專利名稱：一種多元免疫微球、該多元免疫微球的制備技術(shù)以及對(duì)該多元免疫微球進(jìn)行檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)體液中特異性抗原或抗體含量的多元免疫微球、該多元免疫微球的制備技術(shù)以及對(duì)該多元免疫微球進(jìn)行檢測(cè)的方法。
本發(fā)明的目的之一是提供一種成倍甚至成百倍的提高可容納信息含量的多元免疫微球，目的之二是提供一種簡(jiǎn)單的多元免疫微球的制備技術(shù)，目的之三是提供一種操作簡(jiǎn)便、可以準(zhǔn)確迅速地檢測(cè)血清或其他體液中特異性抗原或的對(duì)多元免疫微球進(jìn)行檢測(cè)的方法，特異性抗原包括各種疾病標(biāo)志物、細(xì)胞因子和可溶性細(xì)胞表面標(biāo)記等，特異性抗體包括自身抗腫瘤抗體、自身抗核抗體等。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種多元免疫微球，包括乳膠微球，其特殊之處在于所述乳膠微球的直徑在1微米～30微米之間、按照直徑間隔大于或等于0.3微米制成，其外包被有不同的特異性抗原或特異性抗體。
上述特異性抗原或特異性抗體可以是與各種疾病相關(guān)的標(biāo)志物，如腫瘤標(biāo)志物、自身抗體、各種病原微生物抗原或抗體、各種細(xì)胞因子、各種細(xì)胞的可溶性表面標(biāo)記、各種可溶性受體分子等。
一種多元免疫微球的制備技術(shù)，其特殊之處在于選取直徑間隔大于或等于0.3微米、直徑在1微米～30微米之間的乳膠微球制成直徑大小不同的乳膠微球，在同一直徑的乳膠微球的表面包被一種特異性抗原或特異性抗體制成一種免疫微球；將制備好的免疫微球用PBS洗滌后，將表面包被有不同特異性抗原或抗體的免疫微球進(jìn)行混合，即制成多元免疫微球。
一種對(duì)多元免疫微球進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特殊之處在于①將多元免疫微球與待測(cè)樣品混合進(jìn)行抗原和抗體的特異性結(jié)合，再將多元免疫微球用PBS進(jìn)行洗滌；②對(duì)多元免疫微球進(jìn)行二次結(jié)合反應(yīng)，再用PBS洗滌后重新懸??；③用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析、檢測(cè)，通過檢測(cè)免疫微球的大小及其發(fā)光強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱得出相應(yīng)的待測(cè)抗原或抗體的含量。
上述方案中，針對(duì)用抗原包被過的多元免疫微球，在第②步中二次結(jié)合反應(yīng)是指加入經(jīng)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光色素標(biāo)記過的相應(yīng)的抗抗體，如抗人Ig抗體進(jìn)行反應(yīng)。
上述方案中，①將表面標(biāo)記有不同特異性抗原的多元免疫微球放入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，離心完畢后棄去上清液，加入足量待測(cè)血清或其他待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘～2小時(shí)，在反應(yīng)過程中可使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS洗滌2次，棄去上清液，用PBS進(jìn)行重懸；②加入標(biāo)記有特定熒光素的抗Ig抗體，37℃孵育10分鐘～60分鐘，在反應(yīng)過程中應(yīng)使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘～5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液后，再次用PBS進(jìn)行重懸；③加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。該方案適用于檢測(cè)體液種各種特異性抗體。
上述方案中，針對(duì)用抗體包被的多元免疫微球，在第②步中二次結(jié)合反應(yīng)是指先加與微球上吸附的抗體具有相同特異性的抗體，如鼠單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，用PBS洗滌后重懸；然后再加入標(biāo)記有特定熒光素的抗Ig抗體進(jìn)行反應(yīng)。
上述方案中，①將表面標(biāo)記有不同特異性抗體的多元免疫微球放入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，棄去上清液，加入足量待測(cè)血清或其他待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘～2小時(shí)，在反應(yīng)過程中應(yīng)使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS洗滌2次，棄去上清液，用PBS進(jìn)行重懸；②先加入與免疫微球上所標(biāo)記抗體的特異性完全相同的鼠單克隆抗體，37℃孵育10分鐘～60分鐘，在反應(yīng)過程中要使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS洗滌2次，棄去上清液，用PBS進(jìn)行重懸，然后加入標(biāo)記有特定熒光素的抗鼠Ig抗體，37℃孵育10分鐘～60分鐘，在反應(yīng)過程中使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液后，再次用PBS進(jìn)行重懸；③加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。該方案適用于檢測(cè)體液種各種特異性抗原。
使用以上方法制備的多元免疫微球可用于人及各種動(dòng)物體液中各種疾病相關(guān)的特異性抗原或抗體含量的檢測(cè)，如腫瘤標(biāo)志物、自身抗體、各種病原微生物抗原或抗體、各種細(xì)胞因子、各種細(xì)胞的可溶性表面標(biāo)記、各種可溶性受體分子等。檢測(cè)人的標(biāo)本，就用抗人的抗體；檢測(cè)動(dòng)物的標(biāo)本，就用抗動(dòng)物的抗體。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、制作簡(jiǎn)單，信息量大，一組多元免疫微球上可容納數(shù)十種、數(shù)百種的抗原或特異性抗體的信息，其檢測(cè)結(jié)果的信息含量成倍甚至成百倍的提高，僅用一次檢測(cè)即可獲得待測(cè)樣品中多種抗原或抗體的含量；2、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速由于利用多元免疫微球上的數(shù)十種、數(shù)百種抗原或特異性抗體對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其操作步驟僅需兩步即可完成，在1小時(shí)內(nèi)即可給出檢測(cè)結(jié)果；3、敏感性高可以檢測(cè)出待測(cè)樣品中極其微量的抗原或抗體的含量；4、特異性強(qiáng)因?yàn)槭翘禺愋缘目乖涂贵w反應(yīng)，因而具有很高的特異性；5、可靠性好各項(xiàng)試驗(yàn)流程易于標(biāo)準(zhǔn)化，一次完成檢測(cè)，試驗(yàn)誤差小，重復(fù)性好，可有效保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠；6、成本低、減輕患者負(fù)擔(dān)試劑消耗少，設(shè)備的重復(fù)使用減少，有效降低檢測(cè)成本；血清用量小，有利于患者的身體復(fù)原，因此可廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)及進(jìn)行研究。
