專利名稱：同時檢測細胞增殖抑制活性和毒性的方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種同時檢測一種物質(zhì)的細胞增殖抑制活性和毒性的方法，其可在篩選這種物質(zhì)在增殖抑制中它的活性的過程中實施。
背景技術：
在藥物開發(fā)過程中，特別是在腫瘤學領域，對作為有效增殖抑制劑的物質(zhì)進行鑒定是非常重要的。存在各種基于細胞的體外檢測來用于研究這類候選物質(zhì)的抗增殖作用。這類檢測的實例是，例如，MTT比色檢測、[3H]胸苷攝取檢測和WST檢測(Johnston，P.，見Cellular Assays inHTS，Methods in Molecular Biology，110卷，Janzen W.P.(編輯)，HumanaPress，NJ，107-116頁；Bellamy，W.T.，Drugs 44(1992)690-708)。對藥物開發(fā)來說，這類檢測能夠用于高通量篩選大量潛在的候選藥物，這是必需的。
為了確定造血細胞的增殖狀態(tài)，已知的是用待研究物質(zhì)和一種試劑與細胞群接觸，所述試劑能夠在ATP存在的條件下產(chǎn)生熒光，并且檢測作為增殖狀態(tài)量度的熒光(US 2002/0 146680)。美國專利號5,972,639描述了一種通過熒光測量確定在細胞培養(yǎng)物中細胞數(shù)目的方法。
然而，這些檢測是耗時的，僅能提供有限的結(jié)果，而且不能區(qū)分抑制增殖和誘導細胞死亡。
因此，需要一種簡單并同時能夠檢測一種物質(zhì)對增殖和誘導細胞死亡的影響的檢測方法。而且，也需要該檢測方法可以進行自動操作。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種以增殖的哺乳動物細胞樣品為檢測體系，同時檢測一種物質(zhì)的細胞增殖抑制活性和細胞毒性(誘導細胞死亡)的方法，其特征在于a)用所述物質(zhì)以至少兩個不同的預定濃度處理預定體積的作為細胞懸液或作為貼壁細胞的所述細胞樣品；b)用對死細胞或活細胞特異染色的第一種熒光染料和任選地用染色所有細胞的第二種熒光染料處理所述細胞樣品；c)向所述細胞樣品中加入預定量的大小為約1-約20μm的膠乳顆粒至所述體積，并任選性地用第三種熒光染料對所述膠乳顆粒進行染色；d)測定所述樣品中細胞總數(shù)與膠乳顆粒數(shù)量的比例；e)用步驟d)的結(jié)果及通過對所述樣品進行流式細胞分析測定-死細胞或活細胞的數(shù)目，其通過由所述第一種熒光染料在第一個波長下激發(fā)的熒光測定；-每體積的細胞總數(shù)目，其通過在第一個角度下散射光或備選性地通過由所述第二種熒光染料在第二個波長下激發(fā)的熒光測定；-每體積的膠乳顆粒的數(shù)目，其通過在第二個角度下散射光或備選性地通過由所述第三種熒光染料在第三個波長下激發(fā)的熒光測定；f)用步驟d)和e)的結(jié)果測定所述物質(zhì)的細胞增殖活性和毒性。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，死細胞用一種熒光染料進行特異染色，膠乳顆粒和細胞的數(shù)目通過不同的側(cè)向散射光和正向散射光進行測定。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，細胞是人CD34+祖細胞。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，以所述待研究物質(zhì)的至少五種不同濃度實施該方法，其優(yōu)選可以計算增殖和誘導細胞死亡的IC50值。優(yōu)選地，濃度范圍是一個大約1-10,000的系數(shù)。
細胞用待研究物質(zhì)處理后，在允許細胞增殖的標準條件下培養(yǎng)細胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在多個裝置，優(yōu)選地在多孔微量滴定板中平行培養(yǎng)細胞。另外，同樣將待研究物質(zhì)以不同濃度加在這些裝置中，優(yōu)選地是通過自動吸取方式加入。
