專利名稱：多種微量試樣的注入和轉(zhuǎn)移方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多種的微量液體試樣同時(shí)并行地向容器的注入、和轉(zhuǎn)移方 法。特別地，本發(fā)明涉及在進(jìn)化工程、制藥、食品、生物風(fēng)險(xiǎn)、臨床檢驗(yàn) 機(jī)構(gòu)、化合物質(zhì)毒性檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)等中，在使多種微量液體試樣反應(yīng)時(shí)所必需 的、可以同時(shí)并行地進(jìn)行試樣的分取的方法。
背景技術(shù)：
將多種(例如1000種以上)、微量(例如亞鈉升)試樣涂布或結(jié)合
在板上來(lái)并行、同時(shí)地進(jìn)行相同處理的微型板已得到實(shí)用。另一方面，人
們也開發(fā)出了將各種試樣結(jié)合到各自的小珠上進(jìn)行操作的方式(on-beads 法)
但是，目前的方式中，需要用于將試樣涂布到板上的特別裝置(微型 描繪器(Micro-plotter)或微型分注器(Micro-dispenser))，其操作既費(fèi) 事又費(fèi)時(shí)間。另外，如此涂布的試樣在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，通常僅在一定的反應(yīng) 條件下是可能的，即使轉(zhuǎn)移至不同的反應(yīng)條件，所有的試樣也都置于相同 的反應(yīng)的條件下，從而無(wú)法對(duì)超過(guò)1000種的多種試樣進(jìn)行不同階段的反 應(yīng)，或?qū)⑦@些所有試樣分別置于不同的反應(yīng)條件下。另一方面，也有使用 小珠，在其中結(jié)合各自的試樣進(jìn)行操作的方式，但目前沒(méi)有將這些小珠一 個(gè)一個(gè)地分開(空間分離)來(lái)進(jìn)行操作。其理由是進(jìn)行單獨(dú)分離的操作需 要開發(fā)特別的裝置，而且即使使用這些裝置，分離、配置時(shí)也很繁瑣，且 尚未公開后續(xù)處理較容易的方式(即，同時(shí)并行、快速地轉(zhuǎn)移試樣的方 式)。此外，制作超過(guò)1000種的不同的反應(yīng)條件的簡(jiǎn)便的方式也尚未想 到。
一方面，人們已知了在具有多個(gè)(multi)微孔的基板(plate)上，可 以同時(shí)進(jìn)行例如PCR之類的生物化學(xué)反應(yīng)(日本專利文獻(xiàn)特開平5 — 317030號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)O )。然后，還進(jìn)行了為使微孔的容量更小，
并且能順利進(jìn)行反應(yīng)的改良(WO2002/025289 (專利文獻(xiàn)2))。但是， 使用目前的多孔板的方法或裝置時(shí)，雖然其他種類的試樣也同時(shí)進(jìn)行反 應(yīng)，但各反應(yīng)的條件相同，不能對(duì)每一個(gè)孔的反應(yīng)條件進(jìn)行單獨(dú)地控制。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
然而，很多時(shí)候想要對(duì)于相同的試樣，在反應(yīng)液的組成不同的條件下 進(jìn)行反應(yīng)來(lái)研究其結(jié)果。但是，這種情況下，需要在各容器(孔)中單獨(dú) 地調(diào)整反應(yīng)液的組成，但當(dāng)其數(shù)目超過(guò)1000時(shí)，這種調(diào)整是不現(xiàn)實(shí)的， 實(shí)際上實(shí)施幾乎不可能。通常采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法來(lái)代替，按照各條件的代表 性的設(shè)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，再演繹出結(jié)果。
這是由于存在如下問(wèn)題的緣故，即向超過(guò)1000的容器(孔)中填 充反應(yīng)液太復(fù)雜，另外，在該情況下需要改變組成。
因此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種即使對(duì)于超過(guò)1000的容器 (孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形狀和表面狀態(tài)不允許溶液向容器 (孔)內(nèi)的流入，也可以簡(jiǎn)單地填充反應(yīng)液等溶液的方法。
進(jìn)而，本發(fā)明的第二目的在于提供一種即使對(duì)于超過(guò)1000的容器 (孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形狀和表面狀態(tài)不允許溶液向容器 (孔)內(nèi)的流入，也可以簡(jiǎn)單地填充反應(yīng)液等溶液，并且在該情況下也可 以容易地改變組成的方法。
