專利名稱：反應方法
反應方法本發(fā)明涉及用于進行多步反應(例如化學或生化反應，特別是擴增 反應，例如聚合酶鏈反應)的方法，其中實現了后續(xù)步驟，例如分析物 檢測或進一步的擴增，以及涉及可以在這些方法中使用的例如試劑容器 和試劑轉移裝置的元件。有非常多的其中化學或生物化學測定或反應在多步反應中進行的 實例，也即進行第一反應，然后需要添加一種或多種另外試劑來進行第 二反應或對第 一反應的進行提供指示的意義。特別是在第 一反應之后需 要從反應容器上除去帽子或蓋子來允許添加該一種或多種另外試劑的 情況下，所述一種或多種另外試劑的引入會產生污染問題。擴增反應特別容易引入污染，這是因為需要原料試劑的量非常低。 甚至微小痕量的產物(例如前述的擴增產物)會污染，并由此成為其它 反應的"引子"。在需要反應自動進行的情況下，問題會被惡化，這是由于蓋子等的 除去通常不容易在自動裝置中實現。因此，其可能在開口反應容器中進 行，因此會保留污染的風險。最近，開發(fā)了一些封閉管測定方法。然而使用這些測定方法，需要 擴增和探針在均相系統(tǒng)中。盡管目前這是可行的，但有時會存在優(yōu)選非 均相方法的理由，特別是需要使用的探針會在或大或小程度上抑制該擴 增反應的情況下。本申請人找到了 一種進行多步反應的改進方法。依照本發(fā)明的第一方面，提供了進行多步反應的方法，所述方法包括1) 在反應容器中添加一種或多種第一試劑，所述反應容器包括能 夠容納試劑的上部腔室，該上部腔室與限制試劑流的下部腔室連通，2) 使所述反應容器承受離心力，以驅動所述一種或多種第一試劑 進入下部腔室中；3) 在該笫一腔室添加另外試劑，并關閉所述腔室；4) 使上部腔室或下部腔室其中至少之一經受使所述一種或多種第 一試劑或所述另外試劑分別參與第 一反應或達到所需反應條件的條
件；5)使所述反應容器承受離心力，以驅動所述另外試劑進入下部腔 室中，并使其與下部腔室中的內容物相互作用； 其中至少步驟(2) ~ (5)是自動進行的。通過在添加所述另外試劑后關閉反應容器，會有效消除后續(xù)外部污 染發(fā)生的可能性，例如在進行笫 一反應或達到所需反應條件時。適宜地，下部腔室包括受限進入管，例如毛細管或其它小管，在通 常的環(huán)境下試劑不會例如由于表面張力而進入該管。該管在其下端將祐二 封閉。對于物質在其中加熱或冷卻的反應，優(yōu)選該腔室具有高的表面積與 體積之比，使可以發(fā)生快速熱交換，毛細管提供了這種腔室的良好實 例。這些管能夠用于少量體積流體樣品的快速加熱或冷卻。因此在特別優(yōu)選的實施方案中，在步驟(4)中，是下部腔室經受 所需的條件。在上述步驟(3)中，合適地通過適當形狀的蓋子將反應容器關閉， 該蓋子可以與反應容器的開口以卡扣配合(snap fit),或旋入其上部空 間，以形成氣密性密封。然而，也可以使用其它關閉方法和器具，例如 使用密封膜、金屬箔或層壓的金屬膜施加在反應容器的開口上。此外， 如下所述，在某些裝置中，特別是在其中將樣品等自動遞送到反應容器 中的自動化裝置中，可以使用其它部件，例如遞送噴嘴、遞送棒(例如 通過使用磁性珠子和磁性棒實現物質的轉移)或刀具或穿刺棒，用作同 樣用于關閉該反應容器的器具。該一種或多種笫 一試劑和該另外試劑可以是只有在經受特定條件 時才會一起反應的試劑的組合，該特定條件例如加熱和/或冷卻或照射， 例如UV光照射，其可以在上述步驟(4)中施加。可選擇地，該一種 或多種第 一試劑可以用于在預備步驟中與 一種或多種已經分配到下部 腔室中的附加試劑進行反應，例如在預備離心步驟中。如果合適，任何 預分配的試劑可以在下部腔室中進行冷凍干燥。然而，所述試劑在步驟(4)的過程中不必參與反應?？赡軆H需要 確保在被混合在一起之前，該一種或多種第 一試劑或該另外試劑達到所 需的反應條件，例如達到所需的溫度，且任選地在該溫度下保持適當時 間。在這種情況下，在步驟(4)中可以將所需條件應用所需的時間間隔。該方法可廣泛應用于一定范圍的反應。例如，其可以用于在其終點處進行詢問(interrogated)的聚合酶鏈反應(PCR)。在這種情況下， 該一種或多種第一試劑或該另外試劑，但優(yōu)選該一種或多種第一試劑包 括包含或懷疑包含目標核酸(例如DNA)以及進行PCR所需的試劑， 例如引物、緩沖液、鎂鹽和聚合酶，的樣品。如果需要， 一些或所有進行PCR所需的試劑，特別是緩沖液、聚合 酶、鹽和一些穩(wěn)定劑等，可以包含在固態(tài)珠子中，將其添加到上部反應 室中，在將液體樣品添加到上部反應室中時就將其溶解或分散以釋放這 些組分。這種珠子的實例可從例如Amersham Biosciences UK購得?？蛇x擇地，這些PCR試劑可以預先分配到下部腔室中，以冷凍干燥 形式，或在如上所述的預備離心步驟中旋轉下降。在步驟4中，將PCR試劑(在該階段其優(yōu)選在下部腔室中)經受進 行PCR反應所需的熱循環(huán)步驟。這可以通過將反應容器的至少下部腔室 引入到熱循環(huán)控制裝置中來進行，所述熱循環(huán)裝置例如是通過各種方法 加熱和冷卻的支柱加熱器(solid block heater)。目前的支柱加熱器都是 通過電氣元件或熱電設備等進行加熱的。其它反應容器可以通過卣素燈 泡/湍流空氣設置進行加熱。該容器可以通過熱電設備、壓縮機制冷技 術、強制通風或冷卻流體進行冷卻。然而優(yōu)選地，下部腔室和/或上部腔室包含導電聚合物，或與其相 鄰，該導電聚合物本身可以用作電阻加熱器以實現加熱或冷卻。在WO 98/24548中描述了這種反應容器的實例。特別地，該下部腔室包括封閉的玻璃管，至少圍繞其側壁涂覆有導 電聚合物?？梢栽谙虏壳皇业纳隙撕拖露颂峁╇娊佑|，該下部腔室可以 通過控制設備(例如計算機)與供電裝置相連接，該控制設備可以經編 程以:換照進行PCR反應所需的方式順序加熱和冷卻下部腔室。上接觸用 作散熱器，確保在下部腔室中進行的加熱方案不會過度加熱任何在該過 程中儲存在上部腔室中的另外試劑。如果該另外試劑是熱敏性的，例如 其是用于產生生物發(fā)光或化學發(fā)光信號的試劑，這會是特別重要的。這種試劑的特別實例包括信號系統(tǒng)，其檢測DNA，優(yōu)選在擴增反應 后剩余的樣品中的特異性擴增的DNA。這種信號系統(tǒng)可以基于各種性 質，但特別地為產生可視信號，其為熒光、化學發(fā)光或生物發(fā)光的信號。
