專(zhuān)利名稱(chēng)：核酸純化芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及生物技術(shù)，具體地涉及用于提取和純化核酸的基于芯片的微流控(microfluidic)方法和裝置。
背景技術(shù)：
基因組學(xué)有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，如犯罪分析、臨床診斷等。其應(yīng)用于諸如農(nóng)業(yè)、保健、環(huán)境監(jiān)測(cè)和藥學(xué)研究等的領(lǐng)域。在大多數(shù)情況下，基因組DNA從來(lái)自人血的白細(xì)胞獲得。用于獲得這種DNA的方法通常要求從各自生物來(lái)源分離核酸。對(duì)于從血中純化人DNA來(lái)說(shuō)，DNA開(kāi)始時(shí)限制于白細(xì)胞內(nèi)。為了提取和純化該DNA，必須用一種或多種不同方法打開(kāi)(裂解)細(xì)胞膜，這些方法包括化學(xué)、滲透壓、熱、電和物理方法。
在醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室從血中獲得這種DNA的當(dāng)前技術(shù)仍然非常費(fèi)力并且要求很多經(jīng)常是手工的步驟。以前的步驟是裂解血細(xì)胞，其中細(xì)胞被破裂打開(kāi)并且其核酸被釋放入可用于純化的溶液和相應(yīng)區(qū)域中。細(xì)胞膜破裂和釋放核內(nèi)容物的方法意味著其它生物分子也將在溶液中存在。這些分子中的一些，如蛋白質(zhì)和金屬?gòu)?fù)合物(例如血紅蛋白)以不期望的方式與核酸結(jié)合，進(jìn)而干擾典型的后續(xù)處理步驟如PCR擴(kuò)增(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。因此，需要從碎片材料中分離DNA的步驟。之后，任何DNA純化系統(tǒng)的要求都是必須分離核酸，同時(shí)洗去這些抑制劑。所有這些步驟一般都是手工操作，需要大量時(shí)間。因此，開(kāi)發(fā)能自動(dòng)進(jìn)行這些操作、使用更少樣品的一些方法是重要的。
生產(chǎn)能以自動(dòng)方式處理和加工微升μl(或更小)體積的人全血以提供純化的基因組DNA作為輸出的微流控芯片將是有用的。最理想的是，這種DNA樣品制備微流控芯片是集成微混合器、微過(guò)濾器、微反應(yīng)器等的裝置。輸出應(yīng)該具有與現(xiàn)在使用的常規(guī)宏觀系統(tǒng)相似的產(chǎn)率和純度。分子生物學(xué)技術(shù)的當(dāng)前趨勢(shì)要求測(cè)試方法保持良好產(chǎn)率結(jié)果但減少測(cè)試時(shí)間、試劑體積和成本。而且，自動(dòng)化水平增加更常見(jiàn)。還有小型化的要求，使得測(cè)試不需限制于中心實(shí)驗(yàn)室、而可以是便攜的，以便用于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用或護(hù)理點(diǎn)測(cè)試。
對(duì)于芯片設(shè)計(jì)，在過(guò)去10年中已經(jīng)多次公開(kāi)單個(gè)的過(guò)濾器、閥、混合器和反應(yīng)器組件，但對(duì)于不同組件的這些設(shè)計(jì)有專(zhuān)門(mén)的應(yīng)用，排斥了它們用于一般性目的的組合。實(shí)現(xiàn)DNA樣品制備/純化要求的所有這些組件的集成仍是一種大挑戰(zhàn)。盡管在聚合物襯底上集成多個(gè)組件之前已經(jīng)被公開(kāi)，這些一般用于微陣列、PCR系統(tǒng)。用于從血中進(jìn)行DNA樣品制備/純化的全微流控方案技術(shù)的唯一已知實(shí)例已經(jīng)被Kim等人公開(kāi)。見(jiàn)Kim et al.，″A Disposable DNA Sample Preparation Mierofluidie Chip forNucleic Acid Probe Assay，″IEEE-MEMS 2002，pp.133-136。其將硅過(guò)濾器和玻璃反應(yīng)器集成在PDMS襯底上(襯底包括混合器)。Kim等人報(bào)告的方案是在聚合物襯底上集成微機(jī)械組件的變換方式。不同的組件是結(jié)合物(binder)(由玻璃制造)和過(guò)濾器(由硅、鎳和PDMS制造)。連接襯底不同于傳統(tǒng)互連(interconnect)襯底，因?yàn)榛ミB形成微混合器。
當(dāng)前用于核酸純化的典型操作方案涉及很多步驟，其中多種試劑被加入樣品中，并且樣品被離心以分離沉淀組分和溶液。這種方法非常復(fù)雜，很多情況下仍是手工進(jìn)行。因?yàn)楹怂嵋阎x擇性結(jié)合一些表面，大量研究集中于這些類(lèi)型的相互作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)適用于核酸結(jié)合的多種表面，并且這種結(jié)合技術(shù)使用硅膠珠結(jié)合、偶聯(lián)抗體、硅烷、合成核酸、聚賴(lài)氨酸、聚-T-DNA、某些酸和堿。
最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種方法和裝置，以試圖改進(jìn)微型裝置中的基因組分析系統(tǒng)。美國(guó)專(zhuān)利No.6,379,929公開(kāi)了在微加工襯底中等溫?cái)U(kuò)增核酸的方法和組合物。也公開(kāi)了在微加工襯底中分析等溫?cái)U(kuò)增核酸的方法和組合物。提供的微加工襯底和等溫?cái)U(kuò)增和檢測(cè)方法意圖用于多種診斷方法，尤其是與特征為基因序列或基因表達(dá)改變的疾病相關(guān)的那些。然而，這些僅關(guān)注核酸擴(kuò)增，而沒(méi)有考慮DNA提取和純化。
