專利名稱：溶血試樣的穩(wěn)定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溶血試樣的穩(wěn)定化方法。
背景技術(shù)：
在血球中的糖化蛋白質(zhì)中，特別是糖化血紅蛋白(HbA1c)反映生體內(nèi)的血糖值的過去的歷史，因此是糖尿病的診斷或治療等中的重要指標(biāo)。
糖化血紅蛋白例如可以通過高速液相色譜(HPLC)法、微型柱(minicolumn)法、免疫法等測(cè)定血紅蛋白的糖化率，最近，還研究出了使用糖化氨基酸氧化還原酶(FAOD)的酶法測(cè)定方法。
前述酶法，首先，將紅細(xì)胞溶血以制備溶血試樣，將果糖基氨基酸氧化酶(以下稱為″FAOD″)加到此溶血試樣中，使其作用于糖化血紅蛋白的糖化部分并產(chǎn)生過氧化氫。此過氧化氫的量對(duì)應(yīng)于前述糖化血紅蛋白的糖化量。然后，將過氧化物酶(以下稱為″POD″)和還原劑加到此試樣中，將前述POD作為催化劑在前述過氧化氫和前述還原劑之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)。此時(shí)，如果使用通過氧化而顯色的基質(zhì)作為前述還原劑，則可以通過測(cè)定這種顯色來測(cè)定前述過氧化氫量，結(jié)果是，可以得知血球中的糖化血紅蛋白量。這種酶法適用于實(shí)際的臨床醫(yī)療領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
但是，這種酶法會(huì)產(chǎn)生以下的問題。也就是，在測(cè)定糖化蛋白質(zhì)時(shí)，如前所述，首先，必須制備溶血試樣，但是并不一定在溶血試樣剛剛制備完之后就立即測(cè)定糖化蛋白質(zhì)。即，在收集一定數(shù)量的溶血試樣后，再將它們?nèi)坑糜跍y(cè)定，根據(jù)各溶血試樣的不同，則在從制備到測(cè)定開始的時(shí)間不同，由于將這樣的溶血試樣的放置，則會(huì)發(fā)現(xiàn)有測(cè)定精度下降的現(xiàn)象。具體地，即使是相同的溶血試樣，在將其放置在室溫下時(shí)，根據(jù)放置時(shí)間，會(huì)發(fā)現(xiàn)測(cè)定值隨時(shí)間上升，產(chǎn)生無法得到正確的糖化蛋白質(zhì)的質(zhì)量的問題。為了避免這種問題、維持優(yōu)異的測(cè)定精度而要求在剛剛制備完溶血試樣之后就立即進(jìn)行對(duì)糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定。但是，在臨床醫(yī)療的領(lǐng)域中，必須處理大量的檢測(cè)體，因此對(duì)各檢測(cè)體來說，在剛剛制備完溶血試樣之后就立即進(jìn)行測(cè)定，在效率方面也有實(shí)際的困難。
因此，本發(fā)明的目的在于例如提供即使放置在室溫下，對(duì)在以后所進(jìn)行的測(cè)定中的測(cè)定的精度也不會(huì)產(chǎn)生影響的溶血試樣的穩(wěn)定化方法。
為了實(shí)現(xiàn)前述目的，本發(fā)明的溶血試樣的穩(wěn)定化方法，其特征在于在使血球溶血的溶血試樣中，含有選自碳酸離子、碳酸氫離子和二氧化碳中的至少一種。
本發(fā)明者等對(duì)將溶血試樣放置在室溫下時(shí)，對(duì)前述的糖化血紅蛋白的測(cè)定值隨著時(shí)間增加的原因進(jìn)行了認(rèn)真研究。其結(jié)果是，可以推斷由于在放置溶血試樣時(shí)，大氣中的二氧化碳溶解到前述溶血試樣中，溶解的二氧化碳導(dǎo)致前述試樣中的血紅蛋白結(jié)構(gòu)緩慢變化，伴隨著這種變化，蛋白酶引起的消化反應(yīng)速度產(chǎn)生變化，或者血紅蛋白自身的氧化還原能也發(fā)生變化，因此前述的FAOD或POD引起的氧化還原反應(yīng)受到影響，其結(jié)果是，測(cè)定值上升?；谶@種推斷進(jìn)行研究的結(jié)果是，本發(fā)明者等發(fā)現(xiàn)通過使二氧化碳溶解于溶血試樣中，或者通過使溶血試樣含有碳酸離子或者碳酸氫離子，可以抑制前述這種溶血試樣的放置而產(chǎn)生的測(cè)定值的經(jīng)時(shí)變化，從而完成本發(fā)明。所有本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)通過這樣的溶血試樣的放置，測(cè)定值隨時(shí)間變化而上升；推斷這種上升的原因是溶解了二氧化碳；以及通過使溶血試樣預(yù)先含有二氧化碳或碳酸離子或者碳酸氫離子可以解決前述課題。如果根據(jù)這種溶血試樣的穩(wěn)定化方法，就不需要?jiǎng)倓傊苽渫曛缶土⒓赐ㄟ^酶反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，因此在前述的臨床領(lǐng)域中，可以非常有效地測(cè)定以糖化血紅蛋白為代表的糖化蛋白質(zhì)，并可以認(rèn)為其是非常有用的方法。