這種方法可以特別用于添加否則可能抑制該擴增反應的熒光探針(probe)。例如， 一些DNA結合劑或高濃度的探針，以及使用可以在 一些情況下通過對聚合酶的抑制或通過形成非常穩(wěn)定的絡合體來抑制 PCR擴增的DNA類似物(例如多肽核酸(PNA))制備的探針。如果需要，下部腔室可以經受使所述信號生效所需的一些條件，例 如溫度條件。例如，探針可能需要使反應混合物加熱，以使存在的DNA 變性，然后冷卻到一定溫度，在該溫度下探針退火為通常包含擴增序列 的目標序列。該信號系統(tǒng)優(yōu)選是可以在不開啟反應容器的情況下均勻檢測到的 信號系統(tǒng)。這種信號系統(tǒng)可以包括例如可見信號試劑，例如當和雙鏈DNA結 合時會釋放出與在溶液中游離時不同的、可區(qū)別的可見信號的DNA結 合劑。這種染料的實例是公知的，包括溴化乙錠，以及以SYBR(例如 SYBRGreen I或SYBRGold)的商品名稱銷售的試劑，或其他染料，例 如YOPRO-l。由來自該試劑的信號表明的顯著或大量DNA的存在可以 表示擴增反應已經進行。可選擇地或另外地，該信號系統(tǒng)可以包括帶有標記的探針，其特異 性結合到擴增產物上。適宜地，該標記為熒光標記，在用適當波長的光 線照射后可以4企測到，然后^r測來自該標記產生的發(fā)射。在商業(yè)中可以 得到較寬范圍的熒光標記。其實例為羅丹明染料、熒光素或花青染料。 染泮+的特別實例可以Cy5、 Cy5.5、 TAMRA、 ROX、 FAM、 HEX、 TET 和JOE購得。在特別優(yōu)選的實施方案中，該信號系統(tǒng)包含帶有熒光標記的探針和 能夠通過吸收探針發(fā)射的熒光能量或將熒光能量給與探針而與帶有熒 光標記的探針相互作用的DNA結合劑的組合。該公知的現象被稱為萸 光能量轉移(FET)或熒光諧振能量轉移(FRET)。用落入給體分子激 發(fā)光譜中的特定波長的光激發(fā)該給體分子，然后其會釋放在其熒光發(fā)射 波長范圍內的光。受體分子在給體發(fā)射波長上被激發(fā)，因此通過各種距 離依賴性能量傳遞機制接收來自給體分子的能量。熒光能量轉移檢測是 以對給體和受體發(fā)射波長變化的監(jiān)控為基礎的。在該實施方案中，添加該試劑組合作為該另外試劑，加熱和冷卻該 下部腔室以確保該熒光標記的纟果針退火為樣品中存在的標的物。DNA 結合劑插入到由探針和標的物形成的雙螺旋(duplex)之間，因此會與 熒光標記相互作用，或者通過將熒光能量提供給標記以增強其信號(由 此用作熒光給體，同時探針上的標記作為熒光受體或猝滅劑)，或者通 過猝滅來自熒光標記的熒光信號。該DNA結合劑可以是在這些條件下本身可以熒光的結合劑。然而 優(yōu)選，其是自身并不是熒光的或者在這些條件下不釋放可見光的，而僅 作為探針上的熒光標記的猝滅劑的試劑。這樣，避免了分解復雜可見信 號的需要?？梢砸栽摲绞讲僮鞯幕衔锏奶貏e實例包括蒽醌化合物，例 如式(I)的DNA結合化合物其中R1、 R2、 113和114獨立選自氫、X、 NH-ANHR和NH-A-N(O)R，R，，，其中X為羥基、鹵素、氨基、Cw烷氧基或C2-8烷酰氧基，A為C2-4亞烷基，其在NH和NHR或N(O)R，R"之間的鏈長為至少2個碳原子，R、R，和R，，各自獨立選自d-4烷基和C2-4羥基烷基和C2-4二羥基烷基，只要與氮原子相連的碳原子上沒有羥基且沒有被兩個羥基取代的碳原子即 可；或者R，和R"—起為C2—6亞烷基，其與和R，和R"相連的氮原子形成 具有3~7個原子的雜環(huán)，只要R1、 R2、 R3和W至少一個為NH-A-N(O)R，R"即可。這種DNA雙螺旋結合劑的特定實例為米托蒽醌(1,4-二羥基-5,8-雙[[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基]-9,10-蒽二酮)或其鹽，例如鹽酸鹽或 二鹽酸鹽。其它在這些條件下不釋放可見信號的DNA結合劑的實例包括諾加 霉素(211國(201,3卩,401,5卩,601,11卩,1301,1401)]-11畫[6-脫氧畫3國0曱基國2,3,4-三-0-曱基-a-L-p比喃甘露糖基)氧]陽4國(二曱氨基)國3,4,5,6,9,ll,12,13,14,16國十氫國 3,5,8,10,13-五羥基-6,13-二曱基-9,16-二氧代-2,6-環(huán)氧-2H-并四苯并[l,2-b] 氧雜環(huán)辛三烯(oxocin) -14-羧酸曱酯)或道諾霉素((8S,-順式)-8-乙酰
基-10-[3-氨基-2，3,6-三脫氧-a-L-Lyxo-六吡喃糖基)氧]-7,8,9,10 -四氫-6,8,11-三羥基-1-曱氧基-5，12-并四苯二酮)。本領域的技術人員將理解，或者使用常規(guī)方法可以確定用于探針的 DNA結合劑和熒光標記的適當組合。然而，也可以使用化學熒光或生物熒光信號系統(tǒng)。 生物熒光信號系統(tǒng)的一種特別實例包括熒光素酶/熒光素系統(tǒng)，其中 在ATP存在下熒光素酶作用于底物熒光素上產生光。然而，熒光素酶是 一種具有高度熱敏性的酶，因此其不能承受例如在PCR過程中可能產生 的溫度。通過使用本發(fā)明的方法，當在下部腔室中在升高溫度下進行反 應時，所述試劑可以保持在上部腔室中，只在方便的時候，在反應結尾 時，當下部腔室中的溫度降低到該熒光素酶保持活性的溫度水平時，才 會添加該信號系統(tǒng)。在WO 02/ 090586中描述了在PCR過程中使用生物 發(fā)光信號系統(tǒng)的特定類型的測定，其內容包括在此作為參考結合進來。產生";號通過常規(guī)的檢測設備讀取:例如i學系統(tǒng)，比如分光熒光計，或者在化學發(fā)光或生物發(fā)光信號系統(tǒng)的情況下使用的照相機。該 設備可以包括在該裝置中。在光學檢測系統(tǒng)的情況中，優(yōu)選該光學檢測 器是光密封的，以確?？梢栽跊]有來自非入射光的干擾下進行檢測。優(yōu)選地，該反應容器的設置使得可以通過容器直接讀取信號，例如 通過下部腔室的透明底部或通過容器頂部的透明蓋子或密封元件。然而 如果需要，可以通過光導纖維從反應容器中將熒光傳送出來。然而，該方法還有很多其它的應用，如果需要，在步驟(5)之后 可以在下部腔室中進行另外的反應階段。這種方法的實例是嵌套式或多 重PCR反應。在這種情況下，該另外試劑可以包括另外的PCR反應混 合物，包括不同的引物，以及如果需要的另外的緩沖液、酶等，以進行 第二PCR反應。在這種情況下，在將該另外試劑分配之后，為了實現所 需的第二PCR反應，使下部腔室經過進一步的熱循環(huán)。這對于DNA擴增的高度敏感性是有利地。在抑制劑可以存在于樣 品材料中的情況下，這是有用的。其改進了在實際應用中與嵌套式PCR 相關的重要的遺留問題。該方法也可以以各種方式與逆轉錄(RT-PCR)相關應用。例如， 該一種或多種第 一試劑可以包含進行逆轉錄酶方法所需的試劑，用于由
RNA制備cDNA。因此在步驟(2)中使其旋轉下降，然后添加作為所 述另外試劑的為擴增與所關心的RNA序列相應的cDNA所需的PCR試 劑。在步驟(4)中將包含逆轉錄酶反應混合物的下部腔室進行培育， 以制備與RNA互補的cDNA。在上述步驟(5)中使包含對該cDNA具有特異性的引物的PCR試 劑旋轉下降，然后可以通過使下部腔室經歷所需的熱循環(huán)條件進行擴增 反應。可選擇地，PCR試劑可以包含該一種或多種第一試劑，在步驟(2) 中使其旋轉下降到下部腔室中。該逆轉錄酶反應混合物是所述另外試 劑，其保持在上部腔室中。在步驟(4)中，使上部腔室進行培育，以 進行RT反應，產生cDNA。(為此，需要使用例如如上所述的導電聚 合物使上部腔室可以獨立加熱/冷卻)。然后在步驟(5)中將由此得到 的包含cDNA的混合物旋轉下降到下部腔室中。然后，可以使下部腔室 經受為進行PCR反應所需的熱循環(huán)。該方法也可以應用于防遺留問題的措施中。例如，在第一試劑為能 夠進行均質檢測反應的PCR試劑，且在步驟4中進行PCR的情況下， 所述另外試劑可以包括能夠在分析或讀取內容物之后使產物降解的試 劑。可選擇地，在使用作為所述另外試劑(如上所述)添加的單獨信號 系統(tǒng)進行檢測的情況下，可以在另外接下來的步驟中通過例如如下所述 的多隔間筒體或容器添加能夠使產物降解的試劑。