專利名稱：分子間隔臂、其制備方法、以及在包含分子或生物分子的分析芯片上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子間隔臂、用于制備將分子單元連接到固相載體的間隔臂的方法、以及這種間隔臂在包含分子或生物分子的分析芯片上的應(yīng)用。
在以下的披露內(nèi)容中，方括號[]之間的標(biāo)記指代在說明書末尾列出的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明針對的分析芯片更具體地，但不是唯一地，為生物芯片和用于生物分析的微系統(tǒng)。可將它們分成三類DNA芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-chip)以及細(xì)胞芯片(cell-on-chip)。
當(dāng)前，出現(xiàn)了新型的芯片糖芯片(glycochip)。這種生物芯片或者是天然或合成物質(zhì)沉積的結(jié)果，或者是各種寡糖序列的支持的多步平行合成(組合化學(xué))的結(jié)果，寡糖表現(xiàn)了某些大類的內(nèi)源性糖綴合物的分子多樣性，例如硫酸乙酰肝素。本發(fā)明尤其適用于這種新型的生物芯片，因?yàn)槠溆绕湓试S利用化學(xué)方法將這些分子連接到生物芯片載體，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該化學(xué)方法有效并且簡單。
可通過本發(fā)明的間隔臂連接到固相載體的分子或生物分子(特此稱為“分子單元”)可以為例如核酸(DNA或RNA)、糖、糖蛋白、糖脂等。其他的進(jìn)一步實(shí)例在下面給出。
背景技術(shù)：
在大多數(shù)生物芯片中，間隔物(spacer)提供固相載體[2]和例如寡肽、寡核苷酸[3]或寡糖[4]探針之間的連接。這種間隔物可以同時(shí)起多種作用連接分子、空間隔開臂、探針斷裂的部位等。
實(shí)際上，載體通過探針接近目標(biāo)的識別部位可阻礙、或甚至阻止探針/目標(biāo)識別，并因此損害生物芯片的分析精度和質(zhì)量。當(dāng)探針較小時(shí)，例如在糖芯片的情形中，尤其如此。
下面的原理公式表示間隔物的形成然后斷裂的總圖解，其中X’表示固相載體，而X”為分子單元。
到目前為止，已生產(chǎn)了許多間隔臂，但是它們具有某些未解決的缺點(diǎn)。具體地說，它們的結(jié)構(gòu)對可用來將它們連接到固相載體的化學(xué)方法具有嚴(yán)格限制，和/或它們不可能容易地連接任何類型的生物分子，和/或它們是如此化學(xué)上穩(wěn)定的，以至于一旦連接到固相載體，它們就不容易被斷裂以便恢復(fù)生物分子，并且所述斷裂可導(dǎo)致所述分子或載體的破壞。
文獻(xiàn)[4](US-A-6,579,725)描述了用于連接寡糖的間隔臂。盡管比其他更早的現(xiàn)有技術(shù)的間隔臂更有效，但是這種間隔臂沒有可能同時(shí)解決所有上述問題。還會注意到，不能一直如所希望的那樣產(chǎn)生其長度、官能度、反應(yīng)性以及阻礙性。

發(fā)明內(nèi)容
準(zhǔn)確地說，本發(fā)明通過提供下式(I)的分子間隔臂使得同時(shí)解決現(xiàn)有技術(shù)的所有上述問題成為可能 其中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、以及R3為如下X0和X4各自獨(dú)立于其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As以及Si；X1、X2和X3各自獨(dú)立于其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As和Si，以及選自各自含有例如2～20個(gè)碳原子的芳基或雜芳基；Z1和Z2各自獨(dú)立于其他取代基地選自C-R、Si-R、C、N、P以及As，其中R為含有例如1～40個(gè)碳原子的烷基；
R1、R2和R3各自獨(dú)立于其他取代基地選自H、烷基、芳基以及雜芳基，每個(gè)含有2～20個(gè)碳原子；[Gp]表示保護(hù)仲胺-N-的基團(tuán)或參與間隔臂官能化的分子；其中，n、m和p各自為大于或等于1的整數(shù)并彼此獨(dú)立地進(jìn)行選擇，優(yōu)選地為1≤n、m和p≤40；其中，[Sup]表示H或所述間隔臂可共價(jià)連接的硅烷化固相載體；其中，[mo]表示H或用于通過所述間隔臂共價(jià)連接到所述硅烷化固相載體的分子單元。
當(dāng)然，X0至X4為形成本發(fā)明的間隔臂主鏈的原子，例如選自H、O、各含有2～20個(gè)碳原子的烷基、芳基以及雜芳基的基團(tuán)可能連接到這些原子。
這種間隔臂(I)可通常用于將分子單元[mo]連接到固相載體[Sup]，例如為了制造生物芯片，或者更有利地用于制造糖芯片，其中[mo]通常為使所述生物芯片官能化(功能化)的分子。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，在上面定義的間隔臂[1]中X0和X4各自獨(dú)立于其他取代基地選自C、O、N、S以及Si；和/或X1、X2和X3各自獨(dú)立于其他取代基地選自C、O、N、S和Si，以及選自各含有例如2～10個(gè)碳原子的芳基或雜芳基；和/或