另外，前述的本發(fā)明的溶血試樣的穩(wěn)定化方法，例如，可以使用一種含有表面活性劑的血球溶血用的溶血試劑溶液，其進(jìn)一步含有選自碳酸離子、碳酸氫離子和二氧化碳中的至少一種。如果使用這種溶血試劑溶液，則可以容易地進(jìn)行前述的本發(fā)明的溶血試樣的穩(wěn)定化，所以可以認(rèn)為，例如在臨床領(lǐng)域等測(cè)定糖化蛋白質(zhì)時(shí)這種溶血試劑溶液是非常有用的試劑。另外，通過本發(fā)明的溶血試樣的穩(wěn)定化方法可以進(jìn)行溶血試樣的制造。


圖1是表示根據(jù)本發(fā)明制備的溶血試樣的一個(gè)實(shí)施例中，前述溶血試樣的保存時(shí)間和測(cè)定值變化的關(guān)系的曲線圖。
圖2是表示在前述實(shí)施例中，其它的溶血試樣的保存時(shí)間和測(cè)定值變化的關(guān)系的曲線圖。
圖3是表示在前述實(shí)施例中，另外的溶血試樣的保存時(shí)間和測(cè)定值變化的關(guān)系的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
如前所述，本發(fā)明的溶血試樣的穩(wěn)定化方法的特征在于在使血球溶血的溶血試樣中，含有選自碳酸離子、碳酸氫離子和二氧化碳中的至少一種。另外，在本發(fā)明中，所述的溶血試樣中含有二氧化碳是指在前述溶血試樣中溶解有二氧化碳。
首先，對(duì)在溶血試樣中溶解二氧化碳而將前述溶血試樣穩(wěn)定化的方法的一個(gè)例子進(jìn)行說明。
對(duì)于前述溶血試樣中的二氧化碳的溶解濃度，例如可以根據(jù)用于溶血處理的血球量等適當(dāng)確定，例如，在2～35℃時(shí)，該溶解濃度為約8mmol/L或以上，優(yōu)選為約10～80mmol/L，更優(yōu)選為約15～80mmol/L。具體地，前述溶血試樣中的血球濃度為約5g/L時(shí)，二氧化碳的溶解濃度在約2～35℃下，例如該溶解濃度優(yōu)選為約8mmol/L或以上，更優(yōu)選為約10～80mmol/L，特別優(yōu)選為約15～80mmol/L。另外，不含二氧化碳的溶血試樣(血球濃度為5g/L)的二氧化碳濃度通常為0.4～1mmol/L左右。
在本發(fā)明中，優(yōu)選在前述溶血試樣中進(jìn)一步含有表面活性劑。通過含有表面活性劑，例如，在測(cè)定糖化血紅蛋白等糖化蛋白質(zhì)時(shí)，可以有效地進(jìn)行用于分解前述蛋白質(zhì)的蛋白酶處理。另外，如前所述，由于二氧化碳的影響，例如，血紅蛋白的消化速度可能會(huì)產(chǎn)生變化，但是如果添加表面活性劑，則可以進(jìn)一步促進(jìn)其消化反應(yīng)。作為前述表面活性劑，沒有特別的限制，例如，可以使用聚氧乙烯對(duì)-叔辛基苯基醚(Triton類表面活性劑等)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基醚(Tween類表活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij類表面活性劑等)等非離子性表面活性劑，具體地，例如可以列舉出TritonX-100、Tween-20、Brij35等。
前述溶血試樣中的表面活性劑的含有濃度例如優(yōu)選為約6～40mmol/L，更優(yōu)選為約10～40mmol/L，特別優(yōu)選為約15～40mmol/L。具體地，在前述溶血試樣中的血球濃度為約5g/L時(shí)，表面活性劑的濃度在約2～35℃下，例如為約8mmol/L，優(yōu)選為約10～40mmol/L，更優(yōu)選為約15～40mmol/L。
在本發(fā)明的穩(wěn)定化方法中，為了使二氧化碳溶解于溶血試樣中，例如，優(yōu)選進(jìn)一步包括通過含有表面活性劑且溶解了二氧化碳的溶血試劑溶液使血球溶血的工序。通過使用這種溶血試劑溶液而使血球溶血，從而可以制備溶解了二氧化碳的溶血試樣。
