專利名稱：抗人多囊蛋白－1 n端多克隆抗體papc1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥分子生物學(xué)、免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，是一類抗人PC-1N端多克隆抗體PAPC1，可用于制備研究常染色體顯性遺傳性多囊腎病發(fā)病機(jī)制的試劑。
背景技術(shù)：
常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是嚴(yán)重危害人類健康的遺傳性腎臟病，患者雙側(cè)腎臟密布囊腫，常在中年后期發(fā)展成為終末期腎衰竭，由于其致病基因在體內(nèi)廣泛表達(dá)，還常累及其他有上皮的器官，包括肝臟、胰腺、卵巢和脈絡(luò)叢等，危害甚大。目前已經(jīng)明確，多囊蛋白的功能異常及由此導(dǎo)致的一系列生物信號傳導(dǎo)的異常是ADPKD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。85～90％ADPKD的發(fā)生系由于多囊腎病基因1(PKD1)的編碼產(chǎn)物—多囊蛋白-1(PC-1)的結(jié)構(gòu)和功能異常所致，但迄今為止對PC-1的具體功能尚不清楚。PC-1的功能研究正在成為當(dāng)前國際上研究ADPKD的熱點(diǎn)。
腎臟的PC-1表達(dá)主要在腎小管上皮細(xì)胞，它是一個分子量約460kD的跨膜糖蛋白，由4302個氨基酸組成，包括1個龐大的胞外區(qū)，11個跨膜區(qū)和1個相對小的胞漿尾。其中胞外區(qū)含3074個氨基酸殘基，其所擁有的眾多復(fù)雜的蛋白基序決定了胞外部分對PC-1行使正常生理功能的重要性。因此，人們通常從胞外區(qū)著手，運(yùn)用多種研究方法試圖闡明PC-1的復(fù)雜功能，包括確定PKD1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和PC-1的表達(dá)水平，分析PC-1在組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的分布模式等。在這些實(shí)驗(yàn)中，多數(shù)應(yīng)用了抗PC-1胞外區(qū)的抗體，如英國的Ong等制備了針對PC-1N端的單克隆抗體7e12(Ong A.C.et al.Polycystin-1expression in PKD1，early-onset PKD1，and TSC2/PKD1 cystic tissue.Kidney Int，1999，56(4)1324-1333)。然而多數(shù)抗體在免疫組織化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫印記(Westernblot)和免疫沉淀(IP)等綜合性能指標(biāo)中，僅能滿足其中的一至兩項(xiàng)指標(biāo)的檢測，而能夠應(yīng)用于IP的抗體則更少見，且實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差。當(dāng)前迫切需要一個穩(wěn)定性好、綜合性能指標(biāo)良好的抗PC-1多克隆抗體用于PC-1的功能研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種穩(wěn)定性好、能夠滿足免疫組織化學(xué)、ELISA、Western blot、IP等多種免疫學(xué)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需求的抗人PC-1多克隆抗體PAPC1。本發(fā)明抗體能特異性結(jié)合人PC-1胞外區(qū)N端的flank-LRR-flank區(qū)和部分WSC區(qū)的第46～202位氨基酸殘基，經(jīng)免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、ELISA、Western blot和IP等免疫學(xué)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，其敏感性高，特異性強(qiáng)。故該抗體可用于檢測ADPKD的發(fā)病機(jī)制。
本發(fā)明多克隆抗體PAPC1是用分子生物工程技術(shù)制備的，其為PC-1N端第46～202位的氨基酸殘基與6個組氨酸組成的融合蛋白經(jīng)免疫新西蘭大白兔所得到的抗體。制備方法如下1.制備抗原(1)制備人腎組織總RNA取新鮮健康成人腎組織，用RNA抽提試劑盒，按常規(guī)的異硫氰酸胍法提取總RNA。
(2)合成引物根據(jù)已知的人類PKD1 cDNA序列(GenBankL33243)，設(shè)計(jì)并合成引物。正向引物 其5’端引入BamHI酶切位點(diǎn) 反向引物 其5’端引入HindIII酶切位點(diǎn) (3)RT-PCR擴(kuò)增PKD1e2以人腎組織總RNA為模板，用上述引物通過RT-PCR擴(kuò)增編碼PC-1N端flank-LRR-flank區(qū)和部分WSC區(qū)的PKD1 cDNA序列PKD1e2，其全長474bp，核苷酸序列見表1。