Z1和Z2各自可獨(dú)立于其他取代基地選自C、N、C-R以及Si-R，其中R為含有1～30個(gè)碳原子，優(yōu)選1～20個(gè)碳原子，更優(yōu)選1～10個(gè)碳原子的烷基；和/或R1、R2和R3各自可獨(dú)立于其他取代基地選自H，烷基、芳基以及雜芳基，每個(gè)含有2～10個(gè)碳原子；根據(jù)本發(fā)明，n、m和p也可彼此獨(dú)立地進(jìn)行選擇，使得1≤n、m和p≤30，優(yōu)選為1≤n、m和p≤20，并且更優(yōu)選為1≤n、m和p≤10。
根據(jù)本發(fā)明，作為實(shí)例，在上面定義的間隔臂[1]中，X0和X4為C；X1、X2和X3為C；Z1和Z2為C；并且R1、R2和R3為H。
根據(jù)本發(fā)明，保護(hù)基團(tuán)[Gp]可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何保護(hù)仲胺的基團(tuán)。優(yōu)選那些能夠經(jīng)受住用于合成間隔臂、用于將其連接到載體以及用于將其連接到分子單元[mo]的化學(xué)反應(yīng)的基團(tuán)。其可選自例如Ac、Bn(芐基)、C1～C40芳基(R)、Troc、z、TCA、BOC、Fmoc等，以便與間隔臂(I)的仲胺一起形成以下化學(xué)基團(tuán)中的一種(＞N-表示受保護(hù)的仲胺)＞N-Ac乙酰胺(＞N-CO-Me)；＞N-Bn苯甲酰胺；＞N-RC1～C40芳酰胺；＞N-Troc氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(＞N-C(O)OCH2CCl3)；＞N-z氨基甲酸芐酯(＞N-C(O)OCH2Ph)；＞N-TCA三氯乙酰胺(＞N-CO-CCl3)；＞N-BOC氨基甲酸叔丁酯(＞N-C(O)OCMe3)；＞N-Fmoc氨基甲酸9-芴基甲酯 (Ph＝苯基并且Me＝甲基)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地保護(hù)基團(tuán)選自Ac、BOC或C1～C40芳基。
根據(jù)本發(fā)明，參與間隔臂官能化的分子[Gp]可以為例如C1～C40、例如C1～C30、例如C1～C20或C1～C10烷基或芳基。其可為任何取代基(不必需是保護(hù)性的)，當(dāng)使用時(shí)，該取代基可參與間隔臂的官能化。其可以為例如疏水基，可以使得間隔臂相對于要進(jìn)行連接的分子[mo]和/或其在間隔臂使用(例如，用在糖芯片或蛋白芯片上)過程中的作用變得更加特異的和/或更加有選擇性的。
根據(jù)本發(fā)明，固相載體可以為例如任何可被硅烷化的載體。其可以是例如板、小珠(billes)或毛細(xì)管。其可以是例如基于硅土、玻璃或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的材料，例如用于制備生物芯片的載體或表面。載體的硅烷化可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，分子單元[mo]可為天然或合成的分子。例如由于分析的原因，其可為任何必須連接到載體的分子。其可以是小分子，例如具有在約180～400000g.mol-1范圍內(nèi)的分子量。當(dāng)其是糖(sugar)時(shí)，[mo]可具有例如在180～10000g.mol-1范圍內(nèi)的分子量。當(dāng)其是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，[mo]可具有例如在5500～400000g.mol-1范圍內(nèi)，通常在5500～220000g.mol-1范圍內(nèi)(大多數(shù)蛋白質(zhì)的分子量)的分子量。
這種分子單元[mo]可為例如選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物、肽、蛋白質(zhì)、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂、糖脂蛋白等。
在單糖之中，可以提到的是葡萄糖、葡萄糖胺、疊氮葡萄糖胺、D-核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、2-脫氧-D-核糖、L-巖藻糖、N-乙?；?D-葡萄糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺、N-乙酰基-神經(jīng)氨酸、D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-山梨醇、D-甘露醇等。
在寡糖之中，可以提到的是蔗糖，乳糖，硫酸乙酰肝素片段，肝素、軟骨素、硫酸皮膚素的糖片段，劉易斯抗原等。
在多聚寡糖之中，可以提到的是硫酸乙酰肝素、肝素、軟骨素、硫酸皮膚素等的糖部分。