發(fā)明詳述當存在推測為細胞抑制劑的物質(zhì)時，在培養(yǎng)細胞過程中細胞生長的延遲可以通過細胞死亡和/或細胞增殖抑制造成的。因此，在培養(yǎng)后僅測定細胞的數(shù)量不可能直接推斷該物質(zhì)的毒性和/或抑制活性。這種推斷需要知道活細胞和死細胞的數(shù)量及它們相對于細胞總量的比例。本發(fā)明提供了一種快速同時測定這些參數(shù)的方法。另外，依照本發(fā)明的方法可被自動實施，從而允許高通量地檢測某種物質(zhì)的毒性和增殖抑制活性。
根據(jù)本發(fā)明，將確定的(預定的)等分試樣的膠乳顆粒加入到每個細胞培養(yǎng)裝置中。基于在流式細胞分析中對膠乳顆粒的計數(shù)，可以估測進行所有計數(shù)的液體體積。因此，本發(fā)明提供了一種當存在推測為檢測體系中的細胞的增殖抑制劑和/或?qū)ζ溆卸拘缘奈镔|(zhì)時，可同時測定培養(yǎng)后每體積的細胞總數(shù)(其是細胞增殖的量度)和每體積的活細胞數(shù)的方法。對不同濃度的物質(zhì)比較細胞總數(shù)和死細胞或活細胞數(shù)提供了該物質(zhì)抑制細胞增殖和毒性之間關系的信息。這一點可直接通過圖3推斷。如果死細胞相對于總細胞的比例顯著增加而細胞總數(shù)降低，則表明該物質(zhì)毒性很高。但是，如果死細胞相對于總細胞的比例沒有隨該物質(zhì)濃度增加而顯著增加，而細胞總數(shù)降低，則表明該物質(zhì)具有低毒性。具有高毒性的物質(zhì)的實例顯示在圖3中。5-氟尿嘧啶和阿霉素是同時表現(xiàn)出毒性和顯著的增殖抑制的物質(zhì)。對5-氟尿嘧啶而言，在該物質(zhì)增殖抑制活性大于50％的濃度范圍內(nèi)，死細胞占總細胞的比例范圍是0到25％之間。對阿霉素而言，在增殖抑制活性大約為80％時，死細胞的比例隨該物質(zhì)濃度高達40％或甚至更高而增加。
增殖細胞，例如CD34細胞的培養(yǎng)過程按如下所述進行。在進行FACS分析前，向每個儲器裝置(優(yōu)選微量滴定板或類似物質(zhì))中加入染色活細胞或死細胞的熒光染料和不同數(shù)量的膠乳珠，分別對活細胞或死細胞進行染色并對作為被分析的細胞培養(yǎng)基的體積的量度的膠乳顆粒進行計數(shù)。加入待研究物質(zhì)并在不同裝置中進行細胞培養(yǎng)后，將微量滴定板放在自動吸取裝置上，其將來自每個儲器的細胞樣品的等分試樣送經(jīng)FACS流體腔。對不同數(shù)目的膠乳珠進行分析(從而給出關于測定的培養(yǎng)基體積的信息)，停止測定，自動吸取裝置從下一個儲器中吸取等分試樣，并如前所述再次開始分析。
此處所用的術語“待研究物質(zhì)”或“物質(zhì)”描述的是任何推測具有增殖抑制活性或細胞毒性活性的物質(zhì)。所述物質(zhì)可以是例如，抗體、多肽、短肽、寡核苷酸或低分子量化合物。該化合物至少使用兩個不同的濃度，但優(yōu)選地是更多個濃度，例如五個不同濃度或更多。其原因是基于這些不同濃度的結(jié)果，可能很容易地研究濃度依賴的增殖抑制和細胞死亡誘導，并且確定該物質(zhì)是否誘導大量細胞死亡和/或抑制增殖。對這些數(shù)值進行比較，特別是對濃度依賴的增殖和細胞死亡誘導進行比較，可能鑒定潛在的顯示例如強的增殖抑制而不誘導大量細胞死亡的候選物質(zhì)。另外，在不同濃度下實施本發(fā)明的方法，可計算出增殖(“增殖活性”)和誘導細胞死亡(“毒性”)的IC50值。濃度和濃度范圍依賴于待研究物質(zhì)的所需效能，也依賴于研究中所用的細胞類型。通常，濃度范圍在微摩爾范圍，在約0.01μM/ml-100μM/ml之間。
