專利名稱：一種藥物殘留的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物殘留的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
所謂獸藥殘留是指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及/或其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。獸藥殘留既包括原藥也包括藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。主要的殘留獸藥有抗生素類殘留、激素類殘留和驅(qū)蟲藥類殘留。獸藥通常是通過在預(yù)防和治療動(dòng)物疾病用藥、在飼料添加劑中使用以及在食品保鮮中引入藥物而帶來(lái)對(duì)食品的污染。
獸藥殘留對(duì)人體的危害1.人長(zhǎng)期攝入含獸藥殘留的動(dòng)物源性食品后，獸藥殘留不斷在人體內(nèi)蓄積，當(dāng)積累到一定程度后，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性作用。如磺胺類藥物可引起腎損害，特別是乙?；前吩谀蛑腥芙舛鹊?，析出結(jié)晶后對(duì)腎臟損害更大。
2.經(jīng)常食用一些含低劑量抗菌藥物的食品還能使易感個(gè)體出現(xiàn)過敏反應(yīng)，這些藥物包括青霉素、四環(huán)素、磺胺類藥物及某些氨基糖苷類抗生素等。這些藥物具有抗原性，刺激機(jī)體內(nèi)抗菌素體的形成，造成過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起休克、喉頭水腫、呼吸困難等嚴(yán)重癥狀。呋喃類引起人體的不良反應(yīng)主要是胃腸反應(yīng)和過敏反應(yīng)，表現(xiàn)在以周圍神經(jīng)炎、藥熱、嗜酸性白細(xì)胞增多為特征的過敏反應(yīng)?；前奉愃幬锏倪^敏反應(yīng)表現(xiàn)為皮炎、白細(xì)胞減少、溶血性貧血和藥熱。青霉素藥物引起的變態(tài)反應(yīng)，輕者表現(xiàn)為接觸性皮炎和皮膚反應(yīng)，嚴(yán)重者表現(xiàn)為致死性過敏性休克。
3.動(dòng)物在經(jīng)常反復(fù)接觸某一種抗菌藥物后，其體內(nèi)的敏感菌株將受到選擇性的抑制，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生大量耐藥菌株。如果耐藥菌株傳播到人類身上，將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果。當(dāng)人體發(fā)生疾病時(shí)，就給臨床上感染性疾病的治療帶來(lái)一定的困難，延誤正常的治療。已發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期食用低劑量的抗生素能導(dǎo)致金黃色葡萄菌耐藥菌株的出現(xiàn)，也能引起大腸桿菌耐藥菌株的產(chǎn)生。至今為止，具有耐藥性的微生物通過動(dòng)物性食品轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)時(shí)，對(duì)人體健康產(chǎn)生危害的問題尚未得到解決。
4.在正常條件下，人體內(nèi)有非常多的有益菌，有益菌群能抑制其他菌群的過度繁殖，某些菌群能合成B族維生素和維生素K以供機(jī)體使用。過多應(yīng)用藥物會(huì)使這種平衡發(fā)生紊亂，造成一些非致病菌死亡，使菌群的平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致長(zhǎng)期的腹瀉或引起維生素缺乏等反應(yīng)，造成對(duì)人體的危害。
5.長(zhǎng)期食用含低劑量激素動(dòng)物性食品的后果也不可忽視。
除以上影響以外，獸藥殘留還具有致畸、致癌、致突變作用。
目前對(duì)于這些獸藥殘留的檢測(cè)方法有高效液相色譜分析法(HPLC)和氣象色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(GC/MS)或液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(LC/MS)。這些方法普遍存在著儀器昂貴，方法復(fù)雜，操作繁瑣，試劑消耗量大的局限性。酶聯(lián)免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)技術(shù)以靈敏度高，特異性好，成本低，操作簡(jiǎn)單在獸藥殘留檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。但ELISA試劑盒，價(jià)格昂貴，僅能對(duì)單一的獸藥檢測(cè)，通量較低，且操作費(fèi)時(shí)，不便于進(jìn)行大批量分析。
液相芯片系統(tǒng)是生物芯片領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)展成熟的一項(xiàng)技術(shù)。
