專利名稱：類雌激素毒性快速檢測試片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種類雌激素毒性快速檢測試片的制備方法，該方法制備的檢測試片能夠?qū)崿F(xiàn)對類雌激素毒性的快速在線檢測，以便確定類雌激素的生態(tài)毒理學效應(yīng)，也可以作為環(huán)保、科研、商檢及食品水產(chǎn)等單位進行類雌激素污染的檢測和研究。
背景技術(shù)：
雌激素是人和動物體內(nèi)重要的化學信使之一，對生長發(fā)育、內(nèi)分泌功能、生殖功能起著重要的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，水環(huán)境中存在著一類具有雌激素活性，能夠模擬雌激素功能的環(huán)境化學物質(zhì)，稱之為類雌激素。這類物質(zhì)主要包括避孕藥中的合成雌激素；植物產(chǎn)生的某些天然物質(zhì)和一些人工合成的環(huán)境污染物(如多氯聯(lián)苯、DDT、鄰苯二甲酸酯、烷基酚等)。由于這些物質(zhì)能夠影響機體正常的激素代謝，干擾內(nèi)分泌功能，導致發(fā)育生殖異常，因而越來越受到人們的關(guān)注和重視。
由于類雌激素的種類繁多，化學結(jié)構(gòu)差異很大，很難用某個通用的化學結(jié)構(gòu)式表示。因而，很難使用化學儀器來鑒別。由于化學分析不能給出類雌激素的毒性效應(yīng)，僅能檢測已知類雌激素的種類和濃度，這樣，即使檢測出某些類雌激素具有相同的環(huán)境濃度，但也無法區(qū)分它們的雌激素活性的大小。因此，目前對類雌激素毒性的檢測主要是通過生物篩選來進行。生物篩選是根據(jù)化合物對生物的雌激素效應(yīng)，來確定所測化合物是否為類雌激素，其主要方法有動物實驗。通過測定類雌激素對性成熟前實驗動物(如大鼠和小鼠)子宮生長的促進作用來評價其雌激素活性，評價標準有子宮濕重和子宮濕重與體重之比。在魚中則為性腺與體重之比。這種方法是經(jīng)典的類雌激素毒性檢測方法，它能夠檢測多種雌激素，靈敏度較高，操作也較方便，但受到實驗本身所選指標的限制，存在較大的實驗誤差。
細胞培養(yǎng)。利用對雌激素敏感的細胞系檢測類雌激素活性。所用的細胞系有人乳腺癌MCF7、T47D細胞和ZR-75-1細胞、Hela細胞、大鼠子宮原代細胞、大鼠垂體原代細胞、鼠淋巴細胞經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的LeC-9細胞等。環(huán)境化合物的雌激素活性可以通過細胞的增殖試驗檢驗；其活性也可以通過雌激素作用元件調(diào)控的基因表達和雌激素所誘導的孕激素生成來加以檢測。目前使用最為廣泛的是MCF7細胞系，它的好處在于能反映對人體的作用，并且靈敏度較高。在用細胞培養(yǎng)進行類雌激素毒性檢測時，假陽性或假陰性的比例較高，這是該方法主要的不足之處，也是在使用這種方法時必須注意的問題。
雌激素受體結(jié)合試驗。體外測定類雌激素與雌激素受體的特異性親和力來檢測其活性大小。雌激素需與受體蛋白結(jié)合為復(fù)合物，才能作用于相應(yīng)的靶器官產(chǎn)生作用。受體親和力與雌激素活性之間具有明顯的相關(guān)性，但激素與受體的結(jié)合并不一定激活雌激素受體和激素控制的基因表達。類雌激素與受體的親和力大小可以通過對氚標記雌二醇的競爭性抑制反應(yīng)來測定。該法由于需要使用同位素標記物，所以實驗操作具有一定的危害性。
