu)選佐劑組合物誘導(dǎo)體液應(yīng)答或Th2應(yīng)答。這類佐劑可包括誘導(dǎo)IL-4、L-6和/或IL-10生產(chǎn)的佐劑以及增強(qiáng)T細(xì)胞非依賴性抗原的免疫原性的其它手段。參閱例如Mond等,AnnualReviews13:655-92(1995);Lesinski等,J.Microbiolog.Methods47:135-49(2001)。然而應(yīng)當(dāng)理解不排除其它應(yīng)答，包括細(xì)胞應(yīng)答，特別是在疫苗策略中共同施用其它毒力因子的情況下。因此，也考慮公知的佐劑如CpG寡脫氧核苷酸、破傷風(fēng)類毒素、皂苷、脂肽和IL-12。在具體的實(shí)施方案中，本文提供的糖基化蛋白質(zhì)與破傷風(fēng)毒素的刺激性表位綴合。參閱例如Kumat等，J.Immunol.148:1499-505(1992)。本文提供的蛋白質(zhì)可以以制劑的形式與佐劑一起同時(shí)或序慣遞送或單獨(dú)遞送。合適的佐劑包括鋁鹽，如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，但是也可以是鈣、鐵或鋅鹽，或可以是?；野彼帷⒒蝓；荹陽(yáng)離子或陰離子衍生多糖或聚辨腈I的不溶性混懸液。參閱例如Robinson等編，VACCINEPROTOCOLS第2版(HumanaPress2003);Powell等編，VACCINEDESIGN:THESUBU證ANDADJUVANTAPPROACH(PlenumP,1995);Plotkin等編，VACCINES第4版(Saunders2004);美國(guó)專利No:6,797,276;6,596,278;6,491,919;4,894,229;5，814，321;5，679，355和4，803，070。在一些實(shí)施方案中，佐劑是不完全弗氏佐劑(IFA)或明礬。使用的佐劑量可根據(jù)佐劑的性質(zhì)廣泛變化，通常范圍在免疫原重量的0.1倍到100倍，更通常從約l倍到約IO倍。在一些實(shí)施方案中，本文描述的全突變酵母細(xì)胞(例如活或死細(xì)胞)可用于預(yù)防性或治療性的疫苗中。例如，全突變酵母細(xì)胞被配制為膠嚢、丸劑、凝膠劑或霜?jiǎng)┯糜诳诜㈥幍阑蛑蹦c施用。所誘導(dǎo)的抗體的中和能力可以使用常規(guī)方法評(píng)估。因此，認(rèn)為中和HIV的抗體可抑制以下一種或多種病毒附著、共受體接合、膜融合或某些有效相互作用。參閱例如美閨專利No.6,391,567;Lin等，77:1337(2003);Lee等，/Wra/.75:12028(2001);Geijtenbeek等，CW/100:587(2000);Brewley等，/j附.C7^附.版123:3892-3卯2(2001);美國(guó)專利申請(qǐng)No.20030096221;200500643卯；20040259785;20040228869和20040096823。細(xì)月包融合包括見于哺乳動(dòng)物細(xì)胞或病毒如HIV-l的脂質(zhì)雙分子層膜的連接或聯(lián)合。該過(guò)程有別于HIV-l對(duì)靶細(xì)胞的附著。在一個(gè)實(shí)施方案中，附著通過(guò)HIV-l外部糖蛋白與人CD4受體的結(jié)合介導(dǎo)。所述相互作用也可包括共受體，其包括但不限于CCR5、CXCR4、CCR2、CCR3、CCR8、STRL33、GPR-15、CX3CR1和APJ。參閱例如Opperman等，Ce///.16:1201-10(2004);Philpott等，Curr.HIVRes.1:217-27(2003)。在具體的實(shí)施方案中，中和抗體是阻止或抑制糖基化gpl20與DC-SIGN結(jié)合的抗體。參閱例如美國(guó)專利No.6，391，567;Lin等，/.Mra/.77:1337-46(2003);Mitchell等，/說(shuō)o/.CTie附.276:31:28939-45(2001)。中和抗體可以是任何同種型。在一些實(shí)施方案中，抗體是IgG抗體。更特別地，抗體可以是IgG!、IgG2、IgG3或IgG4抗體。D.制備和鑒定特異于基本上均一糖基化組合物的抗體的方法本文還提供了制備與含末端al-2聚糖結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括用有效量的本文所述組合物(例如包含通過(guò)本文公開的方法制備的重組蛋白質(zhì)或本文公開的蛋白質(zhì)的組合物)免疫動(dòng)物。所述組合物可還包含佐劑、運(yùn)載體或二者均有。本文提供了通過(guò)本文公開的方法產(chǎn)生的分離的抗體，以及生產(chǎn)所述分離抗體的雜交瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異于Man9GlcNAc2gpl20或Man8GlcNAc2gp120，并優(yōu)選與人糖蛋白不具有顯著的交叉反應(yīng)性?？梢允褂锰禺愑诒疚奶峁┑奶腔鞍踪|(zhì)的抗體的任何合適的生產(chǎn)方法。免疫、生產(chǎn)和分離抗體(多克隆和單克隆)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并描述于科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中。參閱例如Coligan，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(JohnWiley2005);Stites編，BASICANDCLINICALIMMUNOLOGY笫9版(LangeMedicalPublications1998);Goding，MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLEANDPRACTICE第3版(AcademicPress1996);Harlow,ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,(ColdSpringHarbor1998)。本文提供的抗體可以分離自天然來(lái)源、合成、或是使用本領(lǐng)域已知的方法重組產(chǎn)生的多肽?？贵w可以體外或體內(nèi)重組表達(dá)。參閱例如Caruthers(1980)NucleicAcidsRes.Symp.Ser.215-223;Horn(1980)NucleicAcidsRes.Symp.Ser.225-232;Banga，A.K.，THERAPEUTICPEPTIDESANDPROTEINS,FORMULATION,PROCESSINGANDDELIVERYSYSTEMS(1995)TechnomicPublishingCo"Lancaster,Pa.。例如，抗體合成可以4吏用多種固相技術(shù)(參閱例如Roberge(1995)5Wewce269:202;Merrifield(1997)Af"/^A^i矽柳o/.289:3-13)進(jìn)行，并可以例如使用ABI431A肽合成儀(珀金埃爾默公司PerkinElmer)根據(jù)制備商提供的說(shuō)明書實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成?？贵w產(chǎn)生和生產(chǎn)妁重組手段的例示性說(shuō)明包括Delves,ANTIBODYPRODUCTION:ESSENTIALTECHNIQUES(Wiley,1997);Shephard等，MONOCLONALANTIBODIES(OxfordUniversityPress,2000》Goding，MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDPRACTICE(AcademicPress,1993);CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(JohnWiley&Sons,最新版本)。除了使用動(dòng)物(包括但不限于經(jīng)遺傳工程改造的動(dòng)物)的傳統(tǒng)體內(nèi)方法外，也可以體外(例如使用重組抗體結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)噬菌體展示文庫(kù))產(chǎn)生抗體。參閱例如Hoogenboomr卿fife所她c細(xì)o/.15:62-70(1997);Katz(1997)及ev.祝o/;一.祝o附oA26:27-45(1997);Fishwild等，TV"A14:845(1996);Mendez等，TVflZ.G^i".15:146(1997);美國(guó)專利No:6,632,976。多克隆和單克隆抗體一經(jīng)生產(chǎn)，就通過(guò)Western印跡或免疫沉淀分析通過(guò)例如前文Ausubel等中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)試它們對(duì)糖基化蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別。在一些實(shí)施方案中，抗體可以被人源化。美國(guó)專利No.5，585，089;美國(guó)專利No.5,693,761和WO90/07861?；旧暇惶腔目乖褂帽疚奶峁┑姆椒ㄉa(chǎn)。激發(fā)抗原可以是單個(gè)表位、多個(gè)表位、或整個(gè)蛋白質(zhì)單獨(dú)的或與本領(lǐng)域已知的一種或多種免疫原性增強(qiáng)劑組合。激發(fā)抗原可以是分離的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)(例如用抗原的少一部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免疫)或可溶性蛋白質(zhì)(例如僅用蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域部分免疫)。本發(fā)明的抗體可以是IgG、IgM、IgD、IgE或IgA抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是IgG抗體。更特別地，抗體可以是IgG^IgG2、IgG3或IgG4抗體?？贵w可使用任何合適的來(lái)源。例如，抗體可以是人、鼠、大鼠、兔、牛、駱駝、美洲駝、單峰駱駝或猿猴的抗體。一旦鑒定了合適的抗原結(jié)合區(qū)域(例如在體外、體內(nèi)或者體外和體內(nèi)中和的抗體的CDR)，則可以用任何合適的手段修飾抗體以增強(qiáng)其治療效力。本發(fā)明抗體的修飾包括抗體氨基酸序列中的至少一個(gè)突變。例如，可以通過(guò)1務(wù)飾、添加或缺失向編碼抗體的核酸中引入一個(gè)或多個(gè)突變，以改變抗體的一種或多種特性。本發(fā)明的抗體可以以任何合適的手段纟務(wù)飾以賦予或增強(qiáng)期望的效應(yīng)功能或物理特征。參閱例如美國(guó)專利No.6，737，056和US2004/0132101。因此，通因此，抗體可以是人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、融合蛋白，或它們的生物活性片段。在一些實(shí)施方案中，抗體(或其生物活性片段)為融合蛋白。融合蛋白可以包括簡(jiǎn)化純化或生產(chǎn)的額外的肽序列。融合蛋白也可以包括具有生物活性的結(jié)構(gòu)域和/或整個(gè)多肽，以補(bǔ)充抗體的活性。例如，抗體可以與細(xì)胞因子、配體、粘附分子、肽、受體、酶、治療蛋白質(zhì)、染料、有機(jī)小分子或它們的任何生物活性部分融合?？墒褂萌魏魏线m途徑測(cè)定本發(fā)明抗體的親合力。在一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)表面等離振子共振(百艾括爾公司Biacore)測(cè)定親和力。本發(fā)明的抗體也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步修飾以提高結(jié)合親合力。參閱例如美國(guó)專利No.6,350,861。本文提供的抗體可以是適用于免疫測(cè)定的抗體。特別的測(cè)定包括ELISA測(cè)定、三明治測(cè)定、放射免疫測(cè)定和Western印跡。參閱例如ANTIBODYENGINEERING:APRACTICALAPPROACH(OxfordUniversityPress,1996)。這些單克隆抗體通常會(huì)與至少約1jiM、更通常與至少約300nM、一般至少約30nM、優(yōu)選至少約10nM、更優(yōu)選至少約3nM或更佳的Kd結(jié)合，通常通過(guò)ELISA測(cè)定?？梢允褂萌魏魏线m的方法測(cè)定存在毒力因子時(shí)抗體的生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果抗體將生物的致病性和/或毒力因子的毒性降低至少20%、至少50%、60%、70%、80%、90%或100%，則抗體具有抗毒力因子的活性。在另一實(shí)施方案中，如果存在一種或多種其它抗毒力因子時(shí)，本發(fā)明的抗體將生物的致病性和/或毒力因子的毒性降低至少20%、至少50%、60%、70%、80%、90%或100%，則該抗體具有抗毒力活性。本發(fā)明的抗體可特異性地結(jié)合任何合適的糖基化毒力因子。毒力因子可以是粘附因子、外殼蛋白、侵入因子、莢膜、外毒素或內(nèi)毒素?？贵w的抗病原體效應(yīng)可得自抗體與毒力因子的結(jié)合、因子的清除、因子的滅活等等。另一方面，本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸(其含有編碼本文公開的抗體的序列)、包含編碼核酸的載體和包含編碼核酸或載體(其包含編碼核酸)的細(xì)胞。通常，載體包舍與啟動(dòng)子有效連接的抗體編碼核酸，所述啟動(dòng)子適用于在指定的宿主細(xì)胞中表達(dá)。用于表達(dá)本發(fā)明的核酸、表達(dá)盒和載體的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母、真菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了用于在所有這些細(xì)胞中優(yōu)化密碼子使用的方法、密碼子改變的核酸和由密碼子改變的核酸制備的多肽。例示性的宿主細(xì)胞包括革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌和熒光假單胞菌(尸Mm/(wiomw/7woresc^w);革蘭氏P日性細(xì)菌，例如5^印似附j(luò);c"力Vers"、力口氏乳桿菌(丄fl"o6flci7/wsgfl^sen)、乳酸乳球菌(丄fl"ococc"s/"c船)、乳月旨乳J求菌cre附wis)和枯草芽孢桿菌CBfld〃船s^說(shuō)&)。例示性的宿主細(xì)胞也包括真核生物，例如多種酵母，如酵母屬物種(SflccA"/wwj;c"w/;.)，包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母和乳酸克魯維酵母(^T/"j;vm考ces1/""/s)、多形漢森酵母(H""M5^i"/fl"/戸0/77/^1)、黑曲霉(/^/7erg///MSw/gC)和哺乳動(dòng)物細(xì)月包及細(xì)月包系，以及昆蟲細(xì)月包及細(xì)月包系。因此，本發(fā)明還包括抗體及其編碼核酸，它們?cè)谶@些生物和物種中的表達(dá)已經(jīng)4皮優(yōu)化。參閱例如美國(guó)專利No.5,795,737;Baca(2000)/W./尸flmw'to/.30:113-118;Hale(1998)尸她/w￡"，尸"r仏12:185-188;Narum(2001)/w/e"./附扁《.69:7250-7253;Outchkourov(2002)Prate/"24:18-24;Feng(2000)祝0c/^附/"739:15399-15409;和Humphreys(2000)iV幽Vi￡"，20:252-264。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗體和合適賦形劑的藥物組合物，作為治療劑被施用。一方面，本發(fā)明提供了包含經(jīng)改造的本發(fā)明抗體和合適賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明提供了包含上文公開的至少一種單克隆抗體和合適賦形劑的藥物組合物。適用于藥物組合物的配方和賦形劑是本領(lǐng)域公知的。適用于本發(fā)明的抗體(來(lái)自任何來(lái)源，包括但不限于重組來(lái)源)本身可向需要的受試者施用，或以治療或改善多種病癥的劑量與合適的運(yùn)載體或賦形劑混合以藥物組合物的形式施用。參閱例如REMINGTON:THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY(最新版本)。這樣的組合物也可含有(除了蛋白質(zhì)和運(yùn)載體外)稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和本領(lǐng)域公知的其它物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"可藥用的"是指不干擾活性成分的生物活性效果的無(wú)毒物質(zhì)。運(yùn)載體的特征取決于施用的途徑。本發(fā)明的藥物組合物也可含有期望的其它抗病原體物質(zhì)，如細(xì)胞因子或抗微生物劑。當(dāng)本發(fā)明的抗體與一種或多種生物活性劑共同施用時(shí)，本文提供的抗體可以與生物活性劑同時(shí)施用或序慣施用。如果序慣施用，則主治醫(yī)師將會(huì)決定與生物活性劑組合施用本發(fā)明蛋白質(zhì)的適當(dāng)順序。這類抗體的毒性和治療效果可以使用常規(guī)方法測(cè)定。可由個(gè)人醫(yī)師根50據(jù)患者的狀況選擇精確的配方、施用途徑和劑量。參閱例如Fingl.等，THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS1(最新版本)。本文還提供了對(duì)需要的受試者誘導(dǎo)抗病原體的中和抗體的方法，所述方法包括施用有效量的藥物組合物，所述組合物包含本文提供的蛋白質(zhì)或由本文提供的方法制備的蛋白質(zhì)和合適的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括施用佐劑。在具體的實(shí)施方案中，病原體為HIV。本文還提供了對(duì)需要的受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的藥物組合物，所述組合物包含本文提供的蛋白質(zhì)或由本文提供的方法制備的蛋白質(zhì)和合適的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括施用佐劑。在具體的實(shí)施方案中，病原體為HIV。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為gpl20。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含來(lái)自不同HIV菌林的多種gpl20蛋白。本文還提供了鑒定抗HIV傳播的中和性單克隆抗體的方法，包括a)將笫一細(xì)胞與第二細(xì)胞接觸，其中所述第一細(xì)胞表達(dá)樹突細(xì)胞特異性的C型凝集素(DC-SIGN)，所述第二細(xì)胞表達(dá)CD4+和CCR5+,b)將第一和第二細(xì)胞與傳染性病毒顆粒共培養(yǎng)；c)將共培養(yǎng)物與通過(guò)權(quán)利要求20的方法制備的候選抗體接觸；和d)測(cè)定相對(duì)傳染性，其中中和抗體減少或消除傳染性病毒顆粒對(duì)第二細(xì)胞的相對(duì)傳染性。參閱例如US6,391,567;Bashirova等，J.Exp.Med.193:671(2001);Lee等，/75:12028(2001)。本發(fā)明經(jīng)此一般性的說(shuō)明后，通過(guò)參照以下的實(shí)施例將會(huì)更容易理解，除非另有說(shuō)明，提供所述實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明，而不旨在限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)系統(tǒng)的選擇。選擇Pmrl蛋白質(zhì)缺陷型釀酒酵母菌抹，其中pmrl為對(duì)于Ca++AER到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)非常重要的鈣依賴性ATP酶(55，56)。