在糖綴合物之中，可以提到的是硫酸乙酰肝素、肝素、軟骨素、硫酸皮膚素等。
在肽和蛋白質(zhì)之中，可以提到的是趨化因子、細(xì)胞因子(細(xì)胞活素)、胰島素、纖維蛋白原、肌球蛋白、血紅蛋白等。
在酶之中，可以提到的是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶。
在糖蛋白之中，可以提到的是免疫球蛋白G、透明質(zhì)酸等。
在脂之中，可以提到的是水解類脂脂肪(甘油+3個(gè)脂肪酸)、蠟(脂肪酸+脂肪醇)、固醇酯(固醇+脂肪酸)、磷脂(磷脂酸(甘油、2脂肪酸+磷酸酯或磷酸鹽))、磷脂質(zhì)(甘油+2脂肪酸+磷酸酯或磷酸鹽)、鞘脂(鞘氨醇+脂肪酸+磷酸酯或磷酸鹽+氨基醇)；非水解類脂烷烴、類胡蘿卜素、固醇(膽固醇)、類固醇(雌二醇、睪酮)、酸(脂肪酸)、二十酸等。
在脂肪酸之中，可以提到的是花生四烯酸、亞油酸、亞麻酸、月桂酸、神經(jīng)酸、棕櫚酸、油酸等。
在糖脂之中，可以提到的是半乳糖神經(jīng)酰胺、葡(萄)糖神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂、腦苷脂(脂肪酸+鞘氨醇+1糖)、神經(jīng)節(jié)苷脂(脂肪酸+鞘氨醇+多個(gè)糖、神經(jīng)氨酸)等。
在糖脂蛋白之中，提到的可以是MPB83(商標(biāo)名)、GLP19(商標(biāo)名)以及IRBP(商標(biāo)名)。
本發(fā)明還涉及用于通過間隔臂(有利地為本發(fā)明的間隔臂)將分子單元[mo]共價(jià)連接到固相載體的方法。
該方法可包括以下步驟(i)還原下式的化合物的腈官能團(tuán) (ii)從下式的生物分子的烯丙基官能團(tuán)形成醛官能團(tuán)
(iii)在所述經(jīng)還原的腈官能團(tuán)和所述醛官能團(tuán)之間，進(jìn)行還原性胺化，接著對形成的仲胺進(jìn)行保護(hù)，以便獲得活化的生物分子，用于連接到載體，所述活化的生物分子為下式 (iv)固相載體硅烷化，以及具有下式的分子的硅烷化載體的官能化 (v)在使載體官能化的分子和活化的生物分子之間進(jìn)行復(fù)分解反應(yīng)，以便形成根據(jù)本發(fā)明的連接生物分子和載體的間隔臂。
在這個(gè)方法中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、R3以及[mo]為如上文所定義的。
根據(jù)本發(fā)明，下式的化合物
可以是例如烯丙基化的糖，[mo]為所述糖。這種烯丙基化的糖可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法獲得，其中該方法不會損壞糖。其可以是例如在文獻(xiàn)[5]中所描述的方法。
根據(jù)本發(fā)明，仲胺也可用保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。因此，本發(fā)明的方法還可包括將保護(hù)基團(tuán)[Gp]連接到仲胺官能團(tuán)上的步驟。保護(hù)基團(tuán)可以是如上文所定義的。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何化學(xué)方法將其連接到仲胺，例如根據(jù)在文獻(xiàn)[7]中所描述的方法之一進(jìn)行。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明這種方法的各個(gè)步驟，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的有機(jī)化學(xué)方法。這樣，作為實(shí)例，對于腈還原的步驟，可使用在文獻(xiàn)[6]中描述的方法。對于從生物分子的烯丙基官能團(tuán)形成醛官能團(tuán)的步驟，可使用在文獻(xiàn)[5]中描述的臭氧分解方法。對于在經(jīng)還原的腈官能團(tuán)和所述醛官能團(tuán)之間進(jìn)行還原性胺化、接著對氮進(jìn)行保護(hù)以便獲得活化的生物分子的步驟，可使用在文獻(xiàn)[7]中描述的方法。對于固相載體的硅烷化及其官能化的步驟，可使用在文獻(xiàn)[8]中描述的方法。對于復(fù)分解反應(yīng)，可使用在文獻(xiàn)[10]中描述的方法。
因此，本發(fā)明的間隔臂可由相連的三個(gè)部分形成，首先，通過還原性胺化接著通過對在分子單元一側(cè)的氮進(jìn)行保護(hù)，其次，用格拉布斯(Grubbs)復(fù)分解反應(yīng)。格拉布斯復(fù)分解是例如在文獻(xiàn)[11]中所描述的。