卵黃蛋白原(Vitellogenin，VTG)誘導。卵黃蛋白原是卵生脊椎動物中卵黃蛋白的前體，通常只有性成熟的雌魚中才能產(chǎn)生。但在類雌激素存在時，性成熟的雄魚和幼魚體內(nèi)也能產(chǎn)生卵黃蛋白原，通過檢測性成熟的雄魚和幼魚體內(nèi)是否存在卵黃蛋白原可以確定環(huán)境化合物是否具有雌激素效應(yīng)。目前檢測卵黃蛋白原主要有ELISA和Western Blotting兩種方法。該法最大的不足是由于卵黃蛋白原是一種種特異性蛋白，因而，檢測不同魚體內(nèi)的卵黃蛋白原時，需要有相應(yīng)的卵黃蛋白原和卵黃蛋白原抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種類雌激素毒性快速檢測試片的制備方法，方法簡單可靠，操作簡便，解決了類雌激素毒性的快速在線檢測問題。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施卵黃蛋白原通常情況下只有性成熟的雌魚中才能產(chǎn)生，雖然，性成熟的雄魚和幼魚體內(nèi)也存在卵黃蛋白原的基因，但在正常情況下并不表達。當環(huán)境中存在類雌激素時，性成熟的雄魚和幼魚體內(nèi)的卵黃蛋白原基因能夠被誘導表達，在體內(nèi)合成卵黃蛋白原。因此，通過檢測性成熟的雄魚和幼魚體內(nèi)是否存在卵黃蛋白原就可以確定其生活的環(huán)境是否受到類雌激素的污染。
檢測試片以免疫層析為原理，能夠定性或半定量檢測卵黃蛋白原。檢測試片從下到上依次為吸水材料、玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、吸水材料。玻璃纖維膜上吸附了膠體金標記的卵黃蛋白原抗體，硝酸纖維膜上依次固定了卵黃蛋白原抗體和卵黃蛋白原。魚血清樣品從下至上層析。如果樣品中含有卵黃蛋白原，則與從玻璃纖維膜上復(fù)溶下來的膠體金標記的卵黃蛋白原抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。復(fù)合物繼續(xù)向上層析，與硝酸纖維膜上固定的卵黃蛋白原抗體結(jié)合顯色，而未與卵黃蛋白原結(jié)合的膠體金標記卵黃蛋白原抗體則再繼續(xù)向上層析與卵黃蛋白原結(jié)合顯色。即樣品中含有卵黃蛋白原時，檢測試片顯示兩條紅線，樣品中不含卵黃蛋白原時，檢測試片顯示一條紅線。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果檢測試片建立在抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)基礎(chǔ)之上，因而具有很強的專一性和可靠性，能夠定性或半定量檢測樣品中卵黃蛋白原的存在，從而確定類雌激素是否存在。檢測試片體積很小，便于攜帶和使用。使用時僅需100μL左右的魚血清，整個分析過程可在30分鐘內(nèi)完成，不需要特殊儀器和試劑，操作人員也無需特殊培訓，非常適合野外的在線檢測?？梢宰鳛榄h(huán)保、科研、商檢及食品水產(chǎn)等單位進行類雌激素污染檢測的手段之一，也可以作為確定類雌激素的初篩方法，與實驗室精確的化學分析相輔相成。


圖1為一種類雌激素毒性快速檢測試片的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述實施例(1)抗原的誘導和分離純化配制17α-乙炔基雌二醇(17α-ethinylestradiol，EE2)溶液將100mg17α-乙炔基雌二醇先溶于5mL丙酮中，再轉(zhuǎn)溶于10mL豆油，丙酮用氮氣吹干。
腹腔注射，5mg/kg。暴露5-7天。取魚血，4℃離心獲得血清。
血清通過離子交換層析柱，填料為DEAE Sepharose CL-6B。柱子用0.025mol/L Tris·HCl，pH7.5平衡，加樣2mL，梯度洗脫(左0.025mol/L Tris·HCl，pH7.5，0.5mol/L NaCl；右0.025mol/L Tris·HCl，pH7.5)。部分收集器收集洗脫液，以電泳確定各管中是否含有VTG。將VTG蛋白溶液脫鹽凍干成為凍干粉。
(2)抗體的誘導免疫新西蘭大白兔獲得卵黃蛋白原抗體。在兔子皮內(nèi)注射1mgVTG蛋白，皮內(nèi)多點注射。1mg蛋白溶于1mL水中，再加入1mL佐劑。
第28、42、56天各加強免疫一次，劑量與第一次相同。
70天頸動脈放血，4℃離心獲得抗血清。
(3)抗體的分離純化抗血清通過親和層析柱，填料為Protein A Sepharose CL-4B。