液相芯片系統(tǒng)包括液相芯片工作站和不同熒光編碼的微球等。液相芯片工作站是一自動(dòng)化程度極高的檢測(cè)和分析儀器，熒光編碼的微球目前共有100種，可檢測(cè)100種與之相偶聯(lián)的不同種類的目標(biāo)分子。將這些微球懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了一個(gè)液相芯片系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)，可以對(duì)同一個(gè)樣品中的多個(gè)不同的檢測(cè)對(duì)象同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，這種檢測(cè)技術(shù)稱之為xMAP(flexible Multi～AnalyteProfiling)技術(shù)。
在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的微球都帶有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)。在微球的制造過程中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種紅色分類熒光的比例不同，可以把微球分為100種。利用這100種微球，可以標(biāo)記上100種不同的探針分子，同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同的目的分子進(jìn)行檢測(cè)。
為了將不同特性的探針分子偶聯(lián)到微球表面，在微球的表面進(jìn)行了一系列的化學(xué)修飾，可與各種蛋白，肽，核酸等生物分子進(jìn)行偶聯(lián)固定。
將這種標(biāo)記好探針的微球與樣品反應(yīng)。探針可以與相應(yīng)的目標(biāo)分子特異性的結(jié)合，帶有綠色報(bào)告熒光的報(bào)告分子也與目的分子特異性的結(jié)合，本方法適用于定量和定性分析。
檢測(cè)的原理是使微球呈單列高速通過檢測(cè)通道，并使用雙色激光同時(shí)對(duì)微球上的紅色分類熒光和報(bào)告分子上的綠色報(bào)告熒光進(jìn)行檢測(cè)。紅色激光激發(fā)的是微球上的紅色分類熒光，根據(jù)微球的不同熒光編碼，可以將微球分類，從而將各個(gè)不同的分析反應(yīng)區(qū)分開來(lái)。綠色激光激發(fā)的是報(bào)告熒光分子，目的是確定微球上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量。因此，通過紅綠雙色激光的同時(shí)檢測(cè)，可以確定被結(jié)合的待測(cè)物的種類和數(shù)量。由于液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)是的某種熒光編碼的群體信號(hào)，因此可信度更高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)食品安全中的獸藥殘留檢測(cè)種類繁多，檢測(cè)通量需求高的特點(diǎn)，為解決當(dāng)前藥物殘留檢測(cè)中存在的價(jià)格昂貴、樣本需求量大、操作費(fèi)時(shí)、檢測(cè)通量低等缺陷，利用藥物分子的單克隆抗體和偶聯(lián)抗原建立液相芯片競(jìng)爭(zhēng)定量檢測(cè)方法，建立了一種全新的多種藥物殘留檢測(cè)方法。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明提供一種藥物殘留的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)小分子-蛋白偶聯(lián)物與單克隆抗體的預(yù)處理；2)液相芯片系統(tǒng)中微球的活化；3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；4)待測(cè)樣品信號(hào)值的測(cè)定；5)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中藥物殘留的含量。
步驟1)所述的小分子-蛋白偶聯(lián)物與單克隆抗體的預(yù)處理是指先將小分子-蛋白偶聯(lián)物和單克隆抗體分別進(jìn)行純化、除鹽和除雜質(zhì)，然后將抗體與D-生物素偶聯(lián)；所述的小分子是指呋哺唑酮代謝物、喹乙醇和金霉素。
步驟2)所述的液相芯片系統(tǒng)中的微球的活化是指用EDC活化微球上的羧基。
步驟3)所述的制定標(biāo)準(zhǔn)曲線是指用步驟1)預(yù)處理好的抗原標(biāo)準(zhǔn)品，通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)，測(cè)定在不同濃度抗原存在的情況下，液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)到的信號(hào)值，利用抗原濃度和液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)到的信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