菌抹是所謂的異源蛋白質(zhì)的超級(jí)分泌菌，其分泌接近100%的異源蛋白質(zhì)(57-58)。該菌抹分泌僅帶有Man8GlcNAc2的糖蛋白，所述MansGlcNAc2通過(guò)甘露糖普酶在ER中從Man9GlcNAc2切短而來(lái)，這在數(shù)種蛋白質(zhì)中已有報(bào)導(dǎo)(58-60)?？寺IV-1gpl20以表達(dá)分泌的糖蛋白。將釀酒酵母a交配因子(MFa)的信號(hào)序列克隆進(jìn)表達(dá)載體pYES2/CT(英駿公司Invitrogen)中。通過(guò)PCR從酵母總DNA中擴(kuò)增MFa的編碼序列。PCR引物含有Kpnl和BamHI位點(diǎn)。擴(kuò)增了250bp的片段，將其純化并連接進(jìn)pGEM-T(普洛麥格Promega)中。轉(zhuǎn)化和小量制備鑒定后，鑒定了陽(yáng)性克隆。然后用BamHI和Kpnl同時(shí)消化pGEM-T-MFa和pYES2/CT質(zhì)粒。純化MFa條帶和pYES2條帶后，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞中并涂布在LB-氨千青霉素平板上。鑒定含MFa的陽(yáng)性克隆并用于克隆gpl20。使用相應(yīng)的質(zhì)粒(艾滋病研究和參照試劑項(xiàng)目，ARRRP)作為才莫板，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)自菌抹JR-FL、JR-CSF和YU2的HIV-1gpl20蛋白的編碼序列。將經(jīng)PCR擴(kuò)增的pgl20DNA片段克隆進(jìn)含有EcoRI和Xbal位點(diǎn)的pYES2/CT-MFa質(zhì)粒中。然后將三種pYES2/CT-MFa-gp120質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞中，并通過(guò)小量制備進(jìn)行消化分析來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆。使用快速醋酸鋰轉(zhuǎn)化方案將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)二倍體酵母菌林;mwL4(英駿公司Invitrogen)中。pYES2/CT載體含有誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，能夠在半乳糖誘導(dǎo)后高水平表達(dá)重組蛋白質(zhì)。為了生產(chǎn)gpl20并將其分泌到培養(yǎng)基中，將轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在-Ura/棉子糖培養(yǎng)基上于30。C培養(yǎng)過(guò)夜。離心后，用-Ura/半乳糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞用于誘導(dǎo)gpl20表達(dá)。均一糖基化HIV-1Env蛋白的表達(dá)、純化和分析。/;/m7J菌林是溫度敏感的，在許可溫度下生長(zhǎng)緩慢。因此，在不同的溫度和時(shí)間點(diǎn)檢查gpl20表達(dá)，從而測(cè)定這些酵母細(xì)胞能夠表達(dá)最高水平蛋白質(zhì)并將其最為有效地分泌到培養(yǎng)基中的條件。/wir7J酵母細(xì)胞在25'C分泌最大量的gpl20蛋白7到14天(圖2A)。在培養(yǎng)1天后檢測(cè)到gp120蛋白，并在培養(yǎng)基中持續(xù)積累至少14天，表明酵母細(xì)胞持續(xù)生產(chǎn)和分泌異源蛋白質(zhì)。還表明糖基化gpl20蛋白在室溫是穩(wěn)定的。如果/wiWJ菌4朱中生產(chǎn)的gpl20糖蛋白僅含有MansGlcNAc2寡糖，則對(duì)于JR-CSF、JR-FL和YU2而言，蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)分別具有99603Da、96385Da和99621Da的預(yù)測(cè)分子量。Western印跡顯示在SDS-PAGE中這些預(yù)測(cè)大小的蛋白質(zhì)移行。印跡用MAb2G12探測(cè)，其可容易地檢測(cè)/ww/J菌林中生產(chǎn)的gpl加蛋白(圖2A)。純化步驟很簡(jiǎn)單，因?yàn)榻湍概囵B(yǎng)基蛋白質(zhì)含量少。甘露糖結(jié)合凝集素親和層析和凝膠過(guò)濾的組合足夠獲得高于95%的純度。簡(jiǎn)言之，濃縮第14天的培養(yǎng)上清液，并在4'C在透析緩沖液(1mMCaCl2和1mMMnCl2)中透析16小時(shí)。在40，000g于4。C離心30分鐘后，去除含有非目的蛋白質(zhì)的沉淀。然后使用瓊脂糖-Con-A柱(Vector實(shí)驗(yàn)室，CA)純化這些gpl20蛋白。將含有g(shù)pl20蛋白的上清液上樣至預(yù)平衡的Con-A-瓊脂糖柱上，并在4'C孵育16小時(shí)。然后用透析緩沖液洗滌柱，并用洗脫緩沖液(SOOmMa-甲基甘露糖苷、250mMNaC1、20mMTrisCl、1mMCaClz和1mMMnCl2，pH6)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。純化的物質(zhì)主要含有100kDa和160kDa的蛋白質(zhì)。然后使用凝膠過(guò)濾去除160kDa的蛋白質(zhì)。用洗滌緩沖液(50mM咪唑、100mMNaCl、10mM磷酸鈉，pH8.0)洗滌預(yù)先裝填的S印hacrylS-100HR(安發(fā)瑪西亞生物才支術(shù)公司AmershamPharmaciaBiotech)柱。用洗脫緩沖液(50mM咪唑、100mMNaCl、10mM磷酸鈉，pH8.0)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)并收集lml級(jí)分。通過(guò)SDS-PAGE和隨后的考馬斯藍(lán)染色分析級(jí)分(圖2B)。純化后，使用PGNaseF消化和質(zhì)鐠法分析糖型。通常大于90%的Man會(huì)是Man8或Man9。為了評(píng)估gpl20和污染物的量，用內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)消化純化的蛋白質(zhì)，所述酶已知切割高甘露糖和雜合型的糖。來(lái)自圖3的結(jié)果顯示主要的條帶為55-60kDa的蛋白質(zhì)，對(duì)應(yīng)于gpl20多肽的大小。基于圖3數(shù)據(jù)所評(píng)估的gpl20純度大于90%。在后來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，該條帶被進(jìn)一步鑒定為主要是PST1，一種酵母蛋白質(zhì)。參閱圖15。特異于糖基化gpl20蛋白的抗體。為了測(cè)試甘露糖特異性抗體是否能夠被HIV-1Env蛋白質(zhì)誘導(dǎo)并與之反應(yīng)，用酵母細(xì)胞壁提取物酵母聚糖A免疫兔子，所述酵母聚糖A含有p-葡聚糖和ot-甘露聚糖。這些富含甘露糖的結(jié)構(gòu)主要含有末端al，3和al，6鍵，極少有al,2結(jié)構(gòu)，例如通常見于gpl20中的那些。在第0周用含酵母聚糖A的200figCFA免疫兩只兔子，并在笫2周和第4周和之后每四周用100ng含抗原的IFA加強(qiáng)。在笫5周和每次加強(qiáng)后1周收集免疫血清。如通過(guò)ELISA分析(其使用被平板捕獲的酵母聚糖A或甘露糖)所確定的那樣，抗原激發(fā)了良好的抗體應(yīng)答(圖4A)。值得注意的是，免疫血清也識(shí)別一些測(cè)試的gpl20糖蛋白(圖4B)?？垢事毒厶茄鍖?duì)進(jìn)化枝E(ChenMai和93TH975)、C(CN54和96ZM651)和進(jìn)化枝B之一(LAV)顯示廣譜的、但是相對(duì)低水平的反應(yīng)性。相反，2G12MAb主要與進(jìn)化枝B(ADA,JR-FL，BAL，LAV)菌林反應(yīng)，但是對(duì)進(jìn)化枝C(CN54和96ZM651)沒(méi)有應(yīng)答，或?qū)y(cè)試的進(jìn)化枝E菌抹(93TH975和ChenMai)很少應(yīng)答。通過(guò)Western印跡和重復(fù)的ELISA進(jìn)一步證實(shí)了抗體對(duì)進(jìn)化枝EChen菌抹的高效價(jià)。這些結(jié)果提示可以在動(dòng)物中誘導(dǎo)抗甘露糖的抗體，并且能夠獲得對(duì)HIVgpl20的反應(yīng)性。這些發(fā)現(xiàn)為我們新穎的、富含甘露糖的gpl20免疫原的發(fā)展提供了有力的理論基礎(chǔ)。在/7wWJ酵母細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)自菌抹YU2、JR-FL和JR-CSF的gpl20蛋白含有22-24個(gè)Man8結(jié)構(gòu)，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)自相同HIV菌林的gpl20蛋白含有約一半的Man5-9和一半的復(fù)合糖結(jié)構(gòu)。為了確定在酵母中表達(dá)的gpl20蛋白是否被抗甘露聚糖抗體以及2G12更有效地識(shí)別，我們使用在酵母中表達(dá)的來(lái)自YU2菌林的純化的gpl20蛋白與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的YU2進(jìn)行比較。來(lái)自該ELISA分析(圖4C)的結(jié)果顯示來(lái)自酵母的gpi20蛋白與來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相比對(duì)抗甘露聚糖抗體具有高得多的抗原性。該圖也顯示抗甘露聚糖抗體識(shí)別Man9-BSA綴合物但不識(shí)別單獨(dú)的BSA。Man9的分離以及Man9與BSA的綴合。為了使用Man9GlcNAc2作為篩選抗al,2-Man結(jié)構(gòu)抗體的工具，從植物蛋白質(zhì)分離Man9并與BSA綴合。具體地，通過(guò)加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校(UniversityofCaliforniaSanDiego，UCSD)的糖生物學(xué)核心設(shè)備(GlycobiologyCoreFacility)從大豆凝集素(SBA，EYlabs)中分離Man9聚糖。簡(jiǎn)言之，使用PNGaseF釋放純化的SBA上的N-聚糖并使用TCA沉淀純化，以去除蛋白質(zhì)。將上清液通過(guò)Sep-PakC18管以去除殘余的洗滌劑，并在多孔的石墨化碳管(graphitizedcarboncartridge)上純化聚糖。單糖分析表明產(chǎn)率為每25mg蛋白質(zhì)0.2mg。通過(guò)HPAEC-PAD分析聚糖，并與還原的Man9GkNAc2標(biāo)準(zhǔn)和還原的RNAseB聚糖比較。經(jīng)評(píng)估，卯％的聚糖事實(shí)上是Man9GlcNAc2,并且Man9GlcNAc2與Man8GlcNAc2的比例為9:1。對(duì)等分式樣進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。主要的種類是Hex9HexNAc2,盡管也觀察到更少量的更小的聚糖。然后使用sulfo-SMCC(Pierce生化藥劑公司)方法將Maii9GlcNAc2與BSA綴合。簡(jiǎn)言之，使Man9GlcNAc2與2-氨基乙硫醇鹽酸鹽于85。C反應(yīng)30分鐘。將反應(yīng)混合物在水中進(jìn)行透析以去除反應(yīng)試劑和鹽，然后真空干燥。然后將Man9衍生物溶解在100piSMCC反應(yīng)緩沖液(O.lM礴酸鈉，50mMEDTA，pH7.4)中。將BSA在反應(yīng)緩沖液中用sulfo-SMCC活化2小時(shí)。通過(guò)將反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠G25柱，去除過(guò)量的SMCC。合并并濃縮含有BSA-SMCC的級(jí)分。將100jigBSA-SMCC與50jig衍生的Man9反應(yīng)30分鐘。通過(guò)添加0.5M半胱氨酸終止反應(yīng)，并在砩酸鹽緩沖液中進(jìn)行透析。將溶液真空干燥并將BSA-Man9綴合物溶解在0.1ml水中，得到BSA為1mg/ml的濃度。圖5顯示與BSA-SMCC和未綴合的BSA相比，BSA-Man9綴合物的移行。DC-SIGN抗體和重組蛋白質(zhì)的制備。使用抗DC-SIGN抗體監(jiān)測(cè)重組DC-SIGN蛋白質(zhì)的表達(dá)。使用合成肽在兔子中生產(chǎn)兩種抗體。通過(guò)免疫親和層析純化免疫血清。兩種肽抗體均識(shí)別來(lái)自人粘膜組織裂解物中的44kDa條帶。該條帶被抗原肽封閉，指示這兩種抗體是特異性的。DC-SIGN的克隆和表達(dá)。為了進(jìn)行g(shù)pl20-DC-SIGN結(jié)合測(cè)定并測(cè)試激發(fā)的抗體的中和活性，克隆和表達(dá)DC-SIGN的胞外結(jié)構(gòu)域。通過(guò)PCR擴(kuò)增制備DC-SIGN的cDNA片段，并連接進(jìn)pET100載體(英駿公司Invitrogen)。使用BL21(DE3)細(xì)菌在存在0.5MIPTG時(shí)表達(dá)重組蛋白質(zhì)。IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后收獲細(xì)菌細(xì)胞。將細(xì)菌裂解物分離為可溶和不溶的級(jí)分，并通過(guò)SDS-PAGE分析。在不溶級(jí)分中發(fā)現(xiàn)重組的ECD蛋白質(zhì)，并使用Ni-NTA柱純化(圖6A)。從細(xì)菌包涵體中重新折疊并純化DC-SIGN。因?yàn)榘w中的不溶蛋白質(zhì)被不正確地折疊。重新折疊變性的蛋白質(zhì)以獲得具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，并用Ni-NTA和D-甘露糖親和層析純化重新折疊的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)言之，用含有1mg/ml溶菌酶和5ng/mlDNAseI的裂解緩沖液(50mMTris-Cl、150mMNaCl、5mM2ME，pH7.45)裂解細(xì)菌細(xì)胞，以釋放包涵體和可溶性蛋白質(zhì)。通過(guò)離心沉淀包涵體并充分洗滌以去除可溶性蛋白質(zhì)。將包涵體在含有8M尿素的重新折疊緩沖液(20mMTris、10mM2ME、10mMDTT、lmM甘氨酸、1mMGSH、O.lmMGSSG、lmMEDTA，pH10.5)中裂解。用重新折疊緩沖液稀釋尿素濃度，并用1NHC1將溶液順次調(diào)節(jié)為pH9.0、8.8、8.5和8.0。將重新折疊溶液在40,000g離心30分鐘以去除不溶物質(zhì)。然后用Ni-NTA瓊脂糖柱純化重新折疊的蛋白質(zhì)，并用含有500mM咪唑的裂解緩沖液洗脫。用SDS-PAGE和隨后的考馬斯藍(lán)染色分析純化的ECD蛋白質(zhì)的量和純度。圖6A顯示M-NTA純化后，重新折疊的蛋白質(zhì)具有高于卯％的純度。使用用上樣緩沖液預(yù)平衡的D-甘露糖-瓊脂糖柱進(jìn)一步純化來(lái)自Ni-NTA柱的、含有ECD蛋白質(zhì)的洗脫液，從而選擇能夠結(jié)合配體的蛋白質(zhì)。用上樣緩沖液洗滌柱，并用50mMa-D-甘露糖洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE和隨后的考馬斯藍(lán)染色分析級(jí)分。圖6B中的結(jié)合測(cè)定顯示重組蛋白質(zhì)是功能性的，因?yàn)樗詫?duì)多克隆抗體相似的親和力與gpl20結(jié)合。DC-SIGN-gp120相互作用的結(jié)合測(cè)定。為了測(cè)試DC-SIGN活性，進(jìn)行DC-SIGN-gp120結(jié)合測(cè)定。將不同的免疫血清稀釋液(使用不同濃度的2G12MAb作為對(duì)照)與200nggpl20蛋白孵育以測(cè)定ICs。值。平行使用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞中產(chǎn)生的來(lái)自YU2和JR-FL菌林的gpl20蛋白用于比較。然后將孔與抗gpl20多克隆抗體(美國(guó)生物公司USBiological)、隨后與山羊抗兔IgG-HRP綴合物孵育。每個(gè)條件一式兩份進(jìn)行。使用根據(jù)gpl20濃度和OD值創(chuàng)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定與DC-SIGN結(jié)合的gpl20的量。在給定的抗體濃度下的百分比抑制表達(dá)為[(無(wú)抗體時(shí)的gpl20量一存在給定濃度抗體時(shí)的gpl20量)/無(wú)抗體時(shí)的gpl20量x100。測(cè)定了抑制能力，即50%(ICso)和卯。/。(IC9o)抑制劑量。為了測(cè)試每種抗體的廣譜中和反應(yīng)性，使用來(lái)自進(jìn)化枝A、B和C的重組gpl20糖蛋白。使用500ng/孔的純化的ECD蛋白質(zhì)將微孔板包被16小時(shí)。用含有0.1%BSA的TBS-Tween封閉孔。使用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)的來(lái)自YU2菌林的gpl20蛋白與固定的蛋白質(zhì)結(jié)合。然后與抗gpl20-MN多克隆抗體、隨后與山羊抗兔IgG-HRP綴合物孵育孔。底物顯色后，用微孔讀數(shù)器讀出光密度(OD45(j)。每個(gè)條件一式兩份設(shè)置。除了兩種多克隆抗體外，還開發(fā)了抗純化ECD蛋白質(zhì)的MAb。使用ELISA對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行第一次篩選并擴(kuò)增陽(yáng)性克隆后，使用Western印跡進(jìn)一步篩選雜交瘤(圖7)。這些MAb顯示高特異性，因?yàn)楦L(zhǎng)的膠片曝光(30分鐘)不顯示其它可檢測(cè)的條帶。重組的gpl20蛋白和中和實(shí)-瞼。使用來(lái)自不同進(jìn)化枝的gpl20蛋白進(jìn)行免疫血清和雜交瘤上清液的初級(jí)篩選。這些蛋白質(zhì)理想地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)以被完全糖基化。這些蛋白質(zhì)中的許多可得自商業(yè)來(lái)源。篩選需要少于1mg的每種蛋白質(zhì)。HIV中和實(shí)驗(yàn)一般如Binley等，丄W/.78:13232-52(2004)，Li等，JVirol.79:10108-25(2005);Mascola等，/.79:10103-7(2005)中所述進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pHIV-gpt和gpl60envpHXB2在共轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞后生產(chǎn)高滴度的假病毒。如使用Bright-Glo焚光素酶測(cè)定試劑盒(普洛麥格Promega)和最近購(gòu)買的Veritas化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(特納生物系統(tǒng)公司TimerBiosystems)通過(guò)熒光素酶活性所測(cè)量的那樣，該假病毒非常好地感染熒光素酶指示細(xì)胞系LuSIV。使用該系統(tǒng)測(cè)試我們實(shí)驗(yàn)室最近生產(chǎn)的抗HIV-1多克隆抗體(圖8)。兩種多克隆抗體顯示劑量依賴性的中和活性。使用Trim5a多克隆抗體作為陰性對(duì)照，而人MAb(2F5、4E10和2G12)作為陽(yáng)性對(duì)照。制備與免疫刺激劑綴合的gpl20。為了增強(qiáng)均一糖基化gpl20的免疫原性，合成來(lái)自破傷風(fēng)毒素的含有通用T細(xì)胞表位的多抗原肽(MAP)，使用不同的偶聯(lián)步驟制備gpl20-破傷風(fēng)類毒素和gpUO-MAP的綴合物，并分析其偶聯(lián)效力和抗原性。簡(jiǎn)言之，通過(guò)發(fā)展成熟的肽公司(AnaSpec有限公司)合成帶有四個(gè)p2序列分枝(p24)的多抗原肽(MAP)。