專利名稱：通過使用石英振蕩器測(cè)量痕量物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)量環(huán)境中痕量物質(zhì)濃度的簡單且極其精確的方法。更具體地，本發(fā)明涉及利用石英振蕩器，和在結(jié)合蛋白質(zhì)的二氧芑絡(luò)合物和二氧芑之間的抗原-抗體反應(yīng)中的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)的測(cè)量方法，和容易地測(cè)量環(huán)境中存在的痕量二氧芑含量的測(cè)量方法，以及獲得二氧芑毒性等價(jià)量(TEQ)的測(cè)量方法。
背景技術(shù)：
近年來，因來自二氧芑等的環(huán)境激素和其它的環(huán)境污染已產(chǎn)生嚴(yán)重的社會(huì)問題。為了保護(hù)地球環(huán)境，要求可測(cè)量含量從ppm到ppt的化學(xué)物質(zhì)的高等級(jí)的化學(xué)測(cè)量技術(shù)，以便研究這些環(huán)境污染物的爆發(fā)情況和暴露情況的實(shí)際狀況。此外，為了改進(jìn)監(jiān)測(cè)精度，需要增加測(cè)量用樣品和進(jìn)行測(cè)量的次數(shù)這二者。
由于二氧芑具有許多異構(gòu)體和同系物，和二氧芑以非常低的含量存在于環(huán)境中，因此不容易分析它們。目前氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)法是最可靠的方法，和它廣泛用于正式測(cè)量二氧芑。在GC/MS法中，在通過氣相色譜分離蒸發(fā)的樣品組分之后，通過離子化和質(zhì)量分析來檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)。
盡管通過GC/MS法的測(cè)量值具有可靠性，但設(shè)備和專用試劑昂貴。此外，需要要求熟練技術(shù)的樣品預(yù)處理。也就是說，在注入到分析儀之前，需要盡可能地除去測(cè)量干擾物質(zhì)，和此外，由于樣品內(nèi)極低、痕量的二氧芑導(dǎo)致需要事先濃縮二氧芑。在這些預(yù)處理中使用各種專用的玻璃設(shè)備，其中所述預(yù)處理由具有高等級(jí)技術(shù)的熟練分析者在數(shù)天的時(shí)間段內(nèi)人工進(jìn)行。結(jié)果，GC/MS法要求許多時(shí)間和分析用成本，和限制了監(jiān)控頻率的增加。
比GC/MS法更簡單、更快速和不那么昂貴的方法是酶標(biāo)記免疫分析法(ELISA方法)，該方法利用抗原-抗體反應(yīng)作為中心。利用酶活性，使用通過共價(jià)鍵結(jié)合到酶上的抗原或抗體作為探針，ELISA法從而被用于檢測(cè)抗體或抗原的存在。
盡管ELISA法比GC/MS法更簡單、快速和不那么昂貴，但ELISA法可測(cè)量的最低水平是ng/ml單位(ppb單位)，而GC/MS法可測(cè)量的程度為pg/ml(ppt單位)。結(jié)果，僅半定量地使用ELISA法，在篩選的水平上監(jiān)控，以供精確分析的需要。額外地，在ELISA法中需要抗體或抗原的標(biāo)記處理。
另一方面，作為利用生物親和性的痕量成分的測(cè)量方法如免疫反應(yīng)和其它，正在研究一種利用表面胞質(zhì)基因組共振(SPR)方法的生物傳感器(Karube等，Analytica Chimica Acta，304(1995)139-145；Karube等，Analytica Chimica Acta，434(2001)223-230)，和使用石英振蕩器的測(cè)量方法。
使用石英振蕩器的測(cè)量方法通過吸附物質(zhì)到石英振蕩器的表面上并使用石英振蕩器頻率的變化可檢測(cè)并測(cè)量痕量成分，其中所述振蕩器頻率的變化與所吸附的物質(zhì)的重量成正比。結(jié)果，完全不需要用放射性同位素、染料、熒光物質(zhì)、酶、自由基探針標(biāo)記處理用于測(cè)量的抗體、次級(jí)抗體或抗原，從而使得容易、快速和便宜的測(cè)量變得可能。
石英振蕩器在許多電子電路如鐘表、計(jì)算機(jī)和通信/測(cè)量設(shè)備中用作高精度和穩(wěn)定的振蕩元件。此外，石英振蕩器被稱為石英晶體微量天平(QCM)，這是因?yàn)槭⒄袷幤魍ㄟ^將在其電極上的粘著物重量定量地轉(zhuǎn)化成振蕩器頻率的變化，從而能在從ng到fg的數(shù)量級(jí)上高靈敏地分析，和它除用作薄膜厚度測(cè)量計(jì)和化學(xué)傳感器外還用作生物傳感器。
使用石英振蕩器測(cè)量痕量成分的通常方法是通過具有事先在石英振蕩器表面上吸附/固定的識(shí)別元素并使之與被分析物反應(yīng)，和獲得反應(yīng)之前和之后的頻率變化，從而測(cè)量被分析物和識(shí)別元素之間的反應(yīng)性，和被分析物的質(zhì)量。
作為測(cè)量抗原-抗體反應(yīng)的方法，例如提出了以下提及的方法，其中所述方法使用能特異地鍵合到作為抗原的被分析物上的抗體作為識(shí)別元素，進(jìn)而使識(shí)別元素與石英振蕩器結(jié)合。
在JP-A-63-11835所述的方法中，使用抗原或抗體固定在其表面上的石英振蕩器生物傳感器，在所述方法中，通過抗原-抗體反應(yīng)，使固定抗體或抗原的膠乳或其它微粒進(jìn)一步結(jié)合到通過抗原-抗體反應(yīng)結(jié)合的基材上，從而放大石英振蕩器生物傳感器的靈敏度。
另一方面，在JP-A-03-77601所述的方法中，抗原或抗體在液體介質(zhì)中與朝向該抗原或抗體的支持抗體或抗原的不溶性載體顆粒反應(yīng)，同時(shí)允許不參與這種反應(yīng)的固定在其上的抗原或抗體的石英振蕩器在液體介質(zhì)內(nèi)振蕩，從而測(cè)量石英振蕩器振蕩頻率的變化，所述頻率變化歸因于因反應(yīng)引起的凝塊形成。
然而，在JP-A-63-11835和JP-A-03-77601所述的任何方法中，對(duì)于抗原來說，重要的是含多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的聚合物。因此，當(dāng)被分析物是低分子量物質(zhì)如環(huán)境污染物，其中包括二氧芑等時(shí)，或當(dāng)被分析物僅具有一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，抗原或抗體固定在其上的膠乳不可能結(jié)合到被分析物上，或者抗原或抗體固定在其上的不溶性載體形成凝塊，使得不能結(jié)合到石英振蕩器上，從而導(dǎo)致難以測(cè)量。
作為實(shí)例，為了解決該問題，在日本專利申請(qǐng)Nos.2001-117308和2001-117309以及在Xi Chun Zhou等的Analyst，2001，126，pp.71-78中披露了下述方法，該方法包括使用競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，允許多種被分析物結(jié)合到蛋白質(zhì)聚合物上，形成與測(cè)試樣品內(nèi)的被分析物競(jìng)爭(zhēng)的競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。根據(jù)這些文獻(xiàn)中披露的方法，在測(cè)試樣品內(nèi)存在的較大量的被分析物導(dǎo)致更有效地防止競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)合到石英振蕩器表面上的識(shí)別元素上，從而導(dǎo)致降低的頻率變化。因此，甚至當(dāng)測(cè)量目標(biāo)為低分子量物質(zhì)時(shí)，或當(dāng)它是僅含一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的物質(zhì)時(shí)，高度敏感和高度精確的測(cè)量變得可能。