步驟4)所述的測(cè)定待測(cè)樣品的信號(hào)值是指將待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理后，加至檢測(cè)試劑中，利用液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)其信號(hào)值。
作為優(yōu)化方案，本發(fā)明所提供的藥物殘留的檢測(cè)方法包括如下步驟1).小分子-蛋白偶聯(lián)物和單克隆抗體的處理用緩沖液，除鹽柱(購(gòu)自SIGMA公司)將小分子-蛋白偶聯(lián)物和單克隆抗體分別進(jìn)行純化、除鹽和除雜質(zhì)，再溶解于適量的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中；A.用30mL PBS 7.4的磷酸鹽緩沖液平衡除鹽柱；B.加入抗體，收集除鹽柱洗脫下的液體，前3mL棄掉；C.用離心管依次收集第4，5，6，7四個(gè)1mL的液體；D.測(cè)定OD280，估算蛋白的量；2).單克隆抗體偶聯(lián)生物素A.將D-BIONTIN(D-生物素)(SIGMA公司)加入第一步得到的抗體中，室溫輕搖1～2小時(shí)；B.生物素標(biāo)記單克隆抗體后，檢測(cè)生物素偶聯(lián)的效率，將過量的D-BIONTIN用透析法除去，凍干；3).液相芯片檢測(cè)藥物殘留的試驗(yàn)A.用漩渦振蕩器或者超聲波懸浮微球(luminex公司)，大約20s；B.取50μL微球于1.5mL的離心管中，8000g離心1～2min，去上清液；C.加入100μL雙蒸水，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s，8000g離心1～2min；D.吸棄上清，加入80μL的磷酸鹽緩沖液(100mM Monobasic Sodium Phosphate，pH 6.2)(配方及試劑來(lái)源見附表)用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；E.加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS(diluted in dH2O)，用漩渦振蕩器混勻；F.加入10μL 50mg/mL EDC(diluted in dH2O)(sigma公司)。用漩渦振蕩器混勻；G.在室溫避光靜置20min，每10min用漩渦振蕩器輕輕的混勻；H.將已經(jīng)活化的微球≥8000g離心1～2min；I.吸棄上清，加入250μL的50mM MES(配方及試劑來(lái)源見附表)，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；J.將微球≥8000g離心1～2min；
K.吸棄上清，加入120μL的50mM MES，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；L.加入0.1μg小分子-蛋白偶聯(lián)物到重懸浮的微球中，用50mM MES，pH 5.0將總體積調(diào)到500μL；M.用漩渦振蕩器混勻，室溫避光搖動(dòng)2hr；N.將微球≥8000g離心1～2min；O.吸棄上清，用250～500μL的PBS-TBN用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s。室溫避光搖動(dòng)30min；P.將微球≥8000g離心1～2min，吸棄上清，加入1mL的PBS-TBN，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；Q.將微球在≥8000g離心1～2min，吸棄上清，用100μL的PBS-TBN重懸浮微球；R.在1.5mL的離心管中依次加入抗原標(biāo)準(zhǔn)品或被檢樣品的前處理產(chǎn)物，5μL偶聯(lián)抗原的微球、生物素標(biāo)記的抗體、最后用PBS補(bǔ)足體積到100μL；S.把反應(yīng)物混勻，避光室溫旋轉(zhuǎn)60min，將SA-PE(藻紅蛋白)(INVITROGEN公司)用PBS-1％OVA稀釋到4μg/mL；T.向每個(gè)反應(yīng)里加25μL的稀釋的SA-PE，把反應(yīng)物混勻，避光室溫旋轉(zhuǎn)30min，上樣50～75μL到LIQUIDCHIP WORK STATION中；U.根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品所得到的信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到樣品對(duì)應(yīng)的濃度值，得出樣品中藥物殘留的濃度。
本發(fā)明所提供的藥物殘留的檢測(cè)方法應(yīng)用于藥物殘留的檢測(cè)。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果如下真正實(shí)現(xiàn)了高通量，可以在一個(gè)流程中同時(shí)對(duì)幾種藥物的殘留情況進(jìn)行檢測(cè)；簡(jiǎn)化了操作程序，有效的降低了檢測(cè)成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間；可以檢測(cè)到pg級(jí)的水平。


