專利名稱：Dna結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，特別是涉及利用納米粒子分離DNA結合蛋白的系統(tǒng)。
背景技術：
DNA與蛋白質的相互作用包含了大量的生命活動信息，是后基因組時代研究的一個重要內容。特別是，DNA與蛋白質的識別的研究關系到生物大分子的構象特異性識別以及基因轉錄調節(jié)過程中蛋白因子的作用機制等方面問題的解決。傳統(tǒng)的研究DNA與蛋白質相互作用的方法存在一些困難凝膠滯后實驗(EMSA)只能驗證已知蛋白與DNA的相互作用，并且實驗中要用到同位素標記，對實驗者健康有影響；染色質免疫共沉淀法(CHIP)要預先猜測與DNA作用的蛋白因子，并且要用到該蛋白因子的單抗，成本高，此外，抗體的加入又有可能影響DNA與蛋白的結合。
目前，納米科學正在突飛猛進地發(fā)展，將納米科學與生物學結合，用于解決生命研究中的重大問題，這是一個納米科學發(fā)展的必然趨勢。為了更方便直接地研究蛋白質與DNA的相互作用，建立一種基于磁性納米粒子(MNP)的微量蛋白因子的分離系統(tǒng)，以篩選與某一特定DNA序列識別的蛋白質正在成為可能。

發(fā)明內容
所要解決的技術問題本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，以克服現(xiàn)有的凝膠滯后實驗只能驗證已知蛋白與DNA的相互作用，并且實驗中要用到同位素標記，對實驗者健康有影響；染色質免疫共沉淀法需要預先猜測與DNA作用的蛋白因子，并且要用到該蛋白因子的單抗，成本高，此外，抗體的加入又有可能影響DNA與蛋白的結合的缺陷。
技術方案本發(fā)明的技術方案之一是提供一種DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，由如下組分構成(1)表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子；(2)標記有生物素的雙鏈DNA；(3)與雙鏈DNA結合的核蛋白；(4)外加磁場。
上述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之一為，所說的磁性納米粒子是二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子，且表面通過氨基或羧基與鏈霉親和素共價連接。
上述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之二為，所說的磁性納米粒子平均粒徑為50～100nm。
上述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之三為，所說的DNA結合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
上述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的優(yōu)選方案之四為，所說的生物素標記的雙鏈DNA的片段長度范圍為100bp～800bp。
本發(fā)明的技術方案之二是提供一種利用磁性納米粒子分離DNA結合蛋白的方法，包括如下步驟a)二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子表面進行氨基或羧基修飾；b)在經過修飾的磁性納米粒子表面共價連接鏈霉親和素；c)利用表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子結合生物素修飾的雙鏈DNA；d)利用磁性納米粒子的超順磁性分離并洗脫DNA結合蛋白。
上述的利用磁性納米粒子分離DNA結合蛋白的方法的優(yōu)選方案之一為，所說的磁性納米粒子平均粒徑范圍為50～100nm50～100nm。
上述的利用磁性納米粒子分離DNA結合蛋白的方法的優(yōu)選方案之二為，所說的DNA結合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
本發(fā)明的技術方案之三是提供上述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)在研究蛋白質分離及DNA與蛋白質相互作用中的應用。
上述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)在研究DNA與蛋白質相互作用中的應用的優(yōu)選方案為，所說的蛋白質為DNA轉錄因子。
有益效果(1)磁性納米粒子與長鏈dsDNA的鍵合系高效專一，分離過程中蛋白與DNA在最適的結合體系中保持相互特異結合；