血球的溶血例如可以向全血中添加前述溶血試劑溶液來進(jìn)行，也可以從全血回收的血球(粒子)中添加混合前述溶血試劑溶液來進(jìn)行。血球可以通過例如離心分離、血球分離膜等膜處理等現(xiàn)有公知的方法回收。
前述溶血試劑溶液中的表面活性劑(A)和二氧化碳(B)的比例(摩爾比A∶B)沒有特別的限制，優(yōu)選為1∶0.5～1∶13，更優(yōu)選為1∶2～1∶13，特別優(yōu)選為1∶2～1∶3。
前述溶血試劑溶液中的表面活性劑和二氧化碳的濃度，例如可以根據(jù)對(duì)血球的添加量和血球量適當(dāng)確定，例如表面活性劑為約6～42mmol/L、二氧化碳為約8～84mmol/L，優(yōu)選表面活性劑為約6.3～42mmol/L、二氧化碳為約8.4～84mmol/L，更優(yōu)選表面活性劑為10～40mmol/L、二氧化碳為約10～80mmol/L，特別優(yōu)選為表面活性劑為15～40mmol/L、二氧化碳為約15～80mmol/L。另外，前述二氧化碳的濃度例如是2～35℃下的濃度。
含有前述表面活性劑且溶解了二氧化碳的前述溶血試劑溶液，例如可以通過使99.9％的二氧化碳?xì)怏w在含有前述表面活性劑的溶液中起泡而制備。起泡可以使用例如二氧化碳的貯氣瓶等進(jìn)行。其條件沒有特別的限制，通常在2～35℃的條件下進(jìn)行。具體地，在前述溶液為10mL時(shí)，例如通過在自然的大氣壓下、溫度為1.5～35℃、時(shí)間為10秒的條件下起泡，則可以得到二氧化碳的溶解濃度為約20～80mmol/L的溶血試劑溶液。
另外，作為含有表面活性劑的溶液的溶劑，沒有特別的限制，例如可以使用水和各種緩沖液。另外，二氧化碳除了可以溶解于上述的含有表面活性劑的溶液中以外，例如，也可以預(yù)先溶解在用于制備前述溶液的前述溶劑中。
血球和前述溶血試劑溶液的混合比例沒有特別的限制，例如，優(yōu)選將制備的溶血試樣中的二氧化碳的溶解濃度以及表面活性劑的濃度設(shè)定為前述范圍。
另外，在本發(fā)明的穩(wěn)定化方法中，為了使二氧化碳溶解于前述溶血試樣中除了使用前述的溶血試劑溶液以外，例如也可以通過使用表面活性劑的方法、超聲波法、使用滲透壓差的方法等制備溶血試樣后，在該溶血試樣中直接進(jìn)行二氧化碳?xì)怏w的起泡。
接著，對(duì)使溶血試樣含有碳酸離子或者碳酸氫離子而將前述溶血試樣穩(wěn)定化的方法的一個(gè)例子進(jìn)行說明。
前述溶血試樣中的碳酸離子或碳酸氫離子的濃度，例如可以根據(jù)提供溶血處理的血球量等適當(dāng)確定，例如該濃度為約8mmol/L或以上，優(yōu)選為約10～80mmol/L，更優(yōu)選為約15～80mmol/L。具體地，在前述溶血試樣中的血球濃度為5g/L時(shí)，碳酸離子或碳酸氫離子的濃度例如為約8mmol/L或以上，優(yōu)選為約10～80mmol/L，更優(yōu)選為約15～80mmol/L。另外，可以含有碳酸離子和碳酸氫離子的中任意之一，也可以兩者都含有。另外，在含有兩種離子時(shí)，其總濃度例如可以是前述濃度(例如濃度為8mmol/L或以上)。
與前述相同，優(yōu)選在前述溶血試樣中進(jìn)一步含有表面活性劑。另外，表面活性劑的種類和濃度等沒有特別的限制，例如與前述相同。
在本發(fā)明中，為了使溶血試樣含有碳酸離子或碳酸氫離子，例如優(yōu)選包含通過含有表面活性劑且含有碳酸離子或碳酸氫離子的溶血試劑溶液使血球溶血的工序。通過使用這種溶血試劑溶液使血球溶血可以制備含有碳酸離子或碳酸氫離子的溶血試樣。
對(duì)于含有前述表面活性劑且溶解碳酸離子或碳酸氫離子的前述溶血試劑溶液，例如可以通過在含有表面活性劑的溶液中將碳酸鹽溶解而制備。
作為前述碳酸鹽，例如優(yōu)選為堿金屬鹽，具體地，可以使用碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鎂、碳酸鋰、碳酸鈉·鉀、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸銨、碳酸氫銨和三(羥甲基)氨基甲烷碳酸鹽(Tris carbonate)等，其中特別優(yōu)選碳酸鈉等。另外，可以使用它們中的一種，可以將二種或更多種同時(shí)使用。
前述溶血試劑溶液中的表面活性劑(A)和碳酸鹽(C)的添加比例(摩爾比A∶C)例如優(yōu)選為1∶0.2～1∶27，更優(yōu)選為1∶1.5～1∶27，特別優(yōu)選為1∶1.5～1∶4。
作為前述溶血試劑溶液中的碳酸離子或碳酸氫離子的濃度，例如可以根據(jù)向血球的添加量以及血球量適當(dāng)確定，例如該濃度為約8mmol/L或以上，優(yōu)選為約8.4mmol/L或以上，更優(yōu)選為約10～80mmol/L，特別優(yōu)選為約15～80mmol/L。