然而，以上提及的使用石英振蕩器的任一方法測(cè)量含簡單物質(zhì)的模型溶液。在現(xiàn)實(shí)世界的環(huán)境中，多種物質(zhì)共存。例如，在二氧芑用模型溶液中，僅存在2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑(2，3，7，8-TCDD)，但在實(shí)際的取自環(huán)境的樣品(例如，來自焚燒工廠的粉煤灰的提取物)中，具有以各種濃度共存于樣品內(nèi)的大于100種多組分的二氧芑和呋喃。
另一方面，在抗原-抗體反應(yīng)過程中，磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)用作溶劑，但當(dāng)不溶于水的物質(zhì)，如二氧芑是測(cè)量目標(biāo)時(shí)，將二甲亞砜(DMSO)和表面活性劑(含有0.05％Tween 20(商品名，由Sigma Chemical Co.制備)的磷酸鹽緩沖液)與PBS混合，以使測(cè)量目標(biāo)可溶。在此情況下，當(dāng)在DMSO和表面活性劑的影響下固定到石英振蕩器上的抗體的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化時(shí)，將不能識(shí)別單獨(dú)的特定被分析物，因此將使用穩(wěn)定劑以維持抗體的高級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，作為這種穩(wěn)定劑，迄今為止使用牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白水解物、改性蛋白質(zhì)或類似物。
然而，當(dāng)測(cè)量環(huán)境樣品時(shí)，常規(guī)穩(wěn)定劑的穩(wěn)定效果較低，和該效果不可能維持抗體的高級(jí)結(jié)構(gòu)；和因此，即使使用能特異地結(jié)合到行為類似于抗原的被分析物上的抗體，也可能發(fā)生類似于被分析物的與基質(zhì)的抗原-抗體反應(yīng)，因此在包括多種組分的環(huán)境的混合物體系中難以進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。例如，當(dāng)在環(huán)境樣品內(nèi)的2，3，7，8-TCDD被作為測(cè)量目標(biāo)處理時(shí)，僅對(duì)2，3，7，8-TCDD顯示出選擇性的單克隆抗體一般不可能識(shí)別測(cè)量目標(biāo)，因此不能帶來準(zhǔn)確的測(cè)量。結(jié)果，沒有報(bào)道過取自環(huán)境的樣品已實(shí)際上通過使用常規(guī)石英振蕩器的方法來測(cè)量。
此外，當(dāng)篩選(環(huán)境監(jiān)控)二氧芑時(shí)，需要制備大量(相當(dāng)于分析測(cè)試樣品的數(shù)量)的固定抗二氧芑抗體的石英振蕩器，所述石英振蕩器必須儲(chǔ)存，以便一次分析許多測(cè)試樣品。
然而，由于當(dāng)使用常規(guī)的穩(wěn)定劑時(shí)，不可能長期儲(chǔ)存石英振蕩器，這是因?yàn)榭贵w的高級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間流逝會(huì)劣化，和不可能識(shí)別單獨(dú)的特定被分析物，因此不可能進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量。
另一方面，由于二氧芑的毒性隨二氧芑的變體的不同而不同，從環(huán)境監(jiān)控的角度考慮，在環(huán)境內(nèi)的毒性等價(jià)量(TEQ)是重要的。此處，通過用實(shí)際測(cè)量的濃度乘以毒性等價(jià)系數(shù)，推導(dǎo)出毒性等價(jià)量。然而，由于使用石英振蕩器，通過常規(guī)測(cè)量方法，難以準(zhǔn)確地測(cè)量含多種組分的環(huán)境的混合物體系，因此也難以準(zhǔn)確地測(cè)量毒性等價(jià)量。
根據(jù)下述說明，并結(jié)合附圖，本發(fā)明的其它和進(jìn)一步的特征與優(yōu)點(diǎn)將更充分地變得顯而易見。


圖1是顯示放置在石英振蕩器上的識(shí)別元素(抗體)與穩(wěn)定劑之間關(guān)系的前視圖。
圖2是顯示2，3，7，8-TCDD濃度與本發(fā)明的石英振蕩器的振蕩頻率的變化之間關(guān)系的圖表。
圖3是顯示通過ELISA方法的測(cè)量結(jié)果和根據(jù)本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果之間關(guān)系的圖表。
圖4是顯示通過GC/MS方法的測(cè)量結(jié)果和根據(jù)本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果之間關(guān)系的圖表。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于測(cè)量取自環(huán)境的樣品或取自生物的樣品內(nèi)二氧芑濃度的方法，該方法包括使用石英振蕩器；和測(cè)量其毒性等價(jià)量的方法。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供下述(1)一種測(cè)量方法，該方法包括將樣品固定在具有識(shí)別元素和所述識(shí)別元素用穩(wěn)定劑固定在其上的石英振蕩器上，其中所述識(shí)別元素對(duì)特定被分析物具有特異結(jié)合能力，所述穩(wěn)定劑包括合成聚合物；測(cè)量頻率的變化量；比較該結(jié)果與通過使用競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得的石英振蕩器的頻率變化量；和從而測(cè)量在被測(cè)量的樣品內(nèi)所述被分析物的含量。
(2)測(cè)量取自環(huán)境的樣品或取自生物的樣品內(nèi)痕量成分的測(cè)量方法，該方法包括將樣品固定在具有識(shí)別元素和所述識(shí)別元素用穩(wěn)定劑固定在其上的石英振蕩器上，其中所述識(shí)別元素對(duì)特定的多組分被分析物具有特異結(jié)合能力，所述穩(wěn)定劑包括合成聚合物；
測(cè)量頻率的變化量；比較該結(jié)果與通過使用競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得的石英振蕩器的頻率變化量；和從而測(cè)量在被測(cè)量的樣品內(nèi)所述被分析物的含量。
(3)根據(jù)條目(1)或(2)的測(cè)量方法，該方法包括使用凝結(jié)元素(clot element)，所述凝結(jié)元素具有固定在不溶性載體顆粒上的識(shí)別元素；使在石英振蕩器上的所述凝結(jié)元素和識(shí)別元素特異地結(jié)合到被分析物上；和進(jìn)而放大并測(cè)量石英振蕩器頻率的變化。
(4)根據(jù)條目(1)-(3)任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中被分析物是取自環(huán)境或取自生物的二氧芑、呋喃和溴化二氧芑。
(5)根據(jù)條目(1)-(4)任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中被分析物是取自環(huán)境或取自生物的二氧芑，和識(shí)別元素是單克隆或多克隆抗體，所述單克隆或多克隆抗體可特異地結(jié)合到被認(rèn)為是抗原的二氧芑上。
(6)根據(jù)條目(5)的測(cè)量方法，其中識(shí)別元素是IgG、IgM、Fab、F(ab′)2或ScFv，它們是單克隆或多克隆抗體。