插入碳鏈的氮原子具有若干優(yōu)點(diǎn)在兩個(gè)鏈段的連接過程中獲得，其為可用各種方式進(jìn)行保護(hù)的仲胺形式，以便賦予間隔物特定的反應(yīng)性。該官能團(tuán)可有利地按情況通過用各種保護(hù)基團(tuán)或用參與間隔臂的官能化的分子進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得可以改變和控制間隔臂的親水性或疏水性，并且控制其空間位阻。還有利地有可能調(diào)節(jié)間隔臂該部分的親電/親核或酸/堿性因此氮原子保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)優(yōu)選為了優(yōu)化反應(yīng)、相互作用、包括表征或分析的操作的條件進(jìn)行選擇，無論在間隔區(qū)斷裂以便釋放分子單元之前或之后。例如，利用乙?；鶊F(tuán)，由于其小尺寸，所以獲得較小的空間位阻，這在使用間隔臂，例如在分子芯片上使用時(shí)可使分子識別最優(yōu)化。又例如，利用丁基基團(tuán)，獲得疏水碳基取代基，其使間隔臂的該部分具有疏水性，這使得例如親水蛋白質(zhì)對間隔臂的親水部分的識別更具特定性和更具選擇性([mo])。
因此，本發(fā)明提供了可調(diào)節(jié)的間隔臂(或“間隔物”)，其不同的結(jié)構(gòu)影響臂的反應(yīng)性，即，其化學(xué)和/或電化學(xué)和/或空間行為。
本發(fā)明可簡單并有效地加以實(shí)現(xiàn)，并且間隔物有利地具有以下三種性能，尤其是當(dāng)其用于糖芯片的制造時(shí)首先，間隔物成功地執(zhí)行臂的功能，以將糖鏈與支撐該鏈的固體表面隔開；接著，隔離物是可斷裂的臂這就有可能容易地并以靶向的方式打開間隔物，以便將糖從支撐相分離出來；最后，借助間隔物的較低程度的化學(xué)官能度，在用于例如糖單元上的有機(jī)合成過程中進(jìn)行的反應(yīng)的許多條件下和當(dāng)使用糖芯片時(shí)，間隔物保持惰性。
除了本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)外，發(fā)明人在進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)過程中還注意到以下幾方面由于存在固相載體，所以間隔臂使克服空間問題成為可能。其使得可以在良好空間條件下，研究蛋白質(zhì)/糖在獲得的糖芯片上的相互作用。其解決了空間位阻問題，該空間位阻問題是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)靠近糖配體時(shí)在現(xiàn)有技術(shù)中表現(xiàn)出來并且對后面潛在的相互作用有害。
可調(diào)節(jié)臂的長度不同大小的功能性同系物的一種明智的選擇，尤其通過起始反應(yīng)物的選擇，使得制備不同大小的間隔物成為可能。
不僅有可能選擇在糖鏈和固相載體之間的距離，而且有可能通過保護(hù)基團(tuán)控制間隔物的這個(gè)部分的親水或疏水性。
間隔物化學(xué)結(jié)構(gòu)的簡化，在制造它時(shí)和當(dāng)使用糖芯片時(shí)，賦予間隔物在許多有機(jī)反應(yīng)過程中的無化學(xué)活性的性能。
由于間隔物缺少相互作用的化學(xué)官能團(tuán)，所以當(dāng)系統(tǒng)用于糖芯片或更一般性地在小分子芯片的方面，間隔區(qū)對與其他分子的可能相互作用沒有影響。
在不損壞生物分子、例如寡糖分子的反應(yīng)條件下，可將間隔物在其C＝C雙鍵處精確并選擇性地?cái)嗔?。?shí)際上，可方便地使用例如臭氧(O3)分解、格拉布斯復(fù)分解(格拉布斯催化劑)、或二羥基化接著進(jìn)行二醇鋨化(diolosmylation)氧化斷裂(OsO4、NaIO4)、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他溫和化學(xué)反應(yīng)用于所述斷裂。
間隔區(qū)易于斷裂并且這種斷裂不會改變糖的結(jié)構(gòu)的事實(shí)，使得可以對分離出來的寡糖鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的分析控制。還易于計(jì)算在糖合成過程中連接(“加載”)到固相載體的糖探針的數(shù)量。
相比于在文獻(xiàn)[1]中描述的間隔物(例如，辛二醇)，這種間隔區(qū)的優(yōu)點(diǎn)之一在于其長度、官能度、反應(yīng)性以及空間位阻的適應(yīng)性可如所希望的產(chǎn)生。
發(fā)明人還注意到，本發(fā)明的間隔物允許結(jié)合極大范圍的糖、寡糖或多糖，該糖、寡糖或多糖非常普遍地被預(yù)先合成并在相對于它們還原部分的異頭(anomerique)位置用烯丙基基團(tuán)加以保護(hù)。實(shí)際上，這些糖單元可通過一個(gè)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以便直接連接到間隔物上。因此，這種間隔物有利地與許多糖分子相容，如在文獻(xiàn)例如在文獻(xiàn)[7]、[12]以及[13]中已經(jīng)合成并描述的。
本發(fā)明可用于例如糖芯片、例如能夠通過篩選確定那些識別特定蛋白質(zhì)的寡糖序列(例如根據(jù)在文獻(xiàn)[1]中描述的技術(shù))的芯片的制造。在這種應(yīng)用中，本發(fā)明可以優(yōu)化篩選方法，并因此更有效地和更快速地具有(disposer)用于治療或生物技術(shù)用途的分子?？梢灶A(yù)計(jì)，在本發(fā)明的其他應(yīng)用中也存在這種能力。