特別地，本發(fā)明的目的在于提供一種即使容器(孔)的容量微小，也 可以進(jìn)行上述操作的方法。 解決課題的手段
解決上述課題的本發(fā)明如下所述。 一種向由在至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板的 孔內(nèi)注入溶液的方法，其中，
上述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)上述孔的開口處于 向上的狀態(tài)，靜置多孔板時(shí)，即使上述孔的開口被上述溶液覆蓋，也不能
將溶液注入到孔內(nèi)，
在上述多孔板的具有上述孔的主表面上放置溶液，施加從孔的開口朝 向底部的離心力將上述溶液注入到上述孔內(nèi)。如[1]所述的方法，上述離心力為10Xg以上。如[l]所述的方法，上述孔的開口的最大內(nèi)徑為5mm以下。如[3]所述的方法，上述離心力為20Xg以上。如[1]所述的方法，上述孔的開口的最大內(nèi)徑為lmm以下。如[5]所述的方法，上述離心力為100Xg以上。如[1] [6]的任一項(xiàng)中所述的方法，上述孔的內(nèi)部容量為lOiU以下。如[1] [6]的任一項(xiàng)中所述的方法，上述孔的內(nèi)部容量為lul以下。如[1] [8]的任一項(xiàng)中所述的方法，上述多孔板具有1000個(gè)以上的孔。如[1] [9]的任一項(xiàng)中所述的方法，在上述主表面上放置具有多個(gè) 開口的濾膜，進(jìn)而在該濾膜上放置溶液，施加從孔的開口到底部方向的離 心力，將上述溶液通過(guò)上述濾膜的開口注入到上述孔內(nèi)。如[10]所述的方法，是將溶液通過(guò)上述濾膜注入到上述多個(gè)孔的 一部分孔內(nèi)。 —種從由在至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板 (2)的至少一部分的孔，將該孔內(nèi)容納的溶液的至少一部分轉(zhuǎn)移至由在 至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板(1)的孔內(nèi)的方法， 其中，
上述多孔板(2)的孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)上 述孔的開口處于向下的狀態(tài)，靜置多孔板(2)時(shí)，上述孔內(nèi)的溶液不會(huì) 從孔中流出，
將上述多孔板(1)和多孔板(2)進(jìn)行固定以使得兩塊板具有的至少 一部分孔彼此相對(duì)，施加從上述多孔板(1)的開口朝向底部的離心力， 將上述多孔板(2)的孔內(nèi)的溶液注入到上述多孔板(1)的孔內(nèi)。[13]如[12]所述的方法，上述多孔板(1)具有如下的尺寸、形狀和表
面狀態(tài)，即當(dāng)上述孔的開口處于向上的狀態(tài)，靜置多孔板(1)時(shí)，即 使上述孔的開口被上述溶液覆蓋，也不能將溶液注入到孔內(nèi)。如[12]或[13]所述的方法，將具有多個(gè)開口的濾膜放置在上述多孔 板(1)和多孔板(2)之間，施加從上述多孔板(1)的開口朝向底部的 離心力，通過(guò)上述濾膜的開口進(jìn)行上述溶液的轉(zhuǎn)移。如[14]所述的方法，將溶液通過(guò)上述濾膜轉(zhuǎn)移到上述多個(gè)孔的一 部分孔內(nèi)。如[12] [15]的任一項(xiàng)中所述的方法，上述多孔板(1)的孔和多 孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、以及排列是相同的。如[12] [15]的任一項(xiàng)中所述的方法，上述多孔板(1)的孔和多 孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、容量以及排列的至少一部分是不同 的。如[12] [17]的任一項(xiàng)中所述的方法，上述離心力為100Xg以上。
發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，可以進(jìn)行迄今實(shí)現(xiàn)不了的極微量多種試樣的同時(shí)并行操 作(注入、、_y7° (Mess up)、轉(zhuǎn)移、多層、分割、計(jì)量等)。


圖l是本發(fā)明的方法(第一方式)的說(shuō)明圖2是本發(fā)明的方法中使用濾膜的例的概略圖3是本發(fā)明的方法(第二方式)的說(shuō)明圖4是本發(fā)明的方法(第二方式)的說(shuō)明圖5是MMV制作原理的說(shuō)明圖6是MMV制作方法說(shuō)明圖7是MMV制作方法說(shuō)明圖8是MMV的1個(gè)孔的說(shuō)明圖9是使用MMV的培養(yǎng)狀況的說(shuō)明圖10是使用MMV的培養(yǎng)結(jié)果(上為由熒光強(qiáng)度測(cè)定裝置得到的圖 片，下為照片)；
圖11是由熒光強(qiáng)度測(cè)定裝置得到的復(fù)制品制作的情況的圖(左為原
始，右為復(fù)制(replica);