(7)根據(jù)條目(4)-(6)任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，該方法包括在含合成聚合物的穩(wěn)定劑的共存下，固定單克隆或多克隆抗體在石英振蕩器上，所述單克隆或多克隆抗體可特異地結(jié)合到被認(rèn)為是抗原的二氧芑上；在儲(chǔ)存數(shù)天之后，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)；和從而測(cè)量二氧芑的濃度。
(8)根據(jù)條目(1)-(7)任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中該方法包括使用小尺寸的傳感器系統(tǒng)，所述傳感器系統(tǒng)是干電池驅(qū)動(dòng)型或電池驅(qū)動(dòng)型頻率指示器和振蕩電路的聯(lián)合，或者由組合所述傳感器系統(tǒng)和收集數(shù)據(jù)并控制用計(jì)算機(jī)形成的系統(tǒng)，從而測(cè)量石英振蕩器的頻率變化量。
(9)根據(jù)條目(1)-(8)任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，所述方法包括結(jié)合石英振蕩器到微型通道上，所述微型通道具有樣品的提取/預(yù)處理功能，或?qū)⑹⒄袷幤髑度氲轿⑿屯ǖ纼?nèi)；并使用微型通道型化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)會(huì)加速在微型反應(yīng)空間內(nèi)的抗原-抗體反應(yīng)時(shí)間。
(10)根據(jù)條目(1)-(9)任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中作為被分析物的二氧芑是2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑。
(11)根據(jù)條目(1)-(10)任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，所述方法包括通過高速溶劑萃取方法，從取自環(huán)境的樣品或取自生物的樣品中提出被分析物，并進(jìn)行濃縮/清洗預(yù)處理。
(12)一種測(cè)量二氧芑的毒性等價(jià)量的測(cè)量方法，所述方法包括通過權(quán)利要求1-11任何一項(xiàng)的方法測(cè)量2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑的濃度，并測(cè)量全部樣品的毒性等價(jià)量。
(13)用于條目(1)-(12)任何一項(xiàng)的方法的生物芯片，所述生物芯片包括具有識(shí)別元素和所述識(shí)別元素用穩(wěn)定劑固定在其上的石英振蕩器，其中所述識(shí)別元素對(duì)特定被分析物具有特異結(jié)合能力，所述穩(wěn)定劑包括合成聚合物。
以下將詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
首先，解釋測(cè)量本發(fā)明濃度的方法。
本發(fā)明的特征在于使用含特定合成聚合物的穩(wěn)定劑，和將識(shí)別元素固定在石英振蕩器上，所述識(shí)別元素對(duì)包含在多組分的污染材料內(nèi)的被分析物具有特異的結(jié)合能力，和將多種被分析物結(jié)合到聚合物蛋白質(zhì)和類似物上，并將這看成為競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，和使用該競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，使之與測(cè)試樣品內(nèi)的被分析物競(jìng)爭(zhēng)。在本發(fā)明中，通過使用含特定合成聚合物的穩(wěn)定劑，可使用石英振蕩器，準(zhǔn)確地測(cè)量含多種組分的混合物體系的濃度，而這不能通過常規(guī)方法來測(cè)量。
抗體的抗原識(shí)別具有目標(biāo)分子的空間結(jié)構(gòu)的二級(jí)或三級(jí)高級(jí)結(jié)構(gòu)，和尤其需要穩(wěn)定三級(jí)高級(jí)結(jié)構(gòu)，所述三級(jí)高級(jí)結(jié)構(gòu)由Fab部分的末端后部的氨基酸序列(它是抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn))組成。同樣需要穩(wěn)定抗體結(jié)構(gòu)對(duì)抗所有各種外部變化(溫度、脫水、pH、離子強(qiáng)度)。本發(fā)明所使用的穩(wěn)定劑能穩(wěn)定這些。
在本發(fā)明的說明書中。穩(wěn)定劑(也稱為“阻止劑”)是提供(1)降低抗原的非特異吸附(選擇性、敏感度的改進(jìn))和(2)維持高級(jí)結(jié)構(gòu)的試劑，而維持高級(jí)結(jié)構(gòu)是在免疫傳感器過程中或在酶固定的免疫測(cè)定、固相放射免疫測(cè)定等的抗原-抗體反應(yīng)過程中抗體的分子識(shí)別能力的基礎(chǔ)(抗體的穩(wěn)定性、持久性的改進(jìn))。
圖1是顯示放置在石英振蕩器上的識(shí)別元素(抗體)與穩(wěn)定劑之間關(guān)系的例示圖。圖1上方的一排示出了常規(guī)技術(shù)的實(shí)例，和下方的一排示出了本發(fā)明的實(shí)例。以下參考圖1解釋常規(guī)穩(wěn)定劑和本發(fā)明穩(wěn)定劑的差別。
在其中抗體3固定在其上的石英振蕩器1的金電極2的表面處，能常規(guī)地使用的穩(wěn)定劑5被物理吸附或化學(xué)結(jié)合到其中抗體3沒有固定在其上的空間上，并進(jìn)行排斥(或限制)樣品內(nèi)除被分析物以外的共存蛋白質(zhì)的作用，以便在其中抗體3沒有固定在其上的部分石英振蕩器1上非特異地吸附。根據(jù)這一點(diǎn)，能在石英振蕩器上獲得單獨(dú)的抗原-抗體反應(yīng)的凈應(yīng)答。這一作用可類似地應(yīng)用到本發(fā)明所使用的穩(wěn)定劑4上。
然而，由于常規(guī)的穩(wěn)定劑5大多數(shù)是取自生物的產(chǎn)品，如BSA和變性蛋白質(zhì)，其本身不存在穩(wěn)定作用，因此隨著時(shí)間流逝，穩(wěn)定劑5變性為穩(wěn)定劑7，和它不可能維持抗體3的高級(jí)結(jié)構(gòu)。由于這一點(diǎn)，抗體3變性為抗體6并與除特定被分析物以外的物質(zhì)反應(yīng)，因此不能單獨(dú)地準(zhǔn)確測(cè)量特定的被分析物。
與之相比較，由于在本發(fā)明中使用的穩(wěn)定劑4本身對(duì)溫度升高、時(shí)間變化、pH變化等具有耐久性，因此，相對(duì)于溫度升高、時(shí)間變化、pH變化等，抗體3的活性下降很少，且因此抗體3的穩(wěn)定高級(jí)結(jié)構(gòu)得以維持，和能在抗體3固定在石英振蕩器1上的狀態(tài)下保持?jǐn)?shù)天。
至于穩(wěn)定劑，從維持抗體高級(jí)結(jié)構(gòu)的角度考慮，使用化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于生物膜的化合物。例如，可提及由含磷酰膽堿基團(tuán)的化合物的單元等組成的水溶性聚合物，所述化合物包括類似于構(gòu)成細(xì)胞膜的脂質(zhì)體的極性基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，和至于具體實(shí)例，可提及由2-甲基丙烯?；趸一柞Ｄ憠A(MPC)單元等組成的聚合物。MPC聚合物可以是均聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、接枝聚合物、大分子單體的丙烯酸酯衍生物、富馬酸乙酯的衍生物、苯乙烯衍生物和類似物?？赏ㄟ^在JP-A-06-313009、JP-A-10-296063、JP-A-2001-261740等中所述的方法制備MPC聚合物。