(4)構(gòu)建表達(dá)載體pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2將融合蛋白表達(dá)載體pQE30(德國Qiagen公司產(chǎn)品，其閱讀框的5’端含編碼連續(xù)6個組氨酸的核苷酸序列)和PKD1e2分別用BamHI和HindIII雙酶切，將兩種酶切產(chǎn)物膠回收后用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌M15，其轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒通過BamHI/HindIII雙酶切和DNA序列分析鑒定，重組表達(dá)載體為pQE30-PKD1e2，工程菌為M15/pQE30-PKD1e2。
(5)制備融合蛋白PC-1-e2工程菌M15/pQE30-PKD1e2在2×YT培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6時，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)4～5小時。經(jīng)破菌和Ni-NTAAgarose(德國Qiagen公司產(chǎn)品)純化后，行SDS-PAGE電泳，顯示表達(dá)的融合蛋白PC-1-e2相對分子量為19.0kD，純度達(dá)95％以上。融合蛋白PC-1-e2的氨基酸序列見表2。
2.多克隆抗體PAPC1的制備將純化的融合蛋白PC-1-e2皮下免疫3只雌性新西蘭大白兔(代號分別為A、B、C)，多次免疫至兔多抗血清的效價達(dá)1.5×105～2.0×105，取兔血清，再用親和層析法行IgG純化，得到純化的多克隆抗體PAPC1。
3.多克隆抗體PAPC1的鑒定(1)多克隆抗體的效價按常規(guī)間接ELISA法測定抗血清的效價為1∶1.5×105～1∶2.0×105，純化后的多克隆抗體PAPC1效價為1∶1.5×105。
(2)多克隆抗體PAPC1的Western blot鑒定多克隆抗體的Western blot鑒定結(jié)果顯示，兔A、B和C的多克隆抗體PAPC1都與融合蛋白PC-1-e2有特異性反應(yīng)，而作為陰性對照的免疫前的兔A血清則同融合蛋白PC-1-e2沒有特異性反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)證明多克隆抗體PAPC1對PC-1具有高度的敏感性和特異性，并在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中具備良好的穩(wěn)定性。


圖1為本發(fā)明中融合蛋白PC-1-e2的重組表達(dá)載體pQE30-PKD1e2構(gòu)建流程圖；
圖2為本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白重組表達(dá)載體pQE30-PKD1e2的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)對制備抗人PC-1多克隆抗體PAPC1作詳細(xì)描述。
一、材料(1)質(zhì)粒和菌株融合蛋白表達(dá)載體pQE30，該載體自上游至下游依次含有PT5啟動子、2個lac誘導(dǎo)序列、編碼RBS的核苷酸序列、起始密碼ATG、編碼連續(xù)6個組氨酸的核苷酸序列、多克隆位點(diǎn)MCS和終止密碼。該質(zhì)粒還含氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因和復(fù)制子Col E1；表達(dá)宿主菌M15，該菌種含有阻遏質(zhì)粒pREP4，其含卡那霉素抗性標(biāo)記基因。pQE30和M15購自德國Qiagen公司。
(2)動物雌性新西蘭大白兔購自上海第二醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。
(3)主要試劑總RNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒為華舜公司產(chǎn)品，One-Step RT-PCR試劑盒、Ni-NTA純化試劑購自德國Qiagen公司。Protein G抗體純化試劑盒(Mab TrapKit)為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為Takara公司產(chǎn)品。福氏佐劑，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗為Sigma公司產(chǎn)品。
二、制備方法(一)抗原的制備1.制備人腎組織總RNA以正常人腎組織，用華舜公司的大量組織總RNA抽提試劑盒制備總RNA，該試劑盒配有TCL裂解液、RP液、W3液和吸附柱等，操作所用材料均經(jīng)RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC)的0.1％水溶液處理。