圖12是多種溶液的逐次轉(zhuǎn)移的說(shuō)明圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的第一方式是向多孔板的孔內(nèi)注入溶液的方法，所述多孔板由 在至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成。
本發(fā)明的方法中使用的多孔板(以下有時(shí)也稱為MMV (Multi Micro Vessel)(多重并行微小容器))是由在至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的 基板構(gòu)成的。多個(gè)孔可以設(shè)在主表面上，也可以僅設(shè)在任何一個(gè)主表面 上。對(duì)設(shè)在多孔板的一個(gè)主表面上的孔的數(shù)目沒(méi)有特別的限定，但可以為 例如每平方英寸(2.5X2.5cm2) 1000個(gè)以上，處于1000 100,000的范圍 內(nèi)?？椎臄?shù)目可以根據(jù)使用多孔板的目的進(jìn)行適當(dāng)決定。
對(duì)孔的內(nèi)部容量沒(méi)有特別限定，可以參考基板的大小、孔的數(shù)目、反 應(yīng)(溶液的容量)等，進(jìn)行適當(dāng)決定。例如，孔的內(nèi)部容量可以為10ul 以下，也可以為liU以下。對(duì)基板的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如可以由塑 料、硅、凝膠等構(gòu)成。
上述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，§卩當(dāng)上述孔的開口處于
向上的狀態(tài)，靜置多孔板時(shí)，即使孔的開口被應(yīng)填充進(jìn)孔的溶液所覆蓋， 也不能將溶液注入到孔內(nèi)。即，當(dāng)孔的開口具有某種程度的大小時(shí)，如果 在設(shè)有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，則溶液會(huì)自然地流入孔內(nèi)， 進(jìn)行填充。但是，如果孔的開口的尺寸在一定值以下，由于表面張力，溶 液不會(huì)自然地流入孔內(nèi)，需要使用微型注射器等來(lái)注入。這種現(xiàn)象的出現(xiàn) 不僅是由于孔的開口的尺寸，還由于孔的開口的形狀以及孔的開口和孔內(nèi) 的表面狀態(tài)(特別是距開口較近部分的表面狀態(tài))。進(jìn)而，根據(jù)欲注入孔 內(nèi)的溶液(液體)的物理性質(zhì)的不同，也會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象。本發(fā)明的方法
是針對(duì)這種多孔板將溶液注入到孔內(nèi)的方法，如上所述，所述多孔板即使 在設(shè)有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，溶液也不會(huì)自然地流入孔 內(nèi)。
即使在設(shè)有孔的主表面上放置一定量以上的溶液，溶液也不會(huì)自然地 流入孔內(nèi)的孔，取決于孔的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，但例如當(dāng)孔的開口的
最大內(nèi)徑為5mm以下時(shí)，溶液幾乎都自然地流入孔內(nèi)。當(dāng)孔的開口的最 大內(nèi)徑為3mm以下時(shí)，溶液通常不會(huì)自然地流入孔內(nèi)。當(dāng)孔的開口的最 大內(nèi)徑為lmm以下時(shí)，溶液不會(huì)自然地流入孔內(nèi)，此時(shí)本發(fā)明的方法的 效果得到最佳發(fā)揮。
對(duì)孔的開口的形狀沒(méi)有特別限定，但可以列舉出例如圓形、方形(正 方形、長(zhǎng)方形)、菱形、多邊形(例如六邊形、八邊形等)等。進(jìn)而，孔 的開口可以是具有突出的尖端(唇形)的形狀，或者相反也可以對(duì)其進(jìn)行 了倒角的形狀。
對(duì)于孔的深度，可以參考孔的開口的尺寸和孔內(nèi)填充溶液的容量，進(jìn) 行適當(dāng)決定。 一般地，孔的深度相對(duì)于孔的開口尺寸的比例越大，溶液越 難以填充到孔內(nèi)，當(dāng)孔的深度相對(duì)于孔的開口的尺寸的比例為1以上時(shí)， 本發(fā)明的方法特別有效，當(dāng)孔的深度相對(duì)于孔的開口的尺寸的比例為2以 上時(shí)，也能產(chǎn)生有效的功能?？椎纳疃认鄬?duì)于孔的開口的尺寸的比例例如 可以是1 10的范圍，優(yōu)選為2 8的范圍，更優(yōu)選為2.5 5的范圍。但 是，孔的深度最終要考慮到孔內(nèi)填充溶液的容量和孔的開口的尺寸進(jìn)行適 當(dāng)決定，本發(fā)明的方法即使孔的深度相對(duì)于孔的開口的尺寸的比例超過(guò) 10，也能沒(méi)有問(wèn)題地發(fā)揮功能，即，可以進(jìn)行溶液的填充。另外，根據(jù)本 發(fā)明，也可以適用于孔為無(wú)底的類型(即，管狀)，此時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)為適 當(dāng)?shù)臈l件(例如，離心力)，可以將溶液注入到孔(管)的中部，或者也 可以通到另一側(cè)。