將包括類似于生物膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)的這些化合物溶解在PBS溶液中并用作穩(wěn)定劑。至于穩(wěn)定劑的具體實(shí)例，可提及Block Ace(商品名，由Snow Brand Milk Products Co.，Ltd.制備)、Lipidure(商品名，由NOFCorporation制備)或StabilGuard(商品名，由SurModics，Inc.制備)。
所使用的穩(wěn)定劑的濃度與用量可隨穩(wěn)定劑的類型的變化而變化，和在StabilGuard(商品名)的情況下，原樣地使用初始溶液，和在Lipidure(商品名)的情況下，以在10mM PBS(pH7.0)內(nèi)0.01-25％質(zhì)量，優(yōu)選0.1-5％質(zhì)量，更優(yōu)選0.2％質(zhì)量的溶液形式使用它，對(duì)于石英振蕩器的電極(電極直徑0.5cm，電極面積0.196cm2)來說，同樣優(yōu)選使用0.01-0.05ml，更優(yōu)選0.015-0.03ml。
一般地，在抗原-抗體反應(yīng)中，磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)用作溶劑，但當(dāng)在水中難以增溶的物質(zhì)，如二氧芑是測(cè)量目標(biāo)時(shí)，優(yōu)選在PBS內(nèi)混合二甲亞砜(DMSO)以增溶測(cè)量目標(biāo)。優(yōu)選以10-50％，更優(yōu)選以25％的體積比混合DMSO。也可混合表面活性劑并替代DMSO使用。作為表面活性劑，例如可使用向其中添加了0.05％Tween 20(商品名，由SigmaChemical Co.制備)的磷酸鹽緩沖液，且優(yōu)選以0.01-5％，更優(yōu)選以0.03-1％的體積比混合它。
沒有特別限制本發(fā)明中的被分析物，和可提及，例如取自環(huán)境的樣品如焚燒工廠的燃燒灰燼、粉煤灰、土、在燃燒器內(nèi)部的殘?jiān)?、污染的土壤、凝結(jié)的沉積物、污水、廢水、地下水、河/湖/沼澤的水、淤泥，和包含在取自生物的樣品內(nèi)的痕量成分，如母牛的牛奶、母乳、血液、尿、體液、細(xì)胞組織。至于痕量成分，可提及，例如來自所謂的環(huán)境激素和類似物的環(huán)境污染物(它們被列為內(nèi)分泌破壞劑)，如共面的PCB、呋喃、二氧芑、溴化二氧芑，和在人體內(nèi)的痕量激素和類似物。此處所使用的術(shù)語“二氧芑”是多氯化二苯并對(duì)二氧芑(PCDD)和多氯化二苯并呋喃(PCDF)，和作為具體實(shí)例，可提及2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑和2，3，7，8-四氯二苯并呋喃。
在本發(fā)明中，可高靈敏地測(cè)量被分析物，甚至當(dāng)它是低分子量物質(zhì)(所述低分子量物質(zhì)具有約100-1000的分子量)或僅具有一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的物質(zhì)時(shí)。
在本發(fā)明中，多個(gè)被分析物結(jié)合到聚合物蛋白質(zhì)上，其中在允許它與測(cè)試樣品內(nèi)的被分析物競(jìng)爭(zhēng)的反應(yīng)中，所述聚合物蛋白質(zhì)用作競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本發(fā)明所使用的競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是結(jié)合到蛋白質(zhì)聚合物上的多種被分析物。
沒有特別限制蛋白質(zhì)，和鑒于可獲得性和經(jīng)濟(jì)因素，合適地使用例如血清白蛋白(它是在生物化學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的分子量為數(shù)萬的蛋白質(zhì))以及酶如過氧化物酶、β-半乳糖苷酶。
作為使多種被分析物結(jié)合到蛋白質(zhì)聚合物上的方法，可提及，例如混合酸酐法、N-羥基琥珀酰亞胺法、相同反應(yīng)性交聯(lián)法、N-(間馬來酰亞胺基苯甲酰氧基)琥珀酰亞胺型交聯(lián)法或類似方法。
通過使用識(shí)別元素固定在其上的石英振蕩器測(cè)量被分析物。
至于本發(fā)明所使用的石英振蕩器，可使用常規(guī)地使用的那種，和關(guān)于它的變體，可提及例如AT Cut、GT Cut、BT Cut等，和電極材料可優(yōu)選金、銀和類似物。
沒有特別限制石英振蕩器的振蕩頻率，和它應(yīng)當(dāng)根據(jù)用途合適地選擇，和可優(yōu)選5-50MHz，和可更優(yōu)選9-30MHz。當(dāng)振蕩頻率小于5MHz時(shí)，靈敏度不足，和當(dāng)它超過50MHz時(shí)，將產(chǎn)生噪音，影響實(shí)際應(yīng)用。
通過固定識(shí)別元素和穩(wěn)定劑在石英振蕩器上，從而制備生物芯片。
沒有特別限制固定識(shí)別元素到石英振蕩器上的方法，和可通過常規(guī)方式進(jìn)行。例如，可提及包括在石英振蕩器的金電極表面上半胱胺處理之后戊二醛處理，接著允許識(shí)別元素吸附到表面上的方法。
固定在石英振蕩器上的識(shí)別元素具有對(duì)被分析物特異的結(jié)合能力。沒有特別限制本發(fā)明所使用的識(shí)別元素，只要產(chǎn)品特異地結(jié)合被分析物即可，和例如可提及產(chǎn)生與被分析物抗原-抗體反應(yīng)的抗體，特異地識(shí)別被分析物的受體分子等。
至于經(jīng)歷與被分析物抗原-抗體反應(yīng)的抗體，可提及，例如通過使用被分析物和半抗原化被分析物作為抗原，使動(dòng)物如兔子、山羊、綿羊免疫而制備的單克隆抗體、多克隆抗體(IgG、IgM或類似物)或類似物。至于抗體，可使用例如，通過酶處理等獲得的F(ab′)2、Fab′、Fab，和此外，可使用通過基因重組技術(shù)制備的Fab′、scFv和類似物。
對(duì)于識(shí)別被分析物的受體分子沒有特別限制，和例如已知二氧芑結(jié)合到Ah(烯丙基烴)受體上，和因此可使用這種受體。
此外，作為識(shí)別元素，可使用具有結(jié)合到被分析物上的能力的肽、DNA或類似物，和可使用通過分子印記法制備的對(duì)被分析物具有補(bǔ)充結(jié)合位點(diǎn)的聚合物。
將識(shí)別元素固定在石英振蕩器上，和優(yōu)選通過固定游離的識(shí)別元素到不溶性載體顆粒上來形成凝結(jié)元素。通過在固定于石英振蕩器上的識(shí)別元素和凝結(jié)元素之間夾入競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絡(luò)合物，使重量增加，結(jié)果將放大頻率的變化量，和可檢測(cè)/定量化濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)較低的被分析物。當(dāng)識(shí)別元素是經(jīng)歷與被分析物抗原-抗體反應(yīng)的抗體時(shí)，凝結(jié)元素將起到次級(jí)抗體的作用。
