專利名稱：酶抑制劑的分析方法與模塊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶抑制劑定量分析的方法與模塊，尤其涉及具有抑制酶活性的農(nóng)藥的定量分析。
背景技術(shù)：
已知分析蔬果中農(nóng)藥殘余量的方法有分光光度法、極譜法、原子吸收光譜法、薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法、同位素標(biāo)記法、核磁共振波譜法、色質(zhì)聯(lián)用法、螢光法、免疫分析法等等。目前普遍被采用的還是以氣相色譜法和液相色譜法為主，因其具有良好的再現(xiàn)性、靈敏度、并可確定農(nóng)藥品種等優(yōu)點(diǎn)。
然而，前述各方法均需專業(yè)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大量試液的配制，無法簡便地在農(nóng)作物產(chǎn)地、市場、量販超市等一般消費(fèi)者采購場所，由未經(jīng)嚴(yán)格訓(xùn)練的人員進(jìn)行快速的分析。因此，需要一種便于一般人員使用的定量分析方法，使分析的工作可在任意場所進(jìn)行，免除多種大量試液的配置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是利用一般農(nóng)藥具抑制酶活性的特性，提供一種簡便的酶抑制劑定量分析方法與模塊，以分析樣品中農(nóng)藥的含量。
本發(fā)明包含提供酶、用以催化第一化合物的化學(xué)反應(yīng)，此酶的催化能力可被酶抑制劑所抑制，因此從酶被抑制程度的變化(即此化學(xué)反應(yīng)變慢的程度)可推算酶抑制劑的含量。本發(fā)明測量酶被抑制程度的方法是利用第二化合物。此第二化合物會與此化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物快速反應(yīng)而生成第三化合物。由于光學(xué)比色儀能偵測第三化合物所吸收的特定波長的光，故可藉由測量此水解反應(yīng)過程中第三化合物于該特定波長的吸光值變化，測得此化學(xué)反應(yīng)變慢的程度，而計(jì)算出酶抑制劑的含量。
本發(fā)明更包含一種用以定量分析酶抑制劑的組成物，含上述的酶、第一化合物與第二化合物。
本發(fā)明更包含，于每次分析時(shí)，使用干燥形式呈現(xiàn)的各種試劑，且均僅含單次分析劑量，可免除多種大量試液的配置。
本發(fā)明更包含多功能容器，供盛裝待測溶液，亦供各種干燥試劑在此容器中進(jìn)行混合反應(yīng)，此容器還可直接置入攜帶式光學(xué)比色儀中，測量待測溶液的吸光值，使分析工作可簡便地在任意場所進(jìn)行。


圖1至圖4分別顯示本發(fā)明的各種示范模塊。
圖5顯示美文松含量與其吸光值差的關(guān)系。
主要元件符號說明11第一試片12第二試片13試片21，22，23，24容器30光學(xué)比色儀31微處理器32恒溫槽41第一上蓋42第二上蓋43上蓋51第一膠囊52第二膠囊S控制組溶液B緩沖鹽類具體實(shí)施方式
如前述，本發(fā)明是利用一般農(nóng)藥具抑制酶活性的特性，提供一種簡便的酶抑制劑定量分析方法，以分析樣品中農(nóng)藥的含量。本發(fā)明所能分析的農(nóng)藥以具有酶抑制特性為主，包含但不僅限于有機(jī)磷、以溴水處理過的硫代有機(jī)磷、及氨基甲酸鹽。
以下例示本發(fā)明所采用的試劑及其化學(xué)反應(yīng)，應(yīng)了解此僅是舉例說明，而非用以限制本發(fā)明的范圍第一化合物乙酰硫代膽堿酯(Acetylthiocholine，簡稱ACTC)。
酶乙酰硫代膽堿酯酶(簡稱AChE)。
第二化合物5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(5，5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，簡稱DTNB)。
ACTC經(jīng)水解會產(chǎn)生乙酸鹽(Acetate)及硫代膽堿(Thiocholine)。硫代膽堿會與DTNB反應(yīng)形成5-硫-2-硝基苯甲酸酯(5-Thio-2-nitrobenzoate，簡稱TNBZ)，即為上述的第三化合物，其于可見光區(qū)412nm有一吸收尖峰。有關(guān)上述反應(yīng)的原理可詳見于Biochemical Pharmacology，1961，Vol.7，page88-95，在此納入本發(fā)明供參考。