MAP肽通過(guò)HPLC純化為高于90。/。的純度，并通過(guò)質(zhì)鐠法分析。通過(guò)使用已被添加進(jìn)磁心矩陣(corematrix)的半胱氨酸殘基將MAP肽與gpl20共價(jià)偶聯(lián)。使用SMCC方法將半胱氨酸巰基基團(tuán)與gpl20蛋白上游離的氨基基團(tuán)交聯(lián)，因此不會(huì)修飾我們希望開發(fā)抗它的抗體的糖結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)言之，IOmg/ml的gpl20蛋白與10mg/mlSulfo-SMCC(Pierce公司)溶液在偶聯(lián)緩沖液(lxPBS，0.1MEDTA，pH7.2)中反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)溶液應(yīng)經(jīng)過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25柱以去除過(guò)量的SMCC。收集含有蛋白質(zhì)的級(jí)分。合成的MAP肽以10mg/ml溶解在偶聯(lián)緩沖液中，并與活化的抗原以30:1的摩爾比混合，這使得gp120蛋白上大部分游離的氨基基團(tuán)被偶聯(lián)。交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)。所有的反應(yīng)應(yīng)在室溫進(jìn)行。應(yīng)使用類似途徑制備gpl20-破傷風(fēng)類毒素綴合物。借助于它們的游離氨基通過(guò)交聯(lián)將破傷風(fēng)類毒素蛋白質(zhì)(TT，丹麥國(guó)家血清研究所StatensSerumInstitute)與gpl20偶聯(lián)。簡(jiǎn)言之，將100倍摩爾過(guò)量的新鮮戊二酪(防止自身綴合物)與TT在50mM硼酸鹽緩沖液，pH8.0中反應(yīng)。通過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25柱去除游離的戊二醛。然后將TT-戊二醛與gpl20偶聯(lián)。通過(guò)添加1M甘氨酸封閉游離的醛基。反應(yīng)混合物再次經(jīng)過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠GJ5柱。收集含有TT-gp120的級(jí)分并以PBS透析。使用凝膠移動(dòng)測(cè)定分析偶聯(lián)效率。簡(jiǎn)言之，用4-20%梯度SDS-PAGE和隨后的考馬斯藍(lán)染色以及使用抗gp120的抗體通過(guò)Western印跡分析綴合物。綴合物比未綴合的蛋白質(zhì)移動(dòng)得更慢。綴合物的大小改變?nèi)Q于已經(jīng)與gpl20蛋白偶聯(lián)的MAP肽和蛋白質(zhì)分子的數(shù)目。使用ELISA通過(guò)將未綴合的gpl20與抗甘露聚糖的多克隆抗體和2G12MAb比較來(lái)測(cè)試綴合物的抗原性。體內(nèi)篩選gpl20蛋白及其綴合物的免疫原性。免疫5到6周齡的六組BALB/c小鼠(表1)。以所示的劑量皮下注射抗原。在初次免疫后14天和之后每三周用相同劑量的抗原對(duì)小鼠加強(qiáng)免疫。每次加強(qiáng)注射后1周對(duì)它們放血。因此，在第0、2、5、8和11周免疫小鼠，并在第0、3、6、9和12周收集免疫血清?？梢允褂肶U2和JR-FL二者，從而具有更多的Manal，2-Man表位，并開發(fā)更多的廣謙中和性MAb。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>應(yīng)使用ELISA用gpl20抗原包被的微孔板測(cè)試抗體效價(jià)。簡(jiǎn)要說(shuō)明ELISA步驟。Costar微孔板用300ng抗原/孔在100fU的50mM碳酸鹽(pH9.5)中包被24小時(shí)。用200nl封閉緩沖液(溶于PBS的1%BSA，0.02%辟u柳汞)將孔封閉2小時(shí)。洗滌后，將100fil系列稀釋的免疫血清與抗原包被的孔孵育2小時(shí)。用PBS-Tween洗滌5次后，將孔與100pl山羊抗小鼠IgG-HRP綴合物(西格瑪公司Sigma)在1:5000的封閉緩沖液中孵育2小時(shí)。洗滌后，將孔與100jilHRP底物TMB溶液(碧迪生物科學(xué)BDBioscience)孵育10分鐘，并通過(guò)添加100pl的1NHC1終止反應(yīng)。通過(guò)微孔讀數(shù)器讀出A柳的光密度。所有的反應(yīng)在室溫進(jìn)行。篩選免疫血清中來(lái)自不同進(jìn)化枝的gpl20蛋白的交叉反應(yīng)抗體。全球已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了多達(dá)12個(gè)進(jìn)化枝的HIV-1分離林，進(jìn)化枝A(2"/。)、B(12%)和C(42%)構(gòu)成所有HIV-1感染的80%以上。Man9和Man8形式的高甘露糖寡糖在所有的HIV-1菌林和分離抹中是高度保守的。因此，抗Manal，2-Man結(jié)構(gòu)的抗體應(yīng)當(dāng)識(shí)別來(lái)自單個(gè)Man8或Man9的表位，或由2種或3種這些聚糖形成的構(gòu)象表位。因此，抗Manal，2-Man表位的抗體應(yīng)當(dāng)識(shí)別大部分HIV-1菌抹和分離抹。為了開發(fā)具有廣譜中和活性的MAb，我們用gpl20糖蛋白篩選經(jīng)免疫的小鼠和雜交瘤上清液，所述gpl20糖蛋白來(lái)自進(jìn)化枝A(例如Q2317、B2539和Q1769)、B(ADA、YU2、JR-FL、89.6、BaL、SF162)和C(例如DU123、DU422、DU179和98IN012)的菌抹。另夕卜，可以測(cè)試抗高甘露糖Man8結(jié)構(gòu)的抗體。Man8應(yīng)從酵母中生產(chǎn)的gpl20蛋白分離，并使用本文公開的sulfo-SMCC方法與BSA綴合。BSA-Man8將用于包被微孔板并篩選免疫血清中抗Manal，2-Man表位的抗體。選擇對(duì)免疫原的血清效價(jià)^1:10，000、對(duì)來(lái)自不同進(jìn)化枝的gpl20蛋白和BSA-Man8的血清效價(jià)^l:l,000的小鼠用于創(chuàng)建雜交瘤。簡(jiǎn)言之，融合前三天用相同劑量的抗原對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)，之后將小鼠處死并無(wú)菌收集脾。通過(guò)向脾中注射20ml無(wú)菌的完全無(wú)血清DMEM(CSFD)制備細(xì)胞懸浮液。同時(shí)，收集骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14(ATCC)的培養(yǎng)物。用DMEM將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞洗滌三次，并獨(dú)立地重懸于10mlCSFD中。評(píng)估細(xì)胞生存力后，將它們以1:1的比例混合，補(bǔ)充30mlDMEM并通過(guò)離心沉淀。通過(guò)緩慢地添加1ml50。/。聚乙二醇(PEG400，羅氏Roche)并在每滴后攪拌來(lái)重懸細(xì)胞沉淀物。向混合物中逐滴地添加無(wú)菌的CSFD并攪拌，使得終體積為10ml。將融合的細(xì)胞離心并用完全的DMEM-20/HEPES/丙酮酸鹽/HAT重懸。將細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至2.5xl(^個(gè)總細(xì)胞/ml。將融合的細(xì)胞接種于96孔板中并在潮濕的37。C、5%<:02溫箱中孵育7天。然后用完全的DMEM-20/HEPES/丙酮酸鹽/HT替換培養(yǎng)基。在第12到15天，根據(jù)可見的雜交瘤菌落證實(shí)，雜交瘤已可用于篩選。一般將每個(gè)脾的約lx108個(gè)細(xì)胞接種在十個(gè)96孔板中，并獲得^80%的融合效率。使用ELISA用免疫原篩選有可見菌落的孔中的上清液。除了被抗原包被的孔用100fil未稀釋的雜交瘤上清液探測(cè)以外，步驟與篩選免疫血清的相同。將陽(yáng)性孔中的候選雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有DMEM-20/HEPES/丙酮酸鹽和克隆/增殖培養(yǎng)基的24孔中，并增殖3到5天。用來(lái)自不同進(jìn)化枝的gpl20和BSA-Man8如上所述再次篩選上清液。對(duì)所有或大部分測(cè)試的gpl20蛋白和BSA-Man8顯示陽(yáng)性的孔進(jìn)行克隆，每孔涂板1到3個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)7到10天，并如上所述使用相同的抗原組再次篩選候選克隆。重復(fù)亞克隆和篩選，直到建立的穩(wěn)定的目的雜交瘤細(xì)胞系。為了測(cè)試這些MAb抗大量HIV-1菌林和元代分離林的中和活性，在小鼠中生產(chǎn)MAb并用蛋白質(zhì)A親和層析純化。鑒定能夠有效地中和廣譜HIV-1菌林和元代分離林的MAb。對(duì)培養(yǎng)物上清液和MAb進(jìn)行HIV中和測(cè)試以測(cè)試中和同源HIV菌林的能力。因此，對(duì)來(lái)自用酵母中生產(chǎn)的YU2或JR-FLgpl20免疫的動(dòng)物的雜交瘤培養(yǎng)物上清液測(cè)試中和HIV假型的能力，所述HIV假型帶有YU2或JR-FLEnv蛋白質(zhì)以及熒光素酶報(bào)告基因。測(cè)試上清液和MAb中和儲(chǔ)存于U87細(xì)胞中的p24-標(biāo)準(zhǔn)化的病毒感染的能力，所述病毒帶有CD4和CCR5(或當(dāng)使用X4病毒林系時(shí)為CXCR4)。感染之前，病毒假型首先與未經(jīng)稀釋的上清液或系列稀釋的MAb孵育一個(gè)小時(shí)。在48到72小時(shí)后測(cè)量被感染細(xì)胞中產(chǎn)生的熒光素酶的量。中和活性表示為與抗體陰性對(duì)照相比，每種抗體稀釋度下病毒復(fù)制(熒光素酶活性)的抑制百分比％抑制{1[熒光素酶Ab熒光素酶Ab]}100。效價(jià)計(jì)算為帶來(lái)50%抑制的MAb稀釋度的倒數(shù)(ICs。)。然后測(cè)試中和同源病毒的上清液和MAb中和多種元代HIV-1菌抹的能力。實(shí)施例2-4中所使用的材料和方法酵母雙突變體和三突變體的產(chǎn)生酵母菌抹和培養(yǎng)基。該研究中使用的四種酵母缺陷菌林得自O(shè)penBioSystems公司MATa、his3Al、leu2A0、lys2A0、ura3A0、mnnl:kanMX4(10322);MATa、his3Al、leu2A0、metl5A0、ura3A0、mnn4:kanMX4(7034);MATa、his3Al、leu2A0、metl5A0、ura3A0、ochl:kanMX4(4楊);和MATahis3Alleu2A0metl5A0ura3A0pmrl:kanMX4(14534)。兩種親本酵母菌林得自ATCC用于證實(shí)和篩選交配型MATa、trplA63(命名BY4710)和MATa、trplA63(命名BY4711)。野生型二倍體酵母菌林INVScl得自英駿公司(Invitrogen)。所示基因的敲除通過(guò)PCR證實(shí)，使用特異于MNN1、OCHl、MNN4和PMR1基因(參閱http:Vwww.sequence.stanford.edu/group/yeast一deletion一project主頁(yè)上酵母缺失工程(YeastDeletionProject)中的序列)的合成引物和特異于KanMX4盒的合成引物(KanB，5，-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3，(SEQIDNO:8)和KanC，5'-TGATTTTGATGACGAGCGTAAT-3，(SEQIDNO:9))。如(Giaever，2002)所述使用JumpStartTaqDNA聚合酶(西格瑪Sigma)進(jìn)行菌落PCR。所有的酵母培養(yǎng)物在所示的補(bǔ)充了200jig/mlG418(英駿公司Invitrogen)的YPD(1%Bacto-酵母膏、2%Bacto-蛋白胨、2%葡萄糖)或YPD+0.3MKC1中生長(zhǎng)。二倍體和單倍體的選擇使用補(bǔ)充了20ftg/mlL-曱硫氨酸(CSM-lys)或50jtg/mlL-賴氨酸鹽酸鹽(CSM-met)的CSM-met-lys平板(0.67%不含氨基酸的酵母氮基、0.07%CSM-met-lys省卻混合物(dropoutmix)、2%葡萄糖、2%Bacto-瓊月旨)進(jìn)行。CSM-met畫lys省卻混合物得自QbioGene公司。對(duì)于酵母交配型測(cè)試而言，菌抹在SD平板(0.67%不含氨基酸的酵母氮基、2%葡萄糖、2%Bacto-瓊月旨)上選擇。酵母交配。酵母菌林10322(Amnnl)與菌株7034(Amnn4)、4406(Aochl)和14534(Apmrl)交配形成二倍體菌抹DlP-mnnlmnn4(MATa/a;his3Al/his3Al;leu2A0/leu2A0;LYS2/lys2A0;metl5層MET15;ura3A0/ura3A0;mnn4:kanMX4/MNN4;MNNl/mnnl:kanMX4)、DIP，nlochl(MATa/a;his3Al/his3Al;leu2纖eu2A0;metl5A0/MET15;LYS2/lys2A0;ura3A0/訓(xùn)3A0;ochl:kanMX4/OCHl;MNNl/mnnl:kanMX4)和DIP-mnnlpmrl(MATa/a;his3Al/his3Al;leu2A0/leu2A0;LYS2/lys2A0;metl5A0/MET15;ura3A0/ura3A0;pmrl:kanMX4/PMRl;MNNl/mnnl:kanMX4)。如(Giaever,2002)所述，在CSM-met-lys上選擇二倍體并形成孢子。用裂解酶(Zymolyase)IOOT(美國(guó)生物/>司USBiological)消化形成孢子的二倍體的子嚢，并如CurrentProtocolsinMolecularBiology中所述進(jìn)行隨機(jī)孢子分析。將來(lái)自DIP-mnnlmnn4和DIP-mnnlpmrl的孢子涂布在YPD上，而將來(lái)自DIP-mnnlochl的孢子涂布在YPD+0.3MKCl上。通過(guò)將得到的單倍體孢子與親本菌林(BY4710和BY4711)在SD上雜交選擇交配型，并通過(guò)影印培養(yǎng)在CSM-met和CSM-lys上選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷型需要。通過(guò)在YPD上37'C的緩慢生長(zhǎng)篩選Aochl突變，而所有的ORF敲除使用菌落PCR篩選和證實(shí)。最終的雙突變體為AmnnlAmnn4-9(MATa、his3Al、leu2A0、metl5A0、ura3A0、mnnl:kanMX4、mim4:kanMX4)、AmnnlAochl國(guó)3(MATa、his3Al、leu2A0、lys2A0、ura3A0、mnnl:kanMX4、ochl:kanMX4)和AmnnlApmrl-5(MATa、his3Al、leu2A0、lys2A0、眼3A0、mnnl:kanMX4、pmrl:kanMX4)。將單倍體雙突變體AmnnlAmnn4-9和AmnnlAochl-3交配，形成二倍體菌林DlP國(guó)mnnlmnn4ochl(MATa/a;his3Al/his3Al;leu2A0/leu2A0;metl5層MET15;LYS2/lys2A0;ura3層ura3A0;mnn1:kanMX4/mnn1:kanMX4;mm4:kanMX4/M麗4;OCHl/ochl:kanMX4)，然后如上文進(jìn)行孢子形成、消化、隨機(jī)孢子分析和選擇。最后的三突變體單倍體為AmnnlAmnn4Aochl-l-2、AmnnlAmnn4Aochl-l-3和AmnnlAmnn4Aochl-2-5(MATa、his3Al、leu2A0、metl5A0、ura3A0、miml:kanMX4、mim4:kanMX4、ochl:kanMX4);AmnnlAmnn4Aochl-2-4和AmnnlAmnn4Aochl-2-6(MATa、his3Al、leu2A0、lys2A0、ura3A0、mrml:kanMX4、mnn4:kanMX4、ochl:kanMX4);和AmmilAmnn4Aochl-2-2(MATa、Ms3Al、leu2A0、lys2A0、眼3A0、mnnl:kanMX4、mnn4:kanMX4、ochl:kanMX4)。通過(guò)在3，和5，端PCR對(duì)所有克隆證實(shí)每個(gè)ORF的KanMX敲除。將兩個(gè)單倍體三突變體AmnnlAmnn4Aochl-2-4和AmnnlAmnn4Aochl-2-5交配，形成二倍體三突變體AmnnlAmnn4Aochl畫DIP(MATa/a;his3Al/his3Al;leu2層leu2A0;metl5A0/MET15;LYS2/lys2A0;眼3A0/ura3A0;mnnl:kanMX4/mnnl:kanMX4;mim4:kanMX4/mnn4:kanMX4;ochl:kanMX4/ochl:kanMX4)。制備免疫血清戎發(fā)#發(fā)母秉#^戎^。使用酵母細(xì)胞壁提取物酵母聚糖入免疫兔子，所述酵母聚糖A由野生型酵母的p-葡聚糖和a-甘露聚糖組成。在笫0周用200jig含酵母聚糖A的CFA免疫兩只兔子，并在第2周和第4周和之后每四周用100jig含抗原的IFA加強(qiáng)。在第5周和每次加強(qiáng)后1周收集免疫血清。合并得到的血清并用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖純化。拔^母潛齊冷^拔謬。使用合成肽在兔子中產(chǎn)生抗目的酵母蛋白質(zhì)的免疫血清。使用加速的免疫接種時(shí)間表，開始使用200jig的初次免疫接種，在第2、4、6和10周使用100ng的免疫接種，并在第5、7、8和11周采集測(cè)試血樣。使用的肽的序列如下PST1為CDSLESITDSLNLQSLT(SEQIDNO:10)，ECM33為CDSIKKITGDLNMQE(SEQIDNO:11),Gp38為CAVNGVTSKSALESIFP(SEQIDNO:12)，Gasl為CTPKEQLSFVMNLYYEKSGGSKSD(SEQIDNO:13)和CPATGKYWSAATELPPTPNG(SEQIDNO:14)，Gas5為CPAMPSAASAYFTSGAGSPMGTGIATQQS(SEQIDNO:15)和CEIKGNAFFNSESGERFYIRGVDYQPGGS(SEQIDNO:16)，而YJL171c為CSGPQSYQKLDFTNVGFTGS(SEQIDNO:17)和CEVGDRVWFSGKNAPLADY(SEQIDNO:18)。抗原特異性抗體通過(guò)免疫親和層析純化，使用與SulfoLink凝膠(Pierce公司)偶聯(lián)的抗原肽。^/a/口-遽擺的#處潛#并的戎謬。如以前所述(Raschke等，/.5^/.C7^附.248(13):4660-6，1973和Ballon,/必&/C7^附.245:1197-1203,1970)制備對(duì)a1，3-連接的甘露糖殘基特異的抗體，稍加變動(dòng)。簡(jiǎn)言之，將以3.0x107細(xì)胞/ml懸浮于0.9%NaCl中的對(duì)數(shù)期INVScI細(xì)胞在70。C加熱殺死90分鐘。在第1周、第2周、第3周和第4周分別用0.25ml、0.5ml、0.75ml和1.0ml該懸浮液在兔的耳緣靜脈注射三次。末次注射后三天對(duì)兔i丈血。64然后將得到的血清吸附至Amiml酵母細(xì)胞。每5ml血清與5g(濕重)熱殺死的Amnnl酵母在50ml0.9。/oNaCl中孵育。添加疊氮化鈉至0.2。/。，并將懸浮液在室溫顛倒混合孵育過(guò)夜。通過(guò)在6,000g離心20分鐘去除細(xì)胞并重復(fù)吸附。最終的血清以0.9。/。NaCl透析，并用0.2纟鼓米濾紙滅菌。確定酵母全細(xì)胞上的糖型。2G12單克隆抗體購(gòu)自波利門科學(xué)生物免疫研究有限公司(PolymumScientificInc.(ForschungGmbH))。蛋白質(zhì)A-瓊脂糖4B綴合物購(gòu)自英駿公司(Invitrogen，Carlsbad,CA)。山羊抗兔IgGHRP購(gòu)自杰克遜免疫研究公司(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)。名瘦炎^。用1ftil新鮮的4。/。多聚曱醛將30。