至于本發(fā)明中使用的不溶性載體顆粒，沒有特別限制，只要它基本上不溶于本發(fā)明中使用的液體介質(zhì)即可?？商峒?，例如由有機(jī)聚合物物質(zhì)如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸鈉共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-氯代甲基苯乙烯共聚物、氯化聚苯乙烯組成的顆粒；無機(jī)氧化物微粒如氧化硅、氧化硅-氧化鋁；磁性金屬微粒如用有機(jī)薄層涂布的鐵氧體或類似物。
顆粒的直徑可以較大，只要它可穩(wěn)定地分散在液體介質(zhì)中，以便產(chǎn)生振蕩頻率的足量變化即可，和優(yōu)選0.01微米-1微米，更優(yōu)選0.05微米-0.5微米。
沒有特別限制通過允許由不溶性載體顆粒承載識(shí)別元素形成凝結(jié)元素的方法，和可通過常規(guī)方式進(jìn)行。例如，可提及使用偶聯(lián)劑等用于不溶性載體顆粒的化學(xué)吸附方法，在作為不溶性載體顆粒的顆粒表面上使用膠乳(它是具有反應(yīng)性官能團(tuán)的聚合物物質(zhì))的化學(xué)吸附方法，或者利用疏水相互作用等的物理吸附方法。
沒有特別限制凝結(jié)元素的濃度，和可合適地確立，和優(yōu)選為0.01-1.0％質(zhì)量，更優(yōu)選0.05-0.5％質(zhì)量。若它小于0.01％質(zhì)量，則將不充分發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，和若它大于1.0％質(zhì)量，則凝結(jié)元素難以穩(wěn)定地分散在液體介質(zhì)中。
作為本發(fā)明中使用的設(shè)備，可使用例如在JP-A-03-77601中所述的設(shè)備。在測(cè)量設(shè)備中，石英振蕩器末端被連接到測(cè)量系統(tǒng)上，所述測(cè)量系統(tǒng)包括振蕩電路以及計(jì)算頻率和處理數(shù)據(jù)的微機(jī)。
此外，通過使用小尺寸的傳感器系統(tǒng)(它是集成干電池驅(qū)動(dòng)型或電池驅(qū)動(dòng)型頻率指示器和振蕩電路的單元)，本發(fā)明能進(jìn)行測(cè)量。利用它，可用手?jǐn)y帶測(cè)量設(shè)備且可在任何位置處進(jìn)行測(cè)量。
此外，通過將石英振蕩器嵌入微型通道內(nèi)，和使用微型通道型化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)(該系統(tǒng)加速在微型反應(yīng)空間內(nèi)的抗原-抗體反應(yīng)時(shí)間)，從而本發(fā)明可完成測(cè)量。通過使用該系統(tǒng)，可在1分鐘以內(nèi)完成與測(cè)試部分內(nèi)的被分析物的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，從而能快速得多的測(cè)量。具體地，可使用在Kitamori等，Analytical Chemistry，Vol.73，No.6，1213-1218(2001)，Kitamori等，Analytical Chemistry，Vol.74，No.9，2014-2020(2002)中所述的系統(tǒng)。
在使用其中識(shí)別元素是實(shí)施例用抗體的方案的情況下，以下將解釋本發(fā)明的測(cè)量方法的一個(gè)實(shí)施方案。
一旦測(cè)量，通過高速溶劑萃取方法，在數(shù)小時(shí)內(nèi)萃取取自環(huán)境的樣品或取自生物的樣品，和進(jìn)行濃縮/清洗預(yù)處理。在Kazuto等人的“Aquick dioxin analysis technique which combined high speed solventextraction method and immunoassay”，Journal of Resources andEnviroment，Vol37，No.9，87-91(2001)中公開了高速溶劑萃取方法。通過結(jié)合這一預(yù)處理，將本發(fā)明付諸實(shí)施，可根據(jù)收集的樣品在4-5小時(shí)內(nèi)獲得分析結(jié)果，而通過常規(guī)的正式法由收集的樣品來測(cè)量需要花費(fèi)2周。
首先，在緩沖溶液或類似物的液體介質(zhì)中浸漬石英振蕩器，所述石英振蕩器進(jìn)行各種各樣的化學(xué)處理以固定抗體或類似物，同時(shí)允許通過攪拌器以恒定的速度初步攪拌液體介質(zhì)，其中所述液體介質(zhì)放在恒溫器室內(nèi)以供測(cè)量?；蛘邔⒁呀?jīng)歷各種各樣的化學(xué)處理來固定抗體或類似物的石英振蕩器放在恒溫器室內(nèi)以供測(cè)量，和如下所述進(jìn)行抗體的固定操作。
至于在本發(fā)明中使用的液體介質(zhì)的實(shí)例，優(yōu)選磷酸鹽緩沖溶液、甘氨酸緩沖溶液、三鹽酸(tris hydrochloric acid)緩沖溶液和類似物?？紤]到迅速進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)和與此同時(shí)穩(wěn)定地振蕩，攪拌器的旋轉(zhuǎn)速度優(yōu)選500-1500rpm，更優(yōu)選800-1000rpm。同樣優(yōu)選在反應(yīng)過程中維持恒定的旋轉(zhuǎn)速度。
接下來，制備生物芯片。將石英振蕩器浸漬在以上提及的恒溫器室內(nèi)的液體介質(zhì)中，和振蕩，并通過石英振蕩器承載抗體。然后在石英振蕩器上添加0.1-5％的穩(wěn)定劑，和之后用水洗滌掉沒有固定在石英振蕩器上的穩(wěn)定劑。在干燥石英振蕩器之后，或者在溶液中，當(dāng)振蕩頻率穩(wěn)定時(shí)，測(cè)量頻率F1。在本發(fā)明中，在通過使用穩(wěn)定劑固定抗體在石英振蕩器上之后，接著儲(chǔ)存數(shù)天，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，和可測(cè)量二氧芑的濃度。結(jié)果，它可制備并保持較大量的抗體固定的石英振蕩器(生物芯片)，和一次分析大量的樣品。優(yōu)選在儲(chǔ)存期期滿之前使用如此生產(chǎn)的生物芯片。在干燥條件下，在25℃下的儲(chǔ)存時(shí)間段優(yōu)選1-60天，更優(yōu)選1-7天。在干燥條件下，在0-4℃下(冰箱條件)，優(yōu)選1-1000天，更優(yōu)選1-365天，和特別地不大于30天。
接下來，添加多種抗原結(jié)合到其上的蛋白質(zhì)與含抗原的樣品的混合物，于是進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)。若此刻抗原包含在測(cè)試樣品內(nèi)，則會(huì)抑制具有多種抗原結(jié)合到其上的蛋白質(zhì)結(jié)合到承載在石英振蕩器表面上的抗體上。由于石英振蕩器的頻率將隨著結(jié)合到石英振蕩器上的物質(zhì)的重量而下降，因此吸附到石英振蕩器上的抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)的重量下降導(dǎo)致頻率減少的下降。
除去并洗滌掉游離的抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)(它沒有結(jié)合到石英振蕩器表面上的抗體上)。在連續(xù)攪拌的同時(shí)，一旦恒定地穩(wěn)定的頻率測(cè)量為值F2。通過從所得的F1中減去F2，來計(jì)算頻率的變化量ΔF。
盡管在以上提及的測(cè)量中反應(yīng)溫度可以是室溫，但為了建立石英振蕩器的高周期穩(wěn)定性，優(yōu)選在25-37℃的環(huán)境下操作溫度，其中精度為±0.1℃。
在本發(fā)明中，通過使用已知濃度的被分析物來作出校正曲線，和通過使用它，計(jì)算在測(cè)試樣品內(nèi)的被分析物的濃度。
盡管通過用硫酸/含水過氧化氫的混合溶液、高錳酸鉀溶液或類似物洗滌和除去固定在表面上的抗體等，可再次使用本發(fā)明中使用過的石英振蕩器，但可在每次測(cè)量之后更換該石英振蕩器，因?yàn)樗阋?，約100yen。