另外，在使前述溶血試樣含有碳酸離子或碳酸氫離子時(shí)，除了使用前述的溶血試劑溶液以外，例如，也可以在制備了溶血試樣后，在該溶血試樣中直接溶解前述的碳酸鹽，或者也可以添加混合溶解了前述碳酸鹽的溶液。
另外，作為現(xiàn)有的問題，特別是在使血液溶血的狀態(tài)下放置，可以發(fā)現(xiàn)如前所述的那樣，HbA1c值上升，所以在本發(fā)明的穩(wěn)定化方法中，至少在放置溶血試樣，可以含有二氧化碳或碳酸離子、碳酸氫離子。在本發(fā)明的穩(wěn)定化方法中，如前所述的那樣，前述二氧化碳或碳酸離子、碳酸氫離子，例如可以在溶血試樣中含有，也可以預(yù)先在溶血前的檢測(cè)體中含有。另外，可以在溶血試樣或溶血前的檢測(cè)體中直接含有，也可以如前所述的那樣，在溶血試劑溶液中含有二氧化碳或碳酸離子、碳酸氫離子，并將該試劑添加到溶血前檢測(cè)體中。其中，例如從臨床實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)中的便利性和簡易性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為預(yù)先在溶血試劑中含有二氧化碳或碳酸離子、碳酸氫離子，再添加到溶血前的檢測(cè)體中。
只要是如上制備的含有二氧化碳或碳酸離子或者碳酸氫離子的溶血試樣，例如，在室溫條件下保存時(shí)，就可以維持長時(shí)間穩(wěn)定的狀態(tài)。為此，例如，即使在前述的保存后通過酶反應(yīng)進(jìn)行溶血試樣中的糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定時(shí)，也可以抑制測(cè)定值隨時(shí)間的變化。本發(fā)明例如還適用于在低溫條件下保存溶血試樣的情形，由于可以解決前述的室溫條件下的問題，所以可以認(rèn)為本發(fā)明是在室溫(例如，15～35℃左右)下保存溶血試樣時(shí)有用的方法。特別是，在前述這種臨床醫(yī)療等的分析化學(xué)的領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)實(shí)際上制備后的溶血試樣主要保存在室溫下，由于這種條件下的保存會(huì)產(chǎn)生前述的這種問題，所以認(rèn)為本發(fā)明對(duì)室溫下的穩(wěn)定化有用。另外，剛剛制備完之后就立即測(cè)定溶血試樣顯然是可以的，但是如前所述的那樣，由于可以避免保存時(shí)的問題，所以優(yōu)選適用于在前述的臨床醫(yī)療領(lǐng)域中的剛剛制備完之后的使用是困難時(shí)的情形。根據(jù)本發(fā)明，例如可以將溶血試樣調(diào)整后26小時(shí)左右的測(cè)定值保持到與剛剛制備完成之后相同的程度，優(yōu)選保持時(shí)間為3～10小時(shí)左右。
根據(jù)本發(fā)明制備的溶血試樣，例如可以作為糖化血紅蛋白、血紅蛋白、糖化白蛋白(glycocyamidine)、白蛋白、球蛋白、肌紅蛋白等的測(cè)定試樣使用，特別優(yōu)選糖化血紅蛋白。
以下，就根據(jù)本發(fā)明制備的溶血試樣，說明測(cè)定糖化血紅蛋白的方法的一個(gè)例子。
首先，對(duì)前述溶血試樣進(jìn)行蛋白酶處理，分解前述試樣中的糖化血紅蛋白。前述蛋白酶處理通常是在緩沖液中進(jìn)行，其處理?xiàng)l件可以根據(jù)所使用的蛋白酶的種類、糖化血紅蛋白的種類及其濃度等適當(dāng)確定。
作為蛋白酶，沒有特別的限制，例如，可以使用絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶等，具體地，優(yōu)選為胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、氨基肽酶等。另外，在分解的糖化蛋白質(zhì)為糖化血紅蛋白時(shí)，前述蛋白酶優(yōu)選為選擇性地分解前述糖化血紅蛋白的蛋白酶，例如，可以列舉出菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來自豬的胰臟的胰蛋白酶，金屬蛋白酶、來自枯草桿菌(bacillus subtilis)的蛋白酶等。作為來自前述枯草桿菌的蛋白酶可以列舉出商品名為蛋白酶N(例如，F(xiàn)luka公司制造)，商品名為蛋白酶N“Amano”(天野制藥公司制造)等。作為前述金屬蛋白酶可以列舉出來自Bacillus屬的金屬蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如，東洋紡織公司制造的，商品名為Toyoteam)等。其中，更優(yōu)選為金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，特別優(yōu)選為金屬蛋白酶。如果使用如上所述的選擇性地分解的蛋白酶，則可以選擇性地制備特定的蛋白質(zhì)的分解物。