C于YPD+0.3MKC1中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的AmnnlAmnn4Aochl-DIP和INVScI細(xì)胞固定1小時(shí)，并通過(guò)離心沉淀。用PBS將細(xì)胞洗滌一次，并轉(zhuǎn)移至多聚賴氨酸包被的玻片上。風(fēng)干后將細(xì)胞與0.5。/。SDS在室溫(RT)孵育15分鐘。對(duì)于單個(gè)染色，將兔抗酵母聚糖抗體稀釋至10pg/ml，并使用1:500稀釋度的al，3-連接的甘露糖抗血清。將這些抗體與細(xì)胞在RT孵育1小時(shí)。洗滌玻片，并在RT用第二抗體AlexaFluor568綴合的山羊抗兔IgG(美國(guó)分子探針公司MolecularProbe，USA)孵育1小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞，并封固在玻片上。對(duì)于共定位染色，將抗酵母聚糖和2G12抗體分別稀釋至10jig/ml和20Hg/ml，并與細(xì)胞孵育l小時(shí)。將玻片洗滌、探測(cè)并如上文所述使用AlexaFhior568綴合的山羊抗人IgG和AlexaFluor488綴合的山羊抗兔IgG作為第二抗體封固在玻片上。使用ZeissAxioskope熒光顯微鏡(美國(guó)麥可班恩公司McBain，USA)獲得圖像。全細(xì)應(yīng)￡X/SJ。在熱殺死的全酵母細(xì)胞上進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。在0.9%NaCl中于70。C將對(duì)數(shù)期的AmnnlAmim4Aochl-DIP和INVScI細(xì)胞熱殺死1小時(shí)，并在PBS中稀釋為5.0x107細(xì)胞/加1用于包被ELISA板。在50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.5中將來(lái)自SF162菌林(ARRRP)和野生型酵母甘露聚糖(西格瑪Si。gma)的HIV-1gpl20稀釋至5ng/ml。各孔中一百微升的抗原在室溫孵育過(guò)夜。用ELISA封閉緩沖液(PBS，0.1。/。BSA，0.02%硫柳汞)封閉各孔，并在室溫潮濕的溫箱中孵育2小時(shí)。兩次dH20沖洗后，添加10fig/ml的2G12和抗al，3-甘露糖抗體，在封閉緩沖液中進(jìn)行三倍的系列稀釋，并在室溫孵育過(guò)夜。用ELISA洗滌緩沖液(PBS，0.05%Tween20，0.02%硫柳汞)洗滌各孔，并分別用1:10,000稀釋度的山羊抗人IgG-HRP或山羊抗兔IgG-HRP(杰克遜免疫研究公司JacksonImmunoResearch)在37。C對(duì)2G12或al，3-甘露糖孵育1小時(shí)。如前所述洗滌孔，與YMB孵育進(jìn)行顯色，并用HC1終止。使用EMax微板讀數(shù)器(分子裝置>^司MolecularDevices)通過(guò)450nm處的吸光值讀出HRP活性。秉潛l1^。將在30。C生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期AmnnlAmnn4Aochl-DIP細(xì)胞在0.9%NaCl中稀釋至3.0xl0細(xì)胞/ml。在70。C將細(xì)胞熱殺死1小時(shí)。通過(guò)PNGaseF消化從細(xì)胞釋放N-連接的聚糖。釋放的N-連接的聚糖被高曱基化，并通過(guò)Maldi-TOF質(zhì)i普法(MS)通過(guò)UCSD的糖技術(shù)核心資源設(shè)備(GlycotechnologyCoreResource)分析。鑒定和證實(shí)2G12交叉反應(yīng)性糖蛋白伊遽。來(lái)自INVScl、Amnnl、Amim4、Aochl、AmnnlAmnn4、AmnnlAochl和AmnnlAmnn4Aochl菌林的酵母細(xì)胞于30。C在YPD+0.3MKC1中生長(zhǎng)至3.0的OD600。將酵母細(xì)胞在14,000g離心2分鐘。通過(guò)與兩倍體積水冷的丙酮在-80。C孵育30分鐘，對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行丙酮沉淀。將樣品以14,000g離心15分鐘并去除上清液。風(fēng)干15分鐘后，將沉淀物用初始樣品體積1/10的2xLaemmliSDS樣品緩沖液煮沸5分鐘。通過(guò)在RIPA緩沖液中裂解制備酵母細(xì)胞裂解物。簡(jiǎn)言之，將每lml細(xì)胞沉淀物重懸于100jil冰冷的RIPA緩沖液(150mMNaCl、10mMTrispH7.4、1mMEDTApH8.0、1%TritonX-100、1%DOC、0.1%SDS、1mMPMSF、lpg/ml抑肽酶和lng/ml亮肽酶素)中，并通過(guò)與酸洗玻璃珠(西格瑪Sigma)—起振蕩10分鐘破壞細(xì)胞壁。將得到的裂解物在13,000g離心30分鐘以去除任何碎片，將各蛋白質(zhì)濃度在稀釋緩沖液(50mMTrispH7.4、1mMEDTApH8.0、1ng/ml抑肽酶、1jig/ml亮肽酶素和0.1%SDS)中稀釋至0.3mg/ml。添加LaemmliSDS緩沖液至lx并將含有0.24mg/ml蛋白質(zhì)的樣品煮沸5分鐘。對(duì)上清液和細(xì)胞裂解物級(jí)分在4-20%梯度凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分離，并以250mA向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移2小時(shí)。使用第一抗體和隨后用第二抗體在所示的稀釋度下進(jìn)行Western印跡，所述第一抗體包括MAb2G12和如上所述在兔中產(chǎn)生的多克隆抗體，所述第二抗體為山羊抗人IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP(杰克遜免疫研究JacksonImmunoResearch)。使用ECL(通用電氣生物科學(xué)GEBiosciences)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。it叉《j'勝f^#^部為、遂^。內(nèi)源酵母蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位使用CurrentProtocolsinCellBiology中所述的差速離心評(píng)價(jià)。如上所述將來(lái)自INVScl和AmnnlAmnn4Aochl-DIP菌林的對(duì)數(shù)期細(xì)胞培養(yǎng)至3.0的OD咖。將每1ml細(xì)胞沉淀物重懸于100pi蔗糖裂解緩沖液(0.4M蔗糖、2mMEDTA、25mM咪唑，pH7.0、1mMPMSF、1jig/ml抑肽酶和1pg/ml亮肽酶素)中。添加等體積的酸玻璃珠(西格瑪Sigma),并通過(guò)高速振蕩與冰浴孵育交替進(jìn)行15分鐘破壞細(xì)胞壁。將裂解物在500g離心5分鐘，以沉淀未裂解的細(xì)胞和大的聚集體，并將上清液在22,000g離心30分鐘。保留得到的含有細(xì)胞質(zhì)、高爾基復(fù)合體和核內(nèi)體蛋白質(zhì)的上清液用于分析。將主要含有液泡、核、ER和質(zhì)膜蛋白質(zhì)的沉淀物重懸于相似體積的PBS+1.0%Triton中以溶解膜蛋白。如上所述離心級(jí)分，以分離可溶和不溶的膜級(jí)分。凝桌^,和i浙。對(duì)刀豆球蛋白A(ConA)凝集素親和層析而言，將9.5mlTriton可溶膜級(jí)分在4。C與1mlConA-瓊脂糖(Vector實(shí)驗(yàn)室)在5mlTriton洗滌緩沖液(20mMTris，pH7.0、50mMNaCl、10mMCaCl2和1%TritonX-100)中孵育過(guò)夜。用Triton洗滌緩沖液將柱徹底洗滌。為了洗脫與ConA結(jié)合的蛋白質(zhì)，向柱中添加5ml含有0.5M曱基吡喃型甘露糖苷的Triton洗滌緩沖液，然后添加5ml含有0.2mMEDTA和1.0%SDS的Triton洗滌緩沖液。為了從培養(yǎng)上清液中純化，將300mlAmrnilAmnn4Aochl-2-5酵母上清液與10mMCaCl2上樣至5mlConA瓊脂糖柱(Vector實(shí)驗(yàn)室)上，并用ConA洗滌緩沖液(20mMTris，pH7.0、50mMNaCl、10mMCaCl2)、隨后是含有0.5M甲基吡喃型甘露糖苷的ConA洗滌緩沖液徹底洗滌。為了洗脫ConA結(jié)合的蛋白質(zhì)，向柱中添加5ml2xSDS上樣緩沖液，并煮沸5分鐘。雙/^凝應(yīng)迨泳和j^。用TCA沉淀經(jīng)ConA-瓊脂糖純化的蛋白質(zhì)級(jí)分，并重溶于200jil尿素/硫脲再水合溶液(7M尿素、2M硫脲、2%CHAPS、60mMDTT;1。/。兩性電解質(zhì)pH3-10;0.01%溴酚藍(lán))中。將IPGZOOM4-7IPG膠條(英駿Invitrogen)用120pl樣品和20pl再水合緩沖液(7M尿素、2M硫脲、2%CHAPS、°60mMDTT、1%兩性電解質(zhì)pH3-10、0.01°/0溴酚藍(lán))再水合過(guò)夜，用于sypro寶石紅蛋白凝膠，用80jil樣品和60jil再水合緩沖液再水合過(guò)夜用于Western印跡。將膠條上樣至ZOOMIPG電泳儀(英駿Invitrogen)上并調(diào)節(jié)如下200V30分鐘，450V25分鐘，750V25分鐘和2000V60分鐘。對(duì)于第二向而言，將IPG膠條在含有DTT的LDS平衡緩沖液中在定軌搖床上還原15分鐘兩次。然后在含有碘乙酰胺的LDS平衡緩沖液中將膠條烷基化15分鐘，并使用4-12%梯度丙烯酰胺凝膠用MES跑膠緩沖液在IPGZOOM系統(tǒng)上電泳。凝膠電泳直到染料前沿遷移至凝膠底部約0.3對(duì)于sypro寶石紅蛋白染色而言，將凝膠在40。/。曱醇、10%乙酸中固定一小時(shí)并用SYPRO寶石紅蛋白熒光染料染色過(guò)夜。將凝膠在10%甲醇、6%乙酸中脫色120分鐘(換一次脫色溶液)，并在MolecularImagerPharoxFX激光成像儀上用以下參數(shù)成像532nm的激發(fā)波長(zhǎng)、605nm的發(fā)射波長(zhǎng)和100pm的分辨率。對(duì)于Western印跡而言，在第二向電泳后立刻將凝膠浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液(熒駿Invitrogen)中。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上并用1ng/ml的2G12探測(cè)。通過(guò)2G12在2D印跡上檢測(cè)的蛋白質(zhì)與用sypro寶石紅蛋白染色的斑點(diǎn)匹配。將匹配的斑點(diǎn)剪下并用胰蛋白酶(trypson)進(jìn)行凝膠內(nèi)消化。通過(guò)納米LCMS/MS分析消化的肽。上述實(shí)驗(yàn)由蛋白質(zhì)組研究服務(wù)公司(ProteomicResearchServicesIncorporated)進(jìn)行。^€瘦沉/定。如上所述從對(duì)數(shù)期的AmnnlAmnn4Aochl-2-5制備培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞裂解物。通過(guò)在室溫與蛋白質(zhì)A-瓊脂糖4B綴合物孵育2小時(shí)預(yù)清洗這些樣品。對(duì)于抗原-抗體復(fù)合物形成而言，向細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)基樣品中添加10jig的2G12，并在搖床上室溫孵育1小時(shí)。孵育后，向抗原-抗體復(fù)合物中添加20pl蛋白質(zhì)A-瓊脂糖4B綴合物，并在搖床上室溫再孵育1小時(shí)。將樣品在10，000g離心5分鐘并吸出上清液。用800jilPBS將珠子洗滌兩次，并通過(guò)用40nllxSDS樣品緩沖液煮沸來(lái)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。將所有的樣品上樣至4-20。/o梯度SDS-PAGE凝膠上，印跡，并使用抗鑒定的酵母糖蛋白的抗體進(jìn)行Western分析，所述酵母糖蛋白包括ECM33、PST1、GP38、YJL171C、Gasl和Gas5。N-連接的和O-連接的糖基化位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析N-連接的糖基化位點(diǎn)的分析。便用我們最近開發(fā)的軟件分析釀酒酵母基因組和本研究中鑒定的糖蛋白上的N-連接的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化位點(diǎn)的分析。使用軟件NetOGlyc3.1分析釀酒酵母基因組中一些蛋白質(zhì)和本研究中鑒定的糖蛋白上的O-連接的糖基化位點(diǎn)，所述軟件由丹麥技術(shù)大學(xué)的生物學(xué)序列分析中心(CBS)開發(fā)，該軟件可得自http:〃www.cbs.dtu.dk/services/netoglvc。酵母三突變體中生產(chǎn)的gpl20的克隆、表達(dá)和表征試/ApYES2/CT載體得自焚駿(Invitrogen)，pJR-FLsyngp120和pYU-2質(zhì)粒得自艾滋病研究和參照項(xiàng)目(AIDSResearchandReferenceProgram,ARRRP)。不含氨基酸的酵母氮基和-Ura省卻混合物得自美國(guó)生物公司(U.S.Biological.)。抗來(lái)自HIV-1IB的gpl20的兔多克隆抗體(抗gpl20-IIIB)得自懷羅斯塔特有限公司(VirostatInc.)。抗HIV-lYU-2的另一兔多克隆抗體(抗gpl20-YU2)使用合成的肽CEQMHEDIISLWDQSLK(SEQIDNO:19)內(nèi)部合成，并使用與Sulfolink凝膠(Pierce公司)偶聯(lián)的肽親和純化。a-it乾^f希砂7M的尸C/^i謦。將釀酒酵母a-交配因子(MFa)的信號(hào)序列添加到pYES2/CT載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)上游。通過(guò)PCR從總酵母DNA(提取自INVScl)克隆MFa,使用引物MFal-Kpn誦5(5，-ATGGTACCAAAGAATGAGATTTCCTTCAATT-3，(SEQIDNO:20))和MFal-Bam-3(5，-ATGGATCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTATC-3，(SEQIDNO:21))，分別添加Kpnl和BamHI位點(diǎn)。該片段含有將信號(hào)序列從gpl20上去除的Kex2位點(diǎn)。使用T4DNA聚合酶(西格瑪Sigma)根據(jù)制備商的方案進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物純化、用BamHI和Kpnl消化，并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)連接進(jìn)類似消化的pYES2/CT質(zhì)粒中。得到的質(zhì)粒為pYES2/CT-a。JR-FL的編碼序列通過(guò)PCR從pJR-FLsyngpUO擴(kuò)增，使用引物JRFL畫Eco畫5(5，-TGGAATTCTGTGGGTGACTGTATACTAT(SEQIDNO:22))和JRFL-Xba-3(5，-TATCTAGACCCCACAGCGCGCTTCTCCCT-3，(SEQIDNO:23))，分別添加EcoRI和XbaI位點(diǎn)。從pYU-2擴(kuò)增YU-2的編碼序列，使用引物YU2國(guó)Eco-5(5，-TGGAATTCTGTTGTGGGTCACAGTCTATTAT-3，(SEQIDNO:24》和YU2-Xba-3(5，-ATTCTAGATTCTCTTTGCACCACTCTTCT-3，(SEQIDNO:25)),分別添加EcoRI和Xbal位點(diǎn)。如上所述4吏用EcoRI和Xbal消化，將gpl20產(chǎn)物克隆進(jìn)pYES2/CT-a。最終的質(zhì)粒為pYES2/CT-a-JRFL(pJRFL-gp120)和pYES2/CT國(guó)a-YU2(pYU2畫gp120)。發(fā)^嫂脊化A柳w"/A附/m^WcW-2-5發(fā)#。使用質(zhì)粒pJRFL-gp120和pYU2-gp120轉(zhuǎn)化AmnnlAmnn4Aochl-2-5酵母細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，沉淀1.5ml70在YPD+0.3MKC1中生長(zhǎng)的酵母過(guò)夜培養(yǎng)物。去除所有但是余下50jil的上清液，并重懸細(xì)胞。然后加入2nll0mg/ml單鏈的鮭精DNA(西格瑪Sigma)，然后加入1figpJRFL-gp120或pYU2-gp120。振蕩后加入500jdPLATE混合物(40%PEG4000、100mMLiAc、10mMTris，pH7.5、1mMEDTA)和20jil1MDTT，并將混合物在室溫孵育4小時(shí)。將細(xì)胞在42。C熱激10分鐘，沉淀，并重懸于100jil的無(wú)菌dH20中。將細(xì)胞涂布在-ura/葡萄糖(2。/。葡萄糖、0.67。/。不含氨基酸的酵母氮基、0.2%-Ura省卻混合物、2%Bacto-瓊脂)上。將平板在30。C孵育直至菌落出現(xiàn)。直接對(duì)菌落進(jìn)4亍PCR，以證實(shí)每種質(zhì)粒的存在，對(duì)pJRFL-gp120轉(zhuǎn)化林使用引物MFal國(guó)Kpn-5和JRPL-Xba-3，對(duì)于pYU2國(guó)gp120使用引物MFal-Kpn-5和YU2畫Xba-3。^A附rni/A柳w/^Aoc/^發(fā)母詐^迷^p"0。用pJRFL-gp120和pYU2-gp120轉(zhuǎn)化的三突變酵母細(xì)胞在-ura/葡萄糖培養(yǎng)基(2。/。葡萄糖、0.67%不含氨基酸的酵母氮基、0.2%-Ura省卻混合物)上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。將細(xì)胞離心并用-ura/半乳糖培養(yǎng)基(2V。半乳糖、0.67%不含氨基酸的酵母氮基、0.2%-Ura省卻混合物)洗滌兩次，并以O(shè)D6oQ=0.4重懸于-ura/半乳糖中。細(xì)胞在30。C培養(yǎng)，并在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣培養(yǎng)基以測(cè)試蛋白質(zhì)誘導(dǎo)。純化酵母表達(dá)的糖蛋白碗^^沉淀。收集來(lái)自AmimlApmrl的酵母培養(yǎng)物上清液中的PST1蛋白質(zhì)以及經(jīng)轉(zhuǎn)化的AmnnlAmnn4Aochl中表達(dá)的gpl20,并在3000g于40。C離心(貝克曼庫(kù)爾特BeckmanCoulter,Allegra64R,轉(zhuǎn)子F0650)10分鐘以去除任何不溶顆粒。將上清液轉(zhuǎn)移至清潔的燒杯中，加入10mMEDTA，并使用1MTris堿將pH調(diào)節(jié)至pH7.4。緩慢加入硫酸銨同時(shí)攪拌，直至達(dá)到4°C55。/。飽和的終濃度。將溶液再攪拌30分鐘并在4t:以15，000xg離心30分鐘。將沉淀重懸于2mlPBS中，并通過(guò)在4。C以15,000xg離心1小時(shí)回收不溶物質(zhì)。該物質(zhì)^皮稱作AS55沉淀物。向55%AS上清液中緩慢加入硫酸銨同時(shí)攪拌，直到達(dá)到4。C卯％飽和的終濃度。將沉淀重懸于2mlPBS中，并通過(guò)在4。C以15,000xg離心l小時(shí)回收不溶物質(zhì)。該物質(zhì)凈皮稱作AS卯沉淀物。^使用5mlHiTrap脫鹽柱(通用電氣生命科學(xué)GELifeSciences)將AS55和AS90沉淀物脫鹽至5mMpH7.5的磷酸鈉中，并將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)為lmg/ml。尤建親和磁/^#母表這的砂"汄根據(jù)制備商的方案，以每lml凝膠5mg抗體將抗gpl20-IIIB與溴化氰活化的瓊脂糖4B(西格瑪Sigma)綴合。用PBS徹底洗滌柱后，將來(lái)自AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞的AS55樣品與免疫親和柱在室溫孵育2小時(shí)。收集流出液，并用PBS再次洗滌柱。用100mM甘氨酸，pH2.5將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫在1ml含有50pl1MTris，pH9.5的級(jí)分中。