然后在該反應接下來的階段中，可以刺穿該包含降解劑的隔間，將 其中的內容物旋轉下降。所述試劑可以包括能夠降解dUTP PCR產物的尿嘧啶-n-糖基化 酶，或者可選擇地合適的DNAse。后者不僅會降低遺留的風險，而且其 能夠消滅會存在于樣品中的潛在有害的標的物核酸(例如已知具有傳染 性的HBVDNA)。該方法也可以適合制備"熱啟動"擴增反應的形式。擴增反應(例 如PCR反應)依賴于以非常精確的順序并在該步驟的操作所需的精確溫 度下進行的步驟(變性、退火和延伸)的順序。當將試劑于不同溫度混 合在一起(例如在反應開始之前)，即使很短時間，也會產生問題。引 物可能與核酸模板相互作用，導致模板的引物延伸。這會導致所需產物 總產率的降低，以及非特異性產物的產生。之前提出了各種克服這一問題的各種措施，被稱為"熱啟動"反應。 通過使用依照本發(fā)明的方法，可以保持一種或多種進行擴增反應所 需的試劑，例如鎂離子、聚合酶或引物，作為所述另外試劑。然后可以 只在下部腔室中的條件適于進行適當的擴增(例如將其加熱到超過小DNA分子聯合的溫度)時，將該試劑分配。該反應容器的上部或下部腔室中的任何加熱或冷卻都是合適自動 化的，例如通過使用計算機控制輸送到熱循環(huán)器中的電流。適宜地，該 計算機經過編程以保證實現所需的溫度步驟順序。該一種或多種第一試劑和/或該另外試劑可以在步驟(1)和(3)中 分別通過任何簡便的方法分配到反應容器中。例如，可以通過常規(guī)的注 射技術將試劑分配到上部腔室中，優(yōu)選使用適當的分配裝置自動進行?？蛇x擇地，該一種或多種第 一試劑和/或該另外試劑可以放在易石爭容 器(例如筒體)中，該易碎容器設置在通向下部腔室的開口之上的上部 腔室中。這些可以例如在試劑腔室的上和/或下表面上具有可刺穿的壁，例如 金屬或層壓金屬膜表面。然后在適當的階段可以通過破壞腔室壁(例如 通過使刺穿棒或針刺穿可刺穿的壁)使試劑釋放通過腔室的底部，從而 將內容物釋放出來。該刺穿棒或針可以提供在容器的蓋子上，其適宜地形成試劑腔室的 上表面，并可以通過在適當時候在蓋子上施加壓力引入?？蛇x擇地，其 可以設置在用于進行反應的機器上，在適當的時候自動應用，特別在該 上壁本身是可刺穿的情況中。密封筒或容器的上表面可以包括例如膜，例如塑料膜，并在其中結 合有適當的刺穿棒或針。在該實施方案中，容器的上表面本身可以構成 容器的蓋子?？蛇x擇地，提供單獨的蓋子，可以要求所述棒在到達容器 的上表面之前刺穿該蓋子，以使污染風險最小化。特別的容器是具有多于一個隔間的筒狀形式。這些隔間可以分別包 含該一種或多種第一試劑和/或該另外試劑。然而，其也可以帶來以下可 能性額外的試劑可以在該方法過程中的適當時候同時或順序自動添加 到上部腔室中，并且如果需要則旋轉向下，導致出現可以進行任何數量 的其它反應步驟的可能性，和/或不能儲存在一起的試劑在到達反應腔室 時才混合的可能性。
這種筒體將進一步使污染風險最小化，因為它們確保試劑暴露于該 氣氛中的時間不會比需要的更長。這些隔間可以相互相鄰i殳置，例如圓形或4侖形i殳置，或者其可以詔: 置在彼此的頂部。在任一情況中，提供一個或多個適合的棒，使得這些 隔間可以在該方法過程中4要需石皮壞。該容器可以在其上部區(qū)域具有可使容器自動移動到反應容器中的 位置的器具。這種器具的實例可以包括一種或多種環(huán)狀法蘭，其排列以 與實施該方法的裝置上適當的抓取器具相互作用。通過使用這種試劑容器，可以僅通過以適當順序和適當時間遞送適 當試劑，順序進行上述反應的組合，例如嵌套式PCR、 RT-PCR、非均 勻才企測、防遺留和/或熱啟動PCR。這種容器形成了本發(fā)明的另 一方面。因此依照本發(fā)明的另 一方面， 提供了用于存儲試劑的易碎容器，所述容器中具有試劑腔室，在該試劑 腔室的下表面具有至少一個可刺穿的壁，其中其上表面包括另一可刺穿 的壁或包含刺穿器具的蓋子，其設置使得刺穿所述可刺穿的壁會導致試 劑從腔室中釋放出來。該反應容器可以適宜地安裝在可以以離心運動旋轉的平臺等上。該 反應容器適宜地以樞軸式安裝在平臺上，使得在離心過程中，其能夠轉 動以使下部腔室位于外離心路徑上。這可以例如通過一個或多個位于該 容器外表面上的心軸實現，其可以可移動地安裝在位于平臺上的插座 中。其也可以在各階段之間自動移動。例如，其可以適合將反應容器移 動到用于加工步驟的熱循環(huán)器具中。在該優(yōu)選的實施方案中，在該反應 容器具有由導電聚合物構成的加熱器具的情況下，使用自動移動裝備將 其從離心機移動到電源中適當的插座中，從而可以與反應容器上的電接 觸接觸。可選擇地，電接觸可以原位制成。用于進行該方法的自動器具的提供意味著樣品手動操作量最小 化，使該方法得以有效進行，并進一步降低特別是來自操作者DNA的 污染風險。在共同未決中的國際專利申請公開號WO2005019836中提出了用 于上述方法的特別適合的反應容器和裝置，其內容全部引入此處作為參 考。此處所述的裝置能夠進行樣品的非常復雜的多步加工。該裝置包括(i) 平臺，包括(a) 適用于接收樣品的腔室；和(b) 功能部件；(ii) 能夠升高和降低的臂狀物，其包含用于與該功能部件可去除 性連接的器具，使得用該臂狀物可以升高和降低所述部件；以及(iii) 用于移動該平臺的器具，使得任何腔室或功能元件可以相 對于該臂狀物對準。該裝置具有廣泛的應用，可以適合廣泛的使用。該術語"功能部件" 限定為經設計使其可以可逆連接到該裝置的臂狀物上的裝置元件。從此 處的公開中明顯可以看到，該功能部件可以設計以具有廣泛的用途。根 據該裝置的特別應用，本領域的技術人員可以容易地確定該一個或多個 功能部件的特別應用。例如，該功能部件可以包含用于和流體樣品相互 作用的器具。這種器具可以為樣品提供一些物理處理，例如加熱、冷卻、 光學處理、超聲處理等?？蛇x擇地，該功能部件可以包含用于和該腔室 本身相互作用的器具，例如通過用作刀具以刺穿箔密封、封閉腔室、引 入填料等。此外，該功能部件可以用作用于將樣品或包含在其中的分析 物移動到裝置的另 一腔室中的收集器。因此在對本發(fā)明的方法的描述中，該功能部件可以包括用于將可以 在裝置中的其它地方經過預處理的樣品遞送到反應容器中，該反應容器 在這種情況下等同于"適用于接收樣品的腔室"。可選擇地，該功能容 器可以包括用于釋放包含在筒體或如上所述的易碎容器中的試劑的刀 具或刺穿棒。然而在特別的實施方案中，該平臺基本是圓形的，通過旋轉而運 動。這使得該平臺可以相對于臂狀物或其它物理器具對準腔室或功能部 件。當該裝置包括數種不同部件時，這也具有使裝置的尺寸最小化的優(yōu) 點。任選地該平臺可以配有傳感機構，用于當平臺在位于平臺上方的臂 狀物或其它物理處理器具下運動時對功能部件或腔室進行準確定位。然 而，在本方法的內容中，另一個優(yōu)點在于使得保持在平臺上的反應容器 可以4艮容易離心運動。在另一種特別實施方案中，該裝置的設計使得整個平臺可以取下并 容易替換。這使得在任何給定的樣品處理程序之后，可以將用過的且潛 在污染的平臺取下并替換掉，使該裝置可以應用于又一程序中。如果該 裝置如此設計，則優(yōu)選該平臺可以例如釆用配備簡易鎖的扭轉接頭容易 并安全地安裝到裝置中。在本發(fā)明的方法中使用的試劑的自動處理可以通過使用試劑轉移 設備進一步增強。申請人進一步開發(fā)了用于化學和生物化學測定中處理 試劑的方法，以及用于這些方法中的設備。