(1)將新鮮腎組織300mg放入50ml離心管并置冰裕，加入5ml TCL裂解液，用勻漿器充分勻漿，將勻漿液移入50ml離心管中，再用帶針頭的20ml一次性注射器抽打裂解物10次。
(2)加5ml Tris-HCl飽和酚，高速振蕩2分鐘，再加2ml氯仿，用力顛倒混勻后室溫5000g離心10分鐘，移取5ml水相至50ml離心管中。加75％乙醇2.5ml，混勻后移入吸附柱。加RP液5ml，5000g離心5分鐘。
(3)在吸附柱中加W3液5ml，靜置2分鐘后，5000g離心10分鐘。此步驟重復(fù)兩遍。
(4)將吸附柱放入一個干凈的離心管中，往吸附膜中央加500μl無菌純水，靜置3分鐘，5000g離心10分鐘，即獲得總RNA樣品，置-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (5)RNA的鑒定RNA甲醛變性電泳配制1％甲醛變性凝膠(10×MOPS緩沖液10ml，0.1％DEPC水溶液90ml，瓊脂糖1.0克。加熱融化并冷卻至60℃后加入37％甲醛5.4ml和10mg/ml的溴化乙淀6μl，倒入制膠器)；將上述RNA溶液20μl同20μl載樣緩沖液混合，95℃水浴變性2分鐘后加樣電泳?？俁NA電泳后在紫外燈下拍照，可看到清晰的28S rRNA和18S rRNA兩個條帶，前者亮度強(qiáng)于后者。
A260/A280＝1.9418，介于1.7～2.0之間，說明RNA降解較少，純度理想。
2.RT-PCR擴(kuò)增PKD1 cDNA片段PKD1e2(1)引物設(shè)計(jì)合成根據(jù)已知的人類PKD1 cDNA序列(GenBank L33243)，設(shè)計(jì)合成1對引物，用于擴(kuò)增編碼PC-1N端flank-LRR-flank區(qū)和部分WSC區(qū)的PKD1 cDNA。正向引物 其5’端引入BamHI酶切位點(diǎn) 反向引物 其5’端引入HindIII酶切位點(diǎn) 引物由Invitrogen公司合成。
(2)RT-PCR擴(kuò)增以上述人總RNA為模板，用上述引物，采用Qiagen公司的One-Step RT-PCR試劑盒(該試劑盒配有無RNA酶水、QIAGEN酶混合物——反轉(zhuǎn)錄酶和熱啟動TaqDNA多聚酶、5×QIAGEN緩沖液、5×Q溶液、dNTP混合物等)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為總RNA4.0μl(1.354μg)，10mmol/L dNTP混合物2.0μl，QIAGEN酶混合物2.0μl，5×QIAGEN緩沖液10.0μl，5×Q溶液10.0μl，正向引物3.0μl(30pmol)，反向引物3.0μl(30pmol)，無RNA酶水16.0μl。反應(yīng)條件50℃反轉(zhuǎn)錄30分鐘；95℃15分鐘激活熱啟動TaqDNA多聚酶；以cDNA第一鏈為模板，94℃40秒，58℃40秒，72℃1分鐘，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8％瓊脂糖凝膠電泳，并用DNA膠回收試劑盒回收474bp的擴(kuò)增產(chǎn)物PKD1e2。
3.制備感受態(tài)大腸桿菌M15大腸桿菌M15中含有卡那霉素抗性的阻遏質(zhì)粒pREP4，融合蛋白在M15中高效表達(dá)時，需要阻遏質(zhì)粒pREP4表達(dá)的阻遏蛋白作用于表達(dá)載體pQE30的表達(dá)調(diào)控序列，嚴(yán)密調(diào)控融合蛋白的表達(dá)。
(1)取少量-80℃凍存的甘油菌M15，接種于含卡那霉素25μg/ml的LB瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落種于3ml LB(含卡那霉素25μg/ml)的試管中，37℃，250轉(zhuǎn)/分鐘振搖過夜。
(2)取200μl過夜培養(yǎng)菌種于含20ml LB(含卡那霉素25μg/ml)的試管中，37℃，300轉(zhuǎn)/分鐘振搖3小時，至OD600值為0.4，將試管取出冰浴15分鐘。
(3)培養(yǎng)物于4℃，4000g離心10分鐘，棄上清，加入4ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2重懸菌體，冰浴30分鐘。
(4)4℃，4000g離心10分鐘，棄上清，各加入1ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2重懸菌體，在4℃冰箱放置12-24小時即得到感受態(tài)M15菌，可用于轉(zhuǎn)化。