作為前述緩沖液，例如可以列舉出CHES緩沖液、CAPSO緩沖液、CAPS緩沖液、磷酸緩沖液、Tris緩沖液、EPPS緩沖液、HEPES緩沖液等。其pH值例如為6～13，優(yōu)選為7～11。另外，蛋白酶處理溶液中的前述緩沖液的最終濃度，例如為1.0～10mmol/L。
具體地，例如在使用金屬蛋白酶作為前述蛋白酶來處理前述溶血試樣時(shí)，通常反應(yīng)液中的金屬蛋白酶的濃度為0.1～40MU/L，反應(yīng)液中的血球濃度0.05～15體積％、反應(yīng)溫度為15～37℃、反應(yīng)時(shí)間為1分鐘～24小時(shí)、pH值為6～12。
另外，例如在使用蛋白酶K作為前述蛋白酶來處理前述溶血試樣時(shí)，通常反應(yīng)液中的金屬蛋白酶的濃度為10～300KU/L，反應(yīng)液中的血球濃度0.05～15體積％、反應(yīng)溫度為15～37℃、反應(yīng)時(shí)間為1分鐘～24小時(shí)、pH為6～12。另外，前述緩沖液的種類也沒有特別的限制，例如，Tris鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液等。
接著，通過前述蛋白酶處理得到的糖化血紅蛋白分解物用后述的FAOD處理。通過該FAOD處理可以催化后述的式(1)所示的反應(yīng)。與前述FAOD進(jìn)行反應(yīng)的糖化血紅蛋白分解物的糖化部分根據(jù)所使用的FAOD的催化反應(yīng)而異，例如優(yōu)選為氨基酸殘基側(cè)鏈的糖化氨基或糖化α-氨基。其中，由于具有后述的催化功能的FAOD容易作用，所以優(yōu)選為前述氨基酸殘基側(cè)鏈的糖化氨基，例如，可以列舉出賴氨酸殘基側(cè)鏈的糖化氨基、精氨酸殘基側(cè)鏈的糖化氨基。
該FAOD處理優(yōu)選與前述蛋白酶處理同樣地在緩沖液中進(jìn)行，作為前述緩沖液，沒有特別的限制，可以使用與前述蛋白酶處理相同的緩沖液。
該處理?xiàng)l件，例如為反應(yīng)液中的FAOD濃度為200～30,000U/L，反應(yīng)液中的血紅蛋白的濃度為0.1～10g/L，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時(shí)間為1～20分鐘，pH為7～9。
接著，使用POD和因氧化而發(fā)色的基質(zhì)利用氧化還原反應(yīng)測(cè)定前述FAOD處理所產(chǎn)生的過氧化氫。
通過該P(yáng)OD的氧化還原反應(yīng)通常在緩沖液中進(jìn)行，其條件根據(jù)過氧化氫濃度等適當(dāng)決定。通常，反應(yīng)液中的POD的濃度為1～20000IU/L，基質(zhì)濃度為0.0001～1mmol/L，反應(yīng)溫度為20～37℃，反應(yīng)時(shí)間為1～5分鐘，pH為6～9。另外，前述緩沖液沒有特別的限制，可以使用與前述FAOD處理等相同的緩沖液等。
作為前述因氧化而發(fā)色的基質(zhì)，沒有特別的限制，例如可以列舉出N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺鈉、鄰苯二胺(OPD)、組合Trinder試劑和4-氨基安替比林的基質(zhì)等。作為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺鈉，例如可以使用商品名為DA-64(和光純藥公司制造)。作為前述Trinder試劑，例如可以列舉出苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了前述4-氨基安替比林以外，還可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在這種發(fā)色性基質(zhì)中，特別優(yōu)選為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺鈉。