美國(guó)專(zhuān)利No.6,368,871描述了用于操作流體樣品中材料(如顆粒、細(xì)胞、大分子、如蛋白質(zhì)、核酸或其它成分)的裝置和方法。所述裝置包含具有很多微結(jié)構(gòu)(柱形物)和該結(jié)構(gòu)上絕緣膜的襯底。向所述結(jié)構(gòu)施加電壓誘導(dǎo)分離樣品中的材料。所述裝置和方法可用于廣泛的應(yīng)用，如介電電泳(DEP)或使目標(biāo)材料與流體樣品中其它材料分離。這些技術(shù)使用柱形結(jié)構(gòu)，向其施加電壓以利于混合。
美國(guó)專(zhuān)利No.6,168,948提供小型化集成核酸診斷裝置和系統(tǒng)，其包括核酸提取區(qū)，該區(qū)包括核酸結(jié)合位點(diǎn)。該專(zhuān)利公開(kāi)的小型化核酸提取和樣品精制裝置包含多孔的穿流可變形塞子用于結(jié)合核酸，或在小室內(nèi)具有樣品結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。在形成微流體通道以后形成或添加該塞子，使之成為裝配物或原位合成方法。為此原因，它不能被描述為是整體的，或描述為具有由整體設(shè)計(jì)產(chǎn)生的批量制造優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于從細(xì)胞中提取和純化DNA的裝置和方法。這種裝置和方法提供從細(xì)胞材料中系統(tǒng)地取出和分離核酸。典型地，細(xì)胞材料從血(即白細(xì)胞)中獲得。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及微流控裝置。本發(fā)明的裝置在設(shè)計(jì)和構(gòu)造上是整體式的。在一些實(shí)施方案中，所述微流控裝置包含硅襯底、引入微升量和更多材料的入口、混合器、反應(yīng)室、核酸結(jié)合材料和從裝置取出材料的出口。
結(jié)合材料選擇性與核酸結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)首先用熱氧化物工藝處理硅襯底，然后用等離子體蝕刻工藝等離子體蝕刻氧化硅表面(等離子體處理)，從而制備結(jié)合材料。在另一些或其它實(shí)施方案中，通過(guò)用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積(PECVD)工藝在襯底上沉積基于硅烷的氧化硅來(lái)制造本發(fā)明的結(jié)合材料。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用新工藝制造的整體式微流控裝置。這種裝置提供從細(xì)胞材料中提取和純化DNA，但以新的、成本有效的方式構(gòu)造，并且包含以新的且高效的方式生產(chǎn)的新結(jié)合材料。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及處理核酸的方法。在這些實(shí)施方案中，使細(xì)胞材料破裂(裂解)以釋放內(nèi)容物，并分離內(nèi)容物中的核酸部分。這些方法典型地使用化學(xué)技術(shù)以裂解細(xì)胞材料。部分通過(guò)在受控條件下選擇性與結(jié)合材料結(jié)合實(shí)現(xiàn)核酸內(nèi)容物分離，其中所述結(jié)合材料是本發(fā)明的新結(jié)合材料。
本發(fā)明不同于Kim等人的那些，其設(shè)計(jì)是整體式的并且在硅上。這意味著沒(méi)有多種組件的組裝。它還意味著通過(guò)將微通道內(nèi)的大部分流體流維持在襯底平面內(nèi)(低死體積)，使僅僅入口和出口流過(guò)渡成與襯底平面垂直的流(高死體積)，從而使得死體積更小。整體集成到硅上還提供組件間熱絕緣的可能性，導(dǎo)致在更高溫度下降低穩(wěn)態(tài)功率消耗，反應(yīng)器內(nèi)均勻的溫度譜，通過(guò)改變與襯底連接的熱沉快速改變系統(tǒng)溫度，快速熱循環(huán)，和由不同的同時(shí)溫度區(qū)組成的系統(tǒng)。
前面已經(jīng)大致概述了本發(fā)明特征，從而使下面對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述可以更好理解。本發(fā)明另外的特征和優(yōu)點(diǎn)將在下面描述，它們形成本發(fā)明權(quán)利要求的主題。


為了更完全理解本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，參考以下說(shuō)明并結(jié)合附圖，其中圖1A和B是舉例說(shuō)明本發(fā)明兩個(gè)實(shí)施方案的系統(tǒng)示意圖，其中兩者之間的差異在于過(guò)濾器組件的存在(B)或缺少(A)；圖2是根據(jù)本發(fā)明的提取和純化核酸的通用化方法的流程圖；圖3說(shuō)明結(jié)合和洗脫機(jī)制，其中核酸在高鹽條件下(A)與結(jié)合材料結(jié)合，并在低鹽條件下(B)洗脫；圖4示意性舉例說(shuō)明本發(fā)明一種實(shí)施方案的平面截面圖，它設(shè)計(jì)具有硅—玻璃結(jié)合結(jié)構(gòu)；圖5說(shuō)明本發(fā)明一些實(shí)施方案的芯片，包含很多組件；圖6A和B說(shuō)明凝膠電泳板，其中在給定泳道中條帶的存在(或缺少)反映四種不同制備的結(jié)合材料之一的結(jié)合能力；圖7說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的溫度和結(jié)合效率之間的關(guān)系；和圖8說(shuō)明包含由不同方法和/或處理制備的結(jié)合材料的裝置在不同溫度下的核酸洗脫效率。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及從細(xì)胞提取和純化DNA(或其它核酸)的裝置和方法?？偲饋?lái)說(shuō)或分開(kāi)來(lái)說(shuō)，這些裝置和方法可以形成提供提取和純化這些核酸的系統(tǒng)。
提供以下定義以更好理解本發(fā)明。