4.構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體pQE30-PKD1e2和工程菌M15/pQE30-PKD1e2取上述純化的RT-PCR產(chǎn)物PKD1e2和融合蛋白表達(dá)載體pQE30，按常規(guī)分別用BamHI和HindIII雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用DNA膠回收試劑盒純化，分別得到PKD1e2和表達(dá)載體pQE30的酶切片斷，按分子數(shù)9∶1比例，用T4DNA連接酶連接16小時，將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化上述制備的感受態(tài)宿主菌M15，涂于氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)抗性的LB瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)過夜獲得轉(zhuǎn)化子。
挑取轉(zhuǎn)化子經(jīng)LB振蕩培養(yǎng)后，堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA(1)在抗性LB平皿上挑取含質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆，接種在含相應(yīng)抗生素的2ml LB試管中，37℃，250轉(zhuǎn)/分鐘振搖過夜。
(2)4℃，15000g離心30秒，收集菌體。
(3)加100μl冰預(yù)冷的溶液I(50mmol/L Glucose，25Mmol/L Tris-HCl，10Mmol/L EDTA，pH8.0)，振蕩懸浮。加入溶液II(0.2M/L NaOH，1％SDS)200μl，迅速顛倒離心管7次。加入冰預(yù)冷的溶液III(5M/L KAc 60ml，CH3COOH 11.5ml，雙蒸水21.5ml)150μl，振蕩混勻，置冰浴2分鐘。
(4)4℃，15000g離心5分鐘。小心吸取上清約450μl放入另一試管中。
(5)加450μl酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻。4℃，15000g離心2分鐘。
(6)將上層水相約400μl轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入無水乙醇800μl混勻。室溫靜置2分鐘。
(7)4℃，15000g離心5分鐘。棄上清，加入冰預(yù)冷的70％乙醇1ml，4℃下洗滌雙鏈DNA。4℃，15000g離心2分鐘，棄上清，得質(zhì)粒DNA沉淀。
將所得質(zhì)粒DNA經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，初步鑒定為重組質(zhì)粒pQE30-PKD1e2，經(jīng)ABIPRISMTM 3700型DNA測序儀測序分析證實(shí)pQE30載體上連接的是PKD1cDNA，大小為474bp，閱讀框正確。測序引物位于表達(dá)載體pQE30上，正向引物為5’-CGGATAACAATTTCACACAG-3’，反向引物為5’-GTTCTGAGGTCATTACTGG-3’。該大腸桿菌轉(zhuǎn)化子為工程菌M15/pQE30-PKD1e2。重組質(zhì)粒pQE30-PKD1e2的構(gòu)建流程圖見圖1，重組質(zhì)粒pQE30-PKD1e2的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。
5.PC-1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化(1)將上述獲得的工程菌M15/pQE30-PKD1e2接種于含氨卞青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB 25ml，37℃，250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)過夜。
(2)以1∶20體積比接種在2×YT培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，32℃誘導(dǎo)表達(dá)4～5小時。
(3)4℃，9000g，離心3分鐘收集菌體。
(4)每克菌體加5ml 8M/L尿素裂解液(pH8.0)，充分裂解菌體至裂解溶液呈半透明，9000g離心45分鐘，收集上清。
(5)將上清與50％Ni-NTAAgarose混合(每4ml裂解溶液加1ml Agarose)，常溫下250轉(zhuǎn)/分鐘振搖1小時，然后將混合液裝柱，進(jìn)行梯度純化。
(6)配制pH值分別為pH6.3，pH5.9，pH4.5的三種尿素緩沖液(其成分均為100mMNaH2PO4，10mMTris.HCl，8Murea)，按pH值從高到低的順序?qū)θ诤系鞍走M(jìn)行梯度洗脫。pH5.9和pH4.5的尿素緩沖液可將柱上的融合蛋白洗脫下來。分別收集其洗脫蛋白液保存于-80℃冰箱。