通過(guò)Western印跡使用2G12和抗gpl20-YU2對(duì)這些級(jí)分進(jìn)行g(shù)pl20測(cè)試。合并含有g(shù)pl20的級(jí)分并稱作AS55-AP。/^庠子Jt^^^f。對(duì)不同的樣品進(jìn)行獨(dú)立的層析，AS55-AP用于gpl20純化，AS90用于PST1純化。用5mM磷酸鈉，pH7.5平衡5mlHiTrapSPFF柱(通用電氣生命科學(xué)GELifeSciences)。將樣品以1ml/分鐘上樣至柱上，并用15ml5mM磷酸鈉，pH7.5洗滌。用80ml5mM磷酸鈉，pH7.5中0-500mM梯度的NaCl以1ml/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)。總共收集2ml的級(jí)分，并使用斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)測(cè)試3nl樣品中預(yù)期的糖蛋白的存在。合并顯示顯著量蛋白質(zhì)的級(jí)分，并稱作GP-IEC-55和GP-IEC-90。使用如前所述的糖蛋白的ConA純化法進(jìn)一步純化這些級(jí)分。將蛋白質(zhì)洗脫進(jìn)1M曱基吡喃型甘露糖苷中，伴有60分鐘的孵育。潛蛋^W凝應(yīng)過(guò)濾i浙。最后一步，將兩種GP-IEC-55和GP-IEC-90級(jí)分脫鹽進(jìn)上樣緩沖液(50mMTris,150mMNaCl,5mM2-bME，pH7.5)中并通過(guò)AmiconCentricon30(密理博Millipore)濃縮至1mg/ml的終濃度。用相同的緩沖液平衡150ml丙烯葡聚糖凝膠S-HR-200(通用電氣生命科學(xué)GELifeSciences),并將GP-IEC庫(kù)上樣至柱上。用上樣緩沖液以0.3ml/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)，收集2ml級(jí)分，并使用斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)測(cè)試每種級(jí)分的3nl樣品中糖蛋白的存在。合并顯示顯著量糖蛋白的級(jí)分，并總稱為GP-SHR200-55和GP-SHR200-卯。4吏用以下的標(biāo)準(zhǔn)并從過(guò)濾柱中共同洗脫IgG(MW150kD)、AP(MW140kD)、卵清親合素(MW68)和鏈霉親和素(MW53)。果潛^型。用PNGaseF分別消化含有純化gpl20PST1的GP-SHR200-55和GP-SHR200-卯，以釋放所有N-連接的聚糖。將這些聚糖高曱基化，并用UCSD的糖技術(shù)核心研究設(shè)備通過(guò)Maldi-TOF質(zhì)譜法(MS)分析。對(duì)(xl，2-連接的末端甘露糖特異的抗體的免疫和制備使用酵母全細(xì)胞產(chǎn)生抗a1，2連接的甘露糖的抗體。使用三突變體制備對(duì)a1，2連接的甘露糖殘基特異的免疫血清(Raschke等，/說(shuō)o/C&附.248(13):4660-6，1973和Ballon，C7^附.245:1197-1203，1970)。簡(jiǎn)言之，在70。C將以3.0x107細(xì)胞/ml懸浮于0.9%NaCl中的對(duì)數(shù)期AmnnlAmnn4Aochl-DIP熱殺死卯分鐘。在第1周、第2周、第3周和第4周分別用0.25ml、0.5ml、0.75ml和1.0ml該懸浮液在兔的耳緣靜脈注射三次。從第2、3和4周的最后一次注射后三天對(duì)兔i文血。休息四周后，在第9周、第IO周和第11周用相同的懸浮液以0.5ml、0.75ml和1.0ml在兔耳緣靜脈對(duì)兔注射三次。末次注射后3天收集第四次的最終i文血。通過(guò)ELISA和Western印跡測(cè)試得到的血清的gpl20結(jié)合。炎^^#細(xì)應(yīng)爽承幾產(chǎn)^:戎《7,2遽"#的#虞潛的在體。使用三突變體的膜級(jí)分制備對(duì)a1，2連接的甘露糖殘基特異的免疫血清。使用酸洗玻璃珠(西格瑪Sigma)在蔗糖裂解緩沖液(0.4M蔑糖、2mMEDTA、25mM咪唑，pH7.0、1mMPMSF、1pg/ml抑肽酶和1jig/ml亮肽酶素)中裂解來(lái)自AmnnlAmim4Aochl-DIP菌株的對(duì)數(shù)期細(xì)胞。將裂解物在500g離心5分鐘沉淀未裂解的細(xì)胞和大的聚集體，并將上清液在22，000g離心30分鐘。將得到的主要含有液泡、核、ER和質(zhì)膜蛋白質(zhì)的沉淀物重懸于相似體積的PBS+1.0%Triton中以溶解膜蛋白。如上所述離心級(jí)分，以分離可溶和不溶的膜級(jí)分。用這些級(jí)分免疫四組(每組兩只)兔子，一組用野生型(INVScl)的Triton可溶的級(jí)分，兩組用三突變體的Triton可溶級(jí)分，一組說(shuō)明書第67/96頁(yè)用三突變體的Triton不溶級(jí)分。使用加速的免疫接種時(shí)間表，開始使用200Hg的初次免疫接種，在第2、4、6和10周使用100jig的免疫接種，并在第5、7、8和11周采取測(cè)試血樣。通過(guò)ELISA和Western印跡測(cè)試得到的血清的gp120結(jié)合。拔j&,對(duì)趟殺yS^全敘敏發(fā)母的^餘。為了富集對(duì)a1，2連接的甘露糖殘基特異的抗體，接著對(duì)任一顯示gpl20結(jié)合的血清進(jìn)行Aochl和INVScl(WT)酵母細(xì)胞吸附。將每1ml血清與1.0-2.0g(濕重)熱殺死的Aochl和/或WT酵母在5ml0.9%NaCl中孵育。添加疊氮化鈉至0.2%，并將懸浮液在室溫顛倒混合孵育過(guò)夜。通過(guò)在6,000g離心20分鐘去除細(xì)胞，并重復(fù)吸附。最終的血清以0.9%NaCl透析，并用0.2微米濾器滅菌。然后，在蛋白質(zhì)A-瓊脂糖(英駿Invitrogen)上純化抗體，并再次通過(guò)ELISA和Western印跡測(cè)試gpl20結(jié)合。，和^/A^W，2遽凝W廿處潛戎差掙并W拔脊。為了進(jìn)一步純化對(duì)a1，2連接的甘露糖殘基特異的抗體，使用來(lái)自三突變體的ConA洗脫的糖蛋白通過(guò)ELISA純化血清，所述血清來(lái)自顯示gpl20結(jié)合的任一被吸附的抗體。簡(jiǎn)言之，如前所述使用CoiiA凝集素親和層析純化來(lái)自AmnnlAmnn4Aochl-2-5細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞裂解物。根據(jù)制備商的方案，按照每lml凝膠10mg總蛋白質(zhì)，將來(lái)自每種級(jí)分(上清液和裂解物)的蛋白質(zhì)獨(dú)立地與溴化氰活化的瓊脂糖4B(西格瑪Sigma)綴合。用PBS徹底洗滌柱后，將10-20ml選擇的血清過(guò)濾滅菌，并與5ml培養(yǎng)基在室溫孵育2小時(shí)。收集流出液，并用PBS再次洗滌柱。用100mM甘氨酸，pH2.5將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫在1ml含有50pl1MTris，pH9.5的級(jí)分中。以PBS透析后，通過(guò)ELISA和Western印跡對(duì)這些抗體進(jìn)行g(shù)pl20結(jié)合測(cè)試。對(duì)免疫血清進(jìn)行抗gpl20反應(yīng)性和假病毒中和分析奸對(duì)g/7"CW￡X/5^。進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)以測(cè)試抗al，2連接的甘露糖血清對(duì)gpl20的特異性。將不同的HIV-1gpl20蛋白(來(lái)自多種來(lái)源，包括Doms博士的實(shí)驗(yàn)室、ARRRP和商業(yè)公司)在50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.5中稀釋至3-5[ig/ml。將一百微升抗原于每孔中室溫孵育過(guò)夜。用ELISA封閉緩沖液(PBS,1。/。BSA，0.02。/。硫柳汞)封閉孔，并在室溫潮濕的溫箱中孵育2小時(shí)。兩次dH20沖洗后，以封閉緩沖液中不同的稀釋度添加2G12和抗AmnnlAmnn4Aochl-DIP的抗血清，并在室溫孵育過(guò)夜。用ELISA洗滌緩沖液(PBS，0.05%Tween20，0，02%硫柳汞)洗滌孔，并在37'C與1:10,000稀釋度的山羊抗人IgG-HRP或山羊抗兔IgG-HRP(杰克遜免疫研究7>司JacksonImmunoResearch)孵育1小時(shí)。如前所述洗滌孔，與TMB孵育進(jìn)行顯色，并用HC1終止。使用EMax微板讀數(shù)器(分子裝置乂^司MolecularDevices)通過(guò)450nm處的吸光值讀出HRP活性。通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生研究所艾滋病研究和參照試劑項(xiàng)目(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram)(ARRRP)獲得在CHO細(xì)胞中表達(dá)的SF162gpl20。在293T細(xì)胞中表達(dá)的ADA、JR-FL和YU2gpl20得自費(fèi)城大學(xué)(UniversityofPhiladelphia—Doms博士。在上文使用的類似方法中，通過(guò)定量ELISA將哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的gpl20蛋白的結(jié)合親合力與三突變酵母表達(dá)的進(jìn)行比較。使用來(lái)自不同菌林的等量的gpl20酵母(在AmnnlAmnn4Aochl中表達(dá))和gpl20-293(在293T細(xì)胞中表達(dá))包被微孔板。然后使用2G12、抗gpl20-IIIB和抗gpl20-YU2探測(cè)。通過(guò)捕獲等量的蛋白質(zhì)和系列稀釋結(jié)合抗體，來(lái)計(jì)算和比較2G12對(duì)各gpl20的結(jié)合親合力。^和溯/定。293T/17細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(馬納薩斯，吉尼亞洲Manassas,VA)并在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中維持。質(zhì)粒pNL4-3.1ucR-E-購(gòu)自朗道(Landau)博士實(shí)驗(yàn)室。用于生產(chǎn)假病毒的多種HIV-1envgpl60質(zhì)粒得自國(guó)家衛(wèi)生研究所艾滋病研究和參照試劑項(xiàng)目(NIHAIDSResearchReferenceReagentProgram)(NIH，ARRRP)。表達(dá)用于假病毒傳染性的CCR5和CD4的U87.CD4.CCR5和U87.CD4.CXCR4細(xì)胞系由費(fèi)城大學(xué)(UniversityofPhiladelphia)的Doms博士I曽送。對(duì)于假病毒而言，使用磷酸鉤方法根據(jù)制備商的說(shuō)明(英駿Invitrogen)用gpl60env表達(dá)質(zhì)粒和補(bǔ)償性病毒基因組報(bào)告基因載體pNL4-3丄ucE-R—共轉(zhuǎn)染10cm皿的70-80%融合的293T/17細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集含有Env蛋白質(zhì)假型重組病毒的培養(yǎng)物上清液，離心，通過(guò)0.45nm的濾器過(guò)濾，并冷凍在-80'C。為了測(cè)量假病毒傳染性，使用收集的上清液的等分式樣感染每個(gè)表達(dá)CCR5(U87.CD4.CCR5)或CXCR4(U87.CD4.CXCR4)的細(xì)胞系的96孑L板中的10,000個(gè)細(xì)胞。在72小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)后，使用Bright-Glo熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)試劑(普洛麥格Promega，Madison，WI)和Veritas微孔板化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(特納生物系統(tǒng)公司TurnerBiosystems)設(shè)備根據(jù)制備商的說(shuō)明，測(cè)量來(lái)自單輪感染細(xì)胞的熒光素酶活性。測(cè)定一式三份的孔的平均相對(duì)光單位(RLU)，并使用^2xl05rlu/ml的假病毒儲(chǔ)液用于隨后的中和測(cè)定。對(duì)中和測(cè)定而言，使用單輪假型報(bào)告基因測(cè)定來(lái)測(cè)定動(dòng)物血清或純化抗體抗HIV-1病毒的中合抗體(NAb)活性。簡(jiǎn)言之，將表達(dá)CCR5(U87.CD4.CCR5)或CXCR4(U87.CD4.CXCR4)的細(xì)胞系以10,000細(xì)胞/孔涂布在96孔平底板上，并過(guò)夜培養(yǎng)。為了用血清測(cè)試，使用前將樣品于56。C熱滅活45分鐘。第二天在獨(dú)立的96孔平底板上，將25nl適當(dāng)稀釋的假病毒懸浮液一式三份與25pi系列稀釋的抗體樣品混合(這使得抗體終濃度為200ug/ml，或?qū)τ诩兓目贵w為50ug/ml或?qū)τ谘獫{樣品為1:5的稀釋度)，并在37。C孵育1小時(shí)。孵育抗體/病毒混合物后，將培養(yǎng)基從預(yù)孵育的平板細(xì)胞中去除；向細(xì)胞中添加抗體混合物并于37。C在C02溫箱中孵育四小時(shí)。孵育后將混合物從細(xì)胞中去除并用新鮮培養(yǎng)基替代。根據(jù)制備商指示，感染后72小時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)細(xì)胞中添加等體積(通常為50-100ul)的Bright-Glo熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)試劑(普洛麥格Promega，Madison，WI)收集細(xì)胞，并通過(guò)使用Veritas微孔板化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(特納生物系統(tǒng)公司TurnerBiosystems)測(cè)量焚光素酶活性(以RLU計(jì))。4吏用下式將測(cè)試樣品孑L(細(xì)胞/抗體/病毒)、病毒對(duì)照(細(xì)胞/病毒)和細(xì)胞對(duì)照(僅細(xì)胞)孔的熒光素酶活性測(cè)量值平均來(lái)測(cè)定每個(gè)樣品的抑制百分比[(病毒對(duì)照孔-測(cè)試樣品孔)/(病毒對(duì)照孔-細(xì)胞對(duì)照)x100]。實(shí)施例2.酵母糖蛋白PST1與釀酒酵母突變體菌抹中的2G12交叉反應(yīng)，所述突變體的pmrl基因破壞或者Pmrl和mnnl基因均破壞在酵母突變體菌林中篩選2G12交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)。釀酒酵母的糖基化途徑已經(jīng)被深入研究。釀酒酵母基因組中幾乎所有ORF的缺失(Winzder等，Sd^ice285:卯1-卯6，1999和Giaever等，7Va,w/^，418:387-391，2002)以及各種突變體菌林的可獲得性，已經(jīng)提供了研究酵母中聚糖譜型改變的極好機(jī)會(huì)。首先使用2G12對(duì)不同的突變體篩選任一突變體中可能的交叉反應(yīng)性糖蛋白。如圖IO所示，測(cè)試了來(lái)自五種單突變體的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基，所述突變體中缺失了參與ER和高爾基體中糖加工的酶，包括Mnsl、Ochl、Mnn9、Mnnl和Pmrl。結(jié)果顯示在Apmrl突變體的細(xì)胞裂解物中，在約IOO和120kDa處檢測(cè)到兩個(gè)模糊條帶，盡管信號(hào)比用作陽(yáng)性對(duì)照的來(lái)自HIV-1gpl20糖蛋白(298T表達(dá)的)的信號(hào)弱。PMR1基因編碼高親和力的Ca2+/Mn2+P型ATPase，其對(duì)于Ca"和Mn"轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入高爾基體是必需的，并參與Ca"依賴型蛋白質(zhì)分選和加工(Rudolph等，Ce//.58:133-145，1989)。PMR1基因的缺失被認(rèn)為引起一些糖蛋白直接從ER分泌，從而繞過(guò)高爾基體和其中所有的聚糖加工(Rudolph等，CW/.58:133-145，1989)。這會(huì)導(dǎo)致聚甘露糖外部鏈和N-連接的聚糖上末端a-l，3-連接的帽缺乏(Verostek等，G^o^Wogv5(7):671-81，1995)。來(lái)自YU-2菌林的含有釀酒酵母a交配因子信號(hào)序列的HIV-1gpl20基因被用于轉(zhuǎn)化Apmrl酵母。如圖11A所示，培養(yǎng)24小時(shí)后培養(yǎng)基中約100kDa的蛋白質(zhì)在Western印跡中被2G12識(shí)別(本文稱作YP100)。在平行的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)3到9天后，在來(lái)自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基中顯示有2G12反應(yīng)性的YP100，但是在來(lái)自未轉(zhuǎn)化的pmrl突變細(xì)胞的培養(yǎng)基中不可檢測(cè)(圖IIB)。在該實(shí)驗(yàn)中，未轉(zhuǎn)化的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中顯示有范圍90到160kDa的若干條帶，但是其它實(shí)驗(yàn)中未顯示。這些結(jié)果提示gpl20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化引起該蛋白質(zhì)表達(dá)或分泌的提高。起初認(rèn)為gpl20轉(zhuǎn)化的pmrl突變體中2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)(YP100)是gpl20糖蛋白，歸因于以下證據(jù)2G12可檢測(cè)的條帶被gpl20質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)(圖2A、IIA)、在gpl20轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中檢測(cè)到該條帶但在未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中未檢測(cè)到(圖IIB)、其顯示96到100kDa糖蛋白的預(yù)期大小(圖2A和11)、其顯示60kDa(與未糖基化的gpl20相似的分子量)的預(yù)期的EndoH消化的蛋白質(zhì)大小(圖3)。其它研究對(duì)被誘導(dǎo)的YP100蛋白質(zhì)確實(shí)是gpl20提出了懷疑，因?yàn)槭褂每筭pl20的抗體觀察到了不一致的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖10所示，Apmrl酵母細(xì)胞裂解物中-100kDa和120kDa處的兩個(gè)模糊條帶被2G12識(shí)別。這些結(jié)果表明2G12反應(yīng)性的100kDa條帶可能是表達(dá)的外源HIV-1gpl20或者是未知的內(nèi)源酵母蛋白質(zhì)。在Pmrl突變體中鑒定2G12交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)。為了確定被2G12識(shí)別的蛋白質(zhì)是gpl20或酵母糖蛋白，使用凝集素親和層析(圖2B和12)和凝膠過(guò)濾部分純化YPIOO。使用納米LC-MS/MS鑒定純化物質(zhì)中的蛋白質(zhì)。六種肽被鑒定為屬于未知的酵母蛋白質(zhì)PST1(圖13)，盡管一些其它肽與gpl20和酵母蛋白質(zhì)匹配。PST1蛋白質(zhì)在其羧基端含有信號(hào)肽和GPI錨定點(diǎn)，表明其為細(xì)胞壁或膜蛋白質(zhì)并能夠被分泌。成熟蛋白質(zhì)的400個(gè)氨基酸中存在15個(gè)潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)，占3.8%的密度，表明PST1被重度糖基化。