專利名稱：呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條和試紙卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)微量呋喃唑酮代謝物(3-氨基-2-惡唑烷酮，AOZ)的器具，特別是涉及一種呋喃唑酮代謝物殘留分析的膠體金層析檢測(cè)試紙條和試紙卡。
二、技術(shù)背景呋喃唑酮(Furazolidone，F(xiàn)Z)，又名痢特靈，是一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗菌藥物，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌及某些原蟲和真菌具有抑制或殺滅效果，而且藥效穩(wěn)定，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了廣泛的應(yīng)用。但毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)均有很強(qiáng)的毒副作用，可致癌、致突變，可引起溶血性貧血、血小板減少性紫癜、多發(fā)性神經(jīng)炎等多種疾病。1995年歐盟首先禁止呋喃唑酮在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用，隨后美國(guó)、日本、澳大利亞等國(guó)將呋喃唑酮列為禁用藥，我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年3月頒布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》(農(nóng)牧發(fā) 1號(hào))中將呋喃唑酮列為禁用藥。呋喃唑酮是我國(guó)食品安全監(jiān)控的主要藥物之一。
盡管我國(guó)嚴(yán)禁呋喃唑酮用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，但由于其藥效確切，價(jià)格低廉，目前在畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中違禁使用現(xiàn)象仍較嚴(yán)重。呋喃唑酮在食品動(dòng)物中的殘留不僅直接危害食用者的身體健康，同時(shí)還嚴(yán)重制約我國(guó)動(dòng)物性食品出口，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
由于呋喃唑酮在動(dòng)物體內(nèi)很快代謝為AOZ，AOZ與組織蛋白結(jié)合且在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，被視為呋喃唑酮?dú)埩舻臉?biāo)示物。通過(guò)檢測(cè)母體藥物不能判定呋喃唑酮的實(shí)際殘留情況，因此檢測(cè)呋喃唑酮?dú)埩舻淖罴逊椒ㄊ菣z測(cè)其代謝物(AOZ)而并非母體藥物本身。
目前，用于AOZ殘留檢測(cè)的方法主要有理化分析法和酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)等。理化分析法主要是高壓液相色譜(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等。理化分析法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但是樣品需經(jīng)一系列復(fù)雜的處理凈化，繁瑣費(fèi)時(shí)，所需儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，而且只有特定的專業(yè)技術(shù)人員才能操作，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，時(shí)效性差，難以推廣。ELISA法以競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng)為檢測(cè)原理，反應(yīng)顯色后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值進(jìn)行結(jié)果判定?？s短了檢測(cè)時(shí)間，可以定性定量檢測(cè)。但ELISA方法需要配套的酶標(biāo)儀和配套試劑，操作過(guò)程仍較復(fù)雜，而且國(guó)內(nèi)現(xiàn)處在研發(fā)階段，進(jìn)口國(guó)外產(chǎn)品價(jià)格昂貴，因而ELISA方法的應(yīng)用受到了較大限制。
三、內(nèi)容本發(fā)明的目的研制出特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的呋喃唑酮代謝物(AOZ)殘留檢測(cè)試紙條和試紙卡。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護(hù)膜，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條兩端粘貼有保護(hù)膜，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“| |”。
所述的襯板為不吸水的韌性材料，樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜，吸水墊為吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙或?yàn)V油紙，韌性材料為硬質(zhì)塑膠條、或不吸水硬紙條，包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧化纖維素膜，所述的保護(hù)膜為不透明的膠膜。
所述的AOZ金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的AOZ單克隆抗體或多克隆抗體，AOZ衍生物金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體。
所述的偶聯(lián)AOZ或偶聯(lián)AOZ衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA。
所述的試紙條，在樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊及吸水墊上覆蓋有保護(hù)膜，樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有待測(cè)樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向樣品墊一側(cè)約0.5cm處。
