以pamam為間隔臂的仿生免疫吸附劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種以PAMAM為間隔臂的仿生免疫吸附劑，具有如下Gel-PAMAM-AA的化學(xué)結(jié)構(gòu)：其中，Gel代表含羥基的親水載體；AA代表氨基酸；n＝0，1，2或3；PAMAM為聚酰胺-胺型樹枝狀高分子，所述親水載體為瓊脂糖、纖維素或聚乙烯醇，所述氨基酸為L-組氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。本發(fā)明還提供了上述仿生免疫吸附劑的制備方法。本發(fā)明以樹枝狀的大分子PAMAM為間隔臂，使載體外表面具有更多的活性位點(diǎn)，便于偶聯(lián)更多的配基，還調(diào)整了三唑環(huán)的位置和方向，使其離樹狀PAMAM更遠(yuǎn)，更利于目標(biāo)物質(zhì)的吸附，對(duì)IgG具有特異性吸附，且成本低，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和。
【專利說明】以PAMAM為間隔臂的仿生免疫吸附劑及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)療器械，提供了一種血液凈化用仿生免疫吸附劑的制備方法， 特別是可用于血液灌流的免疫吸附劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫吸附療法是近二十年來發(fā)展起來的一種新技術(shù)，用于治療一些傳統(tǒng)方法難以 奏效的疾病。目前臨床上應(yīng)用免疫吸附能通過特異性的清除自身抗體治療多種自身免疫性 疾病。如以蛋白A，G等為配基的蛋白類免疫吸附劑對(duì)免疫球蛋白（IgG)有很好的生物特異 性親和力，含有這類生物特異性配基的免疫吸附劑已證明能去除自身抗體并治療各種自身 免疫性疾病，因而在生物純化及臨床上得到了廣泛應(yīng)用。然而，蛋白類配基存在一些無法忽 視的缺陷：蛋白質(zhì)難以經(jīng)受苛刻的滅菌過程并且較易從載體上脫落，這些脫落的配基會(huì)引 起安全問題；蛋白類免疫吸附劑高昂的價(jià)格給患者造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；蛋白質(zhì)配基難 以進(jìn)行化學(xué)官能團(tuán)的修飾，因而不能以最合適的角度偶聯(lián)在載體上。為了解決這些問題，一 批能選擇性地結(jié)合IgG的仿蛋白質(zhì)類的小分子配基得到了廣泛的研宄和發(fā)展。例如，氨基 酸、多肽、染料、金屬離子等這類具有高度物理化學(xué)穩(wěn)定性和低廉價(jià)格的小分子，能作為蛋 白質(zhì)配基的替代品用于吸附IgG。在這些仿生配基中，氨基酸由于其無毒，價(jià)廉和對(duì)IgG的 高選擇性已代替蛋白質(zhì)用于親和色譜方面。有報(bào)道證明氨基酸能高效地從人血漿或血清中 分咼出IgG。
[0003] 在常用的免疫吸附劑的制備方法中，配基通過氨基、羥基、羧基、醛基等反應(yīng)基團(tuán) 偶聯(lián)于載體上。但是，當(dāng)配基上存在過多的化學(xué)官能團(tuán)或者存在其它能參與偶聯(lián)反應(yīng)的基 團(tuán)時(shí)，載體與配基用于偶聯(lián)反應(yīng)的官能團(tuán)間的選擇性會(huì)減低，從而使配基的親和力受到影 響。因此，增加載體與配基在偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)的選擇性就顯得尤為重要。如果一對(duì)官能團(tuán)彼此 間有很高的反應(yīng)選擇性并且它們對(duì)其它基團(tuán)是惰性的，那么這樣的官能團(tuán)對(duì)就能大大提高 免疫吸附劑的制備效率。而萱氣基和塊基正是這樣的官能團(tuán)對(duì)，>者的Huisgen1，3_偶極 環(huán)加成反應(yīng)是點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)里應(yīng)用最廣泛的。Cu(I)-催化的疊氮基和炔基的環(huán)加成反應(yīng)具 有高選擇性，且對(duì)很多其它的化學(xué)官能團(tuán)是惰性的，并在很廣的反應(yīng)條件下（溶劑、溫度、 PH等）都能保持穩(wěn)定。這些特征使得點(diǎn)擊化學(xué)在生物藕聯(lián)方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如親 和色譜試劑的制備。專利CN201210152387. 3中，通過分別制備了疊氮化的載體和炔化的配 基，并且將二者通過點(diǎn)擊反應(yīng)偶聯(lián)后制備了免疫吸附劑。其中，要制備疊氮化的載體，需將 其先環(huán)氧化后再通過活化基團(tuán)進(jìn)行疊氮化，但該制備方法存在局限性，如疊氮化瓊脂糖的 疊氮基含量影響后續(xù)通過點(diǎn)擊反應(yīng)固載上的配基量，而疊氮基含量則直接受限于環(huán)氧基含 量。通過專利（申請(qǐng)?zhí)?