對(duì)于構(gòu)成多孔板的基板的厚度，可以參考上述孔的深度、和多孔板要 求的強(qiáng)度、特別是孔的底部要求的強(qiáng)度，進(jìn)行適當(dāng)決定。通常，基板的厚 度與上述孔的深度為同等程度以上時(shí)較合適?？椎恼娓髅娴?條邊有時(shí) 可能未經(jīng)精加工地切制而成，有時(shí)也可能具有設(shè)計(jì)成一定高度的邊緣的凸
起。
在本發(fā)明的方法中，在具有上述多孔板的孔的主表面上放置溶液，然 后施加從孔的開口到底部方向的離心力，將溶液注入孔內(nèi)。對(duì)于離心力， 可以考慮到孔開口的尺寸等、溶液向孔內(nèi)流入的困難程度，進(jìn)行適當(dāng)決
定，例如可以為10Xg以上。例如，當(dāng)孔的開口的最大內(nèi)徑為5mm以下 時(shí)，離心力優(yōu)選為20Xg以上。進(jìn)而，當(dāng)孔的開口的最大內(nèi)徑為lmm以 下時(shí)，離心力優(yōu)選為100Xg以上，更優(yōu)選為100 2000Xg的范圍。但 是，也可以根據(jù)孔的形狀或容量等，施加更高的離心力。
參照?qǐng)D1進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的方法。圖1是在離心管內(nèi)設(shè)置MMV的 說(shuō)明圖。由于所使用的離心管的底部不是平面(是球面)，因此為使 MMV的設(shè)置面水平而向離心管內(nèi)填充瓊脂糖凝膠(瓊脂糖凝膠的表面呈 水平狀)。但是，不必一定要是瓊脂糖凝膠，也可以使用其他的材料，另 外，也可以準(zhǔn)備并使用底部為平面的離心管。在離心管內(nèi)的瓊脂糖凝膠的 上面載置MMV，然后加入向MMV的孔內(nèi)填充的試樣溶液(圖的左 側(cè))。圖中，使用大腸桿菌溶液作為試樣溶液。然后，將該離心管安裝到 離心分離機(jī)上，采用規(guī)定的離心力進(jìn)行離心。通過(guò)離心，試樣溶液被注入 進(jìn)孔內(nèi)(圖的右側(cè))。
在通過(guò)離心而注入溶液時(shí)，如果能滿足施加離心力、MMV設(shè)置面是 平坦的、MMV的上方浸滿試樣溶液等條件，也可以使用除離心管以外的 工具。例如，首先在底部為平面的容器中放置MMV，然后向其上方加入 試樣溶液，通過(guò)手動(dòng)旋轉(zhuǎn)容器來(lái)給予離心力，也可以將溶液注入MMV的 孔內(nèi)。
本發(fā)明的方法中，將具有多個(gè)開口的濾膜置于多孔板的主表面上，進(jìn) 而在該濾膜上放置溶液，施加從孔的開口到底部方向的離心力，也可以將 上述溶液通過(guò)上述濾膜的開口，注入到上述孔內(nèi)。使用濾膜可以僅將溶液 注入到一部分孔中。濾膜的開口的圖案可以根據(jù)用途進(jìn)行適當(dāng)選擇。濾膜 的例子如圖2所示。
圖2示出了濾膜1 10。黑色圓點(diǎn)是溶液通過(guò)部分的開口。另外，在 圖的右下方表示組合使用該濾膜的多孔板。黑色圓點(diǎn)是孔，在縱和橫向的
列中分別設(shè)計(jì)了32個(gè)孔，合計(jì)有1024個(gè)孔。
濾膜l是每隔l行，設(shè)計(jì)l行開口 (l行32個(gè))，合計(jì)16行。 濾膜2是每隔2行，設(shè)計(jì)2行開口 (l行32個(gè))，合計(jì)16行。 濾膜3是每隔3行，設(shè)計(jì)3行開口 (l行32個(gè))，合計(jì)16行。 濾膜4是每隔4行，設(shè)計(jì)4行開口 (l行32個(gè))，合計(jì)16行。 濾膜5 8是將濾膜1 4的縱向和橫向(行和列)交替的濾膜。 濾膜9和IO是在一半的表面上設(shè)計(jì)16行或16列的開口 (1行或1列 32個(gè))，合計(jì)16行或16列。
通過(guò)使用上述濾膜，且改變注入溶液的種類進(jìn)行多次溶液注入，可以 控制孔內(nèi)的溶液組成。如圖2所示，依次使用10張濾膜，每張濾膜向 MMV內(nèi)注入不同組成的溶液。具體地說(shuō)，在MMV上裝載濾膜1采用本 發(fā)明的離心法同時(shí)注入溶液。由此溶液進(jìn)入的孔和無(wú)溶液進(jìn)入的孔取決于 濾膜1的圖案。依次從濾膜2到濾膜IO進(jìn)行該操作。這樣一來(lái)，對(duì)每1個(gè) 孔注入不同的溶液、或不注入溶液的這種選擇共有10次。換句話說(shuō)通過(guò) 該操作可以填充2"種組成不同的溶液?！熠啵?024孔中可以填充21()二 1024種組成不同的溶液。
如圖2的右下方所示，從具有1024個(gè)孔的MMV的左上方的孔開始， 標(biāo)記成孔0 孔1023。依此進(jìn)行整理。通過(guò)IO張濾膜實(shí)現(xiàn)1024種溶液環(huán) 境時(shí)，如將每1個(gè)孔的溶液狀態(tài)用10個(gè)數(shù)位(通過(guò)各濾膜的溶液注入成 為遍。10張即為10個(gè)數(shù)位)的二進(jìn)制法(對(duì)于1張濾膜，有溶液進(jìn)入時(shí) 為1，無(wú)溶液進(jìn)入時(shí)為O)來(lái)表示，則孔O的溶液狀態(tài)為