(a)、20倍柱體積的0.1mol/L Tris·HCl，pH8.0平衡柱子(b)、上抗血清樣品(c)、依次用10倍柱體積的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0和10倍柱體積的10mmol/L Tris·HCl，pH8.0洗柱(d)、加入5倍柱體積的100mmol/L Gly，pH3.0，收集樣品，每管預(yù)先加入200μL 1mol/L Tris·HCl，pH8.0，每管收集0.5mL。
(e)、在280nm處測定收集樣品的吸光值以檢出IgG組分，流出組分中IgG的濃度至少為1mg/mL(OD280為1.33)(f)、10倍柱體積的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0調(diào)節(jié)柱床。
分離后的卵黃蛋白原抗體除鹽后凍干。
(4)膠體金-抗體結(jié)合物的制備(a)、待標抗體的準備。將卵黃蛋白原抗體溶于蒸餾水配成蛋白溶液。膠體金pH調(diào)至7.4-7.6，用0.1mol/L K2CO3溶液上調(diào)，用0.1mol/LHCl溶液下調(diào)。
(b)、待標抗體最適穩(wěn)定量的確定。
待標抗體最適穩(wěn)定量的確定可用光電比色法或目測法。
光電比色法制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液(1mL)，分別加入5mL膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1mL 10％NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測定，以O(shè)D值為縱坐標，蛋白質(zhì)用量為橫坐標作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。
目測法以目測法確定膠體金與待標記蛋白質(zhì)用量比例，將標記的蛋白質(zhì)逐級稀釋后(由5μg～45μg另設(shè)對照管)，各取等體積順序加入一系列裝有1mL膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1mL10％氯化鈉，混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。小于5nm顆粒的膠體金溶液，每個管內(nèi)應(yīng)加入5μL33％的雙氧水，否則有不變藍色及聚沉現(xiàn)象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量最低的試管即含穩(wěn)定1mL膠體金的必須蛋白量。在此基礎(chǔ)上再加上20％即為穩(wěn)定所需蛋白質(zhì)的實際用量。
(c)、抗體的標記。
根據(jù)用以標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記抗體蛋白質(zhì)的總量。
在電磁攪拌(使用玻璃外殼攪拌子)下，將抗體蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中(pH已調(diào)至PI超過0.5pH)，加入蛋白質(zhì)時應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。
在磁性攪拌下加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1％。
(d)、濃縮。用超濾離心管濃縮到原體積的1/10量。
(5)膠體金-抗體結(jié)合物的吸附將裁剪好尺寸的玻璃纖維膜浸沒在濃縮過的膠體金標記抗體的溶液中，待完全浸透后取出，自然晾干。
(6)抗原和抗體的固化將抗體和抗原的凍干粉分別配成蛋白溶液。再將抗原和抗體分別固定在硝酸纖維膜的控制線和檢測線上，自然晾干。硝酸纖維膜的其它區(qū)域用牛奶中的蛋白質(zhì)封閉后，取出自然晾干。