使用前述因氧化而發(fā)色基質(zhì)時(shí)，通過使用分光光度計(jì)測(cè)定其發(fā)色(反應(yīng)液的吸光度)，可以測(cè)定過氧化氫的濃度，由此測(cè)定前述試樣中的血紅蛋白糖化量。
作為前述FAOD，例如可以使用催化下式(1)所示的反應(yīng)的FAOD。
...(1)在前式(1)中，R1-CO-CH2-NH-R2是例如糖化蛋白質(zhì)、糖化肽和糖化氨基酸。在前式(1)中，R1表示羥基或來自糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。前述糖殘基(R1)在反應(yīng)前的糖為醛糖時(shí)是醛糖殘基，在反應(yīng)前的糖是酮糖時(shí)，是酮糖殘基。例如，在反應(yīng)前的糖為葡萄糖時(shí)，由于阿瑪竇利重排(Amadori Rearrangement)使反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)為左旋糖結(jié)構(gòu)，此時(shí)，糖殘基(R1)為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)，例如可以用下述式表示，-[CH(OH)]n-CH2OHn是0～6的整數(shù)。另外，在前式(1)中，R2表示氨基酸殘基或肽殘基。
所使用的FAOD的催化反應(yīng)只要是前述的這種反應(yīng)，就沒有特別的限制，優(yōu)選為在前式(1)中作用于糖與α-氨基以外的氨基成鍵的糖化部位的催化反應(yīng)。另外，前述FAOD并不僅限于這種催化功能，可以進(jìn)一步同時(shí)具有作用于糖與α-氨基成鍵的糖化部位的催化功能。
實(shí)施例(實(shí)施例1)(標(biāo)準(zhǔn)試樣的制備)將血紅蛋白的冷凍干燥品用下述溶血試劑溶液A溶解，制備血紅蛋白濃度為4.1g/L、HbA1c值為4.4％的試樣溶液(以下，稱作“試樣Low”)，以及血紅蛋白濃度為5.3g/L、HbA1c值為10.4％的試樣溶液(以下，稱作“試樣High”)。
(檢測(cè)體試樣的制備)將人的全血離心處理(3000rpm，10分鐘，20℃)來回收紅血球，在前述紅血球中添加混合50倍(體積)的下述溶血試劑溶液A，由此進(jìn)行溶血，作為檢測(cè)體試樣。
(溶血試劑溶液A)表面活性劑(聚氧乙烯月桂基醚) 12g/LCHES/MOPS緩沖液(pH9.4) CHES 80mMMOPS 30mMNa2CO333mM在25℃下將前述各試樣(溶血試樣)放置一定時(shí)間(0、2、4、6、8小時(shí))。然后，在放置后的20μL溶血試樣中，添加180μL下述蛋白酶試劑，在37℃下處理5分鐘后，再添加45μL下述FAOD試劑，在37℃下進(jìn)行處理。然后，在主波長700nm、副波長570nm下測(cè)定添加FAOD試劑5分鐘后的反應(yīng)液的吸光度。再將前述測(cè)定值代入使用HbA1c的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)預(yù)先制作的HbA1c(％)和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)線，求得前述溶血試樣的HbA1c(％)，將放置時(shí)間為0小時(shí)的溶血試樣的HbA1c值(％)作為“100％”，對(duì)各溶血試樣的HbA1c值算出相對(duì)值(％)。
另外，除了將表面活性劑的濃度設(shè)定為12g/L、不添加碳酸鈉以外，制備組成與前述溶血試樣A相同的溶血試劑溶液C。然后，除了使用溶血試劑溶液C代替溶血試劑溶液A以外，同樣地制備溶血試樣以及進(jìn)行放置，將進(jìn)行了發(fā)色反應(yīng)的試樣作為比較例1。
它們的結(jié)果如圖1～3所示。另外，圖1～3分別是表示溶血試樣的放置時(shí)間和HbA1c值的相對(duì)值(％)的關(guān)系圖，圖1表示試樣Low的結(jié)果，圖2表示試樣High的結(jié)果，圖3表示檢測(cè)體試樣的結(jié)果。
(蛋白酶試劑)金屬蛋白酶(ARKRAY公司制造) 2MU/LMES緩沖液(pH5.5) 1mM(FAOD試劑)FAOD(ARKRAY公司制造) 17.4KU/LPOD(Kikkman公司制造) 67.0KU/LTris緩沖液(pH7.0)300mM商品名為DA-64(同仁化學(xué)公司制造) 71.3μmol/L(實(shí)施例2)除了使用下述溶血試劑溶液B代替溶血試劑溶液A以外，與前述實(shí)施例1同樣地測(cè)定吸光度，求得HbA1c值的相對(duì)值。這些結(jié)果一并表示于圖1～圖3中。