：01103114.X)報(bào)道的環(huán)氧氯丙烷活化法所得到的活化載體，其環(huán)氧 值約為60ymol/mL。而在嘗試了多種環(huán)氧活化的優(yōu)化方法后，發(fā)現(xiàn)活化載體的環(huán)氧值難以 有明顯的提高，配基固載量也難以進(jìn)一步提高。因此，本發(fā)明采用了一種新的活化載體和吸 附劑的制備方法，以提高載體的活性位點(diǎn)數(shù)，增加吸附劑的配基固載量，從而有效地提高吸 附劑的吸附性能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一目的是提供一種安全、成本低廉，性能穩(wěn)定可靠的以PAMM為間隔 臂的仿生免疫吸附劑。本發(fā)明的第二目的在于提供以PAMM為間隔臂的仿生免疫吸附劑的 制備方法。本發(fā)明的第三目的在于提供該類以PAMAM為間隔臂的仿生免疫吸附劑在IgG分 離中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明以瓊脂糖、纖維素和聚乙烯醇等含羥基的親水凝膠球?yàn)檩d體，氨基酸為仿 生配基，采用點(diǎn)擊化學(xué)設(shè)計(jì)和制備一種以聚酰胺-胺樹枝狀高分子物質(zhì)（PAMM)為間隔臂 的免疫吸附劑，對(duì)IgG具有高選擇性，且成本低廉，性能穩(wěn)定可靠，效果與蛋白A吸附材料相 當(dāng)。以樹枝狀聚合物為間隔臂可克服線形間隔臂的缺點(diǎn)并增大載體對(duì)配基的固載量。聚酰 胺-胺樹狀高分子既具有樹狀大分子的共性，又有自身特色：PAMM是以乙二胺為核心，通 過Michael加成和酰胺化縮合反應(yīng)來進(jìn)行的，整個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)率非常高；在凝膠載體上連接 PAMM型樹枝狀大分子，充分利用其大量活性位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行配基的固定化，偶聯(lián)這種樹枝 狀間隔臂后的載體比偶聯(lián)線形間隔臂的載體的外表面具有更多的活性位點(diǎn)，更易于配基的 鍵合，大大提高配基固載效率，增加免疫吸附劑的吸附能力。瓊脂糖、纖維素和聚乙烯醇等 載體具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)蛋白質(zhì)呈化學(xué)隋性，其親水性和血液相容性也 比較好，容易活化并在比較溫和、簡(jiǎn)單的條件下可進(jìn)行配基的固載反應(yīng)。
[0006]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007]一種以PAMM為間隔臂的仿生免疫吸附劑，具有如下Gel-PAMM-AA的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 一種以PAMM為間隔臂的仿生免疫吸附劑，具有如下Gel-PAMM-AA的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
其中，Gel代表含羥基的親水載體;AA代表氨基酸；n = 0，l，2或3 ;PAMAM為聚酰胺-胺 型樹枝狀高分子，所述親水載體為瓊脂糖、纖維素或聚乙烯醇，所述氨基酸為L-組氨酸、苯 丙氨酸或色氨酸。
2. -種如權(quán)利要求1所述的以PAMM為間隔臂的仿生免疫吸附劑的制備方法，其特征 在于，采用下述方案制備而成： (1)炔化載體的制備

其中，（2)和⑶的順序可以任意，⑴可以在（2)、（3)和⑷之前或之后。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，（1)的具體過程為： 向載體的水溶液中加入3-鹵代丙炔和環(huán)狀冠醚類相轉(zhuǎn)移催化劑，每克載體中加入 3-鹵代丙炔3?15mmol和環(huán)狀冠醚類相轉(zhuǎn)移催化劑0. 2?I. Ommol，20?60°C反應(yīng)6? 60h后，水洗，抽干；其中，所述3-鹵代丙炔為炔丙溴、炔丙氯或炔丙碘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述環(huán)狀冠醚類相轉(zhuǎn)移催化劑為 18-冠醚-6、15-冠醚-5、環(huán)糊精中的一種或多種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，（2)的具體過程為： 在溫度為-10?l〇°C條件下，向丙烯酸Ci?(：4烷基酯的醇溶液中滴加3-疊氮基丙胺， 丙烯酸Cf C 4燒基酯與3-疊氮基丙胺的摩爾比為5?15 :1，保溫反應(yīng)0. 5?3h后，升 溫至20?50°C反應(yīng)12?50h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾，得G 0. 5PAMAM ;-10?10°C下， 向乙二胺的醇溶液中滴加GO. 5PAMAM，乙二胺與GO. 5PAMAM的摩爾比為10?30 :1，保溫反 應(yīng)0. 5?3h后，升溫至20?50°C反應(yīng)12?50h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾得第一代產(chǎn)物 GL OPAMAM ； 在溫度為-10?l〇°C條件下，向丙烯酸(^?