(7)將上述初步純化的融合蛋白樣品液用12％SDS-PAGE電泳分析，操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，1992年10月第2版)。分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％。電泳后用0.05％考馬斯亮藍(lán)250染色液染色3小時，再經(jīng)脫色液脫色。結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌裂解物上清有一條明顯的蛋白條帶，分子量約為19.0kD，與理論預(yù)計(jì)的PC-1融合蛋白PC-1-e2分子量相吻合，確認(rèn)所得的是融合蛋白PC-1-e2。蛋白薄層掃描分析融合蛋白PC-1-e2占菌體總蛋白的47.11％，純化后的融合蛋白PC1-e2的純度在95％以上。
(二)多克隆抗體的制備1.抗原的復(fù)性(1)配制復(fù)性相關(guān)試劑磷酸鹽緩沖液(PBS，pH8.0)NaCl8.0g
KH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gKCl 0.2g雙蒸水 加至 1000ml復(fù)性緩沖液2mmol/L還原型谷胱甘肽，0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽(2)取上述PC-1-e2蛋白樣品液1ml，緩慢加入9ml復(fù)性緩沖液，室溫孵育4小時。在4℃環(huán)境下，將該蛋白溶液對500ml pH8.0 PBS緩沖液進(jìn)行透析48小時，其間更換透析緩沖液5次。
2.免疫新西蘭大白兔將復(fù)性的融合蛋白PC-1-e2 250μg(約250μl)加入等體積的福氏佐劑，充分乳化，對3只8周齡雌性新西蘭大白兔(編號A、B、C)經(jīng)皮下多點(diǎn)和摑窩淋巴結(jié)進(jìn)行注射免疫，1個月后第2次進(jìn)行免疫，然后再每隔2周免疫1次，總計(jì)6次。初次免疫用完全福氏佐劑配制注射液，此后用不完全福氏佐劑配制。每次免疫前1天從被免疫的兔子耳緣靜脈取血，以上述純化的PC-1-e2作為抗原包被酶標(biāo)板，用常規(guī)間接ELISA法測其多克隆抗體效價，可見多抗效價逐步升高，末次免疫后第7天其效價為1∶1.5×105～1∶2.0×105，符合制備多克隆抗體的要求，此時從免疫兔的頸動脈放血，制備多抗血清。
3.制備多抗血清從免疫兔的頸動脈收集全血，置4℃冰箱過夜。次日上午將收縮的血凝塊輕輕取出，將血清移入一個新的離心管，4℃下3000g離心10分鐘，收集血清，分裝，-80℃保存。
4.多克隆抗體的純化將上述收集的兔血清用0.45μm濾器過濾后，采用蛋白G(Protein G)抗體純化試劑盒層析法純化血清多克隆抗體。
層析柱規(guī)格及緩沖液成分如下層析柱HiTrap Protein G HP，1ml緩沖液10×結(jié)合緩沖液0.2M磷酸鈉，pH7.010×洗脫緩沖液1M甘氨酸，pH2.71×中和緩沖液1M三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl)，pH9.0多克隆抗體純化步驟簡述如下①配制結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液的工作液結(jié)合緩沖液工作液2.5ml 10×結(jié)合緩沖液+22.5ml雙蒸水洗脫緩沖液工作液0.5ml 10×洗脫緩沖液+4.5ml雙蒸水②注射器裝滿水，將柱子去頂蓋，將5ml注射器和柱子連接好，確保密封嚴(yán)格，避免產(chǎn)生氣泡。
③將柱子下面的底蓋去掉。
④用5ml雙蒸水沖洗柱子，速度至少1滴/秒，以去除柱子中的乙醇。
⑤平衡層析柱用3ml結(jié)合緩沖液工作液過柱，速度1滴/2秒。
⑥加樣1ml兔血清+1ml結(jié)合緩沖液工作液，混勻后上樣；液體流出速度1滴/秒。
⑦沖洗7ml結(jié)合緩沖液工作液過柱。速度1滴/2秒。
⑧洗脫5ml洗脫緩沖液工作液過柱。速度1滴/2秒。
⑨中和每毫升洗脫液加中和緩沖液75μl，分裝密封后-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.間接ELISA法測定多抗血清效價主要試劑如下①包被液0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)Na2CO31.59gNaHCO32.93g雙蒸水 加至 1000ml
②PBS緩沖液(pH7.4)NaCl 8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O 2.9gKCl0.2g雙蒸水 加至 1000ml③抗體稀釋液含0.05％吐溫-20和1％小牛血清(BSA)的PBS緩沖液(pH7.4)④洗滌液含0.05％吐溫-20的PBS緩沖液(pH7.4)⑤封閉液含1％BSA的PBS緩沖液(pH7.4)⑥磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)0.1M檸檬酸(19.2g/1000ml) 24.3ml0.2M Na2HPO4(28.4g/1000ml) 25.7ml雙蒸水50ml⑦底物顯色溶液鄰苯二胺(OPD)-H2O2(新鮮配制)pH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液 10ml鄰苯二胺 4mg30％H2O215μl⑧終止劑2M H2SO4H2SO422.2ml雙蒸水 177.8ml操作步驟如下①用包被液稀釋抗原(PC-1-e2)成10μg/ml，于酶標(biāo)板每孔加100μl包被，4℃包被過夜(不少于12小時)。