(溶血試劑溶液B)除了不添加Na2CO3以外，通過便攜貯氣瓶(商品名Standard GasCo2；GL Sciences公司制造)在與前述溶血試劑溶液A相同組成的混合液中，進(jìn)行二氧化碳起泡。起泡的條件是在室溫(約20℃)、自然大氣壓下、進(jìn)行10秒。由此，制備二氧化碳濃度約為30mmol/L的溶血試劑溶液B。
如前述圖1～圖3所示，除了未添加碳酸鈉、不進(jìn)行二氧化碳起泡以外，如果是使用與前述溶血試劑溶液A相同組成的前述溶血試劑溶液C的比較例1，則會(huì)由于溶血試樣的放置而使HbA1c值的相對(duì)值隨時(shí)間變化而增大。相對(duì)于此，如果是使用溶血試劑溶液A和溶血試劑溶液B的實(shí)施例，則即使與比較例1同樣地將溶血試樣放置7小時(shí)，也幾乎沒有確認(rèn)出HbA1c值的相對(duì)值的增加。由該結(jié)果，可以知道通過預(yù)先在溶血試樣中溶解二氧化碳，可以防止溶血試樣的放置引起的HbA1c值的相對(duì)值的增加，從而防止溶血試樣的放置而導(dǎo)致測(cè)定精度的降低。
(實(shí)施例3、比較例2)然后，確認(rèn)溶血試樣在25℃下放置24小時(shí)后的HbA1c值的相對(duì)值的變化。首先，使用前述溶血試劑溶液B，與前述同樣地制備溶血試樣，使用剛制備后的溶血試樣和在25℃下放置24小時(shí)后的溶血試樣，分別進(jìn)行發(fā)色反應(yīng)，測(cè)定吸光度。然后，從使用HbA1c的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)預(yù)先制作的HbA1c(％)和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)線，求得前述各溶血試樣的HbA1c(％)。另外，作為比較例2，除了使用溶血試劑溶液C代替溶血試劑溶液A以外，與實(shí)施例1同樣地求得HbA1c(％)。這些結(jié)果如下述表1所示。另外，在下表中，所述的0小時(shí)和24小時(shí)表示溶血試樣在25℃下的放置時(shí)間，括號(hào)內(nèi)的值表示放置24小時(shí)后的HbA1c(％)變化值。


如前述表1所示，可以知道比較例2的測(cè)定變化值為0.9％，相對(duì)于此，實(shí)施例3在測(cè)定誤差的范圍內(nèi)(約0.5％或以下)，即使放置溶血試樣，也可以可靠性高地測(cè)定HbA1c濃度。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，即使將制備的溶血試樣例如保存在室溫下，也可以以與剛剛制備之后的溶血試樣同樣的測(cè)定精度進(jìn)行糖化蛋白質(zhì)的測(cè)定。因此，可以認(rèn)為本發(fā)明是在需要處理大量的檢測(cè)體時(shí)特別有用的溶血試樣的穩(wěn)定化方法。
權(quán)利要求
1.一種溶血試樣的穩(wěn)定化方法，其包含在溶血試樣中含有選自碳酸離子、碳酸氫離子和二氧化碳中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的穩(wěn)定化方法，其中在2～35℃下的所述溶血試樣中的二氧化碳的溶解濃度為8mmol/L或以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所記載的穩(wěn)定化方法，其中在2～35℃下的所述溶血試樣中的二氧化碳的溶解濃度為8～80mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的穩(wěn)定化方法，其中所述溶血試樣中的碳酸離子或碳酸氫離子的濃度為8mmol/L或以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所記載的穩(wěn)定化方法，其中所述溶血試樣中的碳酸離子或碳酸氫離子的濃度為8～80mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的穩(wěn)定化方法，其中在溶血試樣中進(jìn)一步含有表面活性劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所記載的穩(wěn)定化方法，其中溶血試樣中的表面活性劑的濃度為6～40mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所記載的穩(wěn)定化方法，其中溶血試樣中的血球濃度為3～7.5重量％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的穩(wěn)定化方法，其中包含通過含有表面活性劑且含有選自二氧化碳、碳酸離子和碳酸氫離子中的至少1種的溶血試劑溶液使血球溶血的工序。