特別地在分析二氧芑的情況下，由于二氧芑的毒性非常高，和必須使在洗滌之后的溶液燃燒和在濃縮之后在1500℃或更高的高溫下分解，因此優(yōu)選基本上作為一次性產(chǎn)品使用石英振蕩器。
以下將解釋本發(fā)明的毒性等價(jià)量的測(cè)量方法。
在二氧芑的情況下，通過用指定的毒性等價(jià)系數(shù)乘以每一組分的濃度，可計(jì)算每一組分的毒性等價(jià)量(TEQ)。由World HealthOrganization/International Programme on ChemicalSafety(WHO/IPCS)規(guī)定毒性等價(jià)系數(shù)。
2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑(2，3，7，8-TCDD)的毒性等價(jià)系數(shù)為1，和已知當(dāng)與環(huán)境中的其它二氧芑相比時(shí)，它與高的毒性等價(jià)系數(shù)相關(guān)。同樣已知2，3，7，8-TCDD在環(huán)境內(nèi)的濃度高于其它二氧芑的濃度。因此，通過本發(fā)明以上提及的方法測(cè)量2，3，7，8-TCDD的濃度，和根據(jù)通過使用GC/MS方法事先作出的校正曲線，可測(cè)量樣品內(nèi)全部二氧芑的毒性等價(jià)量。可將這種毒性等價(jià)量的測(cè)量方法應(yīng)用到取自環(huán)境的樣品和取自生物的樣品上。
實(shí)施例基于下述實(shí)施例，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，不通過這些實(shí)施例限制本發(fā)明。
實(shí)施例1<石英振蕩器的抗2，3，7，8-TCDD抗體固定和穩(wěn)定處理>
通過將2，3，7，8-TCDD(它是一種低分子量化合物)視為被分析物進(jìn)行試驗(yàn)。
使用At Cut(9MHz)的石英振蕩器。首先，用硫酸/含水過氧化氫的混合溶液洗滌石英振蕩器的金電極表面。在用純水洗滌之后，在石英振蕩器上以2.5L/min循環(huán)氮?dú)庥糜诟稍铩＝酉聛?，石英振蕩器的金電極表面用0.01M半胱胺處理，并用1％戊二醛溶液連續(xù)處理，和在激活抗體結(jié)合之后，用1ml純水洗滌3次。
接下來，通過在石英振蕩器上添加50μg/ml抗2，3，7，8-TCDD單克隆抗體的30微升PBS溶液(pH7.4)，和通過在25℃下反應(yīng)90分鐘，使抗體固定在石英振蕩器上。在用1ml純水洗滌3次之后，在石英振蕩器上添加30微升0.02M的甘氨酸溶液，以便覆蓋(cap)在石英振蕩器上殘留的未反應(yīng)的醛基，和在25℃下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。在用1ml純水洗滌3次之后，在石英振蕩器上添加30微升0.2％穩(wěn)定劑-PBS溶液，和在25℃下進(jìn)行反應(yīng)90分鐘。Lipidure-HM(商品名，由NOF Corporation制備)用作穩(wěn)定劑。在用1ml純水洗滌3次之后，在石英振蕩器上以2.5L/min的流速循環(huán)氮?dú)夤└稍?，?0分鐘之后，測(cè)量固定抗體的石英振蕩器的振蕩頻率，和測(cè)量值表示為F1。
<抗原-抗體反應(yīng)I>
以1∶3的比例，將2，3，7，8-TCDD的DMSO溶液混合到100ng/ml2，3，7，8-TCDD結(jié)合的卵白蛋白(由Research Diagnostics，Inc.制備)的10mM PBS溶液(pH7.4)內(nèi)，和將它視為25％的DMSO溶液。通過在0.001、0.01、0.1、1、10和100ng/ml的濃度下溶解2，3，7，8-TCDD來制備競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)的抗原溶液。
將10微升每種抗原溶液加入到以上所述制備的抗2，3，7，8-TCDD抗體固定的石英振蕩器上，并在25℃下反應(yīng)60分鐘，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)I。由于抗原-抗體反應(yīng)象約300MHz一樣顯著，若判斷65％的抗原-抗體反應(yīng)率足夠的話，則可在10分鐘的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)完成反應(yīng)。在完成反應(yīng)之后，接著用1ml純水洗滌3次，以2.5L/min的流速在石英振蕩器上循環(huán)氮?dú)夤└稍?，和?0分鐘之后，測(cè)量抗體固定的石英振蕩器的振蕩頻率，和測(cè)量值表示為F2。
通過從F1中減去F2計(jì)算的數(shù)值表示為ΔF1，和結(jié)果見表1。此外，圖2示出了與2，3，7，8-TCDD濃度之間的關(guān)系，并用作校正曲線，用于測(cè)量包含從以下提及的實(shí)施例1的焚燒工廠的粉煤灰中提取的樣品內(nèi)的二氧芑的濃度。
表1

根據(jù)表1，顯而易見的是，本發(fā)明中可測(cè)量低至0.001ng/ml(1pg/ml)到100ng/ml的痕量濃度的2，3，7，8-TCDD。
實(shí)施例2<抗原-抗體反應(yīng)II(通過膠乳試劑的敏化反應(yīng))>
通過溶解2，3，7，8-TCDD(由Research Diagnostics，Inc.制備)在1ng/ml的2，3，7，8-TCDD-結(jié)合的卵白蛋白(由ResearchDiagnostics，Inc.制備)溶液內(nèi)，以制備溶液為1ng/ml，和將這視為抗原溶液。以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)I，然后，在洗滌之后，通過添加10微升抗2，3，7，8-TCDD單克隆抗體固定的抗2，3，7，8-TCDD膠乳懸浮液(固體部分0.01％)到免疫試劑用膠乳(由Sekisui Chemical Co.，Ltd.制備)內(nèi)，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)II，并在25℃下培育60分鐘。在完成反應(yīng)之后，通過用純水洗滌，測(cè)量抗體固定的石英振蕩器的振蕩頻率，和測(cè)量值表示為F3。
通過從F2中減去F3計(jì)算的數(shù)值表示為ΔF2，結(jié)果見表2。
為了參考，將單獨(dú)的1ng/ml 2，3，7，8-TCDD結(jié)合的卵白蛋白(由Research Diagnostics，Inc.制備)溶液(它是競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))作為抗原溶液處理，并以相同的方式測(cè)試。結(jié)果見表2。
對(duì)比例1以與實(shí)施例2相同的方式進(jìn)行試驗(yàn)，所不同的是不使用膠乳試劑和穩(wěn)定劑。結(jié)果見表2。
表2

根據(jù)表2，顯而易見的是，通過添加膠乳顆粒，頻率變化的測(cè)量值高10倍或更高，因此在高靈敏度下測(cè)量是可能的。
實(shí)施例3測(cè)試包含在由焚燒工廠的粉煤灰中提取的樣品內(nèi)的2，3，7，8-TCDD的抗原-抗體反應(yīng)。類似于實(shí)施例1，將抗-2，3，7，8-TCDD-抗體固定在石英振蕩器上并進(jìn)行穩(wěn)定化處理，和通過在作為競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物的100ng/ml 2，3，7，8-TCDD結(jié)合的卵自蛋白(由Research Diagnostics，Inc.制備)溶液內(nèi)溶解從焚燒工廠的粉煤灰中提取的樣品，以1ng/ml制備競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)的溶液，并將這視為抗原溶液。通過使用該溶液，以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。結(jié)果見表3。