。另 外，孑L 1023為[llllllllll]。如上所述，本發(fā)明的方法中，使用濾膜可以 自由且容易地(花費(fèi)的功夫少)調(diào)整填充至孔內(nèi)的組成。
本發(fā)明的方法中，對(duì)于孔內(nèi)填充的溶液沒(méi)有特定的限定，但可以列舉 出在進(jìn)化工程、制藥、食品、生物風(fēng)險(xiǎn)、臨床檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、化合物質(zhì)毒性檢 驗(yàn)機(jī)構(gòu)等中，進(jìn)行多種的微量液體試樣反應(yīng)時(shí)使用的反應(yīng)液或培養(yǎng)液。例 如，在鑒定微生物的種類時(shí)進(jìn)行的營(yíng)養(yǎng)需求試驗(yàn)(氨基酸、糖、維生素或 無(wú)機(jī)離子等)或某種生物種類的基因變異試驗(yàn)(即，考察新的營(yíng)養(yǎng)需求性 或環(huán)境耐受性)的時(shí)候，并行處理多種條件的研究將變得容易。特別是，對(duì)于基因的種類，分別缺乏1種成分時(shí)癥狀輕，但同時(shí)缺乏2種以上的成 分時(shí)，有時(shí)會(huì)受到發(fā)育阻礙(可以看到滲出變異體等。存在補(bǔ)充代謝系時(shí) 可以看到這種現(xiàn)象。)。這時(shí)在探尋哪種成分的組合是其原因時(shí)運(yùn)用本方 法，由于可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)數(shù)量龐大的種類的組合，因此很有效。即使僅涉及 2種成分，但存在數(shù)量的問(wèn)題時(shí)，也可以同樣如此。例如，對(duì)于某種酶活
性，Mg+十和^111++具有替代性，假設(shè)其濃度分別在O.lmM到1M的范圍 內(nèi)(假設(shè)有30種條件O.lmM、 0.2mM、 0.3mM……)進(jìn)行各種變化，即 使僅僅進(jìn)行組合也有數(shù)量龐大(900種條件)的種類。對(duì)此大致可以一次 進(jìn)行。
本發(fā)明的第二方式是如下的一種方法，即從由在至少一個(gè)主表面上
具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板(2)的至少一部分孔，將該孔內(nèi)容納的 溶液的至少一部分轉(zhuǎn)移至由在至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的 多孔板(1)的孔內(nèi)。
本發(fā)明的第二方式中，使用了兩塊多孔板，將一個(gè)多孔板(2)的孔 內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)多孔板(1)的孔內(nèi)。這時(shí)，多孔板(2)的孔具有
如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)孔的開口處于向下的狀態(tài)，靜置多
孔板(2)時(shí)，孔內(nèi)的溶液不會(huì)從孔中流出。對(duì)于除此之外的方面，多孔 板(2)可以與上述第一方式中說(shuō)明的多孔板相同。另外，多孔板(1)的
孔不必一定要具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)孔的開口處于向
下的狀態(tài)，靜置多孔板(1)時(shí)，孔內(nèi)的溶液不會(huì)從孔中流出，但是，如 果是這種多孔板也可以?；蛘?，多孔板(1)與上述第一方式中說(shuō)明的多
孔板相同，可以具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)孔的開口處于 向上的狀態(tài)，靜置多孔板時(shí)，即使孔的開口被溶液覆蓋，也不能將溶液注 入到孔內(nèi)。但是，并不限定于此。對(duì)于除此之外的方面，多孔板(1)可 以與上述第一方式中說(shuō)明的多孔板相同。
本發(fā)明的第二方式中，將多孔板(1)和多孔板(2)固定起來(lái)，使得
兩塊板具有的至少一部分的孔彼此相對(duì)，施加從多孔板(1)的開口朝向
底部的離心力，將上述多孔板(2)的孔內(nèi)的溶液注入到上述多孔板(1)
的孔內(nèi)。該狀況如圖3所示。離心力與上述第一方式中相同，可以是10X g以上。為使溶液的轉(zhuǎn)移僅在孔間良好地進(jìn)行，為使多孔板(1)的有孔的 主表面和多孔板(2)的有孔的主表面無(wú)間隙地密封，優(yōu)選進(jìn)行多孔板 (1)與多孔板(2)之間的固定。因此，優(yōu)選兩基板的上述主表面的平面 性和平滑性非常優(yōu)異，并且有時(shí)也優(yōu)選使用固定兩基板的工具。
如圖3所示，多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔的開口尺寸和形 狀、以及排列例如可以相同?；蛘撸嗫装?1)的孔與多孔板(2)的孔 的開口尺寸和形狀、容量以及排列的至少一部分也可以是不同的。例如， 對(duì)于多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔的形狀，也可以選擇成多孔板