本發(fā)明還可用到生物芯片上，在生物芯片中間隔臂必須形成固相載體和寡肽探針、寡核苷酸探針和/或寡糖探針之間的連接。尤其，本發(fā)明的間隔臂可用到寡肽芯片如在文獻(xiàn)[3]中描述的芯片上，或用到寡糖芯片如在文獻(xiàn)[4]中描述的芯片上。
通過閱讀作為說明性的以下實(shí)施例，其他特征和優(yōu)點(diǎn)對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說也將顯而易見。
具體實(shí)施例方式
1)通過實(shí)施例，以下披露了利用那些選自本領(lǐng)域技術(shù)人員易得到的那些方法進(jìn)行的間隔物的合成，該間隔物具有相應(yīng)于十四個(gè)碳的鏈的長度。以下用黑體字的標(biāo)記對應(yīng)反應(yīng)圖解。
所選化合物為構(gòu)成分子單元[mo]的葡萄糖型(1)的單糖(1)(N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNac)在1-位烯丙基化的糖)；帶有待還原的腈官能團(tuán)的4-戊烯腈(3)；以及用于載體官能化的7-辛烯基三甲氧基硅烷(8)。固相載體由基于二氧化硅的可控孔度玻璃珠(CPG)(商標(biāo)名)(6)構(gòu)成。
以下的反應(yīng)圖解概括了在這些實(shí)施例中采用的借助根據(jù)本發(fā)明的間隔臂用來將寡糖(1)連接到載體(6)的所有化學(xué)反應(yīng)。這些化學(xué)反應(yīng)用字母A到F表示。包括間隔臂斷裂的反應(yīng)的實(shí)例在以下的實(shí)施例G中提出。
對于這個(gè)反應(yīng)圖解，在糖上表示的基團(tuán)“R”并沒有有意地進(jìn)行區(qū)分以便簡化表述。這些“R”基團(tuán)表示在形成糖的環(huán)上的各個(gè)位置的取代基，其可以彼此相同或不相同，并且其可以是通常在糖上遇到的取代基。在本文提出的具體實(shí)施例中，使用的糖為N-乙?；咸烟前罚绢I(lǐng)域技術(shù)人員可以毫無困難地確定在化合物(1)、(2)、(5)以及(10)的不同位置上的取代基“R”。
實(shí)施例A寡糖的活化(反應(yīng)A)在這個(gè)實(shí)施例中使用了臭氧分解反應(yīng)。在文獻(xiàn)[5]中描述了所使用的該方法。
將在異頭位置烯丙基化的糖(1)(0.93mmol)溶解在5ml的二氯甲烷和甲醇(1/1)的混合物中將介質(zhì)侵入溫度為-78℃的冷浴(丙酮+干冰)中。然后必須將臭氧O3鼓泡通入溶液中一出現(xiàn)藍(lán)色(臭氧過量的特征)，就用氬氣(或氮?dú)?代替臭氧。反應(yīng)完成時(shí)，通過加入二甲基硫Me2S(4.65mmol，5eq)對介質(zhì)進(jìn)行還原然后形成二甲基亞砜DMSO。過了整夜，介質(zhì)慢慢地回復(fù)到環(huán)境溫度，然后在真空下加以蒸發(fā)有機(jī)殘留物用二乙醚Et2O進(jìn)行提取，然后用水洗滌。將有機(jī)相在真空下蒸發(fā)，然后與甲苯一起共蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(洗提液石油醚/乙酸乙酯8/2)加以純化。
這樣，以75％的產(chǎn)率獲得醛(2)。
實(shí)施例B腈的還原(反應(yīng)B)在文獻(xiàn)[6]中描述了所使用的方法。
將氫化鋁鋰LiAlH4(381mg，10.03mmol，1eq)加入到新蒸餾的二乙醚(20ml)中。
將4-戊烯腈(3)(814mg，1ml，10.03mmol)慢慢加入到溫度為0℃(冰浴)、氮?dú)夥障逻M(jìn)行攪拌的反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌在環(huán)境溫度下必須連續(xù)進(jìn)行大約20分鐘。
接著，將水(0.4ml)、然后是20％的氫氧化鈉水溶液(0.3ml)、以及最后另一量的水(1.4ml)加入這些加入的進(jìn)行必須十分小心，因?yàn)橹泻妥饔每赡軇×?。?dāng)通過沉淀將二乙醚溶液與無機(jī)白色殘留物分離時(shí)，萃取上清液。
用二乙醚洗滌白色固體(殘留物)兩次，并將有機(jī)相合并。將3M的鹽酸HCl溶液加入到該有機(jī)相中，以便獲得酸性pH(pH＜7)沒有進(jìn)行反應(yīng)的4-戊烯腈保留在醚相中，而胺進(jìn)入到水相中。
因此在萃取之后，保存水相并將3M的氫氧化鈉NaOH溶液加入其中，以使pH變?yōu)閴A性pH(pH＞7)然后胺化的產(chǎn)物在這次新的萃取中將進(jìn)入醚相中。因此將萃取的醚相用硫酸鎂(MgSO4)進(jìn)行干燥，然后在真空下蒸發(fā)(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)。
然后通過分餾(球爐，T≈96℃±9℃)將粗胺(4)純化。