本發(fā)明是設(shè)計(jì)多功能的容器，供盛裝待測溶液，待測溶液可含具有酶抑制劑成分的農(nóng)藥。此容器亦供上述各種試劑在其中進(jìn)行混合反應(yīng)，更可將此容器直接置入光學(xué)比色儀中以測量待測溶液的吸光值。應(yīng)注意到此容器是有容量刻度的標(biāo)示，以方便使用者控制待測溶液的體積。而且，容器的材質(zhì)需至少能使測量用的特定波長(如412nm)的光穿透，待測溶液才可接收到此光，此材質(zhì)通常為玻璃或透明塑膠，但不限于此。故應(yīng)可了解本發(fā)明的容器除可用作反應(yīng)器，更可直接置入光學(xué)比色儀中進(jìn)行分析，免除已知需更換多種容器的不便。
茲詳細(xì)說明本發(fā)明定量分析方法的步驟如下(a)提供第一化合物(如ACTC)；酶(如AChE)；及第二化合物(如DTNB)。
應(yīng)注意本發(fā)明所使用的第一化合物、酶、及第二化合物均呈現(xiàn)干燥形式，且分別僅含單次分析劑量。例如使用不溶于水的基材，如塑膠試片，其上固定有單次分析劑量的試劑，使用時(shí)可簡便地將基材直接插入待測溶液中，使固定其上的試劑溶解。基材上可同時(shí)固定指示劑，是可溶于水且有肉眼可辯識的顏色。當(dāng)基材插入待測溶液中時(shí)，觀察基材上的指示劑顏色是否完全除去，以判斷試劑是否完全溶入待測溶液中。指示劑的使用與否，可視其他試劑性質(zhì)的變化而定。例如，第二化合物DTNB本身即有顏色，而可兼具指示劑的功能，因而無需額外使用另一指示劑。
上述試劑除了固定在基材上外，也可固定在容器底部，或容器的上蓋的內(nèi)側(cè)，上蓋的內(nèi)側(cè)也可同時(shí)含有指示劑?；蛘?，也可使用膠囊，以包裝各種試劑。應(yīng)注意酶與第一化合物在溶入水溶液前，宜相互分隔開較佳。
另外，宜注意本發(fā)明所用試劑并不僅限于上述幾種，熟悉此項(xiàng)技藝者可視需要加入其他必要試劑，例如緩沖鹽類，以調(diào)節(jié)水溶液的酸堿值。
(b)提供第一樣品，具有已知含量的酶抑制劑，此種為控制組。宜注意此已知含量亦包含零。
(c)混合第一樣品、酶、第一化合物、及第二化合物，以形成水溶液。其混合順序是使第一化合物最后溶入水中較佳，然而宜注意本發(fā)明的范圍并未限制其順序。
(d)利用光學(xué)比色儀，于特定波長下(如412nm)，測量此水溶液于一固定時(shí)間內(nèi)的吸光值差，定義為第一吸光值差(ΔAbs，控制)?？梢远鄠€(gè)濃度不同的控制組進(jìn)行上述分析步驟，以取得酶抑制劑濃度與吸光值差的關(guān)系，其中亦包含酶抑制劑濃度為零的空白測試。測量結(jié)果的范例可參考圖5所示美文松農(nóng)藥含量與其吸光值差的關(guān)系圖。
(e)提供第二樣品，具未知含量的酶抑制劑，此稱為測試組。宜注意此未知含量亦可能為零。
(f)以該第二樣品取代該第一樣品進(jìn)行(a)至(c)的步驟，測量該水溶液于相同的固定時(shí)間內(nèi)的吸光值差，定義為第二吸光值差(ΔAbs測試)。
(g)比較該第二吸光值差與該第一吸光值差，以計(jì)算該第二樣品中該酶抑制劑的含量。舉例而言，依據(jù)圖5，可獲得酶抑制劑濃度對吸光值差的函數(shù)，以微處理器處理ΔAbs測試與此函數(shù)的關(guān)系，即可獲得第二樣品所含酶抑制劑的濃度。或者，可利用上述空白測試所測得的吸光值差(ΔAbs空白)，直接與第二樣品所測的吸光值差比較，即可計(jì)算出第二樣品中所含酶抑制酶活性的程度，稱為抑制百分比，計(jì)算式如下抑制百分比＝1-ΔAbs測試/ΔAbs空白)×100％上述的計(jì)算皆可利用設(shè)置于光學(xué)比色儀中的微處理器自動處理。
藉由以下范例是詳細(xì)說明本發(fā)明的方法與模塊的操作，應(yīng)了解本發(fā)明并不僅限于此等范例。