圖1呋喃唑酮代謝物殘留、喹乙醇?xì)埩艉徒鹈顾貧埩?個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料如下3-氨基-2惡唑酮(AOZ)單克隆抗體(晶美公司)，金霉素單克隆抗體(晶美公司)，3-甲基喹喔啉(MQCA)單克隆抗體(晶美公司)，卵清蛋白(OVA)與3-氨基-2惡唑酮偶聯(lián)的全抗原OVA-AOZ(晶美公司)卵清蛋白與金霉素偶聯(lián)的全抗原OVA-金霉素(晶美公司)卵清蛋白與3-甲基喹喔啉偶聯(lián)的全抗原OVA-MQCA(晶美公司)液相芯片儀QIAGEN LIQUIDCHIP WORK STATION及配套三種號(hào)碼的微球(QIAGEN公司)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1)在本實(shí)施例中，用33號(hào)微球偶聯(lián)OVA-AOZ，用34號(hào)微球偶聯(lián)OVA-金霉素，用35號(hào)微球偶聯(lián)OVA-MQCA，最后將偶聯(lián)了抗原的微球等比例混在一起，再加入抗體和樣品前處理的待檢物以及標(biāo)準(zhǔn)品。
2)同時(shí)依照同樣的方法作交叉試驗(yàn)。
3)準(zhǔn)備已知量的每種小分子的樣品2個(gè)(一個(gè)1ng，一個(gè)20ng)，做盲實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)方法如下1)用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s。
2)取三種微球各50μL，分別轉(zhuǎn)移到三個(gè)1.5mL的離心管中，離心，去上清。
3)加入100μL的dH2O，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，約20s。
4)≥8000g離心1～2min。
5)吸棄上清，加入80μL的磷酸鹽緩沖液(100mM Monobasic Sodium Phosphate，pH 6.2)，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，約20s，用漩渦振蕩器混勻。
6)加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS(diluted in dH2O)，用漩渦振蕩器混勻。
7)向微球加入10μL 50mg/mL EDC(diluted in dH2O)(SIGMA公司)，用漩渦振蕩器混勻。
8)在室溫避光靜置20min，每10min用漩渦振蕩器輕輕的混勻。
9)將已經(jīng)活化的微球≥8000g離心1～2min。
10)吸棄上清，用250μL的50mM MES(配方見后)，pH 5.0用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，約20s。
11)將微球≥8000g離心1～2min。
12)吸棄上清，用120μL的50mM MES，pH 5.0用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s。
13)分別將加入0.1μg的三種小分子-蛋白偶聯(lián)物到相應(yīng)的三種懸浮的微球中.用50mM MES將總體積調(diào)到500μL。
14)用漩渦振蕩器混勻，在室溫下避光輕搖2hr。
15)將微球在大于等于8000g離心1～2min。
16)吸棄上清，加入250～500μL的PBS-TBN(配方見附表)，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s.在室溫?fù)u30min。
17)將微球≥8000g離心1～2min。
18)吸棄上清，加入1mL到250μL的PBS-TBN用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，約20s。
19)將微球≥8000g離心1～2min。
20)用100μL的PBS-TBN重懸浮微球。
21)將3套微球等體積混合在一起，并分配到6個(gè)試管中。10μL/管。同時(shí)另取四個(gè)試管，做兩份盲樣試驗(yàn)。
22)每個(gè)試管各加入偶聯(lián)了生物素的3種抗體各50ng，和不同濃度的1種或者3種標(biāo)準(zhǔn)抗原(例如0ng，1ng，5ng，10ng，20ng，50ng，具體濃度視情況而定)到6個(gè)管中，用PBS-TBN調(diào)整體積到75μL混勻。
23)避光室溫輕搖60min。
24)將SA-PE(藻紅蛋白)用PBS-1％OVA(卵清蛋白)稀釋到4μg/mL。向每個(gè)反應(yīng)里加25μL的稀釋的SA-PE。用槍上下打幾次把反應(yīng)物混勻。避光室溫輕搖30min。
25)上樣50-75μL到LIQUIDCHIP WORK STATION(液芯工作站)中。
26)檢測(cè)結(jié)果如表1、表2所示。
5.檢測(cè)盲樣的實(shí)驗(yàn)根據(jù)表2結(jié)果，繪制三種小分子作信號(hào)值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見附圖1)。將檢測(cè)到的信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得出盲樣品的量，做比較。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗體梯度和交叉反應(yīng)如表1所示，液相芯片上三種小分子-蛋白偶聯(lián)物和抗體有比較好的特異性反應(yīng)，每種小分子-蛋白偶聯(lián)物與其他抗體的交叉反應(yīng)較低。微球本身的背景值也比較低。