(7)試片的裝配所有部件均裝配在一個不吸水的底襯上，從左到右依次在底襯上粘貼吸水材料1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維膜3、吸水材料6。玻璃纖維膜上吸附了膠體金-抗體結(jié)合物，硝酸纖維膜上分別固定了抗體4和抗原5。樣品在試片上的層析由左向右進行，即使用時應(yīng)將試片的左端朝下插在樣品中，但樣品液面不能超過玻璃纖維膜。
權(quán)利要求
1.一種類雌激素毒性快速檢測試片的制備方法，其步驟如下A、抗原的誘導和分離純化，配制17α-乙炔基雌二醇溶液，將100mg17α-乙炔基雌二醇先溶于5mL丙酮中，再轉(zhuǎn)溶于10mL豆油，丙酮用氮氣吹干，腹腔注射，5mg/kg，暴露5-7天，取魚血，4℃離心獲得血清，血清通過離子交換層析柱，填料為DEAE Sepharose CL-6B，柱子用0.025mol/L Tris·HCl，pH7.5平衡，加樣2mL，梯度洗脫，收集洗脫液，將VTG蛋白溶液脫鹽凍干成為凍干粉；B、抗體的誘導，免疫兔獲得卵黃蛋白原抗體，在兔皮內(nèi)注射1mgVTG蛋白，1mg蛋白溶于1mL水中，再加入1mL佐劑，第28、42、56天各加強免疫一次，70天頸動脈放血，4℃離心獲得抗血清；C、抗體的分離純化，抗血清通過親和層析柱，填料為Protein A SepharoseCL-4B，分離后的卵黃蛋白原抗體除鹽后凍干；D、膠體金-抗體結(jié)合物的制備，首先是待標抗體穩(wěn)定量的確定，用光電比色法或目測法；其次是抗體的標記，在電磁攪拌下，將抗體蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中，加入蛋白質(zhì)時應(yīng)逐滴加入；再是濃縮，用超濾離心管濃縮到原體積的1/10量；E、膠體金-抗體結(jié)合物的吸附，將玻璃纖維膜浸沒在濃縮過的膠體金標記抗體的溶液中，待完全浸透后取出，晾干；F、試片的裝配，在一個不吸水的底襯上，依次粘貼吸水材料(1)、玻璃纖維膜(2)、硝酸纖維膜(3)、吸水材料(6)，硝酸纖維膜(3)上分別固定了抗體(4)和抗原(5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種類雌激素毒性快速檢測試片的制備方法，其特征在于抗體的分離純化，其步驟是(a)、20倍柱體積的0.1mol/L Tris·HCl，pH8.0平衡柱子；(b)、上抗血清樣品；(c)、依次用10倍柱體積的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0和10倍柱體積的10mmol/L Tris·HCl，pH8.0洗柱；(d)、加入5倍柱體積的100mmol/L Gly，pH3.0，收集樣品，每管預(yù)先加入200μL 1mol/L Tris·HCl，pH8.0，每管收集0.5mL；(e)、在280nm處測定收集樣品的吸光值以檢出IgG組分，流出組分中IgG的濃度為1mg/mL；(f)、10倍柱體積的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0調(diào)節(jié)柱床。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種類雌激素毒性快速檢測試片的制備方法，該試片能夠?qū)崿F(xiàn)對類雌激素毒性的快速在線檢測，它包括下列步驟首先是對抗原的誘導和分離純化，離心獲得血清，將VTG蛋白溶液脫鹽凍干成為凍干粉；其次是抗體的誘導，獲得抗血清；再是抗體的分離純化，分離后的卵黃蛋白原抗體除鹽后凍干；第四是膠體金—抗體結(jié)合物的制備；第五是膠體金—抗體結(jié)合物的吸附；第六是抗原和抗體的固化；第七是試片的裝配。本發(fā)明方法簡單，操作方便，試片體積小，便于攜帶和使用，適合環(huán)保、科研、商檢及食品水產(chǎn)等單位進行類雌激素污染檢測。
文檔編號G01N33/531GK1451965SQ0211572
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月18日
發(fā)明者徐盈, 楊方星, 梁勇 申請人:中國科學院水生生物研究所