“核苷”是與核糖或脫氧核糖以糖苷鍵結(jié)合的嘌呤或嘧啶?！昂塑账帷笔呛塑盏牧姿狨ァ９押塑账崾墙?jīng)磷酸二酯鍵連接的、高達(dá)20個(gè)核苷酸或“單體”的線(xiàn)性“序列”?！昂怂帷笔墙?jīng)3’，5’磷酸二酯鍵連接的、核苷酸的線(xiàn)性聚合物(如寡聚體，但更長(zhǎng))。脫氧核糖核酸“DNA”中，糖基是脫氧核糖，核苷酸堿基是腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。核糖核酸“RNA”具有作為糖基的核糖和相同的核苷酸堿基，只是尿嘧啶代替胸腺嘧啶。單鏈DNA具有堿基A、G、T和C的“序列”。例如當(dāng)形成雙螺旋時(shí)，通過(guò)相鄰鏈上堿基之間的氫鍵一起維持這種二級(jí)結(jié)構(gòu)。請(qǐng)注意在這種堿基配對(duì)中，A總與T鍵合，C總與G鍵合。
“基因組DNA”是在生物體的“基因組”(即特定生物的染色體中所有的遺傳材料)中發(fā)現(xiàn)的DNA；其大小一般表示為堿基對(duì)總數(shù)，并作為生存必需的信息傳遞給后代。該詞用于區(qū)分其它類(lèi)型DNA，如質(zhì)粒內(nèi)發(fā)現(xiàn)的DNA?！盎蚪M學(xué)”表示基因組研究，它包括基因組作圖、基因測(cè)序和基因功能。
“基因測(cè)序”表示確定DNA片段、基因、染色體或全基因組中堿基對(duì)的相對(duì)順序。很多基因測(cè)序方法的關(guān)鍵是電泳分離技術(shù)，如“凝膠電泳”、“毛細(xì)管電泳”和“盤(pán)狀電泳”。
“PCR”，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外擴(kuò)增DNA的系統(tǒng)，其中在過(guò)量脫氧核升酸和Taq聚合酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)存在下，將與待擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的兩個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的兩條合成寡核苷酸引物(一條引物對(duì)應(yīng)一條鏈)加到目標(biāo)DNA中。在一系列溫度循環(huán)中，DNA重復(fù)變性、退火到引物上并從引物延伸子鏈。因?yàn)樽渔溤诤罄m(xù)循環(huán)中用作模板，擴(kuò)增以指數(shù)方式發(fā)生。
“活性離子蝕刻”(RIE)或“深活性離子蝕刻“(DRIE)表示這么一種技術(shù)，其中射頻(RF)或微波輻射偶聯(lián)入低壓氣體使氣體分子解離成更具活性的物質(zhì)，待蝕刻襯底(典型地基于硅)被偏置以誘導(dǎo)離子轟擊。通常使用含碳(C)和鹵素如氟(F)、氯(Cl)或溴(Br)的化合物作為氣體。當(dāng)化合物在等離子體中解離時(shí)，生成高活性鹵素原子或鹵素化合物和可沉積到襯底上而阻斷高活性的聚合物。離子被加速到通過(guò)施加或誘導(dǎo)偏置而蝕刻的襯底上，從而去除垂直于離子運(yùn)動(dòng)方向的襯底表面的聚合物，聚合物包被與離子運(yùn)動(dòng)方向平行的襯底表面并阻斷這些表面的蝕刻。離子轟擊還可以激活或加速化學(xué)蝕刻反應(yīng)。RIE因此具有以較高相對(duì)速率蝕刻與離子運(yùn)動(dòng)方向垂直的表面、以較低相對(duì)速率蝕刻與離子運(yùn)動(dòng)方向平行的表面的能力，導(dǎo)致各向異性的蝕刻。
“微機(jī)電系統(tǒng)”(MEMS)源于微機(jī)械結(jié)構(gòu)(含有移動(dòng)部分)和微電子的集成。
根據(jù)本發(fā)明，“熱氧化物工藝”涉及在氧(O2)和/或蒸汽(H2O)存在下將硅|晶片|加熱至600℃-1250℃的溫度。這種升高的溫度增強(qiáng)氧化劑擴(kuò)散，并導(dǎo)致氧化物顯著厚于室溫空氣中硅氧化產(chǎn)生的2nm天然氧化物。
“化學(xué)氣相沉積”(CVD)表示從氣相化學(xué)前體的材料沉積。
根據(jù)本發(fā)明，“整體式”或“整體集成”意思是指所有組件已經(jīng)用通用技術(shù)設(shè)計(jì)、同時(shí)制造于共同襯底上并引導(dǎo)流體流位于襯底晶片表面的平面內(nèi)。
參考圖1，可以在系統(tǒng)示意圖中觀察本發(fā)明。如圖1A所示，通過(guò)閥將多種輸入物(血、裂解劑、高鹽溶液、醇、空氣和低鹽溶液)引入本發(fā)明的微流控裝置。首先通過(guò)閥將血和裂解劑引入混合器或混合室。經(jīng)混合，裂解劑破裂血內(nèi)白細(xì)胞(WBC)和紅細(xì)胞(RBC)的細(xì)胞膜，釋放WBC內(nèi)含有的核酸材料。裂解以后，閥將核酸(與血和血細(xì)胞的其它廢料一起)在高鹽條件下導(dǎo)向結(jié)合室，其中包含由結(jié)合材料組成的結(jié)合物。高鹽溶液流確保核酸選擇性與結(jié)合材料結(jié)合，但廢料通過(guò)并作為廢物流出。核酸仍與結(jié)合材料結(jié)合的情況下，用醇(如乙醇)漂洗結(jié)合物，然后任選地空氣干燥(強(qiáng)制對(duì)流)，最后用低鹽溶液洗脫。因此，血與裂解劑接觸，WBC和RBC一起在混合器內(nèi)裂解。細(xì)胞內(nèi)容物釋放，DNA(來(lái)自WBC)與結(jié)合物結(jié)合。在此實(shí)施方案中，結(jié)合之前細(xì)胞可以?xún)H用一個(gè)混合器裂解，從而實(shí)現(xiàn)裂解、結(jié)合和洗脫的程序。
作為替代方案，所述系統(tǒng)可以使用在引入裂解劑之前能捕獲白細(xì)胞但允許紅細(xì)胞和其它材料通過(guò)的過(guò)濾器。這種實(shí)施方案表示于圖1B。其中血被引入并與磷酸鹽緩沖液(PBS)一起混合，隨后通過(guò)過(guò)濾器。漂洗除去RBC和其它材料以后，如上述裂解WBC并傳入結(jié)合室以進(jìn)一步純化。該實(shí)施方案因此允許在暴露于結(jié)合材料之前進(jìn)行初步純化。