在進行化學或生物化學測定過程中，通常存在將少量固態(tài)試劑從一 個容器轉移到另 一個中的需要。越來越多地，如同在本發(fā)明的方法和例如WO2005019836中所述的 裝置中的需要，這些測定都是使用自動方法和程序進行的，因此需要能 夠獲取并轉移一定量的試劑的自動設備。可以以固態(tài)形式獲取的試劑的特別實例為進行擴增反應(特別是聚 合酶鏈反應或PCR)所需的試劑?？梢缘玫接糜贒NA擴增的有市售的 PCR即用型珠子，例如Amersham Biosciences UK銷售的那些。它們包含進行標準PCR所需的所有組分，包括緩沖劑、鹽和聚合 酶，以冷凍干燥或其它固態(tài)形式。因此其提供了為終端用戶提供穩(wěn)定的 "homebrew"消費品的便利手段。它們將受益于具有長保存期的方便儲 存形式的大規(guī)模生產和可重復生產配方。然而，與可以使用吸液管或移液管在加樣孔之間容易轉移的濕態(tài)試劑不同，珠子需要鑷子將其從一個消費品轉移到另一個中。這可能很難有效實現，特別是在自動設備中。申請人開發(fā)了 一種有效操作固體試劑的有效方法。 因此在另一方面，本發(fā)明提供了用于將固體試劑從第一容器或第一位置轉移到第二容器或第二位置的方法，所述方法包括(i) 將包含帶靜電荷材料的棒置于第一容器或第一位置中的所述固 體試劑附近，所述棒能夠靜電吸引并保持所述固體試劑在其表面，以提 取一定量的所述固體試劑，(ii) 移動該棒和/或該第一或第二容器，使該棒位于第二容器或第 二位置的附近；(iii) 從所述棒上去除該固體試劑，使其放入第二容器或第二位置中。在本發(fā)明的第一方面，該第二容器或位置包括反應容器的上部腔 室。然而，該方法可以更廣泛地用于一般性的試劑轉移。該方法特別有用，因為其可以有效傳遞固體試劑，此外，其特別適用于自動化，可以用于廣泛的測定設備中。此處所用的術語"固體試劑"是指一種或多種固態(tài)的試劑或化學物質。例如，其可以包括粉末、晶體、顆?；蛑樽印Ｌ貏e地，其包括試劑的組合，其以珠子形式結合在一起，例如如上所述的PCR即用型珠子。 在試劑通常存在以液體形式存在的情況中，例如以水溶液的形式，可以 通過常規(guī)的方法，例如冷凍干燥或噴霧干燥法制備適合的固體形式。如 果需要，該珠子或顆粒可以進一步包含常規(guī)的試劑，例如填料、分散劑、 表面活性劑等，以保證該顆粒或珠子在添加到液體(例如水)中時可以 溶解或分散。該帶靜電材料的本性可以根據正轉移的固體試劑的本性而變化。通 常，該材料包括為絕緣體或非導體或者具有可忽略不計的導電性的介電 材料。該材料應該是一種通常攜帶或能夠保持一定時期靜電荷的材料。 所述材料的特別實例為聚合物或塑料，例如聚苯乙烯或乳膠。此外，可以通過預先摩擦步驟在該棒上增加或產生足夠電荷，其中 通過用絕緣體(例如為材料或織物)機械摩擦該棒一次或多次以產生或 增加靜電荷。適合的材料包括合成織物，例如尼龍或聚酯織物。其適宜地是自動進行的，優(yōu)選在自動測定設備中適當設置的操作臺上。在此所用的術語"棒"是指任何適合可以在反應容器等之間引入和 移動的結構。通常其形狀可以是細長的，例如桿形管狀結構，但是其側 面可以傾斜以形成注射器狀或圓錐狀輪廓。其本性上可以是實心或中空的。在該棒是中空的情況下，其能夠容 納另外的元件，例如磁體。在這種情況中，將磁體引入棒可以使其同樣 用于收集磁性固體，例如磁性珠，例如磁性氧化硅珠，其任選地攜帶另 外的試劑，例如結合試劑，例如抗體，或其結合片斷。這種收集可以在 與固體試劑的靜電回收相同的操作中進行，但優(yōu)選作為單獨的操作進 行。整個棒可以由介電或可帶靜電的材料制成，或者其可以包含復合 物，只要用于吸引固體顆粒的區(qū)域(特別是下表面或下部區(qū)域)包含介 電或可帶靜電的材料即可。
適宜地，棒的至少一部分外表面的輪廓可使試劑容納在該輪廓中。 例如，表面可以具有陷窩或凹槽，其具有適于容納固體試劑(例如擴增試劑珠子，例如PCR珠子)的尺寸。這些凹槽或陷窩的尺寸取決于即將使用該棒移動的固體試劑(例如擴增反應或PCR珠子)的尺寸。然而通常，任何陷窩可以為0.5~2mm 的直徑和深度，類似地，凹槽可以為0.5 2mm寬度和深度。 任何輪廓都適宜地位于該棒的下表面上。具有適當輪廓的棒可以是新穎的，其形成了本發(fā)明的另 一 方面。 在上述步驟(ii)中實現的運動可以以任何適合特定的測定及所用 的測定設備的方式進行。在收集該固體試劑之后，可以將該棒手動從一 個位置移動到另一位置，但是該操作合適地自動進行。這可以包括例如 棒垂直向上運動，例如將其從第一容器中完全取出，然后水平運動使其 對準第二容器，然后如果需要，則向下運動，使得容納固體試劑的棒的 端部區(qū)域位于第二容器中?？蛇x擇地，在通過例如棒的向上運動將棒從 第一容器中取出之后，可以移動該容器本身，使得第二容器位于棒的下 面。然后如果需要，只是將棒降低使其進入第二容器中。適合的傳送器具是本領域公知的，可以包括傳送帶、或者傳送盤等。適合的容器可以是任何反應容器，包括單獨的反應容器和在板和其 它中的反應加樣孔，如果需要，該傳送器具將適合使其運動。適宜地，在步驟(iii)中從棒中將固體試劑去除是機械進行的。特 別地，將棒浸漬到液體中，該溶液具有將固體從棒中清除的作用。適宜 地，該液體是在測定的下一階段中所需的溶劑或溶液。例如，在該固體 試劑包含PCR珠子的情況中，可以通過將棒浸漬到再懸浮緩沖液(即 DNA/RNA抽提物等)中將其分配，以從棒上除去珠子。優(yōu)選該棒在使用后可任意處理。棒的上端可以成型或使其適合安裝到自動測定設備上的所需的配 件或者附件中。因此在本說明書中，用于本發(fā)明的方法的棒可以包括如上所述的國 際專利申請公開號WO2005019836中設備的特定功能部件。特別地，其 可以包括一種適于提取PCR即用型珠子并將其移動到用于自動PCR工 藝的反應容器中的部件。
在WO2005019836的i殳備的優(yōu)選實施方案中，該功能部件包括護 套，該護套在用于吸引磁性試劑珠的磁體和珠子本身之間提供了界面， 該不茲性試劑珠可以在上面固定有分析物或反應物。優(yōu)選地，該護套位于 平臺上，由當磁體位于護套中時該復合體可以被護套吸引的材料制成。 在這種實施方案中，優(yōu)選該裝置包括與裝置的臂狀物在一起的磁體，其 可以降低到護套中施加磁場，提升到護套外部以除去該磁場。然后將該 護套放入裝置中包含磁性試劑珠的腔室中。將磁體降低到護套中，該磁 性試劑珠與護套結合在一起。然后提起該護套和磁體，移動平臺，使得 對準新的腔室，然后降低護套和磁體，移開磁體。當移開磁體時，磁性 試劑珠將從護套中落下進入第二腔室中。通過臂狀物使護套進行輕微的 上下運動，確保沒有磁性試劑珠仍與護罩相結合，也用于將磁性試劑珠 與新腔室中的試劑或溶液相混合?？蛇x擇地，可以通過任何適當的方式 將分析物從珠子中洗提出來。磁體和臂狀物的設計使其在不影響彼此操作的情況下彼此相互作 用，使得無論磁體是否就位，該護套都可以單獨提升和降低。在特定的實施方案中，如果依照本發(fā)明該護套形成為棒狀，其也可 以如此處所述用于通過靜電轉移固體試劑。特別適用于執(zhí)行如上所述的試劑轉移方法的設備構成了本發(fā)明的 另 一方面。因此特別地，本發(fā)明進一步提供裝置，其包括含如上所述的可帶靜 電材料的棒，以及用于將所述棒從第一容器轉移到第二容器中的器具。現在將參照附圖通過實施例的方式對本發(fā)明進行特別描述，其中圖l是描述依照本發(fā)明的方法的示意圖；圖2示出了可以用于該方法的裝置的透視圖；圖3示出了圖2中的裝置從側面的橫剖面；圖4示出了用于圖2和3中裝置的平臺的頂視圖；圖5示出了功能部件，此處為刀具，的操作剖面圖，刺穿位于該裝 置的腔室上的層壓膜；圖6示出了此處為刀具的功能部件與臂狀物的叉件之間連接的詳細 情況的視圖；圖7示出了具有用于從樣品腔中取出結合的分析物的磁體的此處為 護套的功能部件操作的橫截面視圖8示出了用于加熱該裝置其中一個腔室中的一定體積溶液的此處為用于加熱器具的物理處理器具的橫截面視圖；圖9示出了具有用于將結合的分析物釋放進入反應容器中的磁體的 此處為護套的功能部件的橫截面視圖；