此處所用的術語“細胞”描述的是這類在增殖檢測中用作檢測體系的增殖的哺乳動物細胞。這類細胞在本技術領域內(nèi)是眾所周知的，是例如人CD34+祖細胞和干細胞、淋巴細胞、正常成纖維細胞/角質(zhì)細胞、正常內(nèi)皮細胞和上皮細胞、人工轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞、白血病細胞和實體瘤細胞。這類細胞的增殖可被已知的抑制劑，例如紫杉醇、阿霉素或5-氟尿嘧啶抑制。
通常，將細胞接種到平行裝置中進行懸浮培養(yǎng)增殖。通常，例如，如果用96孔微量滴定板培養(yǎng)CD34細胞，每孔接種100-400細胞/200μl，并優(yōu)選在標準條件下(無待研究物質(zhì))進行增殖培養(yǎng)直至它們達到每孔約10,000細胞/200μl。在培養(yǎng)細胞時，使用的是常規(guī)的培養(yǎng)基，優(yōu)選加入生長因子。
此處所用的術語“膠乳顆?！笔侵高@類在用于細胞計數(shù)的自動計數(shù)儀的校準流體中廣泛使用的膠乳顆粒。例如，在美國專利號3,977,995中描述了這類膠乳顆粒。這類膠乳顆粒通常包括由聚苯乙烯聚甲基苯乙烯或苯乙烯二乙烯基苯共聚物制造的合成膠乳。顆粒大小通常在1-約20μm，加到細胞懸液中的顆粒數(shù)目是10,000顆粒/200μl。
通過在儀器中進行流式細胞分析，進行用于根據(jù)本發(fā)明的鑒定的參數(shù)的測定，其中在所述儀器中，在不同波長的熒光和在不同角度的散射光可被測定并與提供這類信號的細胞數(shù)相關。當來源于一種樣品的細胞流經(jīng)儀器的分析裝置時，對參數(shù)進行平行地或一個接一個(同時)地測定。優(yōu)選地，這種測定是通過分析型FACS設備進行。在不同角度測定散射光，優(yōu)選地作為正向散射光(FSC)(最大散射光角度高達20°，優(yōu)選地為更低)和側(cè)向散射光(SSC)(角度大約為90°)。雖然細胞和膠乳顆粒在大小上可能不存在很大差異，但它們的關于光散射行為卻相當不同，這可能是由于細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形狀及其不同的折射率造成的。根據(jù)這些差異，可通過相當不同的散射光角度容易地區(qū)分細胞(活細胞/增殖細胞，捕獲的活細胞和死細胞)和膠乳顆粒。SSC與膠乳粒相關，而FSC與細胞相關(參見圖2a)。然而，也可以用熒光染料對所有細胞或所有膠乳顆粒進行染色，通過在不同波長下對熒光進行研究而區(qū)分膠乳顆粒和細胞。對測定參數(shù)的使用僅依賴于所用儀器提供的可能性和便利性。如果儀器能夠同時在三個或四個不同熒光波長下測定熒光，則膠乳顆粒、所有細胞和分裂細胞或死細胞均可用熒光染料進行特異標記。因此，散射光和熒光的所有組合可用于測量參數(shù)，條件是散射光參數(shù)不能用于直接區(qū)分膠乳顆粒和死細胞、活細胞和增殖細胞及活細胞和捕獲細胞。
此處所用的術語“特異染色死細胞或活細胞的熒光染料”是指染料僅進入死細胞(例如碘化丙錠)，或僅在活細胞中富集(例如二乙酸熒光素)。如果需要對所有細胞進行細胞計數(shù)，則需要使用對死細胞和活細胞均進行染色的染料(例如Hoechst 33342)。描述了多種用于選擇性標記活細胞或死細胞的熒光染料(如分子探針目錄；http//www.molecularprobes.com/)。熒光染料以合適的量加入，例如，終濃度為1μg/ml。
提供下述實施例、參考文獻列表和附圖以有助于理解本發(fā)明，其實際范圍在后附的權力要求中闡述。應理解在不偏離本發(fā)明的精神的情況下，可對所闡述的流程進行修改。


圖1是CD34細胞群中細胞生長和細胞死亡的顯微鏡分析。細胞因子刺激的CD34細胞在不用或用細胞毒性化合物處理條件下培養(yǎng)4天和7天。
圖2是標準珠粒、細胞因子刺激的CD34細胞在培養(yǎng)10天后的活細胞和死細胞的FACS分析。細胞或者不用(左列)或者用誘導不同細胞毒性水平的細胞毒性藥物進行處理。