以不同方式觀察，本發(fā)明是從細(xì)胞材料中提取和純化核酸的方法。這種方法一般包括一系列步驟。參考圖2，步驟2001是血液稀釋步驟，以降低粘度并使混合物更易在下面所述裝置的微通道和微室中流動(dòng)。通過(guò)添加磷酸鹽緩沖液(PBS)或其它相似溶液可以實(shí)現(xiàn)稀釋。步驟2002是裂解步驟，其中裂解劑被加入稀釋血溶液中以破裂細(xì)胞膜并從WBC中釋放核酸材料。請(qǐng)注意DNA僅發(fā)現(xiàn)于血中的WBC，因?yàn)镽BC無(wú)核。這些裂解劑典型地是化學(xué)裂解劑(化學(xué)裂解)，也可以使用但其它類(lèi)型裂解，如超聲裂解、熱裂解、電裂解和機(jī)械破碎細(xì)胞膜(稱(chēng)為機(jī)械裂解)。步驟2003是在高鹽含量條件下將釋放的核酸結(jié)合到結(jié)合材料上的步驟。這通過(guò)小心控制溶液內(nèi)的鹽含量(即濃度)和通過(guò)提供特殊處理的結(jié)合表面(結(jié)合材料)而實(shí)現(xiàn)。釋放的核酸經(jīng)流體流和閥的組合被導(dǎo)向結(jié)合材料/室。步驟2004是洗脫步驟，當(dāng)鹽含量條件被改變到低鹽含量或水的條件時(shí)而實(shí)現(xiàn)。
圖3說(shuō)明在高鹽條件下結(jié)合到結(jié)合材料或襯底、在低鹽條件下洗脫(涉及去結(jié)合過(guò)程)的過(guò)程。也可以增加另外的步驟，如過(guò)濾、洗滌、漂洗和干燥。這些洗滌步驟可以包括高鹽洗滌以使結(jié)合更強(qiáng)、醇洗滌以清除碎片或其它廢料，以及任選地空氣干燥以清除醇。這些方法以其自己的權(quán)利使用代表本發(fā)明實(shí)施方案的新裝置。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及微流控裝置。在一些實(shí)施方案中，所述微流控裝置包含硅襯底、用于引入微升量材料的入口、混合器、反應(yīng)室、核酸結(jié)合材料和從用于裝置中取出材料的出口。這些裝置典型地包含已經(jīng)被整體集成的組件。
所述結(jié)合材料選擇性結(jié)合核酸。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)首先用熱氧化物工藝處理硅襯底，然后用等離子體蝕刻工藝等離子體蝕刻氧化硅表面而制備結(jié)合材料。在另一些或其它實(shí)施方案中，通過(guò)用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積(PECVD)工藝將基于硅烷的氧化硅沉積到襯底上來(lái)制造本發(fā)明的結(jié)合材料，使用或不使用后續(xù)的等離子體蝕刻工藝。在另一些或其它實(shí)施方案中，其它類(lèi)型的化學(xué)氣相沉積(CVD)工藝如正硅酸四乙基酯(TEOS)可以用于沉積氧化硅，使用或不使用后續(xù)的等離子體蝕刻工藝。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及引入新的功能性設(shè)計(jì)的微流控裝置。這些裝置提供從細(xì)胞材料中提取和純化DNA，但以新的、成本有效的方式構(gòu)造。這些裝置包含整體式設(shè)計(jì)和新結(jié)合材料。
作為微流樣品處理系統(tǒng)總體觀察，本發(fā)明的裝置和方法提供設(shè)計(jì)用于核酸制備(如純化)的整體式芯片。更具體地，本發(fā)明提供從血(一般是人血，但也可以是其它哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物的血)提取和純化DNA和/或RNA(核酸)。對(duì)于本發(fā)明的裝置，功能性微流控組件典型地集成到單個(gè)襯底上。這些組件具有的功能包括混合、過(guò)濾、結(jié)合等。盡管本發(fā)明已經(jīng)證明成功用于DNA提取，但其應(yīng)用不限于DNA提取，可以用于能選擇性直接或通過(guò)中間介導(dǎo)物質(zhì)或分子間接結(jié)合本發(fā)明結(jié)合物的任何物質(zhì)的純化。
如本發(fā)明所用，整體集成提供這樣的裝置，其中所有組件已經(jīng)被用共同技術(shù)設(shè)計(jì)并使用晶片表面平面內(nèi)的流體流，除了流體入口和出口處流可以垂直于晶片表面或在該表面內(nèi)。組件的這種整體式設(shè)計(jì)提供更容易的制造和操作。
本發(fā)明相對(duì)于當(dāng)前所用宏觀系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是全自動(dòng)操作，小尺寸和功率消耗，便于便攜應(yīng)用。相對(duì)于非整體微觀方案的優(yōu)點(diǎn)是容易裝配和封裝；更小死體積、整體大??；改進(jìn)的熱設(shè)計(jì)(由于硅的熱性質(zhì)和幾何微機(jī)械可能性)；可選地添加另外的感測(cè)功能，因?yàn)樗薪M件都能容易地與電讀出線(xiàn)路通過(guò)界面連接；和可選地使系統(tǒng)部分或全自動(dòng)化。
表面條件、表面積、流動(dòng)譜、使用的化學(xué)物、pH和溫度——所有都極影響本發(fā)明提取和純化核酸的能力。因此，本發(fā)明方法提供對(duì)這些參數(shù)的仔細(xì)控制。這對(duì)于本發(fā)明裝置的設(shè)計(jì)和操作是特別實(shí)際的。