所述的塑料卡由底座和面蓋嵌合在一起構(gòu)成，底座上有放試紙芯的固定槽以及與面蓋相結(jié)合的卡齒，面蓋有觀察窗和加樣孔以及與底座相結(jié)合的卡齒，觀察窗與試紙芯的包被膜相對(duì)應(yīng)，加樣孔與試紙芯的樣品墊相對(duì)應(yīng)，在觀察窗旁邊分別印有T和C，T表示檢測(cè)線，在靠近加樣孔側(cè)，C表示對(duì)照線，在遠(yuǎn)離加樣孔側(cè)。
本發(fā)明的檢測(cè)試紙條和試紙卡具有下列優(yōu)點(diǎn)①特異性強(qiáng)，敏感性高。該膠體金層析檢測(cè)試紙條和試紙卡以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對(duì)單克隆抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，試紙條和試紙卡具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達(dá)到1～5ppb。
②簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)。使用膠體金層析檢測(cè)試紙條和試紙卡，無(wú)需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作，試紙條(卡)加入被檢樣品液后，在10分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
③結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。檢測(cè)試紙條和試紙卡均以顯示棕紅色線“|”和“| |”作為檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在包被膜上顯示一條棕紅色線“|”時(shí)，表示在被檢樣品中含有被檢物，顯示兩條棕紅色線“| |”時(shí)，表示在被檢樣品中不含被檢物。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性等人為誤判。
④節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測(cè)試紙條和試紙卡，比用儀器分析和進(jìn)口ELISA試劑盒的費(fèi)用大幅下降。另外，試紙條和試紙卡的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗(yàn)，海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測(cè)，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場(chǎng)戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和明顯的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。
四

圖1、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙卡俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4、呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙卡剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中，1襯板，2樣品墊，3金標(biāo)物結(jié)合墊，4包被膜，5檢測(cè)線，6對(duì)照線，7吸水墊，8-1樣品浸入端保護(hù)膜，8-2手柄端保護(hù)膜，9標(biāo)識(shí)線，10加樣孔，11觀察窗，12面板，13試紙芯固定槽，14底座。
五具體實(shí)施例方式要制成呋喃唑酮代謝物檢測(cè)試紙條和試紙卡，首先需要制備偶聯(lián)呋喃唑酮代謝物載體蛋白和呋喃唑酮代謝物衍生物載體蛋白，用于制備相應(yīng)的檢測(cè)線和抗體；而且需要制備呋喃唑酮代謝物金標(biāo)抗體和呋喃唑酮代謝物衍生物金標(biāo)抗體，用于制備相應(yīng)的金標(biāo)抗體纖維棉；另外需要制備羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體，用于制備對(duì)照線。
1、呋喃唑酮代謝物(AOZ)與載體蛋白偶聯(lián)采用戊二醛法，將AOZ與載體蛋白BSA進(jìn)行偶聯(lián)制備人工結(jié)合抗原AOZ-BSA。具體制備方法如下稱取BSA30mg溶于5ml pH7.4的0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)中，攪拌下加入AOZ 5～6mg，緩慢滴加25％戊二醛溶液0.1ml，磁力攪拌反應(yīng)4～6h。5000r/min離心10min，收集上清液裝入透析袋，在4℃下用0.01mol/L(pH7.4)的PBS透析72h，每天更換透析液2～3次。最后收集透析袋內(nèi)的橙黃色溶液過(guò)葡聚糖凝膠層析柱(SephadexG-25)進(jìn)一步提純，制得人工結(jié)合抗原AOZ-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工結(jié)合抗原AOZ-OVA或AOZ-HSA。
2、AOZ衍生物與載體蛋白偶聯(lián)碳二亞胺法將AOZ對(duì)醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)與載體蛋白BSA進(jìn)行偶聯(lián)制備人工結(jié)合抗原CPAOZ-BSA。具體制備方法如下稱取BSA 100mg溶于6ml pH7.4的0.01mol/L PBS中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1ml，攪拌溶解；稱取CPAOZ 14mg溶于1.2ml二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌下加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)16.5mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)8.5mg，4℃下磁力攪拌反應(yīng)過(guò)夜，5000r/min離心10min，取上清液并在磁力攪拌下逐滴加入上液中，4℃下密封攪拌反應(yīng)4～6h，5000r/min離心10min，收集上清液裝入透析袋，在4℃下用pH7.4的PBS透析72h，每天更換透析液2～3次。最后收集透析袋內(nèi)的無(wú)色CPAOZ-BSA溶液，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工結(jié)合抗原CPAOZ-OVA或CPAOZ-HSA。