1H NMR分析(Brücker AM 250)
5.82(ddt，3Jtrans＝18Hz，3Jcis＝13Hz，3J(H1)＝6.5Hz，1H，CH＝)，5.00(m，2H，CH2＝)，2.70(t，3JII)＝6.5Hz，2H，CHIII)，2.10(ttd，3J(HII)＝6.5Hz，3J(HC)＝6.5Hz，3J(H2C-)＝1.5Hz，2H，CHI)，1.70(s，2H，NH2)，1.56(quint.，3J(HII)＝3J(HIII)＝6.5Hz，2H，CHII)。
13C NMR分析(Brücker AM 250)138.6(CH＝)，114.6(CH2＝)，42.0(CH2-N)，33.1(CH2)，31.4(CH2)。
實(shí)施例C還原性胺化(反應(yīng)C)在文獻(xiàn)[7]中描述了所使用的化學(xué)方法。
將醛(2)(20.87mmol)溶解到通過氫化鈣(CaH2)新蒸餾的二甲基甲酰胺(1.2ml)中攪拌介質(zhì)并加入胺(4)(31.30mmol，2eq)。在約20分鐘后，將氰基硼氫化鈉NaBH3CN(83.47mmol，4eq)加入到混合物中，將該混合物在環(huán)境溫度下持續(xù)攪拌整夜。
如果反應(yīng)沒有完成，則可以再加入NaBH3CN(1eq)。接著，當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，將吡啶(2.4ml)和乙酸酐(83.47mmol，2eq/胺)加入到混合物中。
當(dāng)反應(yīng)完成(在加入之后約1小時(shí))時(shí)，用二乙醚和水萃取粗化合物。將合并的有機(jī)相用硫酸鎂(MgSO4)干燥，然后進(jìn)行過濾、在真空下蒸發(fā)，然后與甲苯一起共蒸發(fā)。
然后通過硅膠色譜(洗提液環(huán)己烷/乙酸乙酯的梯度從7/3到5/5)純化化合物(5)。
實(shí)施例D載體的官能化(反應(yīng)D和E)在文獻(xiàn)[7]中描述了所使用的化學(xué)方法。
在環(huán)境溫度下，在去離子水(6ml)和99％的乙醇EtOH(8ml)的氫氧化鈉NaOH溶液(700mg)中，將可控孔度玻璃珠(6)(CPG，500，2g)非常緩和地?cái)嚢?小時(shí)。然后離心分離小珠(billes)，提取上清液，并用去離子水充分地洗滌小珠以便達(dá)到中性pH。
然后在真空(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)下干燥小珠，并在用水洗滌、離心、干燥之前在環(huán)境溫度下保持在鹽酸溶液(0.2N HCl)中1小時(shí)，然后在80℃的保溫箱中放置15分鐘。然后用乙醇接著用甲苯(離心機(jī))進(jìn)行洗滌。
然后在參與隨后的硅烷化步驟之前將它們進(jìn)行干燥，反應(yīng)混合物在使用之前已經(jīng)制備了。
將CPG珠(7)引入到甲苯(45ml)、三乙胺Et3N(1.35ml)和7-辛烯基三甲氧基硅烷(8)(C11H24O3Si，M 232.39，100μl)的混合物中將反應(yīng)介質(zhì)在80℃(保溫箱)放置16小時(shí)。
將小珠通過離心從混合物中提取出來，并用乙醇漂洗多次然后進(jìn)行干燥(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)。然后將它們在110℃的溫度(保溫箱)下放置3小時(shí)，以便實(shí)施交聯(lián)步驟。
這樣實(shí)現(xiàn)了硅烷化和交聯(lián)步驟，必需中和在硅烷化步驟(“封端”)中還沒有反應(yīng)的表面硅烷醇的殘余酸性和親水性。將氯化三甲基硅烷TMSCl(109mg，130μl)和在二氯甲烷DCM(10ml)中的三乙胺(506mg，700μl)溶液加入到硅烷化的CPG珠中，并且將混合物在25℃下保持溫和地?cái)嚢?小時(shí)。
然后用二氯甲烷(離心機(jī))、接著用乙腈(離心機(jī))充分漂洗小珠。然后在真空(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)下將它們加以干燥，并放置在保溫箱(80℃)中以便完成干燥。
從而獲得硅烷化的小珠(9)。
實(shí)施例F復(fù)分解反應(yīng)(反應(yīng)F)在文獻(xiàn)[9]中描述了所使用的化學(xué)方法。
在氮?dú)夥障?，將硅烷化的CPG珠(9)(2g，30μmol/g)在二氯甲烷(20ml)中攪拌。然后將糖-間隔物體系(5)(300μmol，＞5eq)和格拉布斯催化劑(6μmol，5mg，0.1eq)加入到介質(zhì)中。然后使反應(yīng)介質(zhì)發(fā)生回流，即，44℃的溫度。
在6小時(shí)后，加入另一部分格拉布斯催化劑(6μmol，5mg，0.1eq)。將混合物在44℃下保持又一個(gè)6小時(shí)，然后回復(fù)到環(huán)境溫度。
將小珠濾出，并用二氯甲烷和用乙醇(離心機(jī))充分洗滌。然后將小珠在真空下加以蒸發(fā)以便干燥。
從而獲得了糖珠(billes sucrées)(10)。