圖10示出了此處在用于密封反應容器的位置具有此處為刀具的功 能部件的反應腔室的橫截面視圖；圖11示出了用于本發(fā)明的方法的容器的一種可替代形式，其可以 進行多個操作，其中(A)描述了具有就位的試劑容器的反應容器的示 意圖，(B)為通過(A)的容器的橫截面，(C)為該容器的示意性側 視圖；圖12示出了可用于本發(fā)明的方法的容器；圖13示出了該容器的一種可替代形式；和圖14示出了可用于試劑轉移方法的棒的側視圖；圖15示出了圖14中棒的底視圖；和圖16示意性地描述了試劑轉移方法。圖1示意性描述了本發(fā)明的方法的操作。該方法是在反應容器68 中進行的，該反應容器68包括具有開口或可開啟的口 686的上部腔室 685，該上述腔室685通向包含玻璃毛細管680的下部腔室。在該特別 實施方案中，毛細管680的側面涂覆有導電性聚合物681和電接觸，在 管680的下端包括接觸683。第二接觸(682)位于上部腔室(685 )的 底部周圍(圖1B)。在第一步中，將第一組試劑(例如PCR反應混合物)分配到反應容 器的上部腔室685中。表面張力會阻止這些試劑進入毛細管680。然而， 反應容器68通過心軸72樞軸式安裝在平臺或園盤傳動裝置上，如曲線 箭頭所示經過離心步驟。這驅動PCR反應混合物進入毛細管中，如圖1 (c)所示。這里，將一種或多種另外試劑(圖1 (D))分配到上部腔室685 中。表面張力再一次使其不能進入毛細管680中。然而，它們被允許保 留在上部腔室685中。使用蓋子687關閉容器68 (圖1E)。此后，處理該反應容器，使在管680中發(fā)生反應，例如PCR反應。 在該特別實施方案中，通過接觸682、 683使適當的電流通過聚合物 681，使毛細管680中的試劑進行熱循環(huán)。在該階段所述另外試劑不能
參與該反應。此外，接觸682作為吸熱裝置，使其與在管680中進行的熱循環(huán)相隔離。然而一旦該反應完成，可以通過進行笫二離心步驟在不取下蓋子 687的情況下添加所述另外試劑。圖2描述了特別適用于進行本發(fā)明的方法的裝置1的透視圖。該裝 置包括通過轉鎖4固定就位的平臺2。該平臺包括多個腔室和功能部件 (在圖4中也示出了 )。該平臺通過步進電機6和傳動帶(未示出)驅 動。使用分度傳感器(未示出)也通過監(jiān)控步進電機6的運動，來監(jiān)控 平臺的位置。臂狀物IO位于平臺2之上，其包括用于可移動地和平臺2上的功 能部件(未詳細示出)相連接的叉件12。示出了該臂狀物IO在升高的 位置，將容器68保持在平臺2之上。該裝置還包括直接位于臂狀物12 的叉件之上的磁體14。示出了該磁體14處于升高的位置。該裝置還包括多個使樣品(例如生物樣品)可以進行預處理以從中 提取DNA的設備和器具。這些包括也位于平臺2之上且示出在升高位 置的加熱器具16,和同樣位于平臺2之上且示出在升高位置的用于對樣 品進行超聲處理的器具18。臂狀物IO和磁體14的線性運動通過與傳動 帶22連接的電機20驅動并通過線性致動器24控制。同樣地，加熱器 具16和用于對樣品進行超聲處理的器具18的線性運動通過與傳動帶22 連接的電機20驅動并通過線性致動器26和28分別控制。該裝置還包 括控制板30和電源32。圖3示出了圖2中裝置的橫剖面。示出的部件與圖2中相同，除了 在該視圖中看不到線性致動器以外。該視圖另外描述了用于轉動平臺的 與電機6連接的傳動帶40和用于感應平臺位置的傳感器42。圖4示出了設計用于在核酸擴增之前處理流體樣品的裝置的平臺2 的頂視圖。該平臺使用轉鎖機構4安裝在該裝置上。該平臺包括兩個功 能部件刀具50和護套52。各功能部件都在各自一側包括凸部54,使 該功能部件可以與該裝置的臂狀物(未示出)相互作用。該凸部的定向 使得隨著平坦轉動，臂狀物的叉狀部分能夠在功能部件的凸部之下滑 動。該裝置還包括數個腔室56、 58、 60、 62、 64和66。這些腔室或反 應容器中的每個都具有與生物樣品(例如尿樣品)的處理以從中提取 DNA使其可以進行擴增反應有關的不同任務。腔室56、 58、 60、 64和 66的橫截面為橢圓性，在腔室的底部560、 580、 600和640各自包含圓 形井狀凹口。腔室62的橫截面為圓形。任何或所有腔室都可以在使用 前用金屬層壓膜覆蓋，以保持試劑清潔。該裝置進一步包括反應容器68,其是適用于進行本發(fā)明的方法的反 應容器。該容器具有上部腔室685,其橫截面是圓形的，其逐漸變窄到 下部腔室，該下部腔室包括在容器底部的以680所示的毛細管。反應容 器68進一步包括使該腔室與裝置的臂狀物(未示出)相互作用的凸部 70。反應容器68具有心軸72，其樞軸式安裝在平臺2上的插座74中。 反應容器68還覆蓋有金屬層壓膜。適宜地，如上關于圖1中所述，該毛細管680涂覆有金屬導電聚合 物681 (參見圖8),并且就在管680的頂端之上具有上部電接觸682, 在管680的底端上具有置于外部的下部電接觸683。腔室60和62共同安裝在單一容器76中。該容器76可以從平臺上 拆卸下來。該平臺還包括切口部分78。下面參照以上附圖和另外的附圖5~ IO對該裝置和平臺用于處理流 體樣品并然后根據本發(fā)明的方法進行核酸擴增反應的應用進行描述。根據選擇的測定，選擇包含樣品腔室60的容器76。在腔室62中預 先添加用于該測定所需的數種試劑。將包含DNA分析物的流體樣品收 集并置于樣品腔室60中。該樣品腔室中可以預先加入可以溶解樣品的 離液鹽(例如鹽酸胍、脲或碘化鈉)。然后將磁性結合珠100添加到樣 品中，關閉樣品容器的蓋子。將該包含樣品腔室60、樣品和試劑腔室62 的容器76裝在平臺2上。然后將平臺2設置在裝置1中，使用轉鎖4 鎖定就位。將臂狀物10降低，平臺2旋轉，使得叉件12嚙合在刀具50 的凸部52之下。然后將臂狀物12升高，然后旋轉平臺2，使腔室56位 于刀具50之下。降低臂狀物，刀具50刺穿覆蓋腔室56的層壓金屬膜 (未示出)。重復操作使得該刀具50連續(xù)刺穿覆蓋腔室58、 60、 62、 64和66以及反應容器68的膜。圖5示出了此處為刺穿位于該裝置的腔室(例如56)頂部的層壓膜 (未示出)的刀具50的功能部件的操作的橫截面圖。該腔室56與平臺 2相結合。該附圖描述了用于和臂狀物的叉件(未示出)相嚙合的功能 部件52的凸部。圖6示出了描述此處為刀具50的功能部件與臂狀物10的叉件12