對(duì)比例2以與實(shí)施例3相同的方式進(jìn)行試驗(yàn)，所不同的是不使用穩(wěn)定劑。結(jié)果見表3。
表3

根據(jù)表3，顯而易見的是，當(dāng)測(cè)量環(huán)境樣品(它為混合物)時(shí)，和在未添加穩(wěn)定劑的情況下，振蕩器頻率變化的應(yīng)答顯著下降。與此相比，在添加穩(wěn)定劑的本發(fā)明實(shí)施例中，頻率變化的測(cè)量值高10倍或更高，當(dāng)與其中未添加穩(wěn)定劑的情況相比時(shí)，因此能高靈敏度地測(cè)量。
在其中未添加穩(wěn)定劑的情況下，通過包含在實(shí)際環(huán)境樣品內(nèi)的高度濃縮的多組分物質(zhì)或者抗體本身的交叉反應(yīng)的抑制導(dǎo)致基于抗原-抗體反應(yīng)的頻率變化下降，這導(dǎo)致難以穩(wěn)定地獲得應(yīng)答。此外，在其中未添加穩(wěn)定劑的情況下，在測(cè)量溶液內(nèi)各種高度濃縮的多組分物質(zhì)的混合物如二氧芑、呋喃，不允許抗-2，3，7，8-TCDD單克隆抗體維持高級(jí)結(jié)構(gòu)以正常地經(jīng)歷抗原-抗體反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致不正常的頻率應(yīng)答。
實(shí)施例4通過ELISA方法測(cè)量在實(shí)施例3中使用的樣品內(nèi)的2，3，7，8-TCDD的濃度，和研究與通過本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果的關(guān)系。圖3示出了結(jié)果。圖3是顯示通過本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果和通過ELISA方法的測(cè)量結(jié)果之間關(guān)系的圖表。
此外，通過GC/MS方法測(cè)量相同的樣品，和研究與通過本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果的關(guān)系。至于測(cè)量設(shè)備，使用HP-6890/JMS-700 Mstation(商品名，由JEOL Ltd.制備)作為氣相色譜/質(zhì)譜儀，和MS-MP8220D(商品名，由JEOL Ltd.制備)作為數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。在GC/MS方法中，測(cè)量存在于樣品內(nèi)的單獨(dú)的二氧芑組分的濃度(如四氯二苯并對(duì)二氧芑(TeCDDs)、五氯二苯并對(duì)二氧芑(PeCDDs)、六氯二苯并對(duì)二氧芑(HeCDDs)、七氯二苯并對(duì)二氧芑(HpCDDs)、八氯二苯并對(duì)二氧芑(OCDDs)、四氯二苯并呋喃(TeCDFs)、五氯二苯并呋喃(PeCDFs)、六氯二苯并呋喃(HeCDFs)、七氯二苯并呋喃(HpCDFs)、八氯二苯并呋喃(OCDFs))，和通過用各毒性等價(jià)系數(shù)乘以各組分的濃度計(jì)算各組分的毒性等價(jià)量，和對(duì)各毒性等價(jià)量求和，并計(jì)算在樣品內(nèi)全部二氧芑的毒性等價(jià)量(TEQ)。圖4示出了結(jié)果。圖4是顯示通過本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果和通過GC/MS方法的測(cè)量結(jié)果之間關(guān)系的圖表。
根據(jù)圖3，顯而易見的是，通過本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果與通過ELISA方法的測(cè)量結(jié)果非常相關(guān)。因此，本發(fā)明的方法可用作濃度測(cè)量方法替代ELISA方法。同樣根據(jù)圖4，顯而易見的是，通過本發(fā)明方法的測(cè)量結(jié)果與通過GC/MS方法的測(cè)量結(jié)果也非常相關(guān)。因此，本發(fā)明的方法可用作毒性等價(jià)測(cè)量方法替代GC/MS方法。
實(shí)施例5將100ng/ml 2，3，7，8-TCDD-結(jié)合的卵白蛋白(由ResearchDiagnostics，Inc.制備)溶液視為抗原溶液，和以與實(shí)施例1相同的方式，在石英振蕩器上固定抗2，3，7，8-TCDD抗體，且進(jìn)行穩(wěn)定化處理。隨后，在25℃下儲(chǔ)存樣品過夜之后，以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行2，3，7，8-TCDD的抗原-抗體反應(yīng)的測(cè)量實(shí)驗(yàn)。測(cè)量結(jié)果見表4。
對(duì)比例3以與實(shí)施例5相同的方式制備樣品和進(jìn)行2，3，7，8-TCDD的抗原-抗體反應(yīng)的測(cè)量實(shí)驗(yàn)，所不同的是不進(jìn)行穩(wěn)定化和過夜儲(chǔ)存。測(cè)量結(jié)果見表4。
對(duì)比例4-6以與實(shí)施例5相同的方式制備樣品和進(jìn)行2，3，7，8-TCDD的抗原-抗體反應(yīng)的測(cè)量實(shí)驗(yàn)，所不同的是不進(jìn)行穩(wěn)定化。類似地測(cè)試3次，和每次視為對(duì)比例4-6。各測(cè)量結(jié)果見表4。
表4

根據(jù)表4，顯而易見的是，當(dāng)用于二氧芑分析的抗體固定的石英振蕩器保存過夜時(shí)，抗原-抗體反應(yīng)的數(shù)量顯著下降。在此情況下，當(dāng)它沒有穩(wěn)定劑時(shí)，基于抗原-抗體反應(yīng)的頻率變化小，和沒有穩(wěn)定地獲得應(yīng)答。
相反，當(dāng)與沒有經(jīng)歷儲(chǔ)存過夜的對(duì)比例3相比較時(shí)，含有穩(wěn)定劑的本發(fā)明實(shí)施例顯示出穩(wěn)定的應(yīng)答，盡管在儲(chǔ)存過夜之后，它的抗原-抗體反應(yīng)程度經(jīng)歷約10％的下降。
實(shí)施例6以與實(shí)施例3相同的方式測(cè)量包含在從焚燒工廠的粉煤灰中提取的樣品內(nèi)的2，3，7，8-TCDD濃度。測(cè)量結(jié)果為97ng/ml。將所測(cè)量濃度應(yīng)用到圖4所示的校正曲線，結(jié)果毒性等價(jià)量為49ng-TEQ/ml。
使用相同的樣品，通過GC/MS方法測(cè)量各組分的濃度。測(cè)量結(jié)果見表5。
表5

根據(jù)表5，顯而易見的是，樣品內(nèi)全部二氧芑的毒性等價(jià)量為58ng-TEQ/ml。
因此，通過測(cè)量2，3，7，8-TCDD(已知在環(huán)境內(nèi)的二氧芑當(dāng)中，它以最高濃度存在且顯示出最高的毒性)的濃度，和根據(jù)通過使用GC/MS方法事先制作的校正曲線，能測(cè)量樣品內(nèi)全部二氧芑的毒性等價(jià)量。
根據(jù)本發(fā)明，在含多組分的污染材料如取自環(huán)境的樣品、取自生物的樣品內(nèi)的痕量成分，可通過非常容易的操作，在高靈敏度下快速地測(cè)量。例如，可通過使用取自生物的樣品如人血清、尿、體液或取自環(huán)境的樣品如河/湖的水、淤泥、燃燒爐的灰塵作為分析樣品，檢測(cè)痕量成分。特別地，可高靈敏度地測(cè)量來自所謂環(huán)境激素和類似物的環(huán)境污染物(它們被列位內(nèi)分泌破壞劑)如二氧芑和在人體內(nèi)的痕量激素等。二氧芑測(cè)量的常規(guī)正式方法(GC/MS方法)每次分析花費(fèi)約250000yen，和它的分析時(shí)間花費(fèi)接近4周。與之相比，根據(jù)本發(fā)明，能以每次分析約20000yen的成本，在約4小時(shí)內(nèi)以與正式方法相同精度水平地測(cè)量。此外，關(guān)于測(cè)量設(shè)備，正式方法的設(shè)備裝置值60000000yen，而在本發(fā)明中，它值約10000yen。因此，本發(fā)明在經(jīng)濟(jì)上極其有利。
