專利名稱：氨基酸的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基酸的分析方法，基于以磷酸三乙胺/乙腈為流動(dòng)相反相分離氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，使用通常的高效液相色譜儀和色譜條件，不再需要其它的儀器配置，就可以完成各種氨基酸試樣的分析，并給出準(zhǔn)確的結(jié)果。
背景技術(shù)：
氨基酸(amino acid，AA)試樣比較復(fù)雜，常見(jiàn)的AA有20多種，色譜分析方法必須有足夠的選擇性，以分辨試樣中所要測(cè)定的AA。大多數(shù)AA對(duì)紫外光無(wú)明顯的吸收，為了檢測(cè)，最常用的手段是使AA分子中的氨基與衍生劑反應(yīng)，生成具有紫外吸收或熒光性質(zhì)的衍生物。
通常采用兩種途徑分析AA試樣。一種是借助離子交換機(jī)理先使AA彼此分離，再用柱后衍生進(jìn)行檢測(cè)。這是一般AA分析儀所使用的辦法。
另一途徑是，AA經(jīng)柱前衍生后，以反相色譜分離AA的衍生物。柱前衍生法分離對(duì)儀器設(shè)備沒(méi)有特殊的要求，同時(shí)采用反相分離模式，但要求衍生反應(yīng)能使每種AA幾乎完全地生成相應(yīng)的特定產(chǎn)物，且有足夠的檢測(cè)靈敏度[朱彭齡、云自厚、謝光華，“現(xiàn)代液相色譜”，第22章，蘭州大學(xué)出版社，1989]。
在早期的文獻(xiàn)報(bào)道中，AA經(jīng)2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生，反相分離衍生物AA-DNFB，分離DNFB-AA是以60mM醋酸鈉(pH＝4.45)為水相，以甲醇為有機(jī)相，在C18柱上進(jìn)行梯度洗脫[Morton R.C.；Gerber G.E.，Anal.Biochem.，170(1988)220.]。后來(lái)，大多使用pH＝6.5-7的醋酸鹽緩沖液-乙腈體系作為流動(dòng)相，使異亮氨酸和亮氨酸之間有足夠的分離度[Shang，Zhen-Hua；Yu，Yi-Nian；Guo，Wei；Jiang，Hui；Zhou，Liang-Mo，Chinese Journal of Chemistry，13(1995)163.]。
中國(guó)專利CN 1053128A公開(kāi)了十八種復(fù)合氨基酸注射液的高效液相色譜分析方法，它以2，4-二硝基氟苯作衍生試劑，用柱前衍生化法對(duì)十八種復(fù)合氨基酸注射液進(jìn)行定量測(cè)定。用定量稀釋配制檢測(cè)液，以一定濃度和pH值的流動(dòng)相乙腈和流動(dòng)相醋酸鈉和醋酸緩沖液作梯度洗脫劑。
實(shí)驗(yàn)表明，反相分離AA-DNFB對(duì)流動(dòng)相pH值的變化很敏感，精確控制流動(dòng)相pH值是至關(guān)重要的。當(dāng)使用接近中性的醋酸鹽溶液作為流動(dòng)相的組分，一個(gè)明顯的問(wèn)題是，流動(dòng)相的酸度遠(yuǎn)離該緩沖液的緩沖區(qū)間，此方法的耐用性(robustness)就得不到保證。不同日期配制的流動(dòng)相和不同品牌，甚至同一品牌不同批號(hào)的色譜柱都可能影響DNFB-AA衍生物的色譜分離結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種氨基酸的分析方法。用磷酸三乙胺/乙腈為流動(dòng)相反相分離氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，可以克服現(xiàn)有技術(shù)之不足。本發(fā)明以磷酸鹽代替原有的醋酸鹽，使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流動(dòng)相體系，提高了分離結(jié)果的重現(xiàn)性。本發(fā)明耐用性好，易于為一般實(shí)驗(yàn)室所采用。通過(guò)選擇水相緩沖區(qū)間和在區(qū)間內(nèi)微調(diào)pH值，使分析方法適用于不同品牌色譜柱和各種試樣類型。不需增加設(shè)備，即可為一般HPLC分析室采用。
本發(fā)明氨基酸的分析方法包括使用高效液相色譜儀，AA經(jīng)2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生，反相分離衍生物AA-DNFB，以磷酸三乙胺/乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫或等度洗脫，在分析柱上反相分離氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，再用外標(biāo)法定量分析計(jì)算出氨基酸的含量。