混合酸酐法冰浴條件下進(jìn)行，將CPAOZ 8.2mg溶解在0.8ml DMF中，攪拌加入三丁胺30ul，反應(yīng)30min，再加入氯甲酸異丁酯20μl反應(yīng)1h，而后加入載體蛋白BSA溶液(BSA50mg溶于2ml pH為7.4的0.01mol/LPBS中)反應(yīng)過(guò)夜，終止反應(yīng)。收集反應(yīng)物裝入透析袋，在4℃下用0.01mol/L(pH7.4)的PBS透析3天，每天更換透析液2～3次。最后收集透析好的反應(yīng)物過(guò)SephadexG-25層析柱進(jìn)一步提純，制得人工結(jié)合抗原CPAOZ-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工結(jié)合抗原CPAOZ-OVA或CPAOZ-HSA。
3、抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體的制備單抗制備以50μg～100μg/只的AOZ-載體蛋白結(jié)合抗原免疫8周齡BALB/c小鼠3～4次，每次免疫間隔時(shí)間3～5周，最后一次超強(qiáng)免疫后3～4天，無(wú)菌取其脾細(xì)胞并與NS0骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10～14天，用間接ELISA方法選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化，而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單克隆抗體可特異地與AOZ反應(yīng)。以體內(nèi)誘生法進(jìn)行單抗制備，以辛酸-硫酸銨法提純單抗，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 多抗制備用AOZ-載體蛋白結(jié)合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200μg～500μg/次，背部皮下分4～6點(diǎn)注射。首免，用AOZ-載體蛋白結(jié)合抗原與等量弗氏完全佐劑(FCA)混合，充分乳化；加強(qiáng)免疫，用AOZ-載體蛋白結(jié)合抗原與等量弗氏不完全佐劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2～3周進(jìn)行，連續(xù)免疫4～5次，每次間隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法測(cè)其定效價(jià)達(dá)到105以上時(shí)，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 4、抗AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體的制備參照抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體的制備方法，以AOZ衍生物載體蛋白結(jié)合抗原替代AOZ載體蛋白結(jié)合抗原，制備抗AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體。
5、金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊的制備①AOZ金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊的制備采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液，即在沸騰的200ml 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鮮配制的1％檸檬酸三鈉8ml，獲得直徑約15nm的膠體金溶液，用0.1mol/L K2CO3調(diào)pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?∶2000的標(biāo)記比將待標(biāo)記的抗AOZ單克隆抗體或多克隆抗體加入pH8.5～9.5的金溶膠中，標(biāo)記10min后，加入20％的PEG10000至終濃度為0.05％，4℃、1500～2000rpm離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析進(jìn)行分離純化，獲得AOZ膠體金標(biāo)記抗體。將1∶100～500稀釋的膠體金標(biāo)記抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)吸附于精制玻璃纖維棉中，4℃低溫真空干燥，制備AOZ金標(biāo)物結(jié)合墊。
②AOZ衍生物金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊的制備參照AOZ金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊的制備方法，以AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體替代AOZ單克隆抗體或多克隆抗體，制備AOZ衍生物金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊。
6、羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體的制備以飽和硫酸銨法提取AOZ及其AOZ衍生物陰性小鼠血清IgG(或陰性兔血清IgG)。即取1份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS(pH7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm離心15min，棄上清；再以適量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm離心15min，棄上清，以適量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱內(nèi)用PBS(pH7.2)透析48h，中間換液3次，4℃、12000rpm離心15min，收集上清，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度。以提取的小鼠血清(或兔血清)IgG按50～100μg/kg體重經(jīng)皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，以ELISA測(cè)定其血清效價(jià)達(dá)到1∶2000以上時(shí)，心臟或動(dòng)脈采血，分離收集高免血清。以飽和硫酸銨法提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于膠體金層析檢測(cè)試紙條和試紙卡對(duì)照線的制備。