本發(fā)明還涉及能提供從細(xì)胞材料中提取和純化核酸的整體微流控裝置。圖4顯示本發(fā)明裝置實(shí)施方案的平面截面示意圖，其中設(shè)計(jì)有硅—玻璃結(jié)合結(jié)構(gòu)。在這個(gè)具體的實(shí)施方案中，裝置400在襯底405中形成，并被玻璃晶片401覆蓋。覆蓋物401是透明的，允許光達(dá)到通道406。402和403是提供入口和出口的硅背側(cè)開(kāi)口。通過(guò)使諸如發(fā)生堵塞、流速、跨通道寬度的流速均一性、流體界面和流體界面通過(guò)系統(tǒng)的進(jìn)程的事項(xiàng)可以檢測(cè)，光進(jìn)出裝置使得能夠光學(xué)感測(cè)裝置性能。光可以進(jìn)出裝置也使得能夠經(jīng)熒光、光吸收或可以通過(guò)玻璃觀察窗的其它類(lèi)型光學(xué)技術(shù)而光學(xué)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于典型的裝置實(shí)施方案，閱讀器涉及圖5所示裝置500。根據(jù)圖5，血和磷酸鹽緩沖液(PBS)可以分別經(jīng)入口501和503引入混合器502。流體然后直接流入過(guò)濾器504，在此捕獲WBC，但允許RBC通過(guò)并經(jīng)出口508流出。請(qǐng)注意過(guò)濾器504可以省略，正如以上系統(tǒng)描述中所提及(見(jiàn)圖1A)。此后，裂解緩沖液經(jīng)入口505引入并裂解被過(guò)濾器捕獲的WBC。WBC裂解以后，釋放的DNA通過(guò)過(guò)濾器504。此時(shí)，閥506將操作關(guān)閉通道507。DNA和其它成分和溶液將進(jìn)入結(jié)合物513并與結(jié)合物表面結(jié)合。核酸與結(jié)合物513結(jié)合以后，可以通過(guò)入口509泵入高鹽溶液使得結(jié)合更強(qiáng)，然后經(jīng)入口510泵入醇以洗滌結(jié)合物并使結(jié)合物潔凈，這有利于結(jié)合物內(nèi)的核酸。此后，任選的可以使用強(qiáng)制對(duì)流干燥結(jié)合物，尤其是干燥(即除去)醇，因?yàn)榇紝⒂绊懹糜诤怂峒兓蠓磻?yīng)如PCR的核酸質(zhì)量。最后的步驟是經(jīng)入口512泵低鹽溶液以釋放DNA。此時(shí)，閥515將操作關(guān)閉通道516。然后，DNA將從出口514被洗脫。任選地，可以增加熱絕緣槽519和電阻加熱器520以熱影響裂解/結(jié)合/洗脫過(guò)程。此外，可以經(jīng)真空或迫使壓縮空氣通過(guò)入口511產(chǎn)生上述強(qiáng)制對(duì)流以干燥結(jié)合物。與傳統(tǒng)天然對(duì)流比較，這種方法更快并更容易控制。
處理順序和樣品(血)和/或試劑引入位置具有靈活性。在一些實(shí)施方案中，樣品和試劑可以引入微通道交叉點(diǎn)、直接進(jìn)入反應(yīng)器或通過(guò)個(gè)或多個(gè)混合器——這依賴(lài)于需要的混合水平和涉及的流速。
在一些實(shí)施方案中，使用傳統(tǒng)MEMS制造技術(shù)在硅晶片或硅/玻璃晶片組合上制造芯片。所有組件如混合器、過(guò)濾器和結(jié)合物位于一個(gè)芯片上，以實(shí)現(xiàn)樣品制備、處理和純化需要的某些功能。這些組件包括通道、輸入端、輸出端、反應(yīng)器、混合器、過(guò)濾器、結(jié)合物、電阻溫度傳感器和電阻加熱器。而且，襯底上的熱絕緣特征提供獨(dú)立的組件熱操作。
上述裝置組件的重要方面是結(jié)合物設(shè)計(jì)。結(jié)合物是直接負(fù)責(zé)DNA或RNA分離和純化的組件。當(dāng)包括核酸和其它碎片或廢物的溶液經(jīng)過(guò)結(jié)合物時(shí)，結(jié)合物將選擇性結(jié)合核酸并使其它材料流過(guò)。在隨后的步驟中，結(jié)合物將在某種工程化條件下釋放核酸。因此，結(jié)合物表面在這種芯片中是重要的。對(duì)于這種表面，本發(fā)明可以使用一或更多的幾種不同設(shè)計(jì)，包括但不限于硅膠珠結(jié)合、酸、堿、硅烷、聚賴(lài)氨酸、偶聯(lián)抗體、合成核酸和聚-T DNA。在一些示例性實(shí)施方案中，根據(jù)制造工藝，結(jié)合物室表面的制備可以包括用熱氧化物工藝隨后用CHF3和O2等離子體蝕刻處理，或作為替代方案用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積(PECVD)基于硅烷的氧化硅。這些工藝產(chǎn)生核酸結(jié)合和洗脫方面良好的表面。使用這種表面，不需額外的處理步驟對(duì)芯片表面進(jìn)行改性。等離子體處理步驟可以在晶片前側(cè)氮化物剝離工藝中實(shí)現(xiàn)，這是無(wú)論何種方式芯片制造必要的步驟。
在一些實(shí)施方案中，結(jié)合物(結(jié)合材料)設(shè)計(jì)有等離子體處理的表面，還考慮溫度如何影響結(jié)合過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，它具有加熱器和結(jié)合物外部的溫度傳感器，以提供不同和/或均勻的溫度，產(chǎn)生更好的結(jié)合條件。還考慮了熱絕緣。在此情況下，通過(guò)襯底上熱絕緣特征使施加的熱可以是局部的，從而使襯底不同部分處于不同溫度。
本發(fā)明的微流樣品處理系統(tǒng)集成所有樣品制備過(guò)程，如混合、過(guò)濾、結(jié)合、洗脫以及單獨(dú)的熱控制。它是已經(jīng)證明成功用于DNA提取的通用系統(tǒng)，但其應(yīng)用不限于DNA提取。整體集成意味著所有組件已經(jīng)用共同技術(shù)設(shè)計(jì)并使用位于晶片表面平面內(nèi)的流體流。已經(jīng)引入熱絕緣特征，使得芯片不同區(qū)域是熱獨(dú)立的。
結(jié)合材料的表面是上述結(jié)合效率的重要因素。結(jié)合的另一個(gè)重要因素是表面積?？梢允褂貌煌椒ㄔ黾咏Y(jié)合表面積。一種這樣的方法是引入一些微機(jī)械特征，如增加柱形物(微結(jié)構(gòu))的數(shù)目，這增加結(jié)合物表面積的垂直面積。為了確認(rèn)，這些柱形物(或其它類(lèi)似微結(jié)構(gòu))的設(shè)計(jì)和排列(放置)必須考慮更容易流動(dòng)的模式、更少氣泡、更低堵塞水平和其它相關(guān)問(wèn)題。另一種方法是通過(guò)化學(xué)或物理方法使表面更粗糙以增加表面積。表面粗糙化可以用于增加玻璃晶片401或硅晶片405上的可用于結(jié)合的表面積。粗糙化玻璃表面的技術(shù)包括活性離子蝕刻、等離子體蝕刻和濕法蝕刻。在所有這些情況下，可以增加表面粗糙度，但可能出現(xiàn)不均勻的突起，如在蝕刻期間由玻璃中氣泡、反應(yīng)產(chǎn)物或非揮發(fā)性成分天然微掩蓋玻璃表面所產(chǎn)生的那些。相似的技術(shù)可以用于增加硅的表面粗糙度。此外，通過(guò)調(diào)節(jié)工藝以增加bosch DRIE工藝中產(chǎn)生的天然槽形結(jié)構(gòu)(scalloping)，深度活性離子蝕刻(DRIE)以后可以在通道側(cè)壁實(shí)現(xiàn)硅表面粗糙化。