第一模塊如圖1所示，取第一試片11(含約0.03mg的AChE與約0.132mg的DTNB)；取第二試片12(含約0.288mg的ACTC與約0.132mg的DTNB)，第一試片11與第二試片12均不含水。于室溫中，依序?qū)⒖刂平M溶液S置入容器21中，容器21的底部事先涂有適量的緩沖鹽類B。接著，依次將第一試片11與第二試片12插入容器21中，待其上的試劑溶解后取出此等試片。繼而將容器21置入攜帶式光學(xué)比色儀30中，測定以2分鐘為間距的吸光值差(ΔAbs控制)。然后改用測試組溶液，重復(fù)上述步驟測得吸光值差(ΔAbs測試)。以攜帶式光學(xué)比色儀30的微處理器31自動計(jì)算測試組的濃度或抑制百分比，并將結(jié)果顯示于螢?zāi)簧稀?br> 第二模塊如圖2所示，提供容器22、及可用以覆蓋容器22的第一上蓋41與第二上蓋42。容器22底部涂有約0.03mg的AChE與適量的緩沖鹽類B，均不含水；第一上蓋41內(nèi)側(cè)涂有約0.288mg的ACTC與約0.264mg的DTNB，均不含水。第二上蓋42不含任何ACTC或BTNB。將控制組溶液S置入容器22中，以第二上蓋42覆蓋容器22并劇烈混合使容器22底部的試劑完全溶解，然后將容器22置于37℃恒溫槽32中。到達(dá)設(shè)定溫度后，取出容器22，除去第二上蓋42，改以第一上蓋41覆蓋容器22并劇烈混合，使第一上蓋41內(nèi)側(cè)的試劑完全溶解，然后將容器22置恒溫槽32中恒溫。到達(dá)設(shè)定溫度后，測定以2分鐘為間距的吸光值差(ΔAbs，control)。繼而改用測試組溶液，重復(fù)上述步驟測得吸光值差(ΔAbs測試)。最后，以攜帶式光學(xué)比色儀30的微處理器31，自動計(jì)算測試組的濃度或抑制百分比，并將結(jié)果顯示于螢?zāi)簧稀?br> 第三模塊如圖3所示，提供容器23、可用以覆蓋該容器的上蓋43、及試片13。容器23底部涂有適量的緩沖鹽類B，上蓋43內(nèi)側(cè)涂有0.03mg的AChE與0.264mg的DTNB，試片13上涂有約0.288mg的ACTC。將控制組溶液S置入容器23中，以上蓋43覆蓋容器23并劇烈混合使其完全溶解。隨后將試片13插入容器23中，待其上的試劑溶解后取出試片13。繼而將容器23置入攜帶式光學(xué)比色儀30中，測定以2分鐘為間距的吸光值差(ΔAbs，control)。最后改用測試組溶液，重復(fù)上述步驟測得吸光值差(ΔAbs測試)，并以攜帶式光學(xué)比色儀30的微處理器31自動計(jì)算測試組的濃度或抑制百分比，并將結(jié)果顯示于螢?zāi)簧稀?br> 第四模塊如圖4所示，取第一膠囊51(含約0.03mg的AChE、約0.264mg的DTNB與適當(dāng)量的緩沖鹽類B)及第二膠囊52(含約0.288mg的ACTC)，第一膠囊51與第二膠囊52均不含水。于室溫中，依序?qū)⒖刂平M溶液S置入容器24中，容器24的底部含有緩沖鹽類B。接著，依次將第一膠囊51與第二膠囊52中的試劑倒入容器24中，待其溶解后，將容器24置入攜帶式光學(xué)比色儀30中，測定以2分鐘為間距的吸光值差(ΔAbs，control)。最后改用測試組溶液，重復(fù)上述步驟測得吸光值差(ΔAbs測試)，并以攜帶式光學(xué)比色儀30的微處理器31自動計(jì)算測試組的濃度或抑制百分比，并將結(jié)果顯示于螢?zāi)簧稀?br> 權(quán)利要求
1.一種酶抑制劑的定量分析方法，包含(a)提供第一化合物；酶，用以催化該第一化合物的化學(xué)反應(yīng)；及第二化合物，用以與該化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物反應(yīng)，而生成第三化合物，該第三化合物是可吸收特定波長的光；其中該第一化合物、該酶、及該第二化合物均呈現(xiàn)干燥形式，且分別僅含單次分析劑量；(b)提供第一樣品，具有已知含量的酶抑制劑，用以抑制該酶的催化能力，該已知含量包含零；(c)混合該第一樣品、該酶、該第一化合物、及該第二化合物，以形成水溶液；(d)利用光學(xué)比色儀，于該特定波長下，測量該水溶液于固定時(shí)間內(nèi)的吸光值差，定義為第一吸光值差；(e)提供第二樣品，具未知含量的該酶抑制劑；(f)以該第二樣品取代該第一樣品，進(jìn)行上述(a)至(c)的步驟，并測量所形成水溶液于該固定時(shí)間內(nèi)的吸光值差，定義為第二吸光值差；(g)比較該第二吸光值差與該第一吸光值差的比率，以計(jì)算該水溶液中該酶抑制劑的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該(a)步驟更包含指示劑，具有肉眼可辨識的顏色。