②用封閉液37℃濕盒封閉1小時。
③用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，每孔加入梯度稀釋好的多抗血清100μl(稀釋度依次為1∶2×10-3，1∶1×10-3，1∶2×10-4，1∶1×10-4，1∶1.5×10-5，1∶2×10-5)，陰性對照為抗原免疫前兔A血清，37℃濕盒溫育2小時。
④用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，每孔加入用抗體稀釋液稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1,000)100μl，37℃濕盒溫育1-2小時。
⑤溫育后再洗3次，加入底物溶液100μl，在避光條件下顯色約30分鐘，待底物顯色適當(dāng)時，每孔滴加50μl終止液，酶聯(lián)檢測儀測定OD492值?？贵w效價以O(shè)D492值≥陰性2倍以上者，判斷為陽性。
間接ELISA法測定抗血清的效價為1.5×105～2.0×105，純化后的多克隆抗體效價為1∶1.5×105。
6.純化的多克隆抗體的Western blot鑒定①將Ni-NTAAgarose純化的融合蛋白PC-1-e2樣品，經(jīng)12％SDS-PAGE膠電泳。
②用半干法電轉(zhuǎn)移將電泳膠蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，電轉(zhuǎn)條件為250伏，90小時。
③取下硝酸纖維素膜，用5％脫脂奶粉封閉2小時，PBST洗滌3次，每次3-5分鐘。
將硝酸纖維素膜分別與3只兔抗血清純化物(A、B、C)和接受免疫之前的兔A陰性血清純化物(稀釋比例均為1∶100)反應(yīng)，37℃孵育1小時，PBST洗滌3次，每次3-5分鐘。用稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)二抗與硝酸纖維素膜在37℃搖床溫育1-2小時，PBST洗滌3次，加入DAB-H2O2底物顯色液，顯色后拍照。結(jié)果表明兔A、B和C的抗血清都與PC-1的融合蛋白PC-1-e2有特異性反應(yīng)，而作為陰性對照的免疫前的兔A血清則同融合蛋白PC-1-e2沒有特異性反應(yīng)。
(三)抗體綜合指標(biāo)的檢測實(shí)驗(yàn)1.免疫組織化學(xué)正常新鮮腎組織經(jīng)4％多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，以抗PC-1N端多克隆抗體PAPC1(1∶500稀釋)做一抗，生物素化羊抗兔IgG做二抗，行常規(guī)免疫組織化學(xué)ABC法，發(fā)現(xiàn)PC-1分布于腎小管組織，尤以遠(yuǎn)端腎小管為主，結(jié)果符合國際同類實(shí)驗(yàn)的普遍發(fā)現(xiàn)。
2.ELISA雙抗體夾心ELISA法用抗PC-1N端單克隆抗體作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，洗滌后加人血清，洗滌后再加抗PC-1N端多克隆抗體PAPC1(作為檢測抗體)，通過與PAPC1結(jié)合的羊抗兔酶標(biāo)IgG與底物系統(tǒng)的顯色反應(yīng)來測定人血清中的PC-1N端含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線及測量值均較理想。
3.Western blot將克隆有PKD1 cDNA全長序列的真核表達(dá)載體pCDNA3.1轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞株，購自上海中科院細(xì)胞所)后，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白(含PC-1)，用抗PC-1N端多克隆抗體PAPC1(1∶250稀釋)做Western blot分析，結(jié)果在450kD～500kD處有一蛋白條帶，同PC-1分子量的理論預(yù)計(jì)值相符。沒有轉(zhuǎn)染該表達(dá)質(zhì)粒的293細(xì)胞則沒有這條帶。說明PAPC1對PC-1具有高度特異性和敏感性。
4.IP將克隆有PKD1 cDNA全長序列的真核表達(dá)載體pCDNA3.1轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用125I對細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記，裂解細(xì)胞，將PAPC1與細(xì)胞裂解液中的蛋白共免疫沉淀，SDS-PAGE分析在450kD～500kD處有一蛋白條帶，同PC-1分子量的理論預(yù)計(jì)值相符。用抗PC-1單克隆抗體對IP產(chǎn)物做Western blot分析，證實(shí)所沉淀的蛋白是PC-1。