實(shí)施例A到F的反應(yīng)圖解 實(shí)施例G探針的斷裂(反應(yīng)G)在文獻(xiàn)[10]中描述了所使用的化學(xué)方法。
當(dāng)已獲得體系(10)(本發(fā)明的固相載體-隔離區(qū)-寡糖鏈)時(shí)，可以斷裂隔離物，而不使糖鏈變性。
在文獻(xiàn)[5]中描述了實(shí)驗(yàn)方案?；瘜W(xué)反應(yīng)式如下 將含糖的CPG珠(10)在1/1的二氯甲烷/甲醇混合物中慢慢地?cái)嚢琛Ｊ菇橘|(zhì)達(dá)到-78℃的溫度(丙酮+液氮)。
然后將臭氧O3鼓泡通入反應(yīng)介質(zhì)中直至出現(xiàn)藍(lán)色。
接著，在用二甲基硫中和介質(zhì)之前，將氬氣鼓泡通入混合物中幾分鐘，然后留置反應(yīng)介質(zhì)整夜以回復(fù)到環(huán)境溫度。
用二乙醚提取小珠，過濾，并用二乙醚和用水漂洗多次。
然后將小珠(12)放到一邊，萃取(二乙醚/水)上清液，并且將有機(jī)相用硫酸鎂(MgSO4)干燥、在真空下蒸發(fā)和與甲苯一起共蒸發(fā)。
從而獲得產(chǎn)物(11)。
2)根據(jù)本發(fā)明的其他分子已利用上面披露的方法(實(shí)施例A到F)加以制備。在下面的實(shí)施例中將詳細(xì)描述這些分子。
實(shí)施例H在這個(gè)實(shí)施例中，[mo]為通過其C-末端連接到本發(fā)明的間隔臂的RGD(Arg-Gly-Asp)肽。載體為如上面所披露的相同的載體。因此，在這個(gè)實(shí)施例中，用RGD代替了實(shí)施例A到F的反應(yīng)圖解的分子(1)。
由此獲得RGD肽連接到其上的小珠。它們具有下式 [mo]通過C-末端連接的RGD肽(Arg-Gly-Asp)實(shí)施例I這個(gè)實(shí)施例使用如在實(shí)施例H中的相同的[mo]，但通過其N-末端連接到本發(fā)明的間隔臂。此外，在本發(fā)明的間隔臂的 中，X1為C并且n＝20。術(shù)語“C”當(dāng)然是用來表示氫化的碳。
獲得的小珠具有下式
[mo]通過N-末端連接的RGD肽實(shí)施例J在這個(gè)實(shí)施例中，[mo]為“唾液酸化的路易斯a因子(sialyl-Lewis a)”。載體與上面披露的方法中的載體一樣。保護(hù)基團(tuán)為Boc。其連接的化學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
由此獲得唾液酸化的路易斯a連接到其上的小珠。它們具有下式 [mo]為唾液酸化的路易斯a因子，其中“1”＝H和CH3實(shí)施例K在這個(gè)實(shí)施例中，[mo]為含硫酸鹽的化合物。載體與上面披露的方法中的載體相同。
由此獲得含硫酸鹽的化合物連接到其上的小珠。它們具有下式
[mo]為含硫酸鹽的化合物，Z為保護(hù)基團(tuán)(例如在“發(fā)明內(nèi)容”部分定義的Gp)在另一種方案中，碳X4用硫原子代替。獲得相應(yīng)的小珠。
實(shí)施例L在這個(gè)實(shí)施例中，[mo]為受保護(hù)的糖。載體與上面披露的方法中的載體相同。
由此獲得受保護(hù)的糖連接到其上的小珠。它們具有下式 受保護(hù)的糖實(shí)施例M在這個(gè)實(shí)施例中，[mo]為唾液酸。載體與上面披露的方法中的載體相同。
由此獲得唾液酸連接到其上的小珠。它們具有下式
唾液酸參考文獻(xiàn)[1]WO-A-03/008927Dukler，N.Dotan，A.Shtavi，A.Gargir. H.M.I.Osborn，T.H.Khan，Tetrahedron，1999，55，1807-1850. D.A.Stetsenko，M.J.Gai，Bioconjugate Chemistry，2001，12，576-586. US-A-6,579,725P.H.Seeberger，R.B.Andrade. R.Roy，C.A.Laferriere，Canadian Journal of Chemistry，1990，68，2045-2054. L.H.Amundsen，L.S.Nelson，Journal of the American ChemicalSociety，1951，73，242-244. J.F.Tolborg，K.J.Jenson，Chemical Communication，2000，147-148. F.Vinet，A.Hoang，EN 00 16940. K.Biswas，D.M.Coltart，S.J.Danishefsky，Tetrahedron Letters，2002，43，6107-6110. C.Sylvain，A.Wagner，C.Miokowski，Tetrahedron Letters，1997，38，1043-1044. Q.J.Plante，E.R.Palmacci，P.H.Seeberger，Science，2001，291，1523-1527. P.H.Seeberger，Chem.Com.，2003，1115-1121. D.M.Ratner，E.R.Swanson，P.H.Seeberger，Org.Lett.2003，4717-4720.