(1) 的1個(gè)開口對(duì)應(yīng)于多孔板(2)的2個(gè)以上的開口 (圖4的 (A))?；蛘撸瑢?duì)于多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔的形狀，也可
以選擇成多孔板(1)的2個(gè)以上的開口對(duì)應(yīng)于多孔板(2)的1個(gè)開口 (圖4的(B))。這種情況下，可以選擇各孔的開口形狀，使相互的開 口適當(dāng)?shù)仄ヅ洹?br> 進(jìn)而，如圖3所示，可以進(jìn)行固定以使得多孔板(1)的孔與多孔板
(2) 的孔全部相對(duì)，也可以是固定使得僅一部分的孔相對(duì)(圖4的 (C))。另外，多孔板(1)的孔與多孔板(2)的孔可以具有相同的開
口形狀，也可以具有不同的開口形狀(圖4的(D))。
此外，將具有多個(gè)開口的濾膜放置在多孔板(1)和多孔板(2)之 間，施加從多孔板(1)的孔的開口朝向底部的離心力，通過(guò)上述濾膜的 開口也可以進(jìn)行上述溶液的轉(zhuǎn)移。這里使用的濾膜可以與上述第一方式中 說(shuō)明的濾膜相同。通過(guò)濾膜，可以將溶液轉(zhuǎn)移到多個(gè)孔的一部分孔內(nèi)。另 外，使用的濾膜不限于1張，也可以數(shù)張重疊使用。這樣一來(lái)，利用少數(shù) 幾張濾膜就可以大量變換開口的圖案。
實(shí)施例
下面，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例1 MMV制作
多孔板(MMV)分為干型(SU—8等的塑料)和濕型(丙烯酰胺凝
膠)。本實(shí)施例中對(duì)于使用由丙烯酰胺凝膠制作的MMV的情況進(jìn)行說(shuō) 明。但是，使用干型的多孔板也可以同樣地實(shí)施。
超高壓水銀燈的強(qiáng)光由于通過(guò)被稱為組合模塊的透鏡陣列，光呈總體
上模糊且均勻地照射。經(jīng)過(guò)反射，將與置于DMDTM中由電腦輸入的數(shù)字
模式數(shù)據(jù)相同的模式投影到凝膠溶液上。由于核黃素的作用，紫外光照射 的地方產(chǎn)生聚合凝膠化。相反未經(jīng)紫外光照射的地方則沒(méi)有開始聚合而保
持液體狀態(tài)，將該液體除去即形成空間(圖5)。利用該原理，制作了如 圖6所示形狀的2種MMV (a)和(b)。
為了制作這樣2種形狀的MMV，在作為MMV的聚合過(guò)程的紫外光 照射時(shí)，采用了分階段的投影方法(圖7)。
MMV (a)的情況首先將紫外光全面投影到凝膠溶液上，形成作為 孔底的^:y于0夕、'(Betting)凝膠，再在該Betting凝膠上充滿凝膠溶 液，投影紫外線形成孔。然后洗凈并除去孔中的未凝膠化的凝膠溶液?？?的尺寸如圖8所示。
MMV (b)的情況首先用形成小孔的模具將紫外線照射到凝膠溶液 上，再在其上充滿凝膠溶液并用形成大孔的模具進(jìn)行照射紫外線。然后洗 凈并除去孔中的未凝膠化的凝膠溶液。然后在事先制作好的Betting凝膠上 裝載形成2層孔的凝膠并照射紫外線，進(jìn)行粘合。
凝膠溶液的組成如下
40%雙丙烯酰胺(1: 39) 10ml
20XTBE緩沖液 1.25ml
砂糖 12.5g
0.001%核黃素水溶液 > 、7 7 7 :y 7° (mess up) 合計(jì) 25ml
這里，雙丙烯酰胺(1: 39)是表示N， N， 一亞甲基雙丙烯酰胺和丙 烯酰胺按重量比1: 39的比例的混合物。將該溶液流入聚合凝膠上，根據(jù) 如圖7所示的模具圖案進(jìn)行光致抗蝕劑紫外光照射。制作具有與模具圖案 相同的均勻形狀的孔。
實(shí)施例2
MMV作為反應(yīng)器的一種應(yīng)用——進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)
(1) 使用的MMV是在25平方mm內(nèi)有100個(gè)孔或1024個(gè)孔的 16%聚丙烯酰胺凝膠MMV。
(2) MMV交換凝膠薄片的凝膠緩沖液。相對(duì)于1片MMV在IX SSC 300ml中輕微振蕩45分鐘。進(jìn)行2次該操作。
(3) 去除進(jìn)行緩沖液交換的MMV的孔中的緩沖液。作為該方法， 是通過(guò)經(jīng)過(guò)干熱滅菌的濾紙從孔中進(jìn)行吸出操作。
(4) 事先將綠色熒光蛋白(GFP)產(chǎn)生大腸桿菌TOPO10以或1或無(wú) 的程度的濃度置于MMV各孔中，并將大腸桿菌溶液充滿MMV各孔。作 為將大腸桿菌溶液充滿MMV各孔的方法，采用本發(fā)明的離心法(圖 1)。如果僅浸于大腸桿菌溶液中，則大腸桿菌溶液不會(huì)流入MMV的各 孔中，但施加約lOOOXg的離心力，可以將大腸桿菌溶液填充進(jìn)全部孔 內(nèi)。
(5) 將充滿大腸桿菌溶液的MMV轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，并將進(jìn)行緩沖 液交換的凝膠薄片覆蓋在MMV上，在1XSSC氣氛中密封培養(yǎng)皿，置于 孵卵器中在37i:下培養(yǎng)18小時(shí)(圖9)。