圖3是由圖2所示的FACS分析定量的細胞數(shù)目和死細胞的比例。所示的是兩種典型的細胞毒性化合物，5-氟尿嘧啶(0.1-100μmol/l)和阿霉素(1-1000ng/ml)。5-氟尿嘧啶和阿霉素的細胞數(shù)目分析的IC50值分別為0.34μmol/l和0.67μg/ml。
具體實施例方式
實施例在一個典型的實驗設計中，通過免疫磁性細胞分選法分離高純度(＞90％)人臍帶血CD34+細胞，進行等分并冷凍在含有DMSO的培養(yǎng)基中。當進行細胞培養(yǎng)時，融化冷凍的CD34+細胞，并在每孔200μl完全培養(yǎng)基的96孔板中接種200個細胞/孔?；A細胞培養(yǎng)基由補加20％人AB血清和抗生素(氨芐青霉素/鏈霉素)的IMDM培養(yǎng)基組成。通過加入下述細胞因子混合物hu-SCF(100ng/ml)、hu-1L6(10ng/ml)、hu-GM-GSF(100U/ml)、hu-TPO(25ng/ml)和hu-EPO(5U/ml)，活化CD34+細胞。在37℃、高濕度及7％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
可使用兩個不同的實驗設計1)在向培養(yǎng)基中補加細胞因子前加入抑制劑化合物以優(yōu)先處理靜息細胞，和2)在用細胞因子活化CD34后4天加入抑制劑化合物以優(yōu)先處理活化的細胞。
如圖1所示，培養(yǎng)4天后，活化并成活的CD34細胞呈現(xiàn)為大的球狀細胞(組A)。當細胞再培養(yǎng)3天后，細胞數(shù)目顯著增加(組C)。培養(yǎng)4天后，細胞毒性藥物在CD34細胞中誘導細胞死亡，在顯微鏡圖象中呈現(xiàn)為碎片狀(組B)，和碎片狀細胞數(shù)目增加而細胞數(shù)目沒有任何顯著增加(組D)。
根據(jù)CD34+細胞的增殖速率，培養(yǎng)9-10天后收獲細胞，并分析細胞數(shù)目和細胞毒性。通過FACS技術分析細胞數(shù)目和細胞毒性?？字械募毎麛?shù)目通過與內(nèi)部的珠粒標準物比較而進行計數(shù)。將10000個珠粒的一份等分試樣(FluoSpheres聚苯乙烯，15μm；Molecular Probes)加入到含有200μl培養(yǎng)基的每個孔中。如圖2所示，在典型的FACS儀器裝置中，活細胞出現(xiàn)在正向散射光(FSG)和低側(cè)向散射光(SSG)的中間/右邊位置，而加入的標準珠粒存在于更低的FSC和高SSC區(qū)域(組A)。將一個以矩形區(qū)域表示的口設置在標準珠粒上，對不同數(shù)目進行計數(shù)，停止分析，計算含有細胞的相應培養(yǎng)基的體積。組E顯示的是該測定方法對所分析的CD34細胞的存活檢測?；罴毎俅纬霈F(xiàn)在正向散射光(FSC)的中間/右邊位置，其顯示低的/無碘化丙錠標記。少量死細胞出現(xiàn)在相對于活細胞群左邊或上部/左邊位置。這時FACS測定法取一等分試樣數(shù)量的珠粒，并計算孔中的細胞數(shù)，而細胞毒性，死細胞的數(shù)目，在該測定中被平行記錄(加入碘化丙錠，終濃度為1μg/ml)。隨著細胞毒性化合物濃度的增加，死細胞簇中的細胞數(shù)目顯著增加(圖2，組F和G)。在最高抑制和細胞毒性濃度下，非常少的細胞還存在于活細胞簇中，大部分細胞已被殺死，證據(jù)是PI染色或碎片增加(組H)。
圖3中顯示的是對于兩種細胞毒性化合物，即5-氟尿嘧啶和阿霉素，計算每孔中CD34細胞數(shù)目和死細胞百分比的典型實例。對于每個檢測濃度，每孔的細胞數(shù)目顯示為柱形圖。對5-氟尿嘧啶而言，細胞數(shù)目在0.3和1.0μmol/l之間顯著降低，而阿霉素在1ng/ml最低濃度時，細胞數(shù)目已經(jīng)更低了。應用IC50計算程序，計算出抑制劑化合物的IC50值，對于5-氟尿嘧啶和阿霉素分別是0.34μmol/l和0.67ng/ml。分析PI陽性的細胞部分而得到的死細胞比例的增加顯示為實線(圖2，組E-H)。
參考文獻Bellamy，W.T.，Drugs 44(1992)690-708.