本發(fā)明氨基酸的分析方法包括下述步驟1)分別用HCl溶液作溶劑制備氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液；2)分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液于為其體積10倍量的容量瓶中，加入0.5MNaHCO3，標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液與NaHCO3的體積比為1∶1；再加入1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，與標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液的體積比為0.5-1∶1，搖勻；置于60℃下加熱60分鐘，冷卻至室溫，用0.1M pH為6.5的磷酸鹽緩沖液沖至刻度，搖勻，備用；3)使用包括泵、混合器、恒溫箱、紫外檢測(cè)器以及工作站所組成的HPLC儀。在C18分析柱上，以的TEAP/ACN為流動(dòng)相，梯度洗脫或等度洗脫分離AA-DNFB；色譜條件如下分析柱C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相AACN B36mM TEAP，pH2-3或6-7洗脫方式 梯度洗脫或等度洗脫檢測(cè) UV300-380nm，溫度 20-45℃，4)用外標(biāo)法定量分析計(jì)算試樣中AA的濃度＝(A試樣/A標(biāo)準(zhǔn))×C標(biāo)準(zhǔn)A試樣試樣色譜圖中AA的峰面積A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中AA的峰面積C標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液AA的濃度。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括下述步驟1)分別用0.1M HCl作溶劑制備AA標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液；2)分別取1mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液于10mL棕色容量瓶中，加入1mL 0.5MNaHCO3，搖勻。再加入0.5-1mL 1％DNFB的乙腈溶液，搖勻；置于60℃下加熱60分鐘，冷卻至室溫，用0.1M pH為6.5的磷酸鹽緩沖液沖至刻度，搖勻，備用。
3)使用包括泵、混合器、恒溫箱、紫外檢測(cè)器以及工作站所組成的HPLC儀。在C18分析柱上，以的TEAP/ACN為流動(dòng)相，梯度洗脫或等度洗脫分離AA-DNFB。色譜條件如下分析柱C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相AACN B36mM TEAP，pH2-3或6-7洗脫方式 梯度洗脫或等度洗脫檢測(cè) UV300-380nm，優(yōu)選360nm，溫度 20-45℃，優(yōu)選35℃；4)用外標(biāo)法定量分析計(jì)算試樣中AA的濃度＝(A試樣/A標(biāo)準(zhǔn))×C標(biāo)準(zhǔn)A試樣試樣色譜圖中AA的峰面積A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中AA的峰面積C標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液AA的濃度。
本發(fā)明采用了磷酸鹽代替原有的醋酸鹽，提高了方法的耐用性。在該緩沖體系中，三乙胺的陽(yáng)離子作為磷酸根的對(duì)離子，而不是鉀或鈉離子。磷酸鹽的緩沖區(qū)間是pH＝2-3和6-8。在所述的AA分析方法中，以36mM磷酸三乙胺，pH＝2-3和6-7水溶液/ACN流動(dòng)相體系洗脫AA-DNFB(2，4-二硝基氟苯)。其次，流動(dòng)相的酸度影響分離選擇性，以不同pH的TEAP為水相，AA分離選擇性顯示很大的差異，這為優(yōu)化色譜條件提供了方便。此外，三乙胺的加入可抑制固定相上殘留硅羥基對(duì)分離的影響。
本發(fā)明使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流動(dòng)相，提高了分離結(jié)果的重現(xiàn)性。通過(guò)選擇水相緩沖區(qū)間和在區(qū)間內(nèi)微調(diào)pH值，使分析方法適用于不同品牌色譜柱和各種試樣類型(例如注射液類、或原料藥中主要成分的測(cè)定等)，解決了氨基酸混合物的分析，并給出準(zhǔn)確的結(jié)果。本發(fā)明不需增加設(shè)備，即可適合于一般HPLC分析室采用。應(yīng)用范圍擴(kuò)大，包括各種氨基酸的分析以及其它物質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸后的間接分析，還包括除氨基酸以外其它能與DNFB進(jìn)行定量衍生反應(yīng)物質(zhì)的分析。


圖1是以36mM TEAP，pH6-7/ACN為流動(dòng)相腎病注射液色譜圖。
圖2是以36mM TEAP，pH6-7/ACN為流動(dòng)相肝病注射液色譜圖。
圖3是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動(dòng)相腎病注射液色譜圖。