為了證實(shí)YP100事實(shí)上是PST1，在兔中產(chǎn)生抗合成肽的多克隆抗體，并使用抗原免疫親和層析純化。通過(guò)2D分離部分純化的Ypl00蛋白質(zhì)，隨后考馬斯藍(lán)染色并進(jìn)行Western印跡分析。圖14A顯示分子量100kDa和等電點(diǎn)(PI)9-10的主要斑點(diǎn)。相同的斑點(diǎn)同樣被2G12(圖14B)和抗PST1多克隆抗體(圖14C)識(shí)別。PST1具有計(jì)算為9.25的PI。所有這些結(jié)果吻合并提示與2G12交叉反應(yīng)性糖蛋白很可能是酵母糖蛋白PST1。這些結(jié)果構(gòu)成了內(nèi)源酵母蛋白質(zhì)顯示出對(duì)HIV特異性中和抗體2G12結(jié)合親合力的首個(gè)證據(jù)。為了進(jìn)一步證實(shí)PST1的2G12特異性，用內(nèi)切-L-N-乙酰葡糖胺糖苷酶H(EndoH)消化YPIOO,該酶特異性地切割高甘露糖型的聚糖。如15通過(guò)考馬斯藍(lán)和抗PST1抗體染色所示，消化后PST1蛋白質(zhì)的遷移從100kDa變化為~60kDa(將笫2和4道與第3和5道比較)。盡管EndoH消化后PST1蛋白質(zhì)仍可被抗PST1識(shí)別，但是其不再被2G12識(shí)別(第7道)，這提示了PST1蛋白上的N聚糖是被HIV-1中和性MAb2G12識(shí)別的表位。SDS-PAGE中EndoH消化后PST1的分子量(~60kDa)高于來(lái)自成熟蛋白質(zhì)的氨基酸的計(jì)算的分子量(41kDa)。這可歸因于O-連接的糖基化，因?yàn)镻ST含有潛在的O-連接的糖基化位點(diǎn)(圖33)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了圖2和11中所示的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)事實(shí)上是具有未知功能的酵母糖蛋白PST1。該蛋白質(zhì)至少被外源基因HIV-1gpl20Eiiv的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)。雙突變體的產(chǎn)生以及雙突變體中PST1的表征。gpl20上2G12的結(jié)合位點(diǎn)被鑒定為在至少三個(gè)N-連接的聚糖簇上發(fā)現(xiàn)的末端(xl，2連接的甘露糖殘基。酵母中的Apmrl突變被認(rèn)為繞過(guò)高爾基體，從而僅在酵母蛋白質(zhì)上留下Man8聚糖。然而，其它證據(jù)提示該突變可能僅繞過(guò)早期高爾基區(qū)室，或引起的€3++變化影響見于高爾基體的酶的效力?？紤]到這個(gè)，用于高爾基體中2G12結(jié)合的最弱的糖基化酶之一將是Mnnlp，該酶負(fù)責(zé)為所有a1，2殘基加上末端a1，3連接的甘露糖帽(Nakajima等，ProcNatAcadSciUSA72:3912-3916，1975)。為了阻止PST1的這類加帽，創(chuàng)建了酵母雙突變體菌抹AmnnlApmrl。將MMW和i^kfiW基因中ORF敲除的酵母缺失菌抹交配并形成孢子，以生產(chǎn)AmnnlApmrl單倍體。進(jìn)行菌落PCR，選擇和證實(shí)Amnnl和Apmrl表型(數(shù)據(jù)未顯示)。驗(yàn)證每個(gè)基因缺失的四個(gè)獨(dú)特引物證實(shí)每種ORF完全缺失并被替換為KanMX4模塊。使用Western印跡用2G12篩選五個(gè)雙突變體菌抹(AmnnlApmrl)。如所預(yù)期的，在所有五個(gè)突變體菌林(圖16)中均檢測(cè)到先前實(shí)驗(yàn)(見圖IO)中看到的100kDa條帶。事實(shí)上似乎存在信號(hào)的增強(qiáng)，這很可能歸因于末端al，3-Man帽的丟失和蛋白質(zhì)上更多al，2-Man的暴露。該假說(shuō)被圖17和18中所示的以下實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。為了分析參與糖基化途徑的基因缺失的作用，研究了該雙突變體與其它酵母單突變體中PST1蛋白質(zhì)大小的變化。使用Western印跡以抗PST1多克隆抗體分析來(lái)自不同菌抹的細(xì)胞裂解物(圖17A，上圖)和培養(yǎng)基(圖17B，下圖)。僅在AmimlApmrl雙突變體的細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到PSTl。培養(yǎng)基顯示野生型菌林中在>200kDa處存在超糖基化的PSTl。Ochl突變體中PSTl顯示到約105kDa處的顯著移行，其與pmrl單突變體在類似大小處移行。這些結(jié)果提示像ochl突變體一樣，pmrl突變體中PSTl上的高甘露糖外部鏈沒(méi)有添加。雙突變體中的PSTl比其在pmrl或ochl中移行得更快，表明雙突變體中MansGlcNAc2核心上的末端al，3-Man缺失。與PST1相反，另一糖蛋白GP38存在于來(lái)自所有測(cè)試菌林的細(xì)胞裂解物中(圖17A,下圖)。該蛋白質(zhì)的大小隨著菌抹突變而大幅地變化。野生型和/i/mmJ顯示大于200kDa的大型超糖基化的大小。z^d7中顯示~卯kDa的條帶，而A/;柳W中顯示110kDa的條帶，提示這兩個(gè)突變體中超糖基化分別完全喪失和截短。pmrlmnnl雙突變體中GP38顯示比pmrl單突變體中略微更小的大小，表明al,3連接的甘露糖帽的喪失，這與這兩種突變體中用PST1觀察到的一致。另外，在來(lái)自野生型或來(lái)自miinl突變體的培養(yǎng)基中均不能檢測(cè)到GP38(圖17B,下圖)。令人感興趣的是，其被pmrl或ochl突變強(qiáng)烈誘導(dǎo)。這進(jìn)一步指出Pmrlp與Ochlp相似，在至少一些蛋白質(zhì)的糖基化中起關(guān)鍵作用。然而，盡管因?yàn)槿笔ж?fù)責(zé)外部鏈起始的基因，Aochl突變幾乎確保超糖基化的喪失，但是Apmrl似乎影響這類鏈延長(zhǎng)的效率。這導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)如PST1完全喪失超糖基化，而其它蛋白質(zhì)如Gp38超糖基化降低。Pmrl單突變體和pmrlmnnl雙突變體中GP38的大小改變顯示與這兩種突變體中PST1相似的模式，表明在高爾基體中被添加的al，3-Man的缺失。為了證實(shí)mnnlp功能的喪失，通過(guò)Western印跡用各結(jié)構(gòu)特異的抗體分析末端al，3-Man和al,2-Man的存在。圖18下圖顯示pmrl單突變體和pmrlmnnl雙突變體中的PST1表達(dá)水平是相似的。然而，抗al，3-Man特異性多克隆抗體在pmrl單突變體中檢測(cè)到一個(gè)條帶，而該活性在雙突變體中完全喪失(圖18，上圖)。相反，抗al，2-ManMAb2G12顯示相反的結(jié)果。雙突變體中2G12信號(hào)比單突變體中強(qiáng)得多(圖18，中圖)。在ochl突變體中，抗al，3-Man抗體檢測(cè)到范圍從70kDa到超過(guò)150kDa的強(qiáng)彌散條帶(smear)，而抗al，2-Man(2G12)檢測(cè)不到，這表明具有al，3-Man結(jié)構(gòu)的多種糖蛋白被抗al，3-Man抗體檢測(cè)。部分純化的Yp100顯示對(duì)PST1抗體和2G12的反應(yīng)性，但對(duì)抗al,3-Man抗體無(wú)反應(yīng)性。2G12MAb與天然和變性的PST1糖蛋白均交叉反應(yīng)。為了測(cè)試2G12是否識(shí)別天然形式PST1上的聚糖，進(jìn)行免疫印跡。用2G12沉淀來(lái)自雙突變體培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，隨后與抗人IgG瓊脂糖孵育。使用SDS樣品緩沖液洗脫免疫復(fù)合物，并在4-20%SDS-PAGE上分離。然后用抗PST1多克隆抗體探測(cè)印跡。如圖19所示，抗PST1在起始材料(笫1道)、預(yù)清洗攪拌(beat)的流出液(第2道)和洗脫液(第6道)中檢測(cè)到強(qiáng)信號(hào)，但是在上清液和洗滌液(第3-5道)中未檢測(cè)到或檢測(cè)到弱信號(hào)。這些結(jié)果表明2G12識(shí)別天然的PST1蛋白質(zhì)，并與糖表位具有高親和力，因?yàn)榇蟛糠諱Ab不沉淀蛋白質(zhì)。PST1基因和蛋白質(zhì)的背景信息PSTlp(原生質(zhì)體分泌的蛋白質(zhì)l)屬于SPS2家族。該蛋白質(zhì)通過(guò)糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨點(diǎn)附著在膜上，并通過(guò)再生原生質(zhì)體分泌。PSTlp據(jù)認(rèn)為對(duì)細(xì)胞壁完整性非常重要，這是因?yàn)槠浣?jīng)Rlmlp介導(dǎo)的細(xì)胞完整性途徑激活而上調(diào)，并且經(jīng)Fkslp介導(dǎo)的細(xì)胞壁損傷而上調(diào)?；蚝图易迤淝绑w具有444個(gè)氨基酸，帶有推定的19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，以及用于GPI錨點(diǎn)附著的25個(gè)氨基酸的C末端結(jié)構(gòu)域。前體的分子量和等電點(diǎn)分別為45,776Da和9.91。其具有大量N-連接的糖基化位點(diǎn)，并富含絲氨酸和蘇氨酸，它們很可能被重度O-糖基化。其成熟蛋白質(zhì)具有400個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量為41,260Da，等電點(diǎn)為9.25。PST1含有15個(gè)潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)，占據(jù)400個(gè)氨基酸中的3.8%?？偣灿?18個(gè)絲氨酸和蘇氨酸，占據(jù)400個(gè)殘基中的29.5%。這些絲氨酸和蘇氨酸中一些是O-連接的糖基化位點(diǎn)(圖33)。PST1與Ecm33最為相似，在整個(gè)蛋白質(zhì)水平上顯示58%的同一性和79%的相似性。在酵母和真菌的不同物種中發(fā)現(xiàn)PST1和Ecm33的同源物，但是在任何其它物種(包括哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲、蠕蟲和鳥)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(圖20)。它們具有類似或重疊到活性，但是它們功能上不是冗余的(PardoM，Mct函一，150:4157-4170，2004)。功能PST1的分子功能是未知的。其參與細(xì)胞壁組建和生物發(fā)生。PST1和Ecm33均為GPI錨定的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，并定位于細(xì)胞表面。表達(dá)、誘導(dǎo)和分泌PST1(YDR055W)最初發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母的培養(yǎng)基中，所述釀酒酵母在再生條件下用蝸牛酶處理孵育以獲得原生質(zhì)體(Padro等，IfeflW，15:459-472，1999)。葡聚糖合酶的一個(gè)亞基FZ^7的破壞上調(diào)YDR055WRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(Terashima等，MolGenGenet，264:64-74，2000)。發(fā)現(xiàn)MAP激酶Mpkl/Slt2的活化或升高的溫度導(dǎo)致環(huán)境脅迫，對(duì)酵母細(xì)胞壁的完整性構(gòu)成危險(xiǎn)，從而激活其miRNA的表達(dá)水平(Jung等，Af/cw力"/.34(5):1049-57，1999)。總而言之，我們發(fā)現(xiàn)酵母糖蛋白與HIV-1廣"i普中和性MAb2G12交叉反應(yīng)，所述MAb2G12結(jié)合由高甘露糖型聚糖上Manal，2-Man組成的表位。該重度糖基化的蛋白質(zhì)被鑒定為PST1,通過(guò)GPI錨點(diǎn)附著的細(xì)胞壁或膜蛋白。其為分泌的蛋白質(zhì)，并在轉(zhuǎn)化或缺失參與糖基化途徑的基因后被上調(diào)。實(shí)施例3.構(gòu)建三突變體并鑒定Ochl/Mnnl/Mnn4突變體中的2G12交叉反應(yīng)性糖蛋白I.構(gòu)建和表征酵母三突變體酵母交配和AmnnlAmnn4Aochl三突變體的,驗(yàn)證為了探索使用酵母生產(chǎn)類似于見于gpl20上的糖蛋白的可能性，必須突變糖基化途徑。釀酒酵母特異的三種蛋白質(zhì)對(duì)于創(chuàng)建N-連接的聚糖是至關(guān)重要的OCHlp起始超甘露糖基化必需的第一個(gè)a1,6甘露糖殘基(Lehle等，F(xiàn)五5S丄e汰，370(1醫(yī)2):41-5，1995)，MNNlp負(fù)責(zé)a1，2殘基的所有末端al，3連接的甘露糖加帽(Nakajima等，7VociVW爿o^5WUSA，72:3912-3916，1975)，MNN4p是甘露糖基磷酸化的正調(diào)節(jié)物(Jigami等，祝oc/^'附祝印/^s爿""，1426(2):335-45，1999)。將這些基因ORF敲除的酵母缺失菌林交配并形成孢子，以生產(chǎn)AmnnlAmnn4和AmnnlAochl單倍體。由于Aochl表型所顯示的溫度敏感性(Lee等，iVw7Vflf/爿ow/5W，97(22):12679-84，1999)，這些克隆的選擇通過(guò)在YPD上于37。C的緩慢生長(zhǎng)確定。進(jìn)行菌落PCR用于Amnnl和Amnn4表型的選擇和驗(yàn)證(數(shù)據(jù)未顯示)。將得到的雙突變體單倍體交配并形成孢子，以產(chǎn)生單倍體三突變體AmnnlAmnn4Aochl。Amnn4和Aochl表型的篩選如前進(jìn)行，對(duì)Aochl使用在YPD上37°C的緩慢生長(zhǎng)，對(duì)Amnn4和Aochl使用PCR。圖23A顯示篩選四種克隆的菌落PCR樣品，其中三個(gè)克隆顯示既存在Amnn4又存在Aochl表型。通過(guò)PCR測(cè)試六個(gè)推定的三突變體以證實(shí)AmnnlAmnn4Aochl基因型。圖21B顯示這些克隆中兩個(gè)克隆的結(jié)果AmnnlAmnn4Aochl-2-5和AmnnlAmnn4Aochl-2-6。每個(gè)基因缺失的四種獨(dú)特ORF特異性引物證實(shí)了每個(gè)基因被完全缺失。如果存在ORF，則內(nèi)部ORF特異性引物(MNN1B、MNN4B、OCHIB、MNN1C、MNN4C和OCHIC)以及上游或下游引物(MNN1A、MNN4A、OCHIA、M腿D、MNN4D和OCHID)的組合得到PCR產(chǎn)物(即MNN1A+MNN1B、MNN1C+MNN1D等)。如圖所示，兩個(gè)克隆對(duì)于MNN1、MNN4和Ochl的引物對(duì)均顯示無(wú)PCR產(chǎn)物，證實(shí)了缺失的基因型。還以WT作為陽(yáng)性對(duì)照測(cè)試了每種ORF特異性引物對(duì)(結(jié)果未顯示)。相反，如果ORF被替換為KanMX模塊，則上游或下游引物與內(nèi)部KanMX特異性引物(KanB和KanC)的組合得到PCR產(chǎn)物。如圖23B所示，對(duì)每個(gè)基因缺失用兩種引物對(duì)測(cè)試時(shí)，這些克隆均顯示預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。將單倍體三突變體中的兩個(gè)AmnnlAmnn4Aochl-2-6和AmnnlArnnn4Aochl-2-5交配以形成二倍體三突變體83AmnnlAmnn4Aochl-DIP。該菌抹可用于與野生型二倍體菌林INVScl的進(jìn)行任何進(jìn)一步的比較研究，包括ELISA、免疫熒光和免疫接種。通過(guò)ELISA測(cè)定三突變體al，3-甘露糖的缺失和2G12交叉反應(yīng)性的提高AmnnlAmnn4Aochl突變酵母菌林預(yù)期生產(chǎn)具有占多數(shù)的MansGlcNAc2聚糖的糖蛋白。為了直接驗(yàn)證這些寡糖的存在，測(cè)試三突變體與兩種甘露糖特異性抗體2G12和抗a1,3連接的甘露糖(抗al，3)抗體的交叉反應(yīng)性。通過(guò)用INVScl全細(xì)胞免疫兔子制備對(duì)a1，3連接的甘露糖特異的免疫血清，并將血清吸附至Ammil細(xì)胞(Raschke等，/必"/C/^附.248(13):4660誦6，1973和Ballon,/祝o/C7ie附，245:1197-1203,1970)。得到的血清預(yù)期富含對(duì)末端(xl，3連接的甘露糖殘基特異的抗體，Mnnlp利用所述al，3連接的甘露糖殘基對(duì)al,2連接的殘基進(jìn)行加帽。相反，已知2G12對(duì)見于核心N-連接的聚糖上的末端a1，2連接的甘露糖殘基特異，雖說(shuō)是這樣的殘基簇(Scanlan等，/Wra/，76:7306-21，2002)。使用WT(INVScl)和AmnnlAmnn4Aochl-DIP細(xì)胞的完整全酵母細(xì)胞包被ELISA平板，并使用2G12和a1，3特異性Ab進(jìn)行探測(cè)。如圖22A所示，抗al，3抗體顯示對(duì)野生型細(xì)胞的高親和力，而三突變體顯示低親和力。納入SF162和野生型酵母甘露聚糖分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。這些結(jié)果顯示三突變體中缺失末端a1，3連接的甘露糖殘基?？筧1,3對(duì)三突變體的任何殘余的親和力可歸因于吸收過(guò)程不完全有效的事實(shí)；仍然存在的其它酵母特異性抗體能夠與三突變體上暴露的表位(即細(xì)胞壁蛋白質(zhì)和p-聚糖)結(jié)合。圖22B顯示2G12能夠與三突變體全細(xì)胞結(jié)合，而在與野生型的結(jié)合中沒(méi)有交叉反應(yīng)。觀察到親和力為10ng/ml到1jig/ml。SF162和野生型酵母甘露聚糖也分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照而納入。這些結(jié)果不僅證實(shí)三突變體中末端ai，3連接的甘露糖殘基的缺失，而且表明了見于核心Man8聚糖上的a1,2連接的甘露糖的暴露。更重要的是，AmnnlAmnn4Aochl酵母結(jié)合2G12的親和力暗示了見于酵母細(xì)胞壁上的一種或多種蛋白質(zhì)上2G12樣表位的存在。通過(guò)免疫熒光測(cè)定三突變體al,3-甘露糖的缺失和2G12交叉反應(yīng)性的提高酵母中的末端a1，3甘露糖殘基不僅加帽a1，2連接的甘露糖殘基，而且是高度免疫原性的，使得它們區(qū)別于HIVgpl20上發(fā)現(xiàn)的聚糖。為了進(jìn)一步證實(shí)AmnnlAmnn4Aochl菌抹中a1，3連接的甘露糖殘基的缺失，我們用抗al，3-Man對(duì)完整的全細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光。如圖23(圖A和C)所示，野生型細(xì)胞壁顯示出對(duì)抗血清(其對(duì)al，3連接的甘露糖殘基特異)的強(qiáng)反應(yīng)，而二倍體三突變體在相同的稀釋度上顯示無(wú)信號(hào)。作為對(duì)照，通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)對(duì)酵母酵母聚糖(其含有常見于酵母細(xì)胞壁的成分即a-甘露聚糖和P-葡聚糖)特異的抗體對(duì)INVScl和AmnnlAmnn4Aochl全細(xì)胞給出相似的信號(hào)(圖23，圖B和圖D)。這些結(jié)果表明對(duì)MNN1蛋白質(zhì)特異的a1，3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的喪失。這樣的活性缺失幾乎嚴(yán)格地在三突變體細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的所有糖蛋白上留下al，2-連接的末端甘露糖殘基。為了證實(shí)三突變體上將al，2-連接的末端甘露糖殘基的暴露，隨后用抗酵母聚糖通過(guò)免疫熒光來(lái)測(cè)試2G12的共定位。圖24(圖A、B、C)顯示2G12與AmnnlAmnn4Aochl-DIP細(xì)胞強(qiáng)烈結(jié)合，并與抗酵母聚糖共定位于細(xì)胞壁上。