(2)采用磁性分離手段，分離的條件溫和，對生物樣品不產生損傷，并且操作簡單、迅速；(3)利用此納米分離系統(tǒng)可以分離得到DNA結合蛋白，彌補目前DNA結合蛋白質分離方法中的不足，提供了安全、可靠、低成本的技術平臺；(4)值得關注的是，本發(fā)明方法可以用于尋找未知的DNA結合蛋白，而不是僅限于驗證某一蛋白與DNA的識別，這為分離與DNA結合的蛋白質提供了良好的分離平臺，并為研究DNA與蛋白質相互作用開辟了新的思路；(5)本發(fā)明的方法可以用于篩選并獲得轉錄因子，能夠為研究基因調節(jié)機制提供更直接的分子水平的證據(jù)。


圖1磁性納米粒子捕捉hCMV MIEP結合的蛋白因子。Lane 1Hela核抽提物；Lane MTakara低分子量蛋白Marker；Lane 2標記有hCMVMIEP的MNP由50mM NaCl洗脫液；Lane 3標記有Biotin-primer的MNP由50mM NaCl洗脫液；Lane4標記有hCMV MIEP的MNP由200mM NaCl洗脫液；Lane 5標記有Biotin-primer的MNP由200mMNaCl洗脫液。該圖說明hCMV MIEP片段至少可以結合分子量為6.2kD、5.4kD、3.8kD和4.1kD的蛋白。
圖2茚三酮顯色產物可見光吸收譜.a.MNP-NH2；b.無水乙醇洗滌MNP-NH2的上清液；c.MNP；d.CH3CH2OH。本圖說明AEAPS能夠通過化學鍵有效地連接在磁性納米粒子的二氧化硅表面。
圖3MNP-NH2-Strepavidin與OB-hCMV MIEP的特異性結合效率。Lane 10.12mg MNP-NH2-Strepavidin與10pmol OB-hCMV MIEP混合后游離的DNA；Lane2～70.12mg MNP-NH2-Strepavidin與20pmol、18pmol、16pmol、14pmol、12pmol、10pmol OB-hCMV MIEP混合后游離的DNA；Lane MDL2000 Marker。該圖說明修飾有Biotin的dsDNA能夠有效地與磁性納米粒子鍵合，鍵合效率為12ng磁性納米粒子結合1pmol DNA。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上?；瘜W試劑廠，引物和探針均由上海生工公司合成。表面包覆有SiO2的磁性納米粒子由上海師范大學納米生物技術實驗室制備。
具體實施過程中，如下步驟是一種可行和優(yōu)選的方法(1)用N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)修飾二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子表面將甲醇、丙三醇及ddH2O按100∶60∶1的比例混合，將表面包覆有SiO2的磁性納米粒子10～30mg加入上述溶液中，超聲25min以上分散均勻，向混合液中滴加1～2mL AEAPS，超聲5～20min混勻，50～80℃水浴攪拌反應10～20hr。加外磁場利用順磁性分離出磁性納米粒子，甲醇清洗，真空干燥過夜，收集磁性納米粒子。
(2)磁性納米粒子表面修飾鏈霉親和素取3～5mg修飾過氨基的磁性納米粒子加入到500μL pH7.0左右的緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)中，超聲分散均勻，加入50～100ug的Strepavidin，溶液室溫振蕩24hr以上。加入戊二醛(25％水溶液)室溫反應2～4hr。用pH5～8左右的緩沖液清洗，將粒子重分散于pH5～8左右的緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子對生物素修飾的雙鏈DNA的捕捉將20μL上述經過鏈霉親和素修飾的磁性納米粒子(約含0.05～0.4mg粒子)用10倍體積的緩沖液平衡，與10pmol～20pmol 5’-biotin標記的雙鏈DNA片段(100bp～800bp)混合，室溫振蕩30min以上。
實施例1表面修飾氨基的磁性納米粒子的制備將甲醇、丙三醇及ddH2O按100∶60∶1的比例混合，將表面包覆有SiO2的磁性納米粒子20mg加入上述溶液中，超聲20～50min分散均勻，向混合液中滴加1～5mL AEAPS，超聲5～10min混勻，50～80℃水浴攪拌反應5hr以上。加外磁場利用順磁性分離出磁性納米粒子，甲醇清洗，40～90℃真空干燥過夜，收集磁性納米粒子。
實施例2磁性納米粒子表面修飾Strepavidin取3mg修飾過氨基的MNP加入到500μL pH7.0左右的磷酸鹽緩沖液(如0.1mol/L，pH7.0)中，超聲分散均勻，加入75ug的Strepavidin，溶液室溫振蕩24hr。加入0.5mL戊二醛(25％水溶液)室溫反應2～4hr。用磷酸鹽緩沖液清洗，將粒子重分散于磷酸鹽緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例3表面修飾有Strepavidin的磁性納米粒子對Biotin修飾的雙鏈DNA的捕捉將20μL上述經過Strepavidin修飾的磁性納米粒子(約含0.15mg粒子)用10倍體積的緩沖液平衡，與10pmol 5’-biotin標記的hCMV MIEP片段(588bp)混合，室溫振蕩30min。用10倍體積的緩沖液清洗粒子。