圖4是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動(dòng)相肝病注射液色譜圖。
圖5是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動(dòng)相丙谷酰胺酸解液色譜圖。
圖6是以36mM TEAP，pH2-3/ACN為流動(dòng)相苯丙氨酸色譜圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1 腎病注射液(Amino acid for renal insufficiency，Hoechst MarionRoussel公司生產(chǎn))和肝病注射液(Amino acid preparation for hepaticinsufficiency，Hoechst Marion Roussel公司生產(chǎn))中AA的分析1.試劑1.1.0.1M HCl 4mL鹽酸與480mL水相混合。
1.2 1％DNFB1g DNFB溶于100mL乙腈中。
1.3.0.5M NaHCO32.1g NaHCO3溶于50mL水中。
1.4.0.1M磷酸鹽緩沖液，pH6.5稱1.74g K2HPO4溶于100mL水中得0.1MK2HPO4。稱1.36g KH2PO4溶于100mL水中得0.1M KH2PO4。向0.1M KH2PO4中加0.1M K2HPO4至pH＝6.5。
1.5.36mM磷酸三乙胺(TEAP)，pH2.75在燒杯中取～950mL水，用移液管取5mL三乙胺加至其中。混合后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.75。將溶液轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶中，用水沖至刻度。過(guò)濾后使用。
1.6.36mM磷酸三乙胺(TEAP)，pH6.50在燒杯中取～950mL水，用移液管取5mL三乙胺加至其中?；旌虾?，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.50。將溶液轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶中，用水沖至刻度。過(guò)濾后使用。
2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 按腎病注射液和肝病注射液的組成，精確稱取AA參照物，以0.1M HCl作溶劑定容。用移液管取AA標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL于25mL容量瓶中，以0.1M HCl沖至刻度，搖勻備用。
3.試樣溶液的制備 用移液管取AA注射液樣品1mL于25mL容量瓶中，以0.1M HCl沖至刻度，搖勻備用。
4.標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液的衍生反應(yīng) 用移液管取稀釋后的AA標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液各1mL，分別置于10mL棕色容量瓶中，加入1mL 0.5M NaHCO3，搖勻，再加入1mL1％DNFB，搖勻。置于60℃加熱塊上加熱60分鐘。冷卻后，用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)沖至刻度，搖勻，準(zhǔn)備HPLC分析用。
5.色譜條件5.1.測(cè)定天冬、谷、脯、丙、異亮、亮氨酸分析柱 Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相 AACN B36mM TEAP，pH6.50梯度83/71/68/10/10B％[VB/(VA+VB)]at 0/10/25/30/35min平衡時(shí)間10min檢測(cè)UV360nm溫度35℃進(jìn)樣體積20μL在此條件下得到如色譜圖1(腎病注射液)和2(肝病注射液)的分離結(jié)果，出峰順序?yàn)樘於?、谷、精、絲、蘇和甘(與試劑峰重疊)、脯、丙、纈、蛋、異亮、亮、色、組、苯丙、賴、酪氨酸5.2.測(cè)定精、絲、蘇、甘、組、蛋、纈、色、苯丙、賴、酪氨酸分析柱 Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相 AACN B36mM TEAP，pH2.75梯度78/60/35/10/10B％[VB/(VA+VB)]at 0/20/30/35/40min平衡時(shí)間10min檢測(cè)UV360nm溫度35℃進(jìn)樣體積20μL在此條件下得到如色譜圖3(腎病注射液)和4(肝病注射液)的分離結(jié)果，出峰順序?yàn)榫?、絲、天冬、谷、蘇、甘、丙、脯、組、蛋、纈、色、苯丙、亮+異亮、賴、酪氨酸。
6.計(jì)算試樣中AA的濃度＝(A試樣/A標(biāo)準(zhǔn))×C標(biāo)準(zhǔn)A試樣試樣色譜圖中AA的峰面積A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中AA的峰面積C標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液AA的濃度7.腎病注射液的分析結(jié)果、準(zhǔn)確度、精密度這里以腎病注射液為例，給出方法的準(zhǔn)確度和精密度。肝病注射液也給出相近的結(jié)果。