7、檢測(cè)試紙條和試紙卡檢測(cè)反應(yīng)原理當(dāng)快速檢測(cè)試紙條和試紙卡測(cè)試端加入待測(cè)樣品溶液后，待測(cè)溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)物及金標(biāo)物結(jié)合墊中的金標(biāo)抗體一起向包被膜擴(kuò)散，并最終滲入手柄端吸水濾紙。在擴(kuò)散過(guò)程中，待測(cè)物可與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉金標(biāo)抗體上待測(cè)物的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與包被膜上偶聯(lián)載體蛋白抗原的檢測(cè)線結(jié)合，檢測(cè)線不能顯色，而羊或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成一條棕紅色對(duì)照線“|”，為陽(yáng)性表示。反之樣品溶液中無(wú)待測(cè)物則不能阻止金標(biāo)抗體與包被膜上偶聯(lián)載體蛋白抗原的檢測(cè)線結(jié)合，顯示棕紅色檢測(cè)線“|”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體也與金標(biāo)抗體結(jié)合，顯示棕紅色對(duì)照線“|”，這樣形成兩條棕紅色線“| |”，為陰性表示。如果包被膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實(shí)施例一、AOZ檢測(cè)試紙條，參見圖1和圖2。圖中1為襯板，用硬質(zhì)塑膠條制成；2為樣品墊，用玻璃纖維棉制成；3為金標(biāo)物結(jié)合墊，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
“5”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標(biāo)記的抗AOZ單克隆抗體玻璃纖維棉；4為包被膜，采用硝酸纖維素膜；5為隱形檢測(cè)線，用AOZ-載體蛋白偶聯(lián)物在包被膜上印制成“|”，載體蛋白為牛血清白蛋白BSA；6為隱形對(duì)照線，用兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上印制成“|”，兩條線平行排列組合為“| |”；7為手柄端的吸水墊，用吸水濾紙制成。將2、3、4、7從右至左依次粘貼固定在塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相搭接。8-1為覆蓋在樣品墊2和金標(biāo)物結(jié)合墊3上面的樣品端白色保護(hù)膜，8-2為覆蓋在吸水墊7上面的手柄端其它顏色保護(hù)膜(如黃色)，9為測(cè)試樣品的帶箭頭標(biāo)示線，即在樣品墊2與金標(biāo)物結(jié)合墊3交界處對(duì)應(yīng)的白色保護(hù)膜偏向樣品墊一側(cè)約0.5cm處印制的標(biāo)示線，在標(biāo)示線右側(cè)保護(hù)膜上印有箭頭及MAX字樣。
試紙條適于檢測(cè)的樣品及其檢測(cè)操作方法與結(jié)果判定檢測(cè)樣品可為組織樣、蛋樣、蜂蜜樣和奶樣。
檢測(cè)樣品制備①組織樣和蛋樣將樣品勻漿后，稱取1g樣品加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min離心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次上清液混勻后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀釋，用于檢測(cè)分析。
②奶樣取奶樣2ml在15℃條件下3000r/min離心5min，除去上層脂肪，取下層液，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min離心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次上清液混勻后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀釋，用于檢測(cè)分析。
③蜂蜜樣取蜂蜜樣品2g，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min離心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min離心10min，取上清液，收集兩次上清液混勻后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀釋，用于檢測(cè)分析。
檢測(cè)操作方法將AOZ膠體金層析檢測(cè)試紙條樣品端插入待測(cè)樣品液中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線，約10～20秒鐘取出檢測(cè)試紙條，水平放置，5～10分鐘觀察判定檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果判定①陽(yáng)性如果在包被膜上顯示有一條棕紅色線“|”，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有AOZ；②陰性如果在包被膜上顯示有兩條棕紅色線“| |”，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含AOZ；③失效如果在包被膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實(shí)施例二、AOZ檢測(cè)試紙卡參見圖3、圖4。圖中1、2、3、4、5、6和7分別為襯板、樣品墊、金標(biāo)物結(jié)合墊、包被膜、隱形檢測(cè)線、隱形對(duì)照線和吸水墊，其制備方法與實(shí)施例一相同，組成試紙芯；14為塑料制成的試紙卡底座，試紙芯固定在底座的固定槽13中；12為塑料制成的試紙卡面板，其上的加樣孔10與試紙芯的樣品墊相對(duì)應(yīng)，是滴加待檢樣品的位置；在面板上的觀察窗11與試紙芯的包被膜相對(duì)應(yīng)，是觀察判定結(jié)果的窗口，其旁邊印有T和C，分別與包被膜上的檢測(cè)線和對(duì)照線相對(duì)應(yīng)。