之間連接的詳細情況的視圖。該臂狀物10的叉件12與位于凸部52之 下的刀具相嚙合。一旦將該裝置的所有層壓膜全部刺穿，則通過旋轉平臺2、降低臂 狀物10以及將平臺旋轉到相反方向使得該臂狀物的叉件12和刀具的凸 部52脫離開，從而將該刀具50返回到在平臺2上的最初位置。然后旋轉平臺，使得樣品腔室60位于用于為樣品進行超聲處理的 器具18之下。用于為樣品進行超聲處理的器具18下降到樣品麟室60 中，開始對樣品進行超聲處理。這提供用于溶解任何存在于樣品中的孢 子以釋放任意DNA的物理溶解步驟。同時，離液試劑比如鹽酸胍液起 到促進DNA與磁性結合材料相結合以形成絡合體的作用。當完成超聲 后，從樣品腔室60中取出用于為樣品進行超聲處理的器具18。在儲存 之前，首先將該用于對樣品進行超聲處理的器具18在兩個洗滌腔室(腔 室56和58)中洗滌。這些腔室中預先加入適合的緩沖液，例如50%的 含水乙醇溶液80。將該用于對樣品進行超聲處理的器具18從樣品腔室 60中提升，旋轉平臺2使緩沖液腔室56位于用于為樣品進行超聲處理 的器具18之下，該用于為樣品進行超聲處理的器具下降到緩沖液腔室 56中，短暫活化并提升。對腔室58重復該操作。在第二次洗滌之后， 將用于為樣品進行超聲處理的器具18提升并儲存。然后使臂狀物10降低，旋轉平臺2，使得12嚙合到護套54的凸部 52之下。然后提起臂狀物IO，由此將護套54提升到平臺2之上。然后 旋轉平臺2使得樣品腔室60直接位于護套54之下。降低臂狀物10，由 此將護套54降低到樣品腔室60中。然后將磁體14降低到護套54中， 將結合DNA的磁性珠100吸引到護套54上。然后提升臂狀物10，由此 將護套54提升到樣品腔室60以外。磁體14和臂狀物10同時被提升， 使其保留在護套54內部。圖7示出了具有用于從樣品腔室60中取出附著的分析物的磁體14 的此處為護套54的功能部件的操作的橫截面視圖。該腔室60連接到平 臺2上。通過臂狀物(未示出)將護套降低到包含在樣品腔室60中的 樣品102中。將磁體14插入護套54中，將絡合有DNA的磁性珠100 吸引到護套54上。然后可以清洗結合到磁性珠100上的DNA,例如在緩沖液(例如乙 醇緩沖液，例如50%的乙醇緩沖液)中清洗兩遍。旋轉平臺2，使包含適當緩沖溶液的第一緩沖液腔室64直接位于吸引有磁性珠100的護套 54之下。將臂狀物10降低，由此將護套54降低到緩沖液腔室64之下。 但是并不降低磁體14。這意味著珠子100不再吸引在護套54上，而是 降低并落入緩沖溶液中?？焖偬嵘徒档捅蹱钗?0,由此護套54的小 規(guī)模垂直運動確保所有珠子100都從護套54上脫落，并與緩沖溶液得 到良好地混合。然后將護套54降低到第一緩沖腔室64中，將磁體14 下降到護套54中，仍結合有DNA的磁性珠100再次附著到護套54上。 在第二緩沖液腔室66中，在包含50%含水乙醇溶液的第二緩沖液中重 復該過程，洗滌珠子100。在第二緩沖液腔室66中對結合有DNA的磁 性珠100進行清洗之后，提升臂狀物10，由此提升護套54,將磁性珠 100保留在緩沖液腔室66中。然而該護套54并不返回到平臺2上，而 是保持與臂狀物IO相連接。現在旋轉平臺，使反應容器68直接位于用于加熱的器具16之下。 該反應容器68包括含毛細管680的下部區(qū)域90和上部區(qū)域92。通過完 整的層壓膜94將下部區(qū)域90與上部區(qū)域92分隔開。上部區(qū)域包括少 量體積，約10(Hd的水96。用于加熱的器具16降低到反應容器68的上 部區(qū)域92中，啟動將水96加熱到約90。C的溫度。 一旦水96凈皮加熱， 升高用于加熱的器具16,將其從反應容器68中取出。然后將用于加熱 的器具16儲存到裝置1上供以后使用。圖8示出了用于加熱包含在裝置1的反應容器68中的上部腔室的 上部部分中的一定體積溶液96的此處為用于加熱的器具16的物理處理 器具的橫截面視圖。反應腔室連接到平臺2上。用于加熱的器具加熱保 存在反應容器68的上部部分92中的水96。反應容器68的上部部分92 和下部部分90通過完整膜94分隔開。再次旋轉平臺，使包含仍結合有DNA的磁性珠100的第二緩沖液 腔室66直接位于護套54之下。降低臂狀物10,由此將護套54降低到 第二緩沖液腔室66中。再次將磁體14降低進入護套，并再次將珠子100 吸引到護套54上。同時提升護套54和磁體14,旋轉平臺，使反應容器 68直接位于護套54之下。降低臂狀物10,以將護套54降低到反應容 器68的上部部分92中。如前，不降低磁體14以使珠子100不再吸引 在護套54上。珠子IOO被釋放到反應容器68的上部區(qū)域92中。如前， 輕微提升和降低臂狀物10和護套54，保證所有珠子都從護套54上釋
放。然后通過溫水96將DNA從珠子100上洗提下來。提升臂狀物10 使護套54從反應容器68中取出。圖9示出了具有用于將結合的分析物100釋放進入反應容器68中 的磁體14的此處為護套54的功能部件的操作的橫截面視圖。磁性珠100 被釋放進入反應容器68的上部部分92中，在此處加熱的水96將DNA 從磁性珠100中洗提出來。再次旋轉平臺，使預先在其中加入用于核酸擴增反應所必需的試劑 的試劑腔室62直接位于護套54之下。降低臂狀物10，由此將護套54 降低到試劑腔室62中。試劑(未示出)預先按照配方制成，使得它們 也結合到磁珠(未示出)上。 一旦護套54在試劑腔室62中就位，將磁 體14降低到護套54中，附著有試劑的磁性珠被吸引到護套54上。將 護套54和磁體14共同提升，以將試劑(未示出)從試劑腔室62中取 出。然后旋轉平臺2，使反應容器68直接位于護套54之下。然后降低 臂狀物10,由此將護套54降低到反應腔室92的上部部分。再次不降低 磁體14,使結合有試劑的磁性珠從護套54釋放到反應容器68的上部區(qū) 域92中。用溫水96將試劑從磁性珠上洗提下來。在完成洗提后，再次 降低臂狀物10,使護套54就位。將磁體14降低到護套54中，將反應 容器68的上部部分92中的所有磁性珠(即來自分析物和用于試劑的那 些)吸引到護套54上。同時提起護套54和磁體14,以取出珠子，旋轉 平臺2。然后將珠子作為廢物沉積到一個用過的緩沖液腔室中。在將珠 子從護套54上釋放后，再次通過臂狀物10的移動和平臺2的旋轉，將 護套返回到其在平臺2上的最初位置。現在反應容器68的上部部分92包括純化的核酸樣品和用于擴增反 應所需的所有試劑?，F在該臂狀物10用于提取刀具50。再次旋轉平臺2 使反應容器68直接位于刀具50之下。降低該臂狀物10,由此將刀具50 降低到反應容器68中。刀具50刺穿膜94，將包含DNA和試劑的水96 滴入反應容器68的下部部分90中。不使用臂狀物取出刀具50,而是將 刀具保留在反應容器68中，在此其作為用于密封反應容器68的塞子。圖9示出了反應容器68的橫截面視圖，此處具有就位以密封反應 容器68的功能部件，在此為刀具50。刀具50還用于刺穿分隔反應容器 68中上部腔室的上部部分92和下部部分90的膜94,使包含DNA分析 物和用于核擴增反應的試劑的水96可以進入毛細管680中。刀具5(H呆
持就位以密封反應容器68,使得在擴增反應期間溶劑不能從腔室中蒸 發(fā)?？蛇x擇地，可以在反應容器68上使用蓋子或其它關閉件。
為了驅動包含DNA和該試劑的水96進入反應容器68的毛細管680 中，將平臺2高速旋轉。離心力驅動流體96進入毛細管680中。由于 在旋轉過程中，使用安裝在插座74中的心軸72，反應容器68能夠以平 臺為軸轉動，所以可以對其進行輔助。此外為了防止在該高速旋轉過程 中包含在腔室56、 58、 60、 64和66中的液體溢出，這些腔室的i殳計具 有橢圓形橫截面，并在底部具有環(huán)形凹口，如圖3所示。這種內部設計 防止任何溢出。