本發(fā)明相對(duì)于當(dāng)前使用的從細(xì)胞中提取DNA的商業(yè)提取試劑盒的其他優(yōu)點(diǎn)包括降低試劑需要量(每個(gè)樣品～2ml比每個(gè)樣品～400ml)、更小血樣要求(每次提取～1μl比每次提取～3001μl)和提取時(shí)間減少(每次＜2小時(shí)比每次～1天)。
提供以下實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，以下實(shí)施例中公開(kāi)的方法僅代表本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。然而根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可以對(duì)所述具體實(shí)施方案進(jìn)行很多改變并仍然獲得一樣或相似結(jié)果。
實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的微流核酸純化芯片可以被制造。這種芯片可以通過(guò)以下步驟制造步驟1裸硅片經(jīng)熱氧化氧化得到厚度約0.5μm的氧化物。然后將0.15μm厚的低壓化學(xué)氣相沉積的化學(xué)計(jì)量的氮化硅層沉積到氧化硅上。
步驟2然后掩蓋前述步驟的晶片用于DRIE。掩模層可以是光刻膠，但RIE深度超過(guò)約40μm時(shí)這可能需要變?yōu)榱硪环N材料。在硅蝕刻以后除去光刻膠。
步驟3用DRIE在硅晶片的前側(cè)蝕刻前述步驟晶片的通道。
步驟4接下來(lái)，用光刻膠選擇性掩蓋前述步驟硅晶片的背側(cè)，用活性離子蝕刻在氮化硅和氧化硅中蝕刻背側(cè)流體入口和出口的開(kāi)口。然后除去光刻膠。
步驟5接著，將硅晶片前側(cè)保護(hù)在一側(cè)卡盤(pán)中，并在氫氧化鉀溶液中通過(guò)DRIE蝕刻晶片，直至背側(cè)孔到達(dá)前側(cè)被蝕刻的特征的底部。
步驟6然后經(jīng)等離子體蝕刻(CHF3和O2)除去晶片前側(cè)的氮化硅，暴露下面的氧化硅。
步驟7接著，將約1μm厚的Al層濺射到玻璃晶片上。
步驟8然后用光刻膠選擇性掩蓋濺射的Al，并用標(biāo)準(zhǔn)的基于磷酸的鋁濕法蝕刻劑進(jìn)行蝕刻，正如半導(dǎo)體工業(yè)所用。
步驟9最后從玻璃晶片上去除光刻膠，將玻璃晶片陽(yáng)極結(jié)合到硅晶片的前側(cè)。結(jié)合之前使玻璃晶片與硅晶片對(duì)準(zhǔn)。
經(jīng)上述工藝制造的所得兩晶片裝置包含蝕刻在硅晶片前側(cè)的微流體通道。這些經(jīng)蝕刻在硅晶片背側(cè)的孔與外部相通。流體通道大小從2μm寬到超過(guò)5mm寬之間變化。典型的通道約10μm寬。典型的過(guò)濾器由約2-3μm柱形物間隔的柱形物組成，柱形物寬和深約10μm。用玻璃加帽晶片封閉通道。
在另外的實(shí)施方案中，連接微流體結(jié)構(gòu)與外部的孔可以通過(guò)在陽(yáng)極結(jié)合之前在玻璃晶片上鉆孔來(lái)產(chǎn)生。這種情況下不需要上述步驟5，其中硅晶片前側(cè)保護(hù)在一側(cè)卡盤(pán)中，并且在氫氧化鉀溶液中通過(guò)DRIE蝕刻晶片，直至背側(cè)孔到達(dá)在前側(cè)被蝕刻的特征的底部。在替代方案或其它實(shí)施方案中，不需要鋁層步驟(步驟7和8)，因?yàn)殇X層用作加熱器、溫度傳感器或流動(dòng)傳感器，沒(méi)必要用于本發(fā)明的所有實(shí)施方案。在一些或其它實(shí)施方案中，通過(guò)打開(kāi)硅背側(cè)的大區(qū)域，大到足以使線(xiàn)結(jié)合工具出入結(jié)合墊，從而實(shí)現(xiàn)與鋁層的結(jié)合墊連接。
最后，值得注意的是，反應(yīng)室和過(guò)濾室典型具有約0.4μl體積，混合器具有約0.15μl死體積。背側(cè)孔典型是晶片背側(cè)的1mm×1mm開(kāi)口，具有與各向異性濕法蝕刻<100>硅相關(guān)的特征性54°斜率。
實(shí)施例2本實(shí)施例用于說(shuō)明進(jìn)一步等離子體處理對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案中使用的熱氧化物法制造的結(jié)合材料的影響。
在這個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)比較四種不同結(jié)合材料的洗脫物來(lái)評(píng)價(jià)熱氧化物法生成的結(jié)合材料的純化效率—單獨(dú)熱氧化物。
—熱氧化物+過(guò)氧化氫/硫酸(“Piranha”，包含3∶1的濃硫酸30％ H2O2)清洗。
—熱氧化物+等離子體蝕刻。
—熱氧化物+等離子體蝕刻+過(guò)氧化氫/硫酸(“Piranha”)清洗。
其中等離子體處理包含CHF3+O2環(huán)境。
在對(duì)于四種不同制備的結(jié)合物的每一種相同的測(cè)試條件下用典型高鹽離液條件如6M鹽酸胍溶液將DNA與各種結(jié)合材料結(jié)合，然后在潔凈的6M鹽酸胍溶液中漂洗材料。然后在低鹽條件下使用1×TE緩沖液(10mM Tris-Cl和1mM EDTA)洗脫DNA和并用PCR擴(kuò)增。