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所記載的穩(wěn)定化方法，其中在含有表面活性劑的溶液中，通過使二氧化碳?xì)怏w起泡來制備溶解了二氧化碳的所述溶血試劑溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所記載的穩(wěn)定化方法，其中所述溶血試劑溶液中的表面活性劑和二氧化碳的比例為1∶0.5～1∶13。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所記載的穩(wěn)定化方法，其中通過在含有表面活性劑的溶液中溶解碳酸鹽來制備含有碳酸離子的所述溶血試劑溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所記載的穩(wěn)定化方法，其中所述碳酸鹽是堿金屬鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所記載的穩(wěn)定化方法，其中所述堿金屬鹽是選自碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鎂、碳酸鋰、碳酸鈉·鉀、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、碳酸銨、碳酸氫銨和三(羥甲基)氨基甲烷碳酸鹽中的至少1種鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所記載的穩(wěn)定化方法，其中表面活性劑和碳酸鹽的比例為1∶0.2～1∶27。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的穩(wěn)定化方法，其中在所述溶血試樣中使二氧化碳?xì)怏w起泡。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的穩(wěn)定化方法，其中在所述溶血試樣中溶解碳酸鹽。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的穩(wěn)定化方法，其中所述溶血試樣是用于測(cè)定糖化血紅蛋白。
19.一種溶血試樣的制造方法，該方法包含權(quán)利要求1所記載的溶血試樣的穩(wěn)定化方法。
20.一種含有表面活性劑的血球溶血用溶血試劑溶液，該溶液進(jìn)一步包含選自碳酸離子、碳酸氫離子和二氧化碳中的至少一種。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所記載的溶血試劑溶液，其中二氧化碳的溶解濃度在2～35℃下為8mmol/L或以上。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所記載的溶血試劑溶液，其中表面活性劑和二氧化碳的比例為1∶0.5～1∶13。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所記載的溶血試劑溶液，其中碳酸離子或碳酸氫離子的濃度為8mmol/L或以上。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所記載的溶血試劑溶液，其中表面活性劑和碳酸鹽的比例為1∶0.2～1∶27。
全文摘要
本發(fā)明提供即使放置于室溫下在之后進(jìn)行的測(cè)定中，對(duì)測(cè)定精度沒有影響的溶血試樣的穩(wěn)定化方法和在該穩(wěn)定化方法中使用的溶血試劑溶液。使用含有表面活性劑且溶解了二氧化碳的溶血試劑溶液使血球溶血來制備溶血試樣。只要是如此制備的溶血試樣，則例如即使保存在室溫下，也可以以與剛剛制備之后的溶血試樣同樣的測(cè)定精度進(jìn)行糖化蛋白質(zhì)等的測(cè)定。在2～35℃下的前述溶血試樣中的二氧化碳的溶解濃度為8mmol/L或以上。
文檔編號(hào)G01N33/66GK1795381SQ20048001473
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月28日
發(fā)明者平井香, 米原聰 申請(qǐng)人:愛科來株式會(huì)社