檢測(cè)樣品及檢測(cè)樣品制備和實(shí)施例一相同。
檢測(cè)時(shí)，將試紙卡平放，從加樣孔滴加待測(cè)樣品液，5～10分鐘從觀察窗判定檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果判定如在包被膜上對(duì)應(yīng)T的位置顯示有一條棕紅色線“|”時(shí)，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有AOZ；如在包被膜上對(duì)應(yīng)T、C的位置顯示有兩條棕紅色線“| |”時(shí)，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含AOZ；如在包被膜上沒(méi)有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實(shí)施例三、檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于以抗AOZ多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊；偶聯(lián)AOZ的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例一，不再重述。
實(shí)施例四、檢測(cè)試紙卡結(jié)構(gòu)和實(shí)施例二基本相同，不同之處在于以抗AOZ多克隆抗體替代AOZ單克隆抗體，制備AOZ金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊；偶聯(lián)AOZ的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例二，不再重述。
實(shí)施例五、檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于以抗AOZ對(duì)醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)單克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊；用AOZ-衍生物載體蛋白偶聯(lián)物替代AOZ-載體蛋白偶聯(lián)物在包被膜上制備檢測(cè)線“|”，偶聯(lián)AOZ衍生物的載體蛋白為人血清白蛋白HSA。
檢測(cè)樣品制備①組織樣和蛋樣將樣品勻漿后，按每克樣品加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振蕩16h(過(guò)夜)，用1mol/LNaOH調(diào)pH至7.0～7.5；再加入5ml正己烷，混勻攪拌10min，4℃條件下5000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉(zhuǎn)振蕩10min，4℃條件下5000r/min離心10min，用N2吹干，加入5mL含0.05％吐溫-20的PBS(pH 7.4，0.15mol/L)稀釋，用于檢測(cè)分析。
②奶樣取奶樣2ml在15℃條件下3000r/min離心5min，除去上層脂肪，取下層液，加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振蕩16h(過(guò)夜)，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.0～7.5；再加入正己烷5ml，攪拌10min，4℃條件下5000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉(zhuǎn)振蕩10min，4℃條件下5000r/min離心10min，用N2吹干，加入5ml含0.05％吐溫-20的PBS(pH 7.4，0.15M)稀釋，用于檢測(cè)分析。
③蜂蜜樣取蜂蜜樣品2g，加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振蕩16h(過(guò)夜)，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.0～7.5；再加入正己烷5ml，攪拌10min，4℃條件下5000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液層，下層溶液加乙酸乙酯8ml，旋轉(zhuǎn)振蕩10min，4℃條件下5000r/min離心10min，用N2吹干，加入5ml含0.05％吐溫-20的PBS(pH 7.4，0.15M)稀釋，用于檢測(cè)分析。
其它包括檢測(cè)操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例一，不再重述。
實(shí)施例六、檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于以抗AOZ對(duì)醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊；用AOZ-衍生物載體蛋白偶聯(lián)物替代AOZ-載體蛋白偶聯(lián)物在包被膜上制備檢測(cè)線“|”，偶聯(lián)AOZ衍生物的載體蛋白為人血清白蛋白HSA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對(duì)照線“|”。
其它包括檢測(cè)樣品、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例五，不再重述。
實(shí)施例七、檢測(cè)試紙卡結(jié)構(gòu)和實(shí)施例二基本相同，不同之處在于以抗AOZ對(duì)醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)單克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊；用AOZ衍生物-載體蛋白偶聯(lián)物替代AOZ-載體蛋白偶聯(lián)物在包被膜上制備檢測(cè)線“|”，偶聯(lián)AOZ衍生物的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA。
其它包括檢測(cè)樣品、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例五，不再重述。