在本發(fā)明多元免疫微球的制備中，作為原料的乳膠微球和不同特異性的羊或兔多克隆抗體，可以自行制備或外購(gòu)。乳膠微球相鄰規(guī)格之間直徑相差大于或等于0.3微米即可，上限應(yīng)當(dāng)保證直徑在1微米～30微米之間的乳膠微球的不同規(guī)格數(shù)量應(yīng)能滿足檢測(cè)需要；本發(fā)明的檢測(cè)方法中，在經(jīng)過最后一步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析、檢測(cè)，根據(jù)微球的大小和熒光信號(hào)的強(qiáng)弱計(jì)算出待測(cè)樣品中相關(guān)的各種標(biāo)志物的含量后，即可根據(jù)其含量的不同和變化，輔助判斷體內(nèi)腫瘤的有無，組織類型、病情的發(fā)展、變化、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后、治療方式的選擇及治療效果的判定等。
實(shí)施例1、使用多元免疫微球進(jìn)行胃癌標(biāo)志物的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在5μm～25μm之間的25種規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備25種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗CA50抗體，抗CA199抗體，抗CA724抗體，抗SA抗體，抗Fer抗體，抗CA494抗體，抗CAMD1抗體，抗IAPP抗體，抗CA19-5抗體，抗CEA抗體，抗CD44抗體，抗γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶抗體，抗醛縮酶抗體，抗谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗體，抗肌酸激酶抗體，抗α-L巖藻糖苷酶抗體，抗核糖核酸酶抗體，抗己糖激酶抗體，抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子抗體，抗β2-微球蛋白抗體，抗丙酮酸激酶抗體，抗5’-核苷酸酶抗體，抗C多肽抗體，抗銅藍(lán)蛋白抗體，抗SIMA抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)胃癌相關(guān)標(biāo)志物含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是第①步將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，加入抗上述胃癌相關(guān)標(biāo)志物的鼠單克隆抗體37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，第②步加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μlPBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
實(shí)施例2、使用多元免疫微球進(jìn)行肺癌標(biāo)志物的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在1μm～30μm之間的31種規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備31種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗P53蛋白、nm23蛋白、CD44v6、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、細(xì)胞角蛋白19可溶性片段、組織多肽抗原、細(xì)胞角蛋白18可溶性片段M3抗原決定簇、癌胚抗原、表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、肌酸激酶同功酶、總唾液蛋白、降鈣素、Fer、CEA、醛縮酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、核糖核酸酶、己糖激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、丙酮酸激酶、5’-核苷酸酶、銅藍(lán)蛋白、tsgf、cd34、st-4-39、grp、CK20、TPS、CYFRA21-1抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)肺癌相關(guān)標(biāo)志物含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是第①步將上述多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；第②步先加入抗上述肺癌相關(guān)標(biāo)志物的鼠單克隆抗體37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；然后加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
實(shí)施例3、使用多元免疫微球進(jìn)行肝癌標(biāo)志物的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在5μm～25μm之間的26種規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備26種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗P53蛋白、nm23蛋白、CD44v6、癌胚抗原、表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、肌酸激酶同功酶、總唾液蛋白、Fer、CEA、醛縮酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、核糖核酸酶、己糖激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、丙酮酸激酶、5’-核苷酸酶、銅藍(lán)蛋白、tsgf、cd34、st-4-39、grp、AFP、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同功酶2、α-L巖藻糖苷酶抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)肝癌相關(guān)標(biāo)志物含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是第①步將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；第②步先加入抗上述肝癌相關(guān)標(biāo)志物的鼠單克隆抗體37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；然后再加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