5.穩(wěn)定性純化的PAPC1在4℃放置半年或在常溫下放置10天效價無明顯改變，說明該抗體在4℃及常溫下穩(wěn)定性較強(qiáng)。
本發(fā)明多克隆抗體PAPC1的穩(wěn)定性好，多PC-1的檢測敏感性高，特異性強(qiáng)，故可用于制備研究常染色體顯性遺傳性多囊腎病發(fā)病機(jī)制的試劑。
表1 PKD1cDNA核苷酸序列GCCTGCCGCGTCAACTGCTCGGGCCGCGGGCTGCGGACGCTCGGTCCCGCGCTGCGCATCCCCGCGGACGCCACAGCGCTAGACGTCTCCCACAACCTGCTCCGGGCGCTGGACGTTGGGCTCCTGGCGAACCTCTCGGCGCTGGCAGAGCTGGATATAAGCAACAACAAGATTTCTACGTTAGAAGAAGGAATATTTGCTAATTTATTTAATTTAAGTGAAATAAACCTGAGTGGGAACCCGTTTGAGTGTGACTGTGGCCTGGCGTGGCTGCCGCGATGGGCGGAGGAGCAGCAGGTGCGGGTGGTGCAGCCCGAGGCAGCCACGTGTGCTGGGCCTGGCTCCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCTTGGCATCCCCTTGCTGGACAGTGGCTGTGGTGAGGAGTATGTCGCCTGCCTCCCTGACAACAGCTCAGGCACCGTGGCAGCAGTGTCCTTTTCAGCTGCCCACGA表2 融合蛋白PC-1-e2的氨基酸序列MHHHHHHGSACRVNCSGRGLRTLGPALRIPADATALDVSHNLLRALDVGLLANLSALAELDISNNKISTLEEGIFANLFNLSEINLSGNPFECDCGLAWLPRWAEEQQVRVVQPEAATCAGPGSLAGQPLLGIPLLDSGCGEEYVACLPDNSSGTVAAVSFSAAHEKL
權(quán)利要求
1.一種抗人多囊蛋白-1多克隆抗體PAPC1的制備方法，包括制備抗原、免疫動物、制備抗體，其特征在于所制備的抗原為PC-1-e2，其氨基酸序列為MHHHHHHGSACRVNCSGRGLRTLGPALRIPADATALDVSHNLLRALDVGLLANLSALAELDISNNKISTLEEGIFANLFNLSEINLSGNPFECDCGLAWLPRWAEEQQVRVVQPEAATCAGPGSLAGQPLLGIPLLDSGCGEEYVACLPDNSSGTVAAVSFSAAHEKL。
2.按權(quán)利要求1所述的多囊蛋白-1多克隆抗體PAPC1的制備方法，其特征在于所說的免疫動物選用的動物為新西蘭大白兔。
3.權(quán)利要求1或2所述制備方法所得的抗多囊蛋白-1多克隆抗體PAPC1。
4.權(quán)利要求3所述抗多囊蛋白-1多克隆抗體PAPC1在制備研究常染色體顯性遺傳性多囊腎病發(fā)病機(jī)制試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥分子生物學(xué)、免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，是一種抗人多囊蛋白－1N端多克隆抗體PAPC1，可用于制備研究常染色體顯性遺傳性多囊腎病發(fā)病機(jī)制的試劑。本發(fā)明根據(jù)人類多囊腎病1基因(PKD1)的cDNA序列和其編碼產(chǎn)物——多囊蛋白－1(PC－1)的分子結(jié)構(gòu)，采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆到編碼PC－1的cDNA，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出PC－1N端的融合蛋白(PC－1的flank－LLR－flank區(qū)和部分WSC區(qū))，以此為抗原免疫動物制備抗血清，并對其進(jìn)行純化得到多克隆抗體PAPC1。經(jīng)針對多囊蛋白－1N端的綜合性能指標(biāo)測試，該抗體在免疫組織化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附、免疫印記和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中性能穩(wěn)定，敏感性高，特異性強(qiáng)，故可用于制備研究常染色體顯性遺傳性多囊腎病發(fā)病機(jī)制的試劑。
文檔編號G01N33/563GK1526733SQ0315118
公開日2004年9月8日 申請日期2003年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者趙海丹, 梅長林 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)