(6) 用熒光強(qiáng)度測(cè)定裝置檢測(cè)培養(yǎng)后GFP的熒光，檢測(cè)出大腸桿菌 的增殖情況。結(jié)果如圖10所示。
以概率分布的大腸桿菌增殖的MMV為基礎(chǔ)，制作圖案與該圖案完全 相同MMV。 [方法]
作為制作復(fù)制品的基礎(chǔ)的MMV是上述進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)的MMV。 (1)如上述在MMV中的大腸桿菌培養(yǎng)中所述，在MMV中進(jìn)行大 腸桿菌培養(yǎng)。這時(shí)通過(guò)離心法將大腸桿菌溶液充滿孔時(shí)，存在有概率的有 大腸桿菌的孔和沒(méi)有大腸桿菌的孔，如圖10所示，適當(dāng)?shù)卣{(diào)整大腸桿菌 溶液濃度。
(2) 在培養(yǎng)大腸桿菌的MMV上疊放新的MMV (在1XSSC中進(jìn)行 緩沖液交換，已吸出孔中的溶液)，使孔彼此對(duì)應(yīng)，再裝進(jìn)離心管，通過(guò) 在1000Xg下進(jìn)行離心將孔中的溶液轉(zhuǎn)移到新的孔中(圖3)。
(3) 在兩MMV的孔中充滿LB培養(yǎng)基，在37。C下培養(yǎng)18小時(shí)。
(4) 用熒光強(qiáng)度測(cè)定裝置檢測(cè)培養(yǎng)后GFP的熒光，檢測(cè)出大腸桿菌 的增殖情況。結(jié)果如圖ll所示。圖的左側(cè)是原先的MMV，右側(cè)復(fù)制后的 MMV。兩者被檢測(cè)出的發(fā)生熒光的孔的圖案幾乎一致，可知含有大腸桿 菌的溶液的孔間轉(zhuǎn)移良好。另外，上述離心中， 一部分的大腸桿菌溶液殘 留在原先的MMV的孔內(nèi)，其培養(yǎng)的結(jié)果被檢測(cè)出來(lái)。
上述實(shí)施例中，使用正常形成的1024孔的MMV，進(jìn)行離心注入，使 其每一個(gè)孔中有概率地存在作為期望值的1細(xì)胞大腸桿菌，繼續(xù)進(jìn)行37°C 下的培養(yǎng)，結(jié)果如圖10所示，增殖成功并可見(jiàn)能觀測(cè)到菌落的孔。這些 孔的分布為泊松分布。這顯示了通過(guò)離心法成功地將大腸桿菌同時(shí)注入， 或該MMV作為培養(yǎng)大腸桿菌的容器發(fā)揮了功能。這種情況下，由于大腸 桿菌內(nèi)含熒光性的蛋白質(zhì)(綠色熒光蛋白質(zhì)GFP)，因此從側(cè)邊觀察可以 看見(jiàn)綠色光，從而表示了其熒光性。
進(jìn)而，使用培養(yǎng)成功的MMV與同型號(hào)的1024孔MMV，頂對(duì)頂 (top-to-top)地進(jìn)行重合，離心并同時(shí)轉(zhuǎn)移試樣(參照?qǐng)D3)。這里，向 試樣被移空的一方的MMV離心注入新鮮的培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，得到(幾 乎)同型的模式的復(fù)制品(參照?qǐng)Dll)。這表示可以進(jìn)行同時(shí)并行轉(zhuǎn)移。
另外，圖3中的溶液的轉(zhuǎn)移僅為1次，但如圖12所示也可以將多種溶 液進(jìn)行逐次轉(zhuǎn)移，其結(jié)果是可以向孔內(nèi)充填具有希望組成的溶液。進(jìn)而這 時(shí)，通過(guò)使用上述濾膜，也可以進(jìn)行調(diào)整，適當(dāng)改變孔內(nèi)的組成。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明可以在進(jìn)化工程、制藥、食品、生物風(fēng)險(xiǎn)、臨床檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、化 合物質(zhì)毒性檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)等中，在使多種微量液體試樣反應(yīng)時(shí)所必需的、同時(shí) 并行地進(jìn)行試樣的分取的領(lǐng)域里得到應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種向由在至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板的孔內(nèi)注入溶液的方法，其中，所述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)所述孔的開口處于向上的狀態(tài)，靜置多孔板時(shí)，即使所述孔的開口被所述溶液覆蓋，也不能將溶液注入到孔內(nèi)，在所述多孔板的具有所述孔的主表面上放置溶液，施加從孔的開口朝向底部的離心力，將所述溶液注入到所述孔內(nèi)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述離心力為10Xg以上。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述孔的開口的最大內(nèi)徑為5mm 以下。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述離心力為20Xg以上。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述孔的開口的最大內(nèi)徑為lmm以下。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述離心力為100Xg以上。