實(shí)施例4、使用多元免疫微球進(jìn)行乳腺癌標(biāo)志物的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在5μm～25μm之間的25種規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備25種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗p16蛋白、C-erb-2蛋白、CA-153、CEA、CD44、p53蛋白、CA549、HCG、nm23蛋白、CD44v6、癌胚抗原、表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、肌酸激酶同功酶、總唾液蛋白、Fer、醛縮酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、核糖核酸酶、己糖激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、丙酮酸激酶、5’-核苷酸酶、銅藍(lán)蛋白抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是第①步將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；第②步先加入抗上述乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物的鼠單克隆抗體37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；然后再加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
實(shí)施例5、使用多元免疫微球進(jìn)行胰腺癌標(biāo)志物的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在5μm～25μm之間的23種規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備23種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗CA19-9、CA494、CA242、CAMD1、IAPP、CA50、p16蛋白、CD44、p53蛋白、nm23蛋白、CD44v6、癌胚抗原、肌酸激酶同功酶、總唾液蛋白、Fer，醛縮酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、核糖核酸酶、已糖激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、丙酮酸激酶、5’-核苷酸酶抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)胰腺癌相關(guān)標(biāo)志物含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是第①步將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；第②步先加入抗上述胰腺癌相關(guān)標(biāo)志物的鼠單克隆抗體37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；然后再加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
實(shí)施例6、使用多元免疫微球進(jìn)行卵巢癌標(biāo)志物的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在5μm～25μm之間的20種乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備20種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗CA125、IAPP、p16蛋白、β2-微球蛋白、CD44、p53蛋白、nm23蛋白、CD44v6、癌胚抗原、肌酸激酶同功酶、總唾液蛋白、Fer，醛縮酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、核糖核酸酶、已糖激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、丙酮酸激酶、5’-核苷酸酶抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)卵巢癌相關(guān)標(biāo)志物含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是第①步將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；第②步先加入抗上述卵巢癌相關(guān)標(biāo)志物的鼠單克隆抗體37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；然后再加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