野生型酵母僅顯示與抗酵母聚糖結(jié)合，未看到2G12信號(hào)(圖D、E、F)。這些數(shù)據(jù)與全細(xì)胞ELISA的結(jié)果相似，說(shuō)明三突變體中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白含有暴露的al，2-連接的甘露糖結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)具有在天然條件下與2G12結(jié)合的能力。值得一提的是三突變酵母細(xì)胞的大小顯著大于野生型細(xì)胞的大小。通過(guò)Western印跡測(cè)定三突變體糖蛋白上al，3甘露糖的缺失和al，2甘露糖的暴露這些2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)在AmnnlAmnn4Aochl酵母的細(xì)胞壁中出現(xiàn)，但是在野生型中缺失。然而，這并不直接意味著暴露的al，2-連接的甘露糖殘基是對(duì)2G12具有親和力的主要原因。使用Western印跡對(duì)一組酵母糖基化突變體測(cè)試了2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)的存在。如圖25左圖所示，僅來(lái)自雙突變體AmnnlAochl和三突變體AmnnlAmnn4Aochl的裂解物顯示被2G12檢測(cè)的特異性蛋白質(zhì)條帶。事實(shí)上，這些糖基化突變體均顯示具有相同數(shù)量(~4-5)的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。這連同其它酵母突變體中信號(hào)的缺乏一起提示了AmnnlAmnn4Aochl和AmnnlAochl突變體中核心Man8的存在對(duì)于2G12對(duì)這些蛋白質(zhì)的特異性起重要作用。另外，Amnnl和AmnnlAmnn4突變體(其具有超糖基化的N-連接的聚糖，所述聚糖帶有大量暴露的otl，2連接的甘露糖殘基)中看到的信號(hào)的缺失進(jìn)一步提示了Man8聚糖在2G12結(jié)合中的獨(dú)特作用。該組酵母糖基化突變體也用抗a1，3^笨測(cè)以-驗(yàn)證a1，3連接的甘露糖帽的存在或缺失。圖25右圖顯示抗al，3-Man血清不能檢測(cè)任何Amnnl表型突變體(包括AmnnlAochl和三突變體)上的蛋白質(zhì)。這進(jìn)一步表明了三突變體和AmnnlAochl菌才朱以及Amnnl和AmnnlAmnn4菌抹上a1，2表位的暴露不被2G12識(shí)別。另一相同的Western印跡進(jìn)行假孵育(不含第一抗體)并顯示在任何菌林內(nèi)無(wú)顯著信號(hào)，從而排除了與山羊抗人第二抗體的相互作用(結(jié)果未顯示)。為了證實(shí)三突變體蛋白質(zhì)對(duì)2G12的反應(yīng)性歸因于酵母菌林的基因型以及具有補(bǔ)償功能的其它蛋白質(zhì)不表達(dá)，分析了不同的三突變體克隆。從AmnnlAmnn4xAmnnlAochl雜交獲得了總計(jì)六個(gè)AmnnlAmnn4Aochl酵母菌抹。各菌林從在YPD+KC1平板上生長(zhǎng)的獨(dú)立單倍體菌落中挑取，并被證實(shí)含有三個(gè)突變(見圖21的克隆2-5和2-6)。在圖26中通過(guò)Western印跡，所有六個(gè)克隆顯示2G12對(duì)相同蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。這表明這些蛋白質(zhì)對(duì)2G12的反應(yīng)性很可能歸因于三突變體的基因型，所述基因型導(dǎo)致突變的聚糖。驗(yàn)證三突變體上的聚糖作為對(duì)AmnnlAmnn4Aochl糖蛋白上存在的寡糖的最終確認(rèn)，對(duì)從全酵母細(xì)胞提取物中提取的N-連接的聚糖進(jìn)行MALDI-TOF和NP-HPLC分型。在圖26中，MALDI-TOF結(jié)果顯示MansGlcNAc2是三突變體提取物中的主要聚糖，具有極其少量的Man9GlcNAc2和MansGlcNAc2。Man8聚糖的水平比Man9或Man5多20倍，從而MansGlcNAc2代表了三突變體中多于90%的總聚糖。NP-HPLC結(jié)果顯示與MALDI-TOF—致，從而Man8是存在于AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞提取物中的主要N-連接的聚糖?？偠灾@些結(jié)果證明了存在于AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞中的聚糖類型主要是Man8GlcNAc2,與核心N-連接的聚糖中發(fā)現(xiàn)的類似。這不僅表明了高度免疫原性的末端al，3連接的甘露糖殘基的缺失，還表明了高甘露糖基化的外部鏈的缺失。所致的末端al，2連接的甘露糖殘基暴露很可能是2G12對(duì)該突變體中發(fā)現(xiàn)的特異性細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的親和力的原因。II.在酵母三突變體中鑒定和驗(yàn)證2G12交叉反應(yīng)性糖蛋白從酵母細(xì)胞中2D分離2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。AmnnlAimm2Aochl酵母中通過(guò)ELISA、免疫熒光和Western印跡顯示對(duì)2G12結(jié)合的這些蛋白質(zhì)是用于生產(chǎn)2G12樣抗體的有希望的抗原。它們將代表在酵母中生產(chǎn)的具有^t擬2G12表位能力的第一種這類抗原，其由見于N-連接的聚糖簇上的a1，2連接的甘露糖殘基構(gòu)象組成。因此，以這些蛋白質(zhì)的部分純化和筌定繼續(xù)該研究。由于細(xì)胞壁和質(zhì)膜中糖蛋白的優(yōu)勢(shì)，使用差速離心從胞質(zhì)蛋白質(zhì)中大量分離膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。將對(duì)數(shù)期的AmmilAmnn4Aochl-DIP細(xì)胞裂解，并進(jìn)行離心，以去除胞質(zhì)、高爾基復(fù)合體和核內(nèi)體蛋白質(zhì)。將主要含液泡、核、ER和質(zhì)膜蛋白質(zhì)的沉淀物溶于1%TritonX-100中，以分離高度可溶的蛋白質(zhì)。如圖28A中觀察到的，2G12結(jié)合蛋白質(zhì)主要存在于膜級(jí)分中，小部分這些蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)溶于Triton中。這些結(jié)果與全細(xì)胞ELISA和免疫焚光一致，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)似乎主要是與細(xì)胞壁或質(zhì)膜結(jié)合的。除了與膜結(jié)合外，先前的結(jié)果還表明了這些2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)被高度糖基化。因此，使用刀豆球蛋白A(ConA)凝集素親和層析純化存在于Triton可溶性級(jí)分中的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。圖28B顯示這些蛋白質(zhì)對(duì)ConA具有高親和力，從而大部分蛋白質(zhì)不能通過(guò)竟?fàn)幮越Y(jié)合(使用0.5M曱基吡喃型甘露糖苷)被完全洗脫，而需要更苛刻的條件洗脫(1%SDS)。從ConA洗脫物得到的蛋白質(zhì)代表了存在于AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞中的高度糖基化的膜蛋白質(zhì)，包括與2G12結(jié)合的蛋白質(zhì)。為了有效地分離這些蛋白質(zhì)用于鑒定，對(duì)該級(jí)分使用2-D凝膠電泳。將兩個(gè)獨(dú)立的等分式樣在pH4.0-7.0IPG膠條上跑膠，隨后在4-12%梯度凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分離。用Sypro寶石紅蛋白對(duì)一塊凝膠染色，將另塊一凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上使用2G12進(jìn)行Western印跡。圖28C顯示通過(guò)Western印跡鑒定了兩個(gè)大斑點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)于在Sypro寶石紅蛋白染色的凝膠上顯影的兩個(gè)斑點(diǎn)(未顯示)。將這些斑點(diǎn)切下進(jìn)行胰蛋白酶消化和納米LC/MS/MS鑒定。較高的2D斑點(diǎn)(110kDa處)鑒定了來(lái)自三種酵母糖蛋白的肽Gas5(5種肽)、ECM33(4種肽)和Gasl(2種肽)。較低的2D點(diǎn)(~95kDa處)鑒定了來(lái)自單個(gè)酵母糖蛋白Y幾171c的7種肽。這些蛋白質(zhì)代表了具有2G12反應(yīng)性的所有或大部分的更高分子量的蛋白質(zhì)?？赡茉谠摯笮》秶鷥?nèi)存在更多未被鑒定的這類蛋白質(zhì)，但是在該篩選中確定地存在未被鑒定的35kDa的蛋白質(zhì)(見圖25和28)。該蛋白質(zhì)的身份未知，但是目前正在研究中。從培養(yǎng)物上清液中l(wèi)-D分離2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。除了細(xì)胞裂解物外，發(fā)現(xiàn)酵母三突變體的培養(yǎng)上清液含有具2G12反應(yīng)性的糖蛋白。通過(guò)Western印跡測(cè)試來(lái)自INVScl和AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞的培養(yǎng)基的2G12反應(yīng)性。圖29A顯示三突變體中對(duì)2G12MAb具有強(qiáng)反應(yīng)性的至少四個(gè)條帶的表達(dá)，而野生型酵母上清液顯示無(wú)信號(hào)。培養(yǎng)基中這些2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)可能代表分泌的糖蛋白，或者代表天然或由于三突變體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化而被釋放進(jìn)培養(yǎng)基中的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)。事實(shí)上，這四種蛋白質(zhì)的大小似乎與細(xì)胞裂解物中存在的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)類似(見圖25A和28A)，主要信號(hào)見于90到115kDa以及37kDa處的一個(gè)條帶。這提示它們可能是存在于細(xì)胞裂解物中的相同蛋白質(zhì)。無(wú)論如何，這些蛋白質(zhì)可能代表模擬2G12表位的其它抗原的事實(shí)保證了它們的鑒定。來(lái)自AmnnlAmnn4Aochl酵母的上清液被直接用在ConA柱上用于部分純化糖蛋白。培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)顯示對(duì)ConA柱非常高的親和力，且不能通過(guò)使用曱基吡喃型甘露糖苷的竟?fàn)幮越Y(jié)合洗脫。因此，通過(guò)用SDS-PAGE上樣緩沖液將ConA珠子煮沸來(lái)洗脫2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)(圖29B)。使用大型(IOcmx16cm)SDS-PAGE凝膠來(lái)分離SDS洗脫物。凝膠的考馬斯藍(lán)染色顯示五個(gè)獨(dú)立的蛋白質(zhì)條帶，將每個(gè)條帶從凝膠上切下(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)再上樣至SDS-PAGE孩i型膠上并通過(guò)Western印跡以2G12探測(cè)來(lái)檢測(cè)這些條帶的2G12反應(yīng)性。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)蛋白質(zhì)條帶(在110kDa處和95kDa處)與2G12結(jié)合(結(jié)果未顯示)，并將其切下。用胰蛋白酶消化這些蛋白質(zhì)，并通過(guò)納米LC/MS/MS在質(zhì)謙公司(Micromass)Q-Tof2上分析，進(jìn)行肽鑒定。UOkDa條帶僅在凝膠切片上鑒定了一個(gè)蛋白質(zhì)[其中4個(gè)肽與ECM33匹配，為通過(guò)2D在膜級(jí)分中110kDa處鑒定的相同蛋白質(zhì)。95kDa條帶僅在凝膠切片上鑒定了一個(gè)蛋白質(zhì)，其中4個(gè)肽與酵母糖蛋白Gp38匹配。這兩種蛋白質(zhì)可能僅代表了培養(yǎng)基中一半的2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)(見圖29A);事實(shí)上培養(yǎng)上清液中存在似乎是2G12反應(yīng)性的四個(gè)條帶。這兩種未鑒定的蛋白質(zhì)可以與細(xì)胞裂解物中存在的相同，或像GP38—樣，可能代表具2G12結(jié)合能力的未知蛋白質(zhì)。這些未鑒定的蛋白質(zhì)仍然在研究中。通過(guò)免疫沉淀-驗(yàn)證2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)。ECM33、Gasl、Gas5、GP38和YJL171c作為2G12反應(yīng)性酵母糖蛋白的鑒定間接進(jìn)行；使用LC/MS/MS鑒定凝膠電泳中通過(guò)Western印跡與2G12結(jié)合的條帶。為了證實(shí)這些蛋白質(zhì)對(duì)2G12的親和力，用2G12免疫沉淀AmrmlAmnn4Aochl細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基，并用抗這些蛋白質(zhì)的抗體4笨測(cè)得到的Western印跡。圖30A顯示4種蛋白質(zhì)Gasl、ECM33、YJL171c和GP38的鑒定，所述蛋白質(zhì)通過(guò)2G12從培養(yǎng)上清液中沉淀。Gasl、ECM33和YJL171c通過(guò)2D分離在三突變體的細(xì)胞裂解物中鑒定，并在兩種實(shí)驗(yàn)中均顯示分別為115kDa、U0kDa和95kDa的相似大小。GP38最初在三突變體的培養(yǎng)上清液中鑒定，但是此處顯示其也能夠被2G12從細(xì)胞裂解物中沉淀。Gas5也用2G12以相對(duì)低的親和力(數(shù)據(jù)未顯示)被沉淀，這可能歸因于與來(lái)自其它鑒定的蛋白質(zhì)相比更少量和更低密度的N-連接的聚糖(圖38)。圖30B顯示用免疫印跡鑒定3種蛋白質(zhì)PST1、ECM33和GP38。通過(guò)2G12將這些蛋白質(zhì)從培養(yǎng)上清液中沉淀。也通過(guò)1D分離在三突變體的培養(yǎng)基中鑒定了ECM33和GP38，并且它們?cè)趦蓚€(gè)實(shí)驗(yàn)中分別顯示-110kDa和~95kDa的類似大小。令人感興趣的是，PST1最初^皮鑒定為Apmrl酵母培養(yǎng)上清液中的2G12結(jié)合蛋白質(zhì)(實(shí)施例2)。與ECM33和GP38相比，能夠觀察到三突變體的上清液中PST1表達(dá)水平非常低(圖30B，第l道)，這可以解釋該蛋白質(zhì)最初未在該突變體中鑒定到的原因。這些結(jié)果證實(shí)了ECM33、Gasl、Gas5、GP38、PST1和YJL171c在該免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的天然條件下結(jié)合2G12的能力。當(dāng)用我們先前的實(shí)驗(yàn)分析時(shí)，顯示這些酵母糖蛋白具有模擬HIV-1gpl20糖蛋白上存在的2G12表位的能力，從而引起通過(guò)Western印跡、免疫沉淀、免疫熒光和ELISA檢測(cè)時(shí)對(duì)該抗體的結(jié)合。兩種2G12反應(yīng)性酵母蛋白質(zhì)的糖蛋白大小移行潛在模擬2G12表位的六種酵母糖蛋白的發(fā)現(xiàn)和鑒定保證了進(jìn)一步研究這些蛋白質(zhì)上的聚糖結(jié)構(gòu)。就一組酵母糖基化突變體通過(guò)Western印跡對(duì)這些蛋白質(zhì)中的兩種即ECM33和GP38進(jìn)行分析。ECM33是對(duì)細(xì)胞壁穩(wěn)定性重要的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白質(zhì)(Pardo，M&ra&Wogy150:4157-70，2004),而gp38是細(xì)胞壁相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)(Destruelle，Afo/.CW/.14(4):2740-54，1994)。圖31(左圖)顯示結(jié)果。在細(xì)胞裂解物中，這些蛋白質(zhì)均存在于所有的菌林中，雖然水平不同。另外，這些蛋白質(zhì)在不含Aochl基因型的任何菌林中被超甘露糖基化。事實(shí)上，Aochl基因型對(duì)兩種蛋白質(zhì)均導(dǎo)致大于80kDa的急劇大小移行，GP38顯示更顯著的改變。這些菌抹的更精密的分析顯示Aochl和AochlAmnnl菌林中兩種蛋白質(zhì)均存在可察覺的大小移行，表明末端al，3連接的甘露糖殘基的缺失。AmmilAmnn4Aochl突變體中最終的蛋白質(zhì)大小顯示與2G12沉淀的蛋白質(zhì)是相同的大?。粚?duì)ECM33為~110kDa,對(duì)GP38為~95kDa(見圖31)。在SDS-PAGE凝膠上未觀察到Amnn4突變體中磷酸甘露糖缺失引起的任何大小移行，提示改變過(guò)于輕微。在培養(yǎng)上清液(圖31,右圖)中，帶有OCHl基因的任何菌林中存在很少甚至無(wú)GP38或ECM33。似乎含Aochl酵母突變體的脆弱細(xì)胞壁導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)釋放進(jìn)培養(yǎng)基中。然而，通過(guò)將存在于AmnnlAmiin4突變體中的200kDa條帶與存在于含Aochl突變體中的110-115kDa條帶比較，能夠在ECM33中看到類似的大小移行。這再次顯示了外部鏈超甘露糖基化的缺乏。同樣在Aochl和AochlAmnnl突變體或三突變體之間也看到來(lái)自Amnnl突變的類似大小移行。總而言之，這些結(jié)果幫助我們觀察到酵母菌林被突變時(shí)超甘露糖基化和a1，3連接的甘露糖帽的缺失。通過(guò)將這些結(jié)果與圖25比較，除非聚糖結(jié)構(gòu)中的這些改變均存在，否則不存在2G12反應(yīng)性。因此，ECM33和GP38以及Gasl、Gas5、YJL171c和PST1結(jié)合2G12的能力取決于酵母三突變體和AochlAmnnl雙突變體中保留的核心Man8寡糖的存在。在兔中生產(chǎn)a1,2甘露糖特異性抗血清，ELISA檢測(cè)其與gpl20交叉反應(yīng)我們從AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞中鑒定了至少六種對(duì)HIVMAb2G12顯示交叉反應(yīng)性的酵母糖蛋白PST1、ECM33、Gasl、Gas5、GP38和YJL171c。另外，通過(guò)全細(xì)胞ELISA和免疫焚光測(cè)定酵母三突變體的細(xì)胞壁能夠與2G12交叉反應(yīng)。因此，為了嘗試誘導(dǎo)與2G12類似的抗體(從而它們對(duì)a1，2連接的末端甘露糖特異)，使用全細(xì)胞、熱殺死的三突變體細(xì)胞免疫兔子。對(duì)來(lái)自第0、4、5和12周的血清樣品測(cè)試HIVEnv特異性總IgG抗體。如圖32所示，對(duì)gpl20特異的抗體水平顯示從第0周到第5周顯著提高，并隨后在第12周降低。與第0周相比，來(lái)自第5周的血清中存在顯著提高的gpl20結(jié)合(P<0.001),而第12周的結(jié)合也顯示顯著的提高(P0.05)，盡管效價(jià)較低。為進(jìn)行比較，用全細(xì)胞、熱殺死的WT細(xì)胞平行免疫兔子。得到的血清顯示從第0周到第12周不存在gpl20特異性抗體水平的顯著提高(見圖32)。通過(guò)比較來(lái)自WT和三突變體免疫的兔子的平行血樣，我們?cè)俅慰吹脚cWT相比，三突變體中g(shù)pl20特異性IgG顯著提高，特別是在第5周(PO.OOl)。