7. 如權(quán)利要求1 6的任一項(xiàng)中所述的方法，其中，所述孔的內(nèi)部容 量為10tU以下。
8. 如權(quán)利要求1 6的任一項(xiàng)中所述的方法，其中，所說(shuō)孔的內(nèi)部容 量為lul以下。
9. 如權(quán)利要求1 8的任一項(xiàng)中所述的方法，其中，所述多孔板具有 1000個(gè)以上的孔。
10. 如權(quán)利要求1 9的任一項(xiàng)中所述的方法，其中，在所述主表面上 放置具有多個(gè)開口的濾膜，進(jìn)而在該濾膜上放置溶液，施加從孔的開口朝 向底部的離心力，將所述溶液通過(guò)所述濾膜的開口注入到所述孔內(nèi)。
11. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中，將溶液通過(guò)上述濾膜注入到所 述多個(gè)孔的一部分孔內(nèi)。
12. —種從由在至少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板 (2)的至少一部分孔，將該孔內(nèi)容納的溶液的至少一部分轉(zhuǎn)移至由在至 少一個(gè)主表面上具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板(1)的孔內(nèi)的方法，其 中，所述多孔板(2)的孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，S卩當(dāng)所 述孔的開口處于向下的狀態(tài)，靜置多孔板(2)時(shí)，所述孔內(nèi)的溶液不會(huì) 從孔中流出，將所述多孔板(1)和多孔板(2)固定起來(lái)使得兩塊板具有的至少一 部分孔彼此相對(duì)，施加從所述多孔板(1)的開口朝向底部的離心力，將 所述多孔板(2)的孔內(nèi)的溶液注入到所述多孔板(1)的孔內(nèi)。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述多孔板(1)的孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)所述孔的開口處于向上的狀態(tài)，靜置 多孔板(1)時(shí)，即使所述孔的開口被所述溶液覆蓋，也不能將溶液注入 到孔內(nèi)。
14. 如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中，將具有多個(gè)開口的濾膜 放置在所述多孔板(1)和多孔板(2)之間，施加從所述多孔板(1)的 開口朝向底部的離心力，通過(guò)所述濾膜的開口進(jìn)行所述溶液的轉(zhuǎn)移。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中，將溶液通過(guò)所述濾膜轉(zhuǎn)移到所 述多個(gè)孔的一部分孔內(nèi)。
16. 如權(quán)利要求12 15的任一項(xiàng)中所述的方法，其中，所述多孔板 (1)的孔和多孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、以及排列是相同的。
17. 如權(quán)利要求12 15的任一項(xiàng)中所述的方法，其中，所述多孔板 (1)的孔和多孔板(2)的孔的開口尺寸和形狀、容量以及排列的至少一部分是不同的。
18. 如權(quán)利要求12 17的任一項(xiàng)中所述的方法，其中，所述離心力為 100Xg以上。
全文摘要
本發(fā)明提供一種向由具有多個(gè)孔的基板構(gòu)成的多孔板的孔內(nèi)注入溶液的方法。上述孔具有如下的尺寸、形狀和表面狀態(tài)，即當(dāng)孔的開口處于向上的狀態(tài)，靜置多孔板時(shí)，即使上述孔的開口被上述溶液覆蓋，也不能將溶液注入到孔內(nèi)，在多孔板的具有孔的主表面上放置溶液，從孔的開口朝向底部方向施加離心力將上述溶液注入到上述孔內(nèi)。本發(fā)明還提供一種從多孔板的孔向別的多孔板的孔轉(zhuǎn)移溶液的方法。即使對(duì)于超過(guò)1000的容器(孔)，且即使容器(孔)的尺寸、形狀和表面狀態(tài)不允許溶液向容器(孔)內(nèi)的流入，也可以簡(jiǎn)單地填充反應(yīng)液等溶液。
文檔編號(hào)G01N35/10GK101375168SQ200680005428
公開日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日
發(fā)明者內(nèi)田秀和, 木下保則, 田山貴宏, 西垣功一 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人琦玉大學(xué)