圖6A表示PCR后的凝膠電泳板，其中泳道4和5對(duì)應(yīng)來(lái)自用單獨(dú)熱氧化物的裝置的洗脫物。結(jié)果表明在所用條件下很少或沒(méi)有發(fā)生核酸的可逆性結(jié)合，因?yàn)橛镜?和5對(duì)應(yīng)洗脫物并且在測(cè)試中不能看到與DNA片段相關(guān)的帶。為了比較，在泳道2和3中可以清除看到帶。圖6B顯示凝膠電泳板，其中泳道4和5對(duì)應(yīng)用熱氧化物+過(guò)氧化氫/硫酸清洗的裝置的洗脫物。另外，沒(méi)有看見(jiàn)核酸帶——這提示很少或沒(méi)有觀察到DNA與結(jié)合材料的可逆性結(jié)合。
圖6A，泳道2和3對(duì)應(yīng)用熱氧化物+等離子體蝕刻結(jié)合材料的裝置的洗脫物。帶指示存在核酸，并且這樣處理的結(jié)合材料成功結(jié)合核酸。圖6B中顯示，泳道2和3是來(lái)自熱氧化物+等離子體蝕刻+過(guò)氧化氫/硫酸清洗結(jié)合材料的裝置的洗脫物?？梢钥吹剑嬖诤怂?，這指示核酸分析物與結(jié)合材料之間的可逆性結(jié)合事件。
因此，顯而易見(jiàn)，根據(jù)本發(fā)明，不經(jīng)進(jìn)一步處理，熱氧化物制造的結(jié)合材料單獨(dú)不足以用作本試驗(yàn)中調(diào)查的200堿基對(duì)片段的DNA的結(jié)合材料。等離子體處理已經(jīng)顯示是用于活化熱氧化物制造的結(jié)合材料的合適處理。
實(shí)施例3本實(shí)施例用于說(shuō)明溫度對(duì)洗脫效率的影響。
實(shí)驗(yàn)在1cm×1cm見(jiàn)方的具有熱氧化硅的硅上進(jìn)行。氧化物表面通過(guò)使用CHF3和O2進(jìn)行CHF3等離子體蝕刻工藝。將5μg純DNA稀釋于8μl 6M鹽酸胍溶液中。然后將DNA置于硅片表面，將第二個(gè)硅片置于頂上，形成三明治排列。然后將小片置于控制濕度的氣密容器中保溫15分鐘。然后在新鮮鹽酸胍中漂洗小片三次(每次100μl)，隨后用70％乙醇漂洗三次(每次100μl)，然后使樣品在室溫干燥，隨之進(jìn)行洗脫。洗脫晶片四次(總計(jì)280μl)，每次用70μl新鮮的10×TE緩沖液(如前述)，每次5分鐘，在4-80℃之間的控制溫度下，如圖7所示。洗脫DNA的量用嵌入染料PicogreenTM定量。
參考圖7，柱形圖顯示洗脫DNA的量如何隨溫度變化，約55℃時(shí)顯示最大，65℃-80℃穩(wěn)定增加。對(duì)于4℃-80℃之間進(jìn)行的試驗(yàn)，80℃下達(dá)到DNA的最大洗脫。一般來(lái)說(shuō)，溫度增加將導(dǎo)致擴(kuò)散增加并弱化分子間鍵，最大洗脫效率應(yīng)出現(xiàn)在較高溫度。不限于任何理論，圖7中約55℃的峰被認(rèn)為是次級(jí)機(jī)制的指示。
上述硅片上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果適用于微機(jī)械結(jié)合反應(yīng)器。反應(yīng)器和裝置襯底是熱絕緣的，以允許獨(dú)立的熱操作。電阻加熱器和電阻溫度傳感器制造在熱絕緣結(jié)合反應(yīng)器之上的玻璃上(即圍繞反應(yīng)器的加熱器)。這導(dǎo)致結(jié)合物處的溫度可以被電控制并獨(dú)立于襯底。微機(jī)械加工的結(jié)合反應(yīng)器用實(shí)施例1所述工序制造。反應(yīng)器能在80℃操作，襯底與熱沉連接以確保系統(tǒng)的其余部分在室溫操作，或在獨(dú)立于結(jié)合物溫度的溫度下操作。
實(shí)施例4本實(shí)施例用于說(shuō)明硅烷沉積的結(jié)合材料經(jīng)或不經(jīng)同時(shí)等離子體處理時(shí)的結(jié)合效率。將這些結(jié)果(即結(jié)合效率)與熱氧化物+等離子體處理結(jié)合材料的結(jié)合效率進(jìn)一步比較，并將所有這些作為三個(gè)溫度的函數(shù)。
實(shí)驗(yàn)在1cm×1cm見(jiàn)方的具有熱氧化硅和基于硅烷的PECVD氧化硅的硅上進(jìn)行，在400℃進(jìn)行沉積。熱氧化硅表面通過(guò)使用CHF3和O2進(jìn)行CHF3等離子體蝕刻處理，基于硅烷的PECVD氧化物樣品分成兩組，其中一組也經(jīng)受CHF3和O2蝕刻處理。將5μg純DNA稀釋于8μl 6M鹽酸胍溶液中。然后將DNA置于硅片表面，將第二個(gè)硅片(與第一個(gè)具有相同氧化物類(lèi)型)置于頂上，形成三明治排列。然后將小片置于控制濕度的氣密容器中并在不同溫度下保溫15分鐘。然后在新鮮鹽酸胍中漂洗小片三次(每次100μl)，隨后用70％乙醇漂洗三次(每次100μl)。然后使樣品在室溫干燥，隨之進(jìn)行洗脫。洗脫晶片三次(總計(jì)210μl)，每次用70μl新鮮的10×TE緩沖液(如前述)。第一次洗脫進(jìn)行20分鐘，第二次15分鐘，第三次5分鐘。所有洗脫均在室溫進(jìn)行。洗脫DNA的量用嵌入染料PicogreenTM定量。
參考圖8，其中x-軸是以攝氏度計(jì)的結(jié)合溫度，y-軸是洗脫DNA的納克(ng)數(shù)。結(jié)果顯示三種不同結(jié)合溫度下洗脫的DNA量(ng)。對(duì)于熱氧化硅和不經(jīng)等離子體蝕刻處理的基于硅烷的PECVD氧化物，最大結(jié)合效率在4℃實(shí)現(xiàn)。與經(jīng)等離子體蝕刻的基于硅烷的PECVD氧化物的結(jié)合在所有條件下都低，并且不隨結(jié)合溫度的改變而增強(qiáng)。通過(guò)冷卻與沉淀熱連接的熱沉而冷卻系統(tǒng)襯底到4℃，從而將這些結(jié)果引入微機(jī)械加工的結(jié)合物。