7.1.準(zhǔn)確度表1準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果(％RSD，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)





對(duì)所有測(cè)試的AA，回收率都在100±1％范圍內(nèi)。
7.2.精密度該方法有較高的精密度，中間精密度和重復(fù)性都不大于0.5％，以下是測(cè)定結(jié)果。
7.2.1.中間精密度表2中間精密度測(cè)定結(jié)果



7.2.2.重復(fù)性表3重復(fù)性測(cè)定結(jié)果(SD標(biāo)準(zhǔn)偏差)


實(shí)施例2 丙谷酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)原料藥(天津天成制藥有限公司生產(chǎn))中主成分丙谷酰胺含量的測(cè)定1.試劑1.1.參見(jiàn)實(shí)施例1。
1.2.6N HCl 濃鹽酸和水按1∶1(V/V)混合。
2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 從干燥器中取出丙谷酰胺基準(zhǔn)物，精確稱取約15mg于帶蓋的聚乙烯管(1)中，用移液管加1mL 6N HCl，蓋嚴(yán)，搖勻備用。
3.試樣溶液的制備 精確稱取丙谷酰胺試樣約15mg于帶蓋的聚乙烯管(2)中，用移液管加1mL 6N HCl，蓋嚴(yán)，搖勻備用。
4.標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液的酸解 將聚乙烯管(1)和(2)于105℃加熱6小。冷卻，搖勻備用。
5.不經(jīng)酸解試樣溶液的制備 精確稱取丙谷酰胺試樣約15mg于帶蓋的聚乙烯管(3)中，用移液管加1mL水，蓋嚴(yán)，搖勻備用。
6.衍生反應(yīng) 用移液管分別從聚乙烯管(1)、(2)和(3)吸取溶液各20L，置于10mL棕色容量瓶中。分別加1mL 0.5M NaHCO3，搖勻。再加0.5mL 1％DNFB，搖勻。將溶液置于加熱塊中，60℃加熱60分鐘，取出冷卻。用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)沖至刻度，搖勻，準(zhǔn)備HPLC分析用。
7.色譜條件分析柱 Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相 AACN B36mM TEAP，pH2.75梯度 78/64.5/60/60B％[VB/(VA+VB)]at0/15/25/30min平衡時(shí)間 10min檢測(cè) UV360nm溫度 35℃進(jìn)樣體積 20μL在此條件下得到如色譜圖5的分離結(jié)果。
8.計(jì)算8.1.當(dāng)未酸解試樣譜圖中Ala-Glu、L-Glu衍生物的峰面積小于Ala-Gln衍生物峰面積的0.1％時(shí)，就不考慮這些雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響。
丙谷酰胺的百分含量＝[(A試樣×W標(biāo)準(zhǔn))/(A標(biāo)準(zhǔn)×W試樣)]×100％W試樣酸解試樣重(mg)W標(biāo)準(zhǔn)丙谷酰胺基準(zhǔn)物重(mg)A試樣酸解試樣譜圖中谷氨酸衍生物峰面積A標(biāo)準(zhǔn)基準(zhǔn)物譜圖中谷氨酸衍生物峰面積
8.2.當(dāng)未酸解試樣譜圖中Ala-Glu、L-Glu的峰面積大于Ala-Gln峰面積的0.1％時(shí)，應(yīng)校正丙谷酰胺的測(cè)定結(jié)果。丙谷酰胺在酸、堿、氧化劑存在下的降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ala-Glu是主要降解物，但沒(méi)觀察到L-Glu。因此，校正時(shí)主要考慮試樣中原有的Ala-Glu。
丙谷酰胺的百分含量＝{[A試樣×AAla-Gln×W標(biāo)準(zhǔn)]/[(AAla-Gln+AAla-Glu×f)×(A標(biāo)準(zhǔn)×W試樣)]}×100％W試樣酸解試樣重(mg)W標(biāo)準(zhǔn)丙谷酰胺基準(zhǔn)物重(mg)A試樣酸解試樣譜圖中谷氨酸衍生物峰面積A標(biāo)準(zhǔn)基準(zhǔn)物譜圖中谷氨酸衍生物峰面積AAla-Gln未酸解試樣譜圖中丙谷酰胺衍生物的峰面積AAla-Glu未酸解試樣譜圖中丙谷二肽衍生物的峰面積f丙谷酰胺和丙谷二肽相對(duì)響應(yīng)因子。
實(shí)施例3 丙谷酰胺注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))中丙谷酰胺含量的測(cè)定1.試劑1.1.參見(jiàn)實(shí)施例1。
1.2.6.7N HCl 167mL濃鹽酸用水稀釋到300mL。