間接競(jìng)爭(zhēng)如表2A，2B，2C，2D可見，三種微球同時(shí)檢測(cè)三種標(biāo)準(zhǔn)品，在每種微球上所得到的信號(hào)值(代表此種標(biāo)準(zhǔn)品的量)和三種微球同時(shí)檢測(cè)一種標(biāo)準(zhǔn)品在此種微球上所得到的信號(hào)值(代表此種標(biāo)準(zhǔn)品的量)是比較相近的，樣品之間的干擾性較低。
檢測(cè)樣品的盲實(shí)驗(yàn)按照表2結(jié)果，繪制信號(hào)值對(duì)小分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3顯示了盲樣品的信號(hào)值和從標(biāo)準(zhǔn)曲線推出的他們的濃度，與實(shí)際濃度比較，偏差比較小。
表1液相芯片上三種小分子-蛋白偶聯(lián)物和抗體的特異性實(shí)驗(yàn)和交叉實(shí)驗(yàn)
表2A 表2B 表2C

表2D

表3

結(jié)果分析呋喃唑酮，喹乙醇，金霉素等在動(dòng)物性產(chǎn)品中的殘留，對(duì)人體具有明顯的急慢性毒性，包括癌癥和染色體突變等特殊毒性，直接危害國(guó)民的身體健康及生命。這些藥物的大量使用對(duì)畜禽健康也構(gòu)成直接威脅。目前對(duì)于這些獸藥殘留的檢測(cè)方法有高效液相色譜分析法(HPLC)和氣象色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(GC/MS)或液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(LC/MS)。這些方法普遍存在著儀器昂貴，方法復(fù)雜，操作繁瑣，試劑消耗量大的局限性。酶聯(lián)免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)技術(shù)以靈敏度高，特異性好，成本低，操作簡(jiǎn)單在獸藥殘留檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。但我國(guó)的免疫試劑盒的研究與開發(fā)大部分處在研發(fā)階段，目前主要依靠國(guó)外進(jìn)口的ELISA試劑盒，價(jià)格昂貴，且僅能對(duì)單一的獸藥檢測(cè)，對(duì)樣本的需求量大，且操作費(fèi)時(shí)，不便于進(jìn)行大批量分析。
與傳統(tǒng)的ELISA分析相比，流式液相芯片技術(shù)比ELISA的靈敏度高10倍左右，準(zhǔn)確性好，需要的樣本量和試劑少，監(jiān)測(cè)過程操作比現(xiàn)有方法更簡(jiǎn)便，不需要洗板步驟；流式液相芯片的穩(wěn)定性，可重復(fù)性好，批間差異非常少；液相環(huán)境更有利于探針和被檢測(cè)物的反應(yīng)；流式液相芯片的定量線性范圍廣，比ELISA多兩個(gè)數(shù)量級(jí)；可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，真正具備高通量的特點(diǎn)，有效降低成本60％以上，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。所以流式液相芯片技術(shù)更具有實(shí)用價(jià)值，因此我們開展此項(xiàng)研究。
高通量，穩(wěn)定性和靈敏度是對(duì)所有檢測(cè)方法的要求。流式液相芯片技術(shù)采用熒光編碼的微球?yàn)榘换|(zhì)，解決了在同一反應(yīng)體系中同時(shí)識(shí)別多個(gè)不同的探針的問題，從而實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高通量。在本試驗(yàn)中，我們用衍生合成的抗原包被微球，保證了捕獲被檢測(cè)物的探針的特異性。在抗體的制備中，我們用蛋白A柱加親和層析的方法純化抗體。最后的抗體的純度在95％以上。經(jīng)驗(yàn)證三種抗體和四環(huán)素，土霉素，強(qiáng)力霉素及呋喃他酮的交叉反應(yīng)率小于3％，并且在交叉試驗(yàn)中得到了三種抗體與三種抗原之間的交叉反應(yīng)率小于5％，從而保證了三種反應(yīng)在同一體系中進(jìn)行。試驗(yàn)中我們同時(shí)做了直接競(jìng)爭(zhēng)和間接競(jìng)爭(zhēng)兩套方案，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)間接競(jìng)爭(zhēng)的效果更好一些。所以最后我們采取了用抗原偶聯(lián)微球，再加入被檢測(cè)物和抗體，用偶聯(lián)微球的抗原和被檢測(cè)物同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)法。通過三種小分子-蛋白偶聯(lián)物濃度的篩選，封閉液等條件的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的靈敏度。可以檢測(cè)到pg級(jí)的水平。