根據(jù)本發(fā)明，通過測(cè)量在環(huán)境內(nèi)高度濃縮且毒性致命的2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑(2，3，7，8-TCDD)的濃度，和通過計(jì)算毒性等價(jià)量，可測(cè)量在含多種組分的被污染材料，如取自環(huán)境的樣品、取自生物的樣品內(nèi)二氧芑的總體毒性等價(jià)量。
本發(fā)明的測(cè)量方法能通過非常容易的操作在高靈敏度下快速地測(cè)量。因此，它適合作為測(cè)量環(huán)境污染物的測(cè)量方法，所述環(huán)境污染物包括被稱為內(nèi)分泌破壞劑的所謂環(huán)境激素等在內(nèi)，如在含多種組分的被污染材料如取自環(huán)境的樣品和取自生物的樣品內(nèi)的二氧芑，和在人體內(nèi)的痕量激素，以及測(cè)量其毒性等價(jià)量的測(cè)量方法。
以涉及本發(fā)明實(shí)施方案的形式描述了本發(fā)明，我們的目的是不通過說明書的任何細(xì)節(jié)限制本發(fā)明，除非另有說明，而是在所附權(quán)利要求中列出的精神和范圍內(nèi)廣義地解釋本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)量方法，該方法包括將樣品固定在具有識(shí)別元素和將所述識(shí)別元素固定在其上的穩(wěn)定劑的石英振蕩器上，其中所述識(shí)別元素對(duì)特定被分析物具有特異結(jié)合能力，所述穩(wěn)定劑包含合成聚合物；測(cè)量頻率的變化量；比較該結(jié)果與通過使用競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得的石英振蕩器的頻率變化量；和從而測(cè)量在被測(cè)量的樣品內(nèi)所述被分析物的含量。
2.一種測(cè)量取自環(huán)境的樣品或取自生物的樣品內(nèi)痕量成分的測(cè)量方法，該方法包括將樣品固定在具有識(shí)別元素和將所述識(shí)別元素固定在其上的穩(wěn)定劑的石英振蕩器上，其中所述識(shí)別元素對(duì)特定的多組分被分析物具有特異結(jié)合能力，所述穩(wěn)定劑包含合成聚合物；測(cè)量頻率的變化量；比較該結(jié)果與通過使用競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得的石英振蕩器的頻率變化量；和從而測(cè)量在被測(cè)量的樣品內(nèi)所述被分析物的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的測(cè)量方法，該方法包括使用凝結(jié)元素，所述凝結(jié)元素具有固定在不溶性載體顆粒上的識(shí)別元素；使在石英振蕩器上的所述凝結(jié)元素和識(shí)別元素特異地結(jié)合到被分析物上；和從而放大并測(cè)量石英振蕩器頻率的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中被分析物是取自環(huán)境或取自生物的二氧芑、呋喃和溴化二氧芑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中被分析物是取自環(huán)境或取自生物的二氧芑，和識(shí)別元素是單克隆或多克隆抗體，所述單克隆或多克隆抗體可特異地結(jié)合到被認(rèn)為是抗原的二氧芑上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的測(cè)量方法，其中識(shí)別元素是IgG、IgM、Fab、F(ab′)2或ScFv，它們是單克隆或多克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，該方法包括在含合成聚合物的穩(wěn)定劑的共存下，固定單克隆或多克隆抗體在石英振蕩器上，所述單克隆或多克隆抗體可特異地結(jié)合到被認(rèn)為是抗原的二氧芑上；在儲(chǔ)存數(shù)天之后，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)；和從而測(cè)量二氧芑的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中該方法包括使用小尺寸的傳感器系統(tǒng)，所述傳感器系統(tǒng)是干電池驅(qū)動(dòng)型或電池驅(qū)動(dòng)型頻率指示器和振蕩電路的聯(lián)合，或者由組合所述傳感器系統(tǒng)和收集數(shù)據(jù)并控制用計(jì)算機(jī)而形成的系統(tǒng)，從而測(cè)量石英振蕩器的頻率變化量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，所述方法包括結(jié)合石英振蕩器到微型通道上，所述微型通道具有樣品的提取/預(yù)處理功能，或?qū)⑹⒄袷幤髑度氲轿⑿屯ǖ纼?nèi)；并使用微型通道型化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)會(huì)加速在微型反應(yīng)空間內(nèi)的抗原-抗體反應(yīng)時(shí)間。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，其中作為被分析物的二氧芑是2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任何一項(xiàng)的測(cè)量方法，所述方法包括通過高速溶劑萃取方法，從取自環(huán)境的樣品或取自生物的樣品中提出被分析物，并進(jìn)行濃縮/清洗預(yù)處理。
12.一種測(cè)量二氧芑的毒性等價(jià)量的測(cè)量方法，所述方法包括通過權(quán)利要求1-11任何一項(xiàng)的方法測(cè)量2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二氧芑的濃度，并測(cè)量全部樣品的毒性等價(jià)量。
13.用于權(quán)利要求1-12任何一項(xiàng)的方法的生物芯片，所述生物芯片包括具有識(shí)別元素和所述識(shí)別元素用穩(wěn)定劑固定在其上的石英振蕩器，其中所述識(shí)別元素對(duì)特定被分析物具有特異結(jié)合能力，所述穩(wěn)定劑包含合成聚合物。
全文摘要
一種測(cè)量方法，該方法包括將樣品固定在具有識(shí)別元素和所述識(shí)別元素用穩(wěn)定劑固定在其上的石英振蕩器上，其中所述識(shí)別元素對(duì)特定被分析物具有特異結(jié)合能力，所述穩(wěn)定劑包括合成聚合物；測(cè)量頻率的變化量；比較該結(jié)果與通過使用競(jìng)爭(zhēng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得的石英振蕩器的頻率變化量；和從而在被測(cè)量的樣品內(nèi)測(cè)量所述被分析物的含量。
文檔編號(hào)G01N5/02GK1662804SQ0381462
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月28日
發(fā)明者黑澤茂 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所