實(shí)施例八、檢測(cè)試紙卡結(jié)構(gòu)和實(shí)施例二基本相同，不同之處在于以抗AOZ對(duì)醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗體替代抗AOZ單克隆抗體，制備AOZ衍生物金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊；用AOZ衍生物-載體蛋白偶聯(lián)物替代AOZ-載體蛋白偶聯(lián)物在包被膜上制備檢測(cè)線“|”，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗體溶液在包被膜上制備對(duì)照線“|”，偶聯(lián)AOZ衍生物的載體蛋白為雞卵清白蛋白OVA。
其它包括檢測(cè)樣品、操作方法和結(jié)果判定等均同實(shí)施例五，不再重述。
權(quán)利要求
1.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護(hù)膜，其特征是金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“||”。
2.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊，在試紙條兩端粘貼有保護(hù)膜，其特征是金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“||”。
3.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，其特征是金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“||”。
4.一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙卡，含有襯板、樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成試紙芯，試紙芯放在特制的塑料卡中，其特征是金標(biāo)結(jié)合墊為吸附AOZ衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“||”。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的試紙條或試紙卡，其特征是所述的襯板為不吸水的韌性材料；所述的樣品墊為玻璃纖維棉，或?yàn)槟猃埬?，或?yàn)榫燮蚁┠?，或?yàn)榫埘ツ?；所述的吸水墊為吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙或?yàn)V油紙；所述的韌性材料為硬質(zhì)塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的包被膜為硝酸纖維素膜，或?yàn)榧兝w維素膜，或?yàn)轸然w維素膜；所述的保護(hù)膜為不透明的膠膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的試紙條或試紙卡，其特征是所述的AOZ金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的AOZ單克隆抗體或多克隆抗體，AOZ衍生物金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的AOZ衍生物單克隆抗體或多克隆抗體，所述的偶聯(lián)AOZ或偶聯(lián)AOZ衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或?yàn)殡u卵清白蛋白OVA，或?yàn)槿搜灏椎鞍譎SA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征是在樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊及吸水墊上覆蓋有保護(hù)膜，樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有待測(cè)樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向樣品墊一側(cè)約0.5cm處。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試紙卡，其特征是所述的塑料卡由底座和面蓋嵌合在一起構(gòu)成，底座上有放試紙芯的槽以及與面蓋相結(jié)合的卡齒，面蓋有觀察窗和加樣孔以及與底座相結(jié)合的卡齒，觀察窗與試紙芯的包被膜相對(duì)應(yīng)，加樣孔與試紙芯的樣品墊相對(duì)應(yīng)，在觀察窗旁邊分別印有T和C，T表示檢測(cè)線，在靠近加樣孔側(cè)，C表示對(duì)照線，在遠(yuǎn)離加樣孔側(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種呋喃唑酮代謝物膠體金層析檢測(cè)試紙條和試紙卡。試紙條含有襯板、樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、纖維素膜、吸水墊，在試紙條的兩端粘貼有保護(hù)膜，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附呋喃唑酮代謝物AOZ金標(biāo)抗體或AOZ衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在纖維素膜上有用AOZ－載體蛋白偶聯(lián)物或AOZ衍生物－載體蛋白偶聯(lián)物印制的直線式隱形檢測(cè)線，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG印制的直線式隱形對(duì)照線，兩條線平行排列組合為“丨丨”。將不帶保護(hù)膜的試紙芯放在特制的塑料卡中，即得到試紙卡，塑料卡的面板上設(shè)有加樣孔和結(jié)果顯示窗。本發(fā)明的試紙條和試紙卡具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速、直觀、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用范圍廣，成本低，易推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1948965SQ20061010696
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2006年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月1日
發(fā)明者張改平, 楊艷艷, 高玉玲, 李學(xué)伍, 王自良, 趙東, 楊繼飛, 范國(guó)英 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所