權(quán)利要求
1.下式(I)的分子間隔臂 -其中X0和X4為可進(jìn)行調(diào)節(jié)的取代基以便使[mo]和[Sup]通過所述間隔臂進(jìn)行連接，X0和X4不同于H并且各自獨(dú)立于間隔臂的其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As和Si；以及-其中，取代基X1、X2、X3、Z1、Z2、R1、R2和R3為如下X1、X2和X3各自獨(dú)立于其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As和Si，以及選自各含有2至20個(gè)碳原子的芳基和雜芳基；Z1和Z2各自獨(dú)立于其他取代基地選自C-R、Si-R、C、N、P以及As，其中R為含有1至40個(gè)碳原子的烷基；R1、R2和R3各自獨(dú)立于其他取代基地選自H、烷基、芳基以及雜芳基，每個(gè)含有2至20個(gè)碳原子；[Gp]表示保護(hù)仲胺-N-的基團(tuán)或參與間隔臂官能化的分子；-其中，n、m以及p各自為大于或等于1的整數(shù)并彼此獨(dú)立地進(jìn)行選擇，優(yōu)選地使得1≤n、m和p≤40；-其中，[Sup]表示H或硅烷化固相載體，所述間隔臂可共價(jià)連接到所述載體上；以及-其中，[mo]表示H或用于通過所述間隔臂共價(jià)連接到所述硅烷化固相載體的分子單元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隔臂，其中，X0和X4獨(dú)立于其他取代基地選自C、O、N、S及Si；和/或X1、X2和X3獨(dú)立于其他取代基地選自C、O、N、S和Si，以及選自各含有2至10個(gè)碳原子的芳基和雜芳基；和/或Z1和Z2獨(dú)立于其他取代基地選自C、N、C-R及Si-R，其中R為含有1至30個(gè)碳原子的烷基；和/或R1、R2和R3獨(dú)立于其他取代基地選自H、烷基、芳基以及雜芳基，每個(gè)含有2至10個(gè)碳原子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隔臂，其中，所述保護(hù)基團(tuán)[Gp]選自Ac、芐基、C1～C40芳基、Troc、z、TCA、BOC以及Fmoc。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隔臂，其中，所述固相載體[Sup]，當(dāng)其存在時(shí)，選自板、小珠和毛細(xì)管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的間隔臂，其中，所述[Sup]是基于二氧化硅或玻璃的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隔臂，其中，所述[mo]，當(dāng)其存在時(shí)，為分子量在180～400000g.mol-1范圍內(nèi)的分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隔臂，其中，所述[mo]，當(dāng)其存在時(shí)，選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物、肽、蛋白質(zhì)、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂以及糖脂蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間隔臂，其中，所述[mo]，當(dāng)其存在時(shí)，為糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的間隔臂的應(yīng)用，用于將分子單元[mo]連接到硅烷化的固相載體[Sup]上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述[mo]為分子量在180～400000g.mol-1范圍內(nèi)的分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述[mo]選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物以及天然或合成的小分子；并且所述[Sup]表示所述間隔臂可連接到其上的硅烷化固相載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述[Sup]選自板、小珠或毛細(xì)管。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中，所述[Sup]是基于二氧化硅或玻璃的。
14.根據(jù)權(quán)利要求9到13中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，用于制備生物芯片。
15.根據(jù)權(quán)利要求9到13中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，用于制備糖芯片。
16.用于通過間隔臂將分子單元[mo]共價(jià)連接到載體的方法，所述方法包括以下步驟(i)還原下式化合物的腈官能團(tuán) (ii)從下式的生物分子的烯丙基官能團(tuán)形成醛官能團(tuán) (iii)在所述經(jīng)還原的腈官能團(tuán)和所述醛官能團(tuán)之間，進(jìn)行還原性胺化，接著對形成的仲胺進(jìn)行保護(hù)，以便獲得用于連接到載體上的活化的生物分子，所述活化的生物分子為下式 (iv)使固相載體硅烷化，以及使具有下式的分子的所述硅烷化的固相載體官能化 (v)在使載體官能化的所述分子和所述活化的生物分子之間進(jìn)行復(fù)分解反應(yīng)，以便形成根據(jù)本發(fā)明的連接所述生物分子和所述載體的間隔臂；在所述方法中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、R3以及[mo]為根據(jù)權(quán)利要求1所定義的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，下式的化合物為烯丙基化的糖，所述[mo]為所述糖，
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述[Sup]選自板、小珠或毛細(xì)管。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或18所述的方法，其中，所述[Sup]為基于二氧化硅或玻璃的。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述[mo]為分子量在180至400 000g.mol-1范圍內(nèi)的分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述[mo]選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物、肽、蛋白質(zhì)、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂以及糖脂蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述[mo]為糖。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，還包括由將保護(hù)基團(tuán)[Gp]連接到所述仲胺官能團(tuán)上構(gòu)成的步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述[Gp]選自Ac、芐基、C1～C40芳基、Troc、z、TCA、BOC以及Fmoc。
25.根據(jù)權(quán)利要求16到24中任一項(xiàng)所述的方法在制備生物芯片中應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求16到24中任一項(xiàng)所述的方法在制備糖芯片中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子間隔臂、用于將分子單元連接到固相載體的方法、以及該間隔臂在包含分子或生物分子的分析芯片上的應(yīng)用。所述間隔臂具有以上化學(xué)式(I)，其中，X
文檔編號G01N33/543GK1922195SQ200580005558
公開日2007年2月28日 申請日期2005年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者韋羅妮克·佩雷蒂, 弗朗索瓦絲·維內(nèi), 達(dá)維德·博納夫 申請人:法國原子能委員會