2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精確稱取約20mg丙谷酰胺或13.5mg谷氨酸基準(zhǔn)物于帶蓋的聚乙烯管(1)中，加100μL水和900μL 6.7N HCl，蓋嚴(yán)，搖勻備用。
3.試樣溶液的制備 取100μL試樣溶液和900μL 6.7N HCl于帶蓋的聚乙烯管(2)中，蓋嚴(yán)，搖勻備用。
4.酸解 將聚乙烯管(1)和(2)置于加熱塊中，105℃加熱6小時(shí)后，取出冷卻，搖勻備用。
5.衍生反應(yīng) 用移液管分別吸取酸解標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液各20mL于10mL棕色容量瓶中。分別加1mL 0.5M NaHCO3，搖勻。再加0.5mL 1％DNFB，搖勻。將容量瓶置于加熱塊中，60℃加熱60分鐘，取出冷卻。用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)沖至刻度，搖勻，準(zhǔn)備HPLC分析用。
6.色譜條件分析柱Kromasil C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相AACN B36mM TEAP，pH2.75梯度 78/64.5/60/60B％[VB/(VA+VB)]at0/15/25/30min平衡時(shí)間 10min檢測(cè) UV360nm溫度 35℃進(jìn)樣體積 20μL在此條件下得到如色譜圖5的分離結(jié)果。
7.計(jì)算7.1.以丙谷酰胺為基準(zhǔn)物時(shí)，丙谷酰胺的濃度按下試計(jì)算丙谷酰胺的濃度(g/100mL)＝A試樣×C標(biāo)準(zhǔn)/A標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)丙谷酰胺基準(zhǔn)物溶液濃度(以100L溶液中基準(zhǔn)物稱量計(jì)算，g/100mL)A試樣試樣譜圖中谷氨酸衍生物峰面積A標(biāo)準(zhǔn)基準(zhǔn)物譜圖中谷氨酸衍生物峰面積7.2.以谷氨酸為基準(zhǔn)物時(shí)，丙谷酰胺的濃度按下試計(jì)算丙谷酰胺的濃度(g/100mL)＝(A試樣×C標(biāo)準(zhǔn)/A標(biāo)準(zhǔn))×(MAla-Gln/ML-Glu)
C標(biāo)準(zhǔn)丙谷酰胺基準(zhǔn)物溶液濃度(以100L溶液中基準(zhǔn)物稱量計(jì)算，g/100mL)A試樣試樣譜圖中谷氨酸衍生物峰面積A標(biāo)準(zhǔn)基準(zhǔn)物譜圖中谷氨酸衍生物峰面積MAla-Gln丙谷酰胺摩爾量ML-Glu谷氨酸摩爾量。
實(shí)施例4 L-苯丙氨酸原料藥中主成分苯丙氨酸含量的測(cè)定1.試劑 參見(jiàn)實(shí)施例1。
2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 從干燥器中取出苯丙氨酸基準(zhǔn)物，于100mL容量瓶中精確稱取約20mg。以0.1M HCl為溶劑溶解并沖至刻度，搖勻。
3.試樣溶液的制備 于100mL容量瓶中精確稱取苯丙氨酸試樣約20mg。以0.1MHCl為溶劑溶解并沖至刻度，搖勻。
4.標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液的衍生反應(yīng) 用移液管分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加入1mL 0.5M NaHCO3搖勻，再加0.5mL 1％DNFB，搖勻。將溶液置于60℃水浴上加熱60分鐘，冷卻。用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)沖至刻度，搖勻，準(zhǔn)備HPLC分析用。
5.色譜條件分析柱 Alltima C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相 ACN/36mM TEAP，pH2.75 體積比48/52等度洗脫檢測(cè)UV360nm溫度35℃進(jìn)樣體積20μL在此條件下得到如色譜圖6的分離結(jié)果。
6.計(jì)算試樣中的苯丙氨酸的百分含量＝(A試樣/A標(biāo)準(zhǔn))×(W標(biāo)準(zhǔn)/W標(biāo)準(zhǔn))×100％A試樣試樣色譜圖中苯丙氨酸的峰面積A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中苯丙氨酸的峰面積W標(biāo)準(zhǔn)苯丙氨酸基準(zhǔn)物的稱量，mgW試樣苯丙氨酸基試樣的稱量，mg。
權(quán)利要求
1.一種氨基酸的分析方法，它包括的步驟是使用高效液相色譜儀，AA經(jīng)2，4-二硝基氟苯柱前衍生，反相分離衍生物氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，其特征在于以磷酸三乙胺與乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫或等度洗脫，在分析柱上反相分離氨基酸-2，4-二硝基氟苯衍生物，再用外標(biāo)法定量分析計(jì)算出氨基酸的含量。