(：4烷基酯的醇溶液中滴加61.(^4嫩11，丙烯 酸Ci?C 4烷基酯與GL OPAMAM的摩爾比為10?30 :1，保溫反應(yīng)0. 5?3h后，升溫至20? 60°C反應(yīng)15?60h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾，得GL 5PAMAM ;-10?10°C下，向乙二胺的 醇溶液中滴加GL 5PAMAM，乙二胺與GL 5PAMAM的摩爾比為30?50 :1，保溫反應(yīng)0. 5?3h 后，升溫至20?60°C反應(yīng)15?60h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾得第二代產(chǎn)物G2. OPAMM ; 在溫度為-1〇?1〇°〇條件下，向丙烯酸(：1?(：4烷基酯的醇溶液中滴加62.0?4嫩11，丙烯 酸Ci?C 4烷基酯與G2. OPAMAM的摩爾比為30?50 :1，保溫反應(yīng)0. 5?3h后，升溫至20? 70°C反應(yīng)18?66h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾，得G 2. 5PAMAM ; - 10?10°C下，向乙二胺的 醇溶液中滴加G2. 5PAMAM，乙二胺與G2. 5PAMAM的摩爾比為70?90 :1，保溫反應(yīng)0. 5?3h 后，升溫至20?70°C反應(yīng)18?66h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾得第三代產(chǎn)物G3. OPAMAM ; 在溫度為-1〇?1〇°〇條件下，向丙烯酸(：1?(：4烷基酯的醇溶液中滴加63.0?4嫩11，丙烯 酸Ci?C 4烷基酯與G3. OPAMAM的摩爾比為70?90 :1，保溫反應(yīng)0. 5?3h后，升溫至20? 80°C反應(yīng)24?72h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾，得G3. 5PAMAM ;-10?10°C下，向乙二胺的甲 醇溶液中滴加G3. 5PAMAM，乙二胺與G3. 5PAMAM的摩爾比為150?170 :1，保溫反應(yīng)0. 5? 3h后，升溫至20?80 °C反應(yīng)24?72h，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓蒸餾得第四代產(chǎn)物G4. 0PAMAM。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述丙烯酸C ^ C 4燒基酯為丙烯酸 甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸異丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸異丁酯或丙烯酸叔 丁酯。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，（3)的具體過程為： 將氨基酸置于甲醇溶液中，加入三甲基氯硅烷，所述三甲基氯硅烷與氨基酸的摩爾比 為1?3 :1，回流至溶液澄清后旋蒸干燥；所述氨基酸置于甲醇溶液中，每Immol氨基酸中 甲醇加入量為1?3ml。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，（4)的具體過程為： 將氨基酸甲酯鹽酸鹽溶于水中，每Immol氨基酸甲酯鹽酸鹽加入水〇. 25?4ml，并加入 三乙胺及第一?第四代PAMAM產(chǎn)物中任意一種的水溶液，氨基酸甲酯鹽酸鹽、三乙胺與第 一?第四代PAMAM產(chǎn)物的摩爾比為1?10 :1?10 :1 ;磁力攪拌下20?90°C反應(yīng)24?96h， 透析并冷凍干燥得氨基酸修飾的PAMM產(chǎn)物，表示為PAMM-AA ;所述第一?第四代PAMM 產(chǎn)物為 GL OPAMAM、G2. OPAMAM、G3. OPAMAM 和 G4. 0PAMAM。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，（5)的具體過程為： 將氨基酸修飾的PAMAM產(chǎn)物溶于水后，加入炔化載體，每克炔化載體加入1?IOmmol 氨基酸修飾的PAMAM產(chǎn)物，然后依次加入硫酸銅和抗壞血酸鈉作催化劑，硫酸銅、抗壞血酸 鈉與氨基酸修飾的PAMAM產(chǎn)物的摩爾比為0.01?0.05 :0.02?0. 1 :1，并于20?90°C反 應(yīng)24?96h，洗滌抽干得目標(biāo)產(chǎn)物Gel-PAMAM-AA。
10.權(quán)利要求1所述的以PAMM為間隔臂的仿生免疫吸附劑在IgG分離中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】B01J20/30GK104492395SQ201410719674
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】董凡, 胡小艷 申請(qǐng)人:珠海健帆生物科技股份有限公司