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該第一化合物與部分含量的該指示劑是固定于第一試片上；該酶與另一部分含量的該指示劑則固定于第二試片上。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，更包含容器，用以盛裝該水溶液，使充作該第一化合物進(jìn)行水解反應(yīng)的反應(yīng)器；該容器為該特定波長的光可穿透的材料所制成，可置于該光學(xué)比色儀中以執(zhí)行該步驟(d)或(f)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，更包含將該酶或該第一化合物固定于該容器的底部。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，更包含該容器的上蓋，該上蓋的內(nèi)側(cè)含有指示劑，具肉眼可辨識的顏色。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，更包含將該酶或該第一化合物固定于該上蓋的內(nèi)側(cè)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該酶抑制劑是選自有機(jī)磷化物及氨基甲酸鹽類化物。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該(a)步驟更包含緩沖鹽類。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該光學(xué)比色儀更包含恒溫槽或溫度計(jì)。
11.一種酶抑制劑定量分析模塊，包含容器，供盛裝水溶液，該水溶液具有含量為X的酶抑制劑；其中，該容器充作第一化合物進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)器，該化學(xué)反應(yīng)可被酶所催化，該酶的催化能力可被該酶抑制劑所抑制，該化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物可與第二化合物反應(yīng)以生成第三化合物，是可吸收具特定波長的光，且該容器為該特定波長的光可穿透的材料所制成；及光學(xué)比色儀，可容納該容器，并透過該容器測量該水溶液于該特定波長的吸光值。
12.如權(quán)利要求11所述的模塊，更包含將該第一化合物或該酶固定在該容器的底部。
13.如權(quán)利要求11所述的模塊，更包含試片，該試片包含指示劑，是具肉眼可辨識的顏色。
14.如權(quán)利要求13所述的模塊，其中該試片更包含該第一化合物或該酶。
15.如權(quán)利要求11所述的模塊，其中該容器更包含上蓋，該上蓋包含指示劑，是具肉眼可辨識的顏色。
16.如權(quán)利要求15所述的模塊，其中該上蓋更包含該第一化合物或該酶。
17.如權(quán)利要求11所述的模塊，其中該X包含零。
18.一種用以定量分析酶抑制劑的組成物，包含第一化合物；酶，用以催化該第一化合物的化學(xué)反應(yīng)；以及第二化合物，用以與該化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物反應(yīng)，而生成第三化合物，該第三化合物是可吸收特定波長的光；其中，該第一化合物、該酶、及該第二化合物均呈現(xiàn)干燥形式，且分別僅含單次分析劑量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種測量水溶液的酶抑制劑含量的方法與模塊，包含利用拋棄式試片、膠囊及多功能的容器，以使化學(xué)反應(yīng)與檢測可在同一容器中進(jìn)行。本發(fā)明亦可用來檢測蔬果中的農(nóng)藥殘留量。
文檔編號G01N21/77GK1908622SQ200510089748
公開日2007年2月7日 申請日期2005年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月5日
發(fā)明者李鴻文, 林岳暉, 張正, 沈燕元, 沈燕士 申請人:五鼎生物技術(shù)股份有限公司