在包含DNA和核擴增的水96進入毛細管680之后，樣品準備好發(fā) 生核酸擴增反應。然而在這一階段，將一種或多種另外試劑添加到反應 容器68的部分90中。這可以通過首先使用臂狀物IO提升刀具50,然 后引入該一種或多種另外試劑來實現。其可以進一步包含進行嵌套式 PCR反應所需的PCR試劑，或在信號系統(tǒng)中所需的試劑。
這里，可以用特別用于該目的的蓋子將反應容器68蓋上，或者如 上所述通過引入密封刀具50。
在該階段，可以手動從裝置1中取出反應容器68,用于進行核酸擴 增反應的另一裝置中。然而在這種情況下，使單一裝置適用于另外進行 核酸擴增及其光學檢測。這些操作是在裝置1的下半部分(未示出)中 進行的。
為使該過程完全自動化，反應容器68具有凸部98,使其能夠使用 與其它功能部件50和54 —樣的方式通過裝置臂狀物10操作。
降低臂狀物10，旋轉平臺2,使反應容器68的凸部98與臂狀物10 的叉件12相嚙合。然后提升臂狀物10,由此提升反應容器68。在圖1 和2中示出了提升的反應容器68。然后旋轉平臺，使切口部分78對準 在提升的反應容器68下面。然后降低臂狀物，由此降低反應容器通過 該切口部分78進入裝置1的下部。
當位于裝置1的下部時，4吏用用于加熱和冷卻毛細管680中的反應 混合物的熱循環(huán)裝置和用于檢測最終產物的光學檢測器，進行核酸擴增 反應。通過用可4吏毛細管680快速加熱和冷卻的導電性聚合物681涂覆 毛細管680輔助該反應。特別地，該反應容器68可以方文入可控電源的 插座中，4吏接觸682和683和聚合物681形成電路。對電路的電力控制
會使聚合物681加熱或冷卻，實現快速熱循環(huán)。
一旦該反應完成，可以將反應容器68返回到平臺2上，以進行第 二離心步驟，優(yōu)選使用臂狀物10。這會驅動所述一種或多種另外試劑進 入毛細管680。然后可以使反應容器經過進一步處理，以適合添加的特 定另外試劑。例如，其可以通過重復前述過程經過另一個熱循環(huán)，或者 將其處理使得信號系統(tǒng)被顯示和/或檢測。
為了檢測，毛細管的封閉下表面684優(yōu)選是透明的，使得可以使用 適當的檢測設備(例如分光熒光計)通過其觀察到可見信號。這可以通 過各種措施實現，包括例如通過臂狀物10將反應容器68轉移到分光熒 光計設備中。然而最優(yōu)選地，當反應容器68位于用于熱循環(huán)過程中的 可控電源的插座中時，安排該分光熒光計從反應容器68中讀取信號。
在完成該操作后，將包含刀具50、護套54和腔室56、 58、 60、 62、 64和66和反應容器68的平臺2全部從裝置中取出并處理掉。然后將包 含所需元件的新平臺引入裝置中，使其可以再次用于另一個樣品處理。
圖IIA描述了將反應容器(150)置于反應容器(68)的上部腔室 (685 )中的設置。該容器(150)在其上表面154具有塑料蓋子，在其 下表面(152)具有箔膜片。容器的側壁是可壓縮的。該容器被分隔成 環(huán)狀設置的各個隔間(153)(圖11B)。各隔間包含不同的試劑。
蓋子(154)(圖11C)具有多個穿刺針(156)，其設置用于刺穿 容器(150)各隔間(153)的下部(152)箔表面。當在蓋子154上施 加壓力時，例如在如上所述方法的步驟(3)中，所有針156刺穿下表 面(152),將試劑釋放到上部腔室(685 )中。
然而如果需要，可以單獨或按順序刺穿各個隔間，例如通過移動與 該裝置相連的刺穿棒或刀具，使其在需要的時候單獨對準所需的隔間。
圖12中示出了這種容器的變體形式。在該情況中，容器(160)具 有由上箔膜和下箔膜(151, 152)限定的單一腔室，包含液體試劑(161)。 其還在其上部區(qū)域具有一對環(huán)形法蘭(162， 163),在其之間限定了用 于抓取臂(未示出)的成型件(164)。
因此可以將該容器自動引入反應容器(68)中，或者實際引入任何 其它所需的反應容器中。通過蓋子上的刺穿針、或者單獨的刺穿棒，刺 穿蕩151、 152,會將腔室161的內容物釋放出來。
因此該容器可以用于如上所述方法，或者用于釋放試劑，例如將其
釋放到上部腔室(685 )中，然后將其從附近除去。可選擇地，在例如 用包含刺穿針的蓋子將其蓋上的情況下，可以將其原位保留在上部腔室 (685 )中，在此其用作封口元^f牛。
圖13中示出了可替代的多隔間容器。在該情況中，容器(170)包 含三種試劑(171、 172、 173),其中第三種包含磁性珠(174),該三 種試劑都位于由上箔膜(151)和下箔膜(152)限定的單獨隔間中。
使用棒(175)刺穿膜(151 )和(152)會使試劑171、 172和174 順序混合在一起。磁性珠的添加使可以進行磁性免疫分離方法。
圖14示出了可用于例如將試劑(例如PCR即用型珠子)轉移到容 器686中(例如在預備步驟中)的棒。 一旦位于容器中，該珠子會溶解， 通過例如添加樣品來進行。可選擇地，該珠子可以被轉移到不同的容器 中，用于初步溶解，然后使用例如吸移管系統(tǒng)轉移最終溶液。
在圖14中示出的棒具有帶靜電或可帶靜電的材料(例如聚苯乙烯 或乳膠)的長桿(r)。其具有頭部結構(2，)，所述頭部結構使其可 以連接在用于自動將其從一個位置移動到另一個位置的設備上。
桿(1)的下表面(3，)具有凹槽(4，)(圖15)，試劑珠可以容 納在其中。
在使用中(圖16 ),將該棒通過頭部(2，)放在自動測定設備(未 示出)上。桿(1，)的至少下部帶靜電，例如通過用絕緣材料摩擦。然 后將其放在容納試劑珠(6，)的第一容器(5，)上方(圖16A)。將該 棒降低到容器(5，)中，直至珠子(6，)被吸引到帶電表面(3，)上為 止，在此將其置于在凹槽(4，)中(圖16B)。
可以將該棒和附著的珠子(6，) 一起從第一容器(5，)中提升出來 (圖16C)。然后將第二容器(7，)放在該棒下面。笫二容器包含溶劑 或溶液(8，)。降低該棒會使表面(3，)浸沒到溶液中，于是珠子會分 配到溶液中(圖16D)。
權利要求
1. 一種進行多步反應的方法，所述方法包括1) 在反應容器中添加一種或多種第一試劑，所述反應容器包括能 夠容納試劑的上部腔室，該上部腔室與限制試劑流動的下部腔室連通，2) 使所述反應容器承受離心力，以驅動所述一種或多種第一試劑 進入下部腔室中；3) 在該第一腔室中添加另外試劑，并關閉所述腔室；4) 使上部腔室或下部腔室中至少之一經受使所述一種或多種第一 試劑或所述另外試劑分別參與第 一反應或達到所需反應條件的條件；5) 使所述反應容器承受離心力，以驅動所述另外試劑進入下部腔 室中，并4吏其可以與下部腔室中的內容物相互作用；其中至少步驟(2) ~ (5)是自動進行的。
2. 依照權利要求1的方法，其中所述反應容器的所述下部腔室是毛細管。
3. 依照權利要求1或2的方法，其中在權利要求1中，使下部腔室 經受使所述一種或多種第 一試劑參與第 一反應或達到所需反應條件的條件。
4. 依照權利要求1 ~3中任一項的方法，其中在步驟(3)中通過適 當形狀的蓋子關閉反應容器。
5. 依照前述權利要求中任一項的方法，其中所述一種或多種第一試 劑包括PCR反應混合物，以及在步驟(4)中，使所述試劑經受熱循環(huán)。