為了檢驗(yàn)本方法的可行性，我們做了大量的盲樣及與ELISA檢測(cè)方法的對(duì)比，通過試驗(yàn)可以看出，液態(tài)芯片的靈敏度更高，在更低的蛋白質(zhì)濃度下，曲線即呈現(xiàn)線性趨勢(shì)。并且實(shí)現(xiàn)了一個(gè)反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)三種獸殘的目的。同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間，2hr內(nèi)即可完成樣品處理和檢測(cè)，得出精確的結(jié)果。為大批量的樣品檢驗(yàn)縮短了時(shí)間，提供了保證。
本方法的建立為解決如何更快，更精確地檢測(cè)獸藥殘留找到了一條新的途徑，相信在這個(gè)平臺(tái)上我們將會(huì)開發(fā)出更多新的產(chǎn)品，以解決目前在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域所存在的問題和不足。
附表各種試劑的配方0.1M NaH2PO4pH 6.2 (Activation Buffer) 250mL

附表各種試劑的配方0.1M NaH2PO4pH 6.2 (Activation Buffer) 250mL

Filter Sterilize and store at 4℃0.05M MES，pH 5.0 (Coupling Buffer)* 250mL

Filter Sterilize and store at 4℃PBS pH 7.4 (Alternate Coupling Buffer)**1000mL

Filter Sterilize and store at 4℃PBS，1％OVA，0.05％Azide pH 7.4 (PBS-TONBlocking/Storage Buffer) 1000mL

Filter Sterilize and store at 4℃
PBS，0.1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％Azide pH 7.41000mL(PBS-TN Blocking/Storage Buffer)

Filter Sterilize and store at 4℃PBS.1％OVA (Assay Buffer)1000mL

Filter Sterilize and store at 4℃
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟1)小分子-蛋白偶聯(lián)物與單克隆抗體的預(yù)處理；2)液相芯片系統(tǒng)中微球的活化；3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；4)待測(cè)樣品信號(hào)值的測(cè)定；5)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中藥物殘留的含量
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于步驟1)所述的小分子-蛋白偶聯(lián)物與單克隆抗體的預(yù)處理是指先將小分子-蛋白偶聯(lián)物和單克隆抗體分別進(jìn)行純化除鹽和除雜質(zhì)，然后將抗體與D-生物素偶聯(lián)
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于步驟1)所述的小分子是指呋喃唑酮代謝物喹乙醇和金霉素
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于步驟2)所述的液相芯片系統(tǒng)中的微球的活化是指用EDC活化微球上的羧基
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于步驟3)所述的制定標(biāo)準(zhǔn)曲線是指用步驟1)預(yù)處理好的抗原標(biāo)準(zhǔn)品，通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)，測(cè)定在不同濃度抗原存在的情況下，液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)到的信號(hào)值，利用抗原濃度和液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)到的信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于步驟4)所述的測(cè)定待測(cè)樣品的信號(hào)值是指將待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理后，加至檢測(cè)試劑中，利用液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)其信號(hào)值