本文引用的所有專(zhuān)利和出版物經(jīng)引用并入此處?？梢岳斫?，上述實(shí)施方案的某些上述結(jié)構(gòu)、功能和操作不是實(shí)施本發(fā)明所必需的，僅僅是為了示例性實(shí)施方案的完整性而包括在說(shuō)明書(shū)中。此外，可以理解，上述引用專(zhuān)利和出版物的具體結(jié)構(gòu)、功能和操作可以與本發(fā)明結(jié)合而實(shí)施，但它們對(duì)于實(shí)施不是關(guān)鍵的。因此應(yīng)該理解，可以在具體描述以外實(shí)施本發(fā)明，而實(shí)際上不偏離所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.用于微流核酸處理的裝置，包含a)硅襯底；b)能提供引入微升量材料的至少一個(gè)出口，所述材料選自哺乳動(dòng)物血、緩沖鹽溶液、裂解劑、鹽水溶液、醇、空氣及其組合；c)混合器，位于混合室內(nèi)，并能將血與緩沖鹽溶液混合；d)裂解室，可以向其中遞送裂解劑以裂解細(xì)胞膜；e)能從裝置中取出材料的至少一個(gè)出口；f)結(jié)合物室，包含能在合適條件下結(jié)合核酸的結(jié)合材料和g)能指導(dǎo)流通過(guò)裝置的至少一個(gè)閥。
2.權(quán)利要求1的裝置，還包含過(guò)濾器，其位于過(guò)濾室內(nèi)并具有足夠大以捕獲白細(xì)胞、足夠小以允許紅細(xì)胞通過(guò)的孔徑。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中所述裝置在設(shè)計(jì)和構(gòu)造上是整體式的。
4.權(quán)利要求1的裝置，其中所述混合室和裂解室是相同的。
5.權(quán)利要求2的裝置，其中所述裂解室和過(guò)濾室是相同的。
6.權(quán)利要求1的裝置，還包含至少一個(gè)光學(xué)上可通過(guò)的通道。
7.權(quán)利要求1的裝置，還包含用于形成電連接的結(jié)合墊。
8.權(quán)利要求1的裝置，還包含玻璃晶片覆蓋物。權(quán)利要求1的裝置，還包含用于選擇性加熱裝置區(qū)域的加熱裝置。
9.經(jīng)包括以下步驟的方法制造的核酸結(jié)合材料a)提供硅襯底；b)用熱氧化物工藝處理硅襯底，以提供氧化硅表面；和c)用等離子體蝕刻劑工藝等離子體蝕刻氧化硅表面。
10.權(quán)利要求10的核酸結(jié)合材料，其中所述等離子體蝕刻劑工藝包括CHF3和O2等離子體蝕刻處理的組合。經(jīng)包括以下步驟的方法制造的核酸結(jié)合材料a)提供襯底；和b)用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積工藝將基于硅烷的氧化硅沉積到襯底上。
11.權(quán)利要求12的核酸結(jié)合材料，其中所述襯底包含硅。
12.處理核酸的方法，包括以下步驟a)在混合室中混合微升量的哺乳動(dòng)物血和鹽水溶液以產(chǎn)生稀釋的血混合物；b)使稀釋的血混合物和裂解劑流入反應(yīng)室，其中所述裂解劑使細(xì)胞壁破裂并釋放白細(xì)胞中所含的核酸；和c)使包含釋放的核酸的混合物流過(guò)結(jié)合室，其中所述結(jié)合室包含在高鹽含量條件下選擇性結(jié)合核酸的結(jié)合材料。
13.權(quán)利要求14的方法，還包括使所述稀釋的血混合物通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾的步驟，以將含核酸的白細(xì)胞與紅細(xì)胞分離。
14.權(quán)利要求14的方法，還包括用漂洗劑漂洗與所述結(jié)合材料結(jié)合的核酸的步驟。
15.權(quán)利要求16的方法，其中所述漂洗劑是乙醇。
16.權(quán)利要求14的方法，還包括用干燥方法干燥與結(jié)合材料結(jié)合的核酸的步驟。
17.權(quán)利要求18的方法，其中所述干燥方法是強(qiáng)制對(duì)流。
18.權(quán)利要求18的方法，其中所述干燥方法包含空氣流。
19.權(quán)利要求14的方法，還包括用低鹽溶液處理與結(jié)合材料結(jié)合的核酸的步驟，以使核酸游離于結(jié)合材料并使得可以收集它。
20.用于微流核酸處理的整體式裝置，包含a)將細(xì)胞材料引入裝置的器件；b)將裂解劑引入裝置的器件；c)使細(xì)胞材料與裂解劑混合以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜裂解并釋放細(xì)胞組分的器件；d)選擇性結(jié)合核酸的手段；e)漂洗結(jié)合的核酸的手段；f)干燥結(jié)合的核酸的手段；和g)去結(jié)合并洗脫核酸的手段。
21.權(quán)利要求22的裝置，其中所述細(xì)胞材料和裂解劑經(jīng)入口引入。
22.權(quán)利要求22的裝置，其中使細(xì)胞材料與裂解劑混合的器件包含卷曲的毛細(xì)管微混合器。
23.權(quán)利要求22的裝置，其中選擇性結(jié)合核酸的器件包含權(quán)利要求10的結(jié)合材料。
24.權(quán)利要求22的裝置，其中選擇性結(jié)合核酸的器件包含權(quán)利要求12的結(jié)合材料。
25.權(quán)利要求22的裝置，其中選擇性結(jié)合核酸的手段包括使用高鹽溶液。
26.權(quán)利要求22的裝置，其中干燥結(jié)合的核酸的手段包括強(qiáng)制對(duì)流干燥。
27.權(quán)利要求22的裝置，其中去結(jié)合并洗脫核酸的手段包括用低鹽溶液漂洗。
28.權(quán)利要求22的裝置，其中去結(jié)合并洗脫核酸的手段包括用高純水漂洗。
全文摘要
本發(fā)明提供從細(xì)胞材料如血中提取和純化核酸(DNA、RNA等)的新系統(tǒng)。這種提取和純化系統(tǒng)依賴(lài)于新的整體式微流控裝置和使用這些裝置的方法。這樣的裝置包含整體整合在單芯片上的很多組件，還包含新的核酸結(jié)合材料。本發(fā)明還涉及制備這種新的核酸結(jié)合材料的方法。
文檔編號(hào)G01N1/34GK1950506SQ200480039520
公開(kāi)日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2004年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者維克托·桑佩爾, 計(jì)洪苗, 陳宇, 王秋杰, 林直明 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局, 新加坡國(guó)立大學(xué)