所有這些p值通過(guò)Student雙尾f檢驗(yàn)計(jì)算?？傊@些結(jié)果可以代表在動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)抗體的第一個(gè)實(shí)例，所述抗體能夠與gpl20上a1，2連接的末端甘露糖殘基交叉反應(yīng)。III.酵母三突變體中被2G12識(shí)別的糖蛋白中N-連接和O-連接的糖基化位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析圖33-38顯示PST1、ECM33、GP38、YJL171c、Gasl和Gas5中潛在N-連接和O-連接的糖基化位點(diǎn)的分析。下表2顯示在酵母突變體中鑒定的2G12反應(yīng)性糖蛋白的概述。鑒定的2G12交叉反應(yīng)性糖蛋白存在若干值得注意的特征。它們均具有大量和高密度的N-連接的和/或O-連接的糖基化位點(diǎn)。其中PST1和ECM33是同一家族的成員，并具有大量和高密度的N-連接和O-連接的兩種糖基化位點(diǎn)。GP38和Y幾171c僅具有大量和高密度的N-連接的糖基化位點(diǎn)，而同一家族中的Gasl和Gas5具有大量和高密度的O-連接的糖基化位點(diǎn)和較低百分比的聚糖分子質(zhì)量(約50%,與其它四種的60%相對(duì))。表2.酵母突變體中鑒定的2G12反應(yīng)性糖蛋白概述酵母突變體中2G12交叉反應(yīng)性糖蛋白的表^<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>下表3顯示18個(gè)基因組中2G12交叉反應(yīng)性糖蛋白的同源物。使用六種2G12反應(yīng)性糖蛋白的蛋白質(zhì)序列從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的HomoloGene(同源基因)數(shù)據(jù)庫(kù)(版本50.1)中搜索同源基因。HomoloGene是用于在若干個(gè)完整測(cè)序的真核基因組的注釋基因中自動(dòng)檢測(cè)同源物的系統(tǒng)。目前，HomoloGene數(shù)據(jù)庫(kù)含有來(lái)自18個(gè)物種的165,820個(gè)HomoloGene群。通過(guò)在NCm主頁(yè)上輸入蛋白質(zhì)參照序列(RefSeq)號(hào)獲得目的HomoloGene。通過(guò)clustalw程序進(jìn)行HomoloGene的多重比對(duì)。各基因的同源物得自HomoloGene數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并列于表中。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)六個(gè)基因的光滑假絲酵母同源物，但是光滑假絲酵母的基因組未包括在HomoloGene數(shù)據(jù)庫(kù)中。表3.18個(gè)基因組中2G12反應(yīng)性糖蛋白的同源物<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>實(shí)施例4.在Ochl/Mnnl/Mnn4三突變體中生產(chǎn)和表征帶有均質(zhì)Man8型聚糖的HIV-1gpl20糖蛋白。與哺乳動(dòng)物表達(dá)體系不同，釀酒酵母中生產(chǎn)的糖蛋白上的糖僅含有構(gòu)建于核心GlcNAc2糖上的甘露糖殘基。全長(zhǎng)gpl20蛋白已經(jīng)在釀酒酵母中成功表達(dá)，盡管它們顯示被超糖基化。為了在酵母中產(chǎn)生嚴(yán)格帶有MansGlcNAc2的gpl20蛋白，必須突變糖基化途徑。三種蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)產(chǎn)生對(duì)釀酒酵母特異的N-連接的聚糖OCHlp起始超甘露糖基化必須的第一個(gè)al，6甘露糖殘基(Lehle等，F(xiàn)五5SZ^汰，370(1-2):41-5，1995)，MNNlp負(fù)責(zé)為所有a1，2殘基加上末端a1，3連接的甘露糖帽(Nakajima等，7VocJcm/5WUSA，3912-3916,1975)，而MNN4p是甘露糖基磷酸化的正調(diào)節(jié)物(Jigami等，祝oc/u附丑^/^"爿"fl，1426(2):335-45，1999)。通過(guò)缺失釀酒酵母中的這三個(gè)基因，產(chǎn)生了用于生產(chǎn)嚴(yán)格帶有Man8寡糖的gpl20的菌林。為了讓gpl20在ER中有效地糖基化并分泌到培養(yǎng)基中，我們首先將釀酒酵母a交配因子(MFa)的信號(hào)序列克隆進(jìn)pYES2/CT載體(英-脧Invitrogen)中，所述栽體含有用于在甘露糖誘導(dǎo)后高水平表達(dá)重組蛋白質(zhì)的GAL1啟動(dòng)子。然后將來(lái)自JR-FL和YU2菌抹的HIV-1gpl20基因(ARRRP)PCR克隆進(jìn)pYES2/CT-a質(zhì)粒。使用快速醋酸鋰轉(zhuǎn)化方案將得到的gpl20表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)單倍體酵母菌林AmnnlAmnn4Aochl中。如圖40的圖A中所看到的，通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證用pYULgp120或pJRFL-gp120轉(zhuǎn)化的四個(gè)獨(dú)立的AmmilAmnn4Aochl-2-5克隆含有相應(yīng)的質(zhì)粒。JRFL-gp120轉(zhuǎn)化林顯示預(yù)期的724kB的PCR產(chǎn)物大小，而YU2-gpl20轉(zhuǎn)化林顯示1697kB處的產(chǎn)物。通過(guò)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有半乳糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)含pYU2-gp120和pJRFL-gp120的這些酵母轉(zhuǎn)化林表達(dá)蛋白質(zhì)。通過(guò)Western印跡用抗gpl20-IIIB(懷羅斯塔特有限公司VirostatInc.)和抗gpl20-YU2檢測(cè)培養(yǎng)基中g(shù)pl20糖蛋白的誘導(dǎo)和分泌。發(fā)現(xiàn)AmnnlAmnn4Aochl酵母轉(zhuǎn)化才朱通過(guò)在30。C生長(zhǎng)6到9天分泌最大量的gpl加(圖39,圖B和C)。如Western印跡所示，這些gpl20蛋白移動(dòng)至假設(shè)其主要含有Man8寡糖而推定的分子量處(對(duì)JR-FL和YU-2gpl20分別為96.4kDa和99.6kDa)。除了對(duì)抗gpl20抗體具有反應(yīng)性以外，這些表達(dá)的gpl20蛋白也顯示對(duì)2G12的反應(yīng)性(圖40)。兩種AmnnlAmnn4Aochl轉(zhuǎn)化株(帶有pYUlgpl20和pJR-FL-gpl20)與未轉(zhuǎn)化的菌林平行生長(zhǎng)，向未轉(zhuǎn)化林的培養(yǎng)基中添加尿嘧咬。由于AmnnlAmnn4Aochl細(xì)胞培養(yǎng)上清液中其它2G12反應(yīng)性蛋白質(zhì)(其中一種具有~110kDa的分子量)的存在，gpl20的誘導(dǎo)在用2G12檢測(cè)時(shí)只能間接看到。未轉(zhuǎn)化的酵母顯示從3-9天起穩(wěn)定的基底表達(dá)水平，強(qiáng)烈提示~110kDa處的基底水平蛋白質(zhì)(ECM33)在該時(shí)間段中不增加。相反，兩種gpl20轉(zhuǎn)化的酵母從3-9天起均顯示110kDa蛋白質(zhì)表達(dá)顯著提高，提示2G12抗體所識(shí)別的gpl20糖蛋白的誘導(dǎo)。引述的文獻(xiàn)1.UNAIDSReportonGlobalAIDSEpidemic.2004.2.McMichaelAJ，HankeT.HIVvaccines1983-2003.NatMed.2003;9(7):874-80.3.GarberDA，SilvestriG，F(xiàn)einbergMB.ProspectsforanAIDSvaccine:threebigquestions,noeasyanswers.LancetInfectDis.2004;4(7):397-413.4.http:〃www.niaid.nih.gov/daids/vaccine5.http:〃www.iavi.org6.GaschenB，TaylorJ，YusimK，F(xiàn)oleyB，GaoF，LangD，NovitskyV，HaynesB，HahnBH，BhattacharyaT,KorberB.DiversityconsiderationsinHIV-1vaccineselection.5Wewce.2002;296(5577):2354-60.7.BurtonDR，DesrosiersRC，DomsRW，KoffWC，KwongPD,MooreJP，NabelGJ，SodroskiJ，WilsonIA,WyattRT.HIVvaccinedesignandtheneutralizingantibodyproblem.NatImmunol.2004;5(3):233國(guó)6.8.Zolla畫PaznerS.IdentifyingepitopesofHIV-1thatinduceprotectiveantibodies.NatRevImmunol.2004;4(3):199-210.9.GeijtenbeekTB，KwonDS，TorensmaR,vanVlietSJ，vanDuijnhovenGC,MiddelJ，CornelissenIL，NottetHS,KewalRamaniVN，LittmanDR，F(xiàn)igdorCG，vanKooykY.DC-SIGN，adendriticcell-specificHIV-l-bindingproteinthatenhancestrans-infectionofTcells.CW/.2000;100:587-97.10.PohlmannS,BaribaudF,LeeB,LeslieGJ,SanchezMD,Hiebenthal-MillowK，MunchJ，KirchhoffF，DomsRW.DC-SIGNinteractionswithhumanimmimodeficiencyvimstype1and2andsimianimmunodeficiencyvirus./2001;75(10):4664國(guó)72.11.PohlmannS，SoilleuxEJ，BaribaudF,LeslieGJ,MorrisLS，T層sdaleJ，LeeB，ColemanN，DomsRW.DC-SIGNR，aDC-SIGNhomologueexpressedinendothelialcells,bindstohumanandsimianimmunodeficiencyvirusesandactivatesinfectionintrans.iVwTVarf顛緣/m2001;98(5):2670-2675.12.CurtisBM，ScharnowskeS，WatsonAJ.Sequenceandexpressionofamembrane-associatedC畫typelectinthatexhibitsCD4-independentbindingofhumanimmunodeficiencyvirusenvelopeglycoproteingpl20.1992;89:8356-60.13.BashirovaAA，GeijtenbeekTB，vanDuijnhovenGC,vanVlietSJ,EileringJB，MartinMP,WuL，MartinTD，ViebigN，KnollePA，KewalRamaniVN，vanKooykY，CarringtonM.Adendriticcell-specificintercellularadhesionmolecule3-grabbingnonintegrin(DC-SIGN)-relatedproteinishighlyexpressedonhumanliversinusoidalendothelialcellsandpromotesHIV-1infection.Afed.2001;193(6):671-8.14.MitchellDA，F(xiàn)addenAJ,DrickamerK.AnovelmechanismofcarbohydraterecognitionbytheC-typelectinsDC-SIGNandDC-SIGNR.Subunitorganizationandbindingtomultivalentligands.C&附.2001;276(31):28939-45.15.FeinbergH,MitchellDA，DrickamerK,WeisWI.StructuralbasisforselectiverecognitionofoligosaccharidesbyDC-SIGNandDC誦SIGNR.2001;294(5549):2163-6.16.PohlmannS，DomsRW.EvaluationofcurrentapproachestoinhibitHIVentry.CurrDrugTargetsInfectDisord.2002;2(1):9-16.17.TrkolaA,PurtscherM，MusterT，BallaunC,BuchacherA，SullivanN，SrinivasanK，SodroskiJ，MooreJP，KatingerH.Humanmonoclonalantibody2G12definesadistinctiveneutralizationepitopeonthegpl20glycoproteinofhumanimmunodeficiencyvirustype1./1996;70(2):1100-8.18.ScanlanCN，PantophletR，WormaldMR,OllmannSaphireE，StanfieldR，WilsonIA,KatingerH,DwekRA，RuddPM,BurtonDR.Thebroadlyneutralizinganti-humanimmunodeficiencyvirustype1antibody2G12recognizesaclusterofalphal—>2mannoseresiduesontheouterfaceofgpl20./Mn/.2002;76(14):7306-21.19.SandersRW，VenturiM,SchiffnerL，KalyanaramanR，KatingerH,LloydKO，KwongPD，MooreJP.Themannose-dependentepitopeforneutralizingantibody2G12onhumanimmunodeficiencyvirustype1glycoproteingpl20./W/W.2002;76(14):7293-305.20.ShattockRJ,MooreJP.InhibitingsexualtransmissionofHIV隱linfection.N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糖，其中所述高甘露糖寡糖為Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其組合。36.權(quán)利要求35的突變真菌細(xì)胞，其中突變真菌為具有破壞了的ochl、muni和mnn4基因的酉良酒酵母。37.權(quán)利要求35的突變真菌細(xì)胞，其中突變真菌為具有破壞了的pmrl和mnnl基因的釀酒酵母。38.權(quán)利要求35的突變真菌細(xì)胞，其中突變真菌為具有破壞了的ochl和mnnl基因的釀酒酵母。39.權(quán)利要求35的突變真菌細(xì)胞，其中突變真菌為具有破壞了的ochl的巴斯德畢赤酵母。40.生產(chǎn)受試者對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求l的組合物。41.生產(chǎn)受試者對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求14的組合物。42.生產(chǎn)受試者對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求18的組合物。43.生產(chǎn)受試者對(duì)包含抗體2G12識(shí)別表位的蛋白質(zhì)特異的抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求22的組合物。44.對(duì)受試者誘導(dǎo)抗病原體的中和抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求1的組合物。45.4又利要求44的方法，其中病原體為HIV。46.對(duì)受試者誘導(dǎo)抗病原體的中和抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求14的組合物。47.權(quán)利要求46的方法，其中病原體為HIV。48.對(duì)受試者誘導(dǎo)抗病原體的中和抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求18的組合物。49.庫(kù)又利要求48的方法，其中病原體為HIV。50.對(duì)受試者誘導(dǎo)抗病原體的中和抗體的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求22的組合物。51.權(quán)利要求50的方法，其中病原體為HIV。52.對(duì)受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求1的組合物。53.岸又利要求52的方法，其中病原體為HIV。54.對(duì)受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求14的組合物。55.4又利要求54的方法，其中病原體為HIV。56.對(duì)受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求18的組合物。57.斥又利要求56的方法，其中病原體為HIV。58.對(duì)受試者預(yù)防或治療病原體誘導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求22的組合物。59.權(quán)利要求58的方法，其中病原體為HIV。60.用于鑒定與N-連接的高甘露糖寡糖特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括檢測(cè)抗體與糖基化多肽和可藥用賦形劑的結(jié)合，所述糖基化多肽含有被抗體2G12識(shí)別的至少兩個(gè)N-連接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50%的N-連接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其組合。61.^=又利要求60的方法，其中抗體存在于HIV感染受試者的血清中。62.權(quán)利要求60的方法，其中糖基化多肽存在于突變酵母細(xì)胞裂解物中。63.用于鑒定與N-連接的高甘露糖寡糖特異性結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括檢測(cè)抗體與突變真菌中產(chǎn)生的糖蛋白的結(jié)合，所述突變真菌具有石皮i不了的酉良酒酵母ochl和mnnl，或ochl、miml和mnn4基因或者石皮壞了的酉良酒酵母ochl和mnnl,或ochl、mnnl和mnn4基因的同源物基因，其中糖基化多肽被抗體2G12識(shí)別。64.權(quán)利要求63的方法，其中抗體存在于HIV感染受試者的血清中。65.組合物，包含突變酵母全細(xì)胞和可藥用的賦形劑，其中突變酵母具有破壞了的釀酒酵母pmrl和mnnl基因，ochl和mnnl基因，或ochl、mnnl和mnn4基因，或者破壞了的釀酒酵母pmrl和mnnl基因，ochl和mnnl基因，或ochl、mnnl和mnn4基因的同源物基因。全文摘要本發(fā)明提供可用于疫苗制劑的多種高甘露糖糖基化多肽。本發(fā)明還提供制備這類糖基化多肽的方法及其激發(fā)HIV中和抗體的用途。文檔編號(hào)G01N33/53GK101313216SQ200680043320公開日2008年11月26日申請(qǐng)日期2006年9月22日優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日發(fā)明者R·J·盧阿倫,峪耿申請(qǐng)人:普洛茨股份有限公司