Johnston，P.，inCellular Assays in HTS，Methods in Molecular Biology，Vol.
110，Janzen W.P.(ed.)，Humana Press，NJ，pp.107-116.
US Patent No.3,977,995.
US Patent No.5,972,639.
US 2002/0146680.
權利要求
1.一種以增殖的哺乳動物細胞樣品為檢測體系，同時檢測一種物質(zhì)的細胞增殖抑制活性和細胞毒性(誘導細胞死亡)的方法，其特征在于g)用所述物質(zhì)以至少兩個不同的預定濃度處理預定體積的作為細胞懸液或作為貼壁細胞的所述細胞樣品；h)用對死細胞或活細胞特異染色的第一種熒光染料和任選地用染色所有細胞的第二種熒光染料處理所述細胞樣品；i)向所述細胞樣品中加入預定量的大小為約1-約20μm的膠乳顆粒至所述體積，并任選地用第三種熒光染料對所述膠乳顆粒進行染色；j)測定所述樣品中細胞總數(shù)與膠乳顆粒數(shù)量的比例；k)用步驟d)的結(jié)果及通過對所述樣品進行流式細胞分析測定-死細胞或活細胞的數(shù)目，其通過由所述第一種熒光染料在第一個波長下激發(fā)的熒光測定；-每體積的細胞總數(shù)目，其通過在第一個角度下散射光或備選地通過由所述第二種熒光染料在第二個波長下激發(fā)的熒光測定；-每體積的膠乳顆粒的數(shù)目，其通過在第二個角度下散射光或備選地通過由所述第三種熒光染料在第三個波長下激發(fā)的熒光測定；l)和用步驟d)和e)的結(jié)果測定所述物質(zhì)的細胞增殖活性和毒性。
2.權利要求1的方法，其特征在于所述死細胞用熒光染料進行特異染色，所述膠乳顆粒和細胞的數(shù)目通過不同側(cè)向散射光和正向散射光測定。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于所述細胞是人CD34+祖細胞。
4.權利要求1-3的方法，其特征在于在多個裝置中平行培養(yǎng)所述細胞，并且通過自動吸取將所述樣品轉(zhuǎn)移到流式細胞分析儀中。
全文摘要
以增殖哺乳動物細胞樣品為檢測體系，同時檢測物質(zhì)的細胞增殖抑制活性和細胞毒性的方法，特征在于a)用物質(zhì)以至少兩個不同的預定濃度處理預定體積的作為細胞懸液或作為貼壁細胞的細胞樣品；b)用第一熒光染料和任選用第二熒光染料處理細胞樣品；c)向細胞樣品中加入預定量的大小為約1－約20μm的膠乳顆粒至所述體積，并任選用第三熒光染料對膠乳顆粒進行染色；d)測定樣品中細胞總數(shù)與膠乳顆粒數(shù)的比例；e)用步驟d)的結(jié)果及對樣品進行流式細胞分析測定－死細胞或活細胞數(shù)；－每體積細胞總數(shù)；－每體積膠乳顆粒數(shù)；f)用步驟d)和e)的結(jié)果測定物質(zhì)的細胞增殖活性和毒性。
文檔編號G01N21/77GK1530643SQ20041003965
公開日2004年9月22日 申請日期2004年3月12日 優(yōu)先權日2003年3月12日
發(fā)明者伯恩哈德·戈勒, 曼弗雷德·庫貝斯, 伯恩哈德 戈勒, 德 庫貝斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司