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的藥物殘留的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟1).小分子-蛋白偶聯(lián)物和單克隆抗體的處理A.用30mL PBS 7.4的磷酸鹽緩沖液平衡除鹽柱；B.加入抗體，收集除鹽柱洗脫下的液體，前3mL棄掉；C.用離心管依次收集第4，5，6，7四個(gè)1mL的液體；D.測(cè)定OD280，估算蛋白的量；2).單克隆抗體偶聯(lián)生物素A.將D-BIONTIN加入第一步得到的抗體中，室溫輕搖1～2小時(shí)；B.生物素標(biāo)記單克隆抗體后，檢測(cè)生物素偶聯(lián)的效率，將過量的D-BIONTIN用透析法除去，凍干；3).液相芯片檢測(cè)藥物殘留的試驗(yàn)A.用漩渦振蕩器或者超聲波懸浮微球，大約20s；B.取50μL微球于1.5mL的離心管中，8000g離心1～2min，去上清液；C.加入100μL雙蒸水，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s，8000g離心1～2min；D.吸棄上清，加入80μL的磷酸鹽緩沖液用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；E.加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用漩渦振蕩器混勻；F.加入10μL 50mg/mL EDC，用漩渦振蕩器混勻；G.在室溫避光靜置20min，每10min用漩渦振蕩器輕輕的混勻；H.將已經(jīng)活化的微球≥8000g離心1～2min；I.吸棄上清，加入250μL的50mM MES，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；J.將微球≥8000g離心1～2min；K.吸棄上清，加入120μL的50mM MES，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；L.加入0.1μg小分子-蛋白偶聯(lián)物到重懸浮的微球中。用50mM MES，pH5.0將總體積調(diào)到500μL；M.用漩渦振蕩器混勻，室溫避光搖動(dòng)2hr；N.將微球≥8000g離心1～2min；O.吸棄上清，用250～500μL的PBS-TBN用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s室溫避光搖動(dòng)30min；P.將微球≥8000g離心1～2min，吸棄上清，加入1mL的PBS-TBN，用漩渦振蕩器或者超聲波重懸浮微球，大約20s；Q.將微球在≥8000g離心1～2min，吸棄上清，用10μL的PBS-TBN重懸浮微球；R.在1.5mL的離心管中依次加入抗原標(biāo)準(zhǔn)品或被檢樣品的前處理產(chǎn)物，5μL偶聯(lián)抗原的微球生物素標(biāo)記的抗體最后用PBS補(bǔ)足體積到100μL；S.把反應(yīng)物混勻，避光室溫旋轉(zhuǎn)60min，將SA-PE用PBS-1％OVA稀釋到4μg/mL；T.向每個(gè)反應(yīng)里加25μL的稀釋的SA-PE，把反應(yīng)物混勻，避光室溫旋轉(zhuǎn)30min，上樣50～75μL到LIQUIDCHIP WORK STATION中；U.根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品所得到的信號(hào)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到樣品對(duì)應(yīng)的濃度值，得出樣品中藥物殘留的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物殘留的檢測(cè)方法，針對(duì)食品安全中的獸藥殘留檢測(cè)種類繁多，檢測(cè)通量需求高的特點(diǎn)，為解決當(dāng)前藥物殘留檢測(cè)中存在的價(jià)格昂貴、樣本需求量大、操作費(fèi)時(shí)、檢測(cè)通量低等缺陷，利用藥物分子的單克隆抗體和偶聯(lián)抗原建立液相芯片競(jìng)爭(zhēng)定量檢測(cè)方法，建立了一種全新的多種藥物殘留檢測(cè)方法，包括如下步驟1).小分子－蛋白偶聯(lián)物與單克隆抗體的預(yù)處理；2).液相芯片系統(tǒng)中微球的活化；3).標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；4).待測(cè)樣品信號(hào)值的測(cè)定；5).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中藥物殘留的含量。真正實(shí)現(xiàn)了高通量，可以在一個(gè)流程中同時(shí)對(duì)幾種藥物的殘留情況進(jìn)行檢測(cè)；簡(jiǎn)化了操作程序，有效的降低了檢測(cè)成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1825118SQ200610067180
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2006年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者王蕾, 陳書琨, 琴智鋒, 汪朝暉, 崔志君, 林明祥, 陳大軍 申請(qǐng)人:北京盈九思科技發(fā)展有限公司