2.一種氨基酸的分析方法，其特征在于它包括下述步驟1)分別用HCl溶液作溶劑制備氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液；2)分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液于為其體積10倍量的容量瓶中，加入0.5MNaHCO3，標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液與NaHCO3的體積比為1∶1；再加入1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，與標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液的體積比為0.5-1∶1，搖勻；置于60C°下加熱60分鐘，冷卻至室溫，用0.1M pH為6.5的磷酸鹽緩沖液沖至刻度，搖勻，備用；3)使用包括泵、混合器、恒溫箱、紫外檢測(cè)器以及工作站所組成的HPLC儀；在C18分析柱上，以的磷酸三乙胺/乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫或等度洗脫分離AA-2，4-二硝基氟苯；色譜條件如下分析柱 C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相 A乙腈 B36mM磷酸三乙胺，pH2-3或6-7洗脫方式 梯度洗脫或等度洗脫檢測(cè) UV 300-380nm，溫度 20-45C°，4)用外標(biāo)法定量分析計(jì)算試樣中AA的濃度＝(A試樣/A標(biāo)準(zhǔn))×C標(biāo)準(zhǔn)A試樣試樣色譜圖中AA的峰面積A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中AA的峰面積C標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液AA的濃度。
3.一種氨基酸的分析方法，其特征在于它包括下述步驟1)分別用0.1M HCl作溶劑制備氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液；2)分別取1mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液于10mL棕色容量瓶中，加入1mL 0.5MNaHCO3，搖勻。再加入0.5-1mL 1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液，搖勻；置于60C°下加熱60分鐘，冷卻至室溫，用0.1M pH為6.5的磷酸鹽緩沖液沖至刻度，搖勻，備用；3)使用包括泵、混合器、恒溫箱、紫外檢測(cè)器以及工作站所組成的HPLC儀。在C18分析柱上，以的磷酸三乙胺/乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫或等度洗脫分離AA-2，4-二硝基氟苯；色譜條件如下分析柱 C18，5μm，250×4.6mm流動(dòng)相 A乙腈 B36mM磷酸三乙胺，pH2-3或6-7洗脫方式 梯度洗脫或等度洗脫檢測(cè) UV 360nm溫度 35C°；4)用外標(biāo)法定量分析計(jì)算試樣中AA的濃度＝(A試樣/A標(biāo)準(zhǔn))×C標(biāo)準(zhǔn)A試樣試樣色譜圖中AA的峰面積A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中AA的峰面積C標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液AA的濃度。
4.按照權(quán)利要求2或3所說(shuō)的氨基酸的分析方法，其特征在于所說(shuō)的36mM磷酸三乙胺與乙腈的體積比為1∶0.01-100。
5.按照權(quán)利要求2或3所說(shuō)的氨基酸的分析方法，其特征在于所說(shuō)的磷酸鹽緩沖液為K2HPO4與KH2PO4，或Na2HPO4與NaH2PO4。
6.按照權(quán)利要求2或3所說(shuō)的氨基酸的分析方法，其特征在于所說(shuō)的試樣溶液是含多種氨基酸組成的原料及其制劑，或是主成分為丙谷酰胺或苯丙氨酸原料藥及其制劑。
7.按照權(quán)利要求6所說(shuō)的氨基酸的分析方法，其特征在于所說(shuō)的含多種氨基酸組成的原料的制劑是腎病注射液或肝病注射液。
8.按照權(quán)利要求6所說(shuō)的氨基酸的分析方法，其特征在于所說(shuō)的主成分丙谷酰胺制劑是丙谷酰胺注射液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氨基酸的分析方法。在C
文檔編號(hào)G01N30/06GK1749748SQ200510014478
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月14日
發(fā)明者朱彭齡, 朱潤(rùn)之 申請(qǐng)人:天津藥業(yè)研究院有限公司