6. 依照權利要求4的方法，其中熱循環(huán)是通過使電流通過導電聚合 物來實現的，所述導電聚合物構成上部腔室或者下部腔室或與上部腔室 或下部腔室相鄰。
7. 依照權利要求5或6的方法，其中所述另外試劑包括進行第二 PCR反應所需的 一種或多種另外試劑。
8. 依照權利要求5或6的方法，其中所述另外試劑包括用于檢測擴 增核酸的信號系統(tǒng)。
9. 依照權利要求8的方法，其中該信號系統(tǒng)包括在擴增DNA的存 在下產生熒光、化學發(fā)光或生物發(fā)光信號的試劑。
10. 依照權利要求9的方法，其中該信號系統(tǒng)可以在不打開反應容 器的情況下檢測到。
11. 依照權利要求9或10的方法，其中該信號系統(tǒng)包括熒光標記探 針和DNA結合劑的組合，所述熒光標記探針與如果DNA已經在PCR 反應過程中被擴增則會在該DNA中發(fā)現的序列特異性結合，所述DNA 結合劑能夠通過吸收由該探針發(fā)出的熒光能量或通過為探針提供熒光 能量而與該熒光標記探針相互作用。
12. 依照權利要求11的方法，其中該DNA結合劑是與DNA結合 時不會釋放熒光的結合劑。
13. 依照權利要求1 ~4中任一項的方法，其中該一種或多種第一試 劑或另外試劑包括進行標的物逆轉錄酶方法所需的試劑，所述一種或多 種第一試劑或另外試劑中的另 一則包括可由所述標的物逆轉錄酶方法 得到的cDNA擴增所需的PCR試劑。
14. 依照權利要求5的方法，其中另外試劑是能夠降解該擴增反應 產物的試劑。
15. 依照權利要求1-4中任一項的方法，其中所述一種或多種第一 試劑包括用于進行擴增反應所需的一些試劑，以及其中所述另外試劑包 括所述擴增反應必需的、不包含在所述一種或多種第 一試劑中的試劑， 以及其中，在步驟(4)中，將所述一種或多種第一試劑達到便于發(fā)生 適當擴增的溫度條件。
16. 依照前述權利要求中任一項的方法，其中在添加之前，將該一 種或多種第 一試劑和/或該另外試劑提供在位于開向下部腔室的開口之 上的上部腔室內部的筒體或易碎容器中。
17. 依照權利要求16的方法，其中通過打破所述筒體或易碎容器， 將該一種或多種第 一試劑和/或該另外試劑添加到反應容器中。
18. 依照權利要求17的方法，其中使用刺棒或刀具打破所述筒體或 易碎容器。
19. 依照前述權利要求中任一的方法，其中，在步驟1)中，該一 種或多種第一試劑是固體試劑，使用包括如下的方法將其轉移到反應容 器中(i) 將棒置于在第一容器或第一位置中的所述固體試劑附近，所述 棒包括帶靜電的材料，所述棒能夠靜電吸引并保持所述固體試劑在其表 面上，以提取一定量的所述固體試劑，(ii) 移動該棒和/或該第一容器或反應容器，使該棒位于反應容器的附近；(iii)從所述棒上去除該固體試劑，使其放入第二容器或第二位置中。
20. 用于儲存試劑的易碎容器，所述容器在其中具有試劑腔室，該 試劑腔室在其下表面具有至少一個可刺穿的壁，其中上表面包括另一可 刺穿的壁或包括刺穿器具的蓋子，其經設置使得所述可刺穿的壁的刺穿 會導致試劑從該腔室中釋放出來。
21. 依照權利要求20的容器，其中該可刺穿的壁是金屬或層壓金屬 膜表面。
22. 依照權利要求20或21的容器，其中該試劑腔室具有多于一個隔間。
23. 依照權利要求22的容器，其中該隔間彼此相鄰設置。
24. 依照權利要求22的容器，其中該隔間設置在彼此的頂部。
25. 依照權利要求20~24中任一項的容器，其進一步包括用于使該 容器自動移動到反應容器內的位置的器具。
26. 依照權利要求25的容器，其中所述器具包括一個或多個環(huán)狀法
27. —種將固體試劑從第 一容器或第 一位置轉移到第二容器或第二 位置的方法，所述方法包括(i) 將棒置于在第一容器或第一位置中的所述固體試劑附近，所述 棒包括帶靜電的材料，所述棒能夠靜電吸引并保持所述固體試劑在其表 面上，以提取一定量的所述固體試劑，(ii) 移動該棒和/或該第一容器或第二容器，使該棒位于第二容器 或者位置附近；(in)從所述棒去除該固體試劑，使其放入第二容器或第二位置中。
28. 依照權利要求27的方法，其是自動進行的。
29. 依照權利要求27或28的方法，其中該固體試劑是經過冷凍或 噴霧干燥的試劑的聚集物。
30. 依照權利要求29的方法，其中該固體試劑是包含用于進行核酸 擴增反應所需的一種或多種試劑的珠子。
31. 依照權利要求30的方法，其中該擴增反應是聚合酶鏈反應。
32. 依照權利要求27-31中任一項的方法，其中該棒的帶靜電材料 是聚苯乙烯或乳膠。
33. 依照權利要求27- 32中任一項的方法，其中在預備步驟中，通 過用絕緣體摩擦該棒，在該棒上產生或增加電荷。
34. 依照權利要求33的方法，其中該絕緣體是合成織物。
35. 依照權利要求33或34的方法，其中該摩擦步驟是自動進行的。
36. 依照權利要求27~35中任一項的方法，其中該棒是中空的。
37. 依照權利要求36的方法，其中提供磁鐵，其可以容納在該棒中。
38. 依照權利要求27 37中任一項的方法，其中該棒的至少一部分 外表面的輪廓可使試劑容納在該輪廓內。
39. 依照權利要求38的方法，其中該輪廓包括一個或多個陷窩或凹槽。
40. 依照權利要求38或39的方法，其中該棒的下表面是輪廓化的。
41. 依照權利要求27 40中任一項的方法，其中在步驟(iii)中， 將該棒浸沒在液體中，以從該棒上去除任何固體試劑。
42. 依照權利要求42的方法，其中該固體試劑是包含適用于進行 PCR的試劑的珠子，該液體是再懸浮緩沖液或DNA/RNA提取物。
43. 依照權利要求27 42中任一項的方法，其中該棒在使用后可任 意處理。
44. 一種裝置，包括包含可帶靜電的介電材料的棒，以及用于將所 述棒從第 一容器轉移到笫二容器中的器具。
45. 依照權利要求44的裝置，其包括(iv) 平臺，其包括(c) 適用于接收樣品的腔室；和(d) 功能部件；(v) 能夠升高和降低的臂狀物，其包括用于與該功能部件可去除 性連接的器具，使得所述部件可以用該臂狀物升高和降低；以及(vi) 用于移動該平臺的器具，使得任何腔室或功能部件可以相對 于該臂狀物對準，其中所述功能部件是該棒。
46. —種棒，其包含可帶靜電的介電材料，其經輪廓化以將固體試 劑通過靜電容納在其外表面上的凹槽或陷窩中。
全文摘要
一種進行多步反應的方法，所述方法包括1)在反應容器中添加一種或多種第一試劑，所述反應容器包括能夠容納試劑的上部腔室，該上部腔室與限制試劑流動的下部腔室連通；2)為所述反應容器施加離心力，以驅動所述一種或多種第一試劑進入下部腔室中；3)在該第一腔室中添加另外試劑，并關閉所述腔室；4)使上部腔室或下部腔室其中至少之一經受使所述一種或多種第一試劑或所述另外試劑參與第一反應或達到所需的反應條件的條件；5)為所述反應容器施加離心力，以驅動所述另外試劑進入下部腔室中，并使其可以與下部腔室中的內容物相互作用；其中至少步驟(2)～(5)是自動進行的。該方法可使在不打開容器的情況下在該容器中進行多步反應。其特別適用于和PCR反應結合使用。
文檔編號G01N35/00GK101147070SQ200680009786
公開日2008年3月19日 申請日期2006年1月26日 優(yōu)先權日2005年1月26日
發(fā)明者D·J·斯奎勒爾, M·A·李 申請人:恩尼格馬診斷有限公司