實施例4分離與雙鏈DNA結合的蛋白質Hela細胞核抽提物與25pmol hCMV MIEP片段在緩沖液B(8mMHEPES(pH 7.9)，100mM KCl，6mM MgCl2，0.08mM EDTA，0.2mM DTT，8％甘油，0.04mg/mL鮭魚精DNA)中30℃水浴反應1hr。加入用緩沖液B平衡好的磁性納米粒子約0.3mg捕捉hCMV MIEP片段與其結合蛋白的復合物，室溫振蕩反應30min。磁性分離納米粒子，用5倍體積的緩沖液B清洗粒子，而后依次加入含50～200mM NaCl的洗脫液，室溫洗脫5min，收集洗脫液。即得到與hCMV MIEP片段結合的蛋白。
實施例5分離系統(tǒng)在研究DNA與蛋白質相互作用中的應用在獲得與hCMV MIEP片段結合的蛋白后，選擇可與NFκB、AP-1等轉錄因子特異性結合的單克隆抗體與聚丙稀酰胺凝膠中的蛋白轉漬條帶進行免疫印跡分析，獲得特異性陽性結果，表明hCMV MIEP片段結合的蛋白中含有特異性轉錄因子，并進行進一步的分離、測序、同源性比較等。
權利要求
1.一種DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，由如下組分構成(1)表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子；(2)標記有生物素的雙鏈DNA；(3)與雙鏈DNA結合的核蛋白；(4)外加磁場。
2.根據(jù)權利要求1所述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的磁性納米粒子是二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子，且表面通過氨基或羧基與鏈親和素共價連接。
3.根據(jù)權利要求1所述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的磁性納米粒子平均粒徑為50～100nm。
4.根據(jù)權利要求1所述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的DNA結合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
5.根據(jù)權利要求1所述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，其特征在于，所說的生物素標記的雙鏈DNA的片段長度范圍為100bp～800bp。
6.一種利用磁性納米粒子分離DNA結合蛋白的方法，包括如下步驟(1)二氧化硅包裹的γ-Fe2O3納米粒子表面進行氨基或羧基修飾；(2)在經過修飾的磁性納米粒子表面共價連接鏈霉親和素；(3)利用表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子結合生物素修飾的雙鏈DNA；(4)利用磁性納米粒子的超順磁性分離并洗脫DNA結合蛋白。
7.根據(jù)權利要求6所述的利用磁性納米粒子分離DNA結合蛋白的方法，其特征在于，所說的磁性納米粒子粒徑范圍為50～100nm。
8.根據(jù)權利要求6所述的利用磁性納米粒子分離DNA結合蛋白的方法，其特征在于，所說的DNA結合蛋白的分子量范圍為6.2kD至4.1kD。
9.權利要求1所述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)在研究蛋白質分離及DNA與蛋白質相互作用中的應用。
10.根據(jù)權利要求9所述的DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)的應用，其特征在于，所說的蛋白質為轉錄因子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種DNA結合蛋白磁性納米粒子分離系統(tǒng)，由如下組分構成表面修飾有鏈霉親和素的磁性納米粒子；標記有生物素的雙鏈DNA；與雙鏈DNA結合的核蛋白；和外加磁場。磁性納米粒子與長鏈dsDNA的鍵合系高效專一，分離過程中蛋白與DNA在最適的識別體系中保持相互特異結合。采用磁性分離洗脫手段條件溫和，對樣品不產生損傷，并且操作簡單迅速。利用此納米分離系統(tǒng)可以分離得到DNA結合蛋白，為研究DNA與蛋白質相互作用提供了可靠的技術平臺。
文檔編號G01N33/68GK101045743SQ20061014830
公開日2007年10月3日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權日2006年12月29日
發(fā)明者沈鶴柏, 王皓月, 周海清, 費儉, 陳偉 申請人:上海師范大學