實(shí)施例7、使用多元免疫微球進(jìn)行多種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在1μm～30μm之間的51種規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備51種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗CA50、CA19-9、CA724、SA、Fer、POA、PSA、CA494、CA27.29、DU-PAN-2、CA242、CAMD1、IAPP、C多肽單抗、銅藍(lán)蛋白、CK19、tsgf、cd34、st-4-39、grp、p53蛋白、CK20、TPA、TPS、NSE、CYFRA21-1、p16蛋白、p21蛋白、p15蛋白、C-erb-2蛋白、CA-153、CA19-5、CEA、CD44、CA549、AFP、SIMA、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、醛縮酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、α-L巖藻糖苷酶、核糖核酸酶、已糖激酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β2-微球蛋白、丙酮酸激酶、5’-核苷酸酶、CA125、HCG、SIXE、CA19抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)體液中各種腫瘤標(biāo)志物含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是第①步將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；第②步先加入抗上述體液中各種腫瘤標(biāo)志物的鼠單克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；然后再加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
實(shí)施例8、使用多元免疫微球進(jìn)行細(xì)胞因子含量的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在5μm～25μm之間的、相互之間直徑相差0.3微米的30種規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備30種不同特異性的羊或兔多克隆抗體，再用這些多克隆抗體分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些多克隆抗體包括抗IL-1、IL-2、IL-3一直到IL-20、IFN、TNF、各種生長(zhǎng)因子抗體。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的多克隆抗體包被之后即形成不同特異性的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)體液中各種細(xì)胞因子含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；第②步先加入抗上述體液中各種細(xì)胞因子的鼠單克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液；然后再加入熒光色素標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析，。
實(shí)施例9、使用多元免疫微球進(jìn)行自身免疫性抗體的檢測(cè)準(zhǔn)備直徑在1μm～30μm之間的30種不同規(guī)格的乳膠微球，同時(shí)準(zhǔn)備30種特異性抗原，再用這些抗原分別標(biāo)記不同規(guī)格的乳膠微球，這些抗原包括各種微生物抗原、自身核抗原等。不同規(guī)格的乳膠微球被上述不同的抗原包被之后即形成不同的免疫微球，將這些免疫微球混合即形成檢測(cè)體液中各種自身抗體含量的多元免疫微球。
檢測(cè)方法是將這些多元免疫微球放入微量離心管中3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清液，加入100μl待測(cè)血清進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，第②步加入熒光色素標(biāo)記的兔抗人抗體，37℃孵育30分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液，用100μl PBS進(jìn)行重懸；第③步加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
權(quán)利要求
1.一種多元免疫微球，包括乳膠微球，其特征在于所述乳膠微球的直徑在1微米～30微米之間、按照直徑間隔大于0.3微米制成，其外包被著不同的特異性抗原或特異性抗體。
2.如權(quán)利要求書1所述的一種多元免疫微球，其特征在于所述包被的抗原或特異性抗體是與各種疾病相關(guān)的標(biāo)志物，如腫瘤標(biāo)志物、自身抗體、各種病原微生物抗原或抗體、各種細(xì)胞因子、各種細(xì)胞的可溶性表面標(biāo)記或各種可溶性受體分子。
3.如權(quán)利要求書1所述的一種多元免疫微球的制備技術(shù)，其特征在于選取直徑間隔大于0.3微米、直徑在1微米～30微米之間的乳膠微球制成直徑大小不同的乳膠微球，在同一直徑的乳膠微球的表面包被一種特異性抗原或抗體制成一種免疫微球；將制備好的免疫微球用PBS洗滌后，將表面包被有不同特異性抗原或抗體的免疫微球進(jìn)行混合，即制成多元免疫微球。
4.如權(quán)利要求書1所述的一種多元免疫微球的檢測(cè)方法，其特征在于①將多元免疫微球與待測(cè)樣品混合進(jìn)行抗原和抗體的特異性結(jié)合，再將多元免疫微球用PBS進(jìn)行洗滌；②對(duì)多元免疫微球進(jìn)行二次結(jié)合反應(yīng)，再用PBS洗滌后重新懸浮；③用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)、分析，通過檢測(cè)免疫微球的大小及其發(fā)光強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱得出相應(yīng)的待測(cè)抗原或抗體的含量。
5.如權(quán)利要求書4所述的一種多元免疫微球的檢測(cè)方法，其特征在于針對(duì)用抗原包被過的多元免疫微球，在第②步中二次結(jié)合反應(yīng)是指加入經(jīng)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光色素標(biāo)記過的相應(yīng)的抗抗體進(jìn)行反應(yīng)。
6.如權(quán)利要求書5所述的一種多元免疫微球的檢測(cè)方法，其特征在于所述第①步是將表面包被有不同特異性抗原的多元免疫微球放入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，離心完畢后棄去上清液，加入足量待測(cè)血清或其他待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘～2小時(shí)，在反應(yīng)過程中可使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS洗滌2次，棄去上清液，用PBS進(jìn)行重懸；所述第②步是加入標(biāo)記有特定熒光素的抗Ig抗體，37℃孵育10分鐘～60分鐘；反應(yīng)過程中應(yīng)使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘～5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液后，再用PBS進(jìn)行重懸。
7.如權(quán)利要求書4所述的一種多元免疫微球的檢測(cè)方法，其特征在于所述第②步中針對(duì)用抗體包被的多元免疫微球，二次結(jié)合反應(yīng)是指先加與微球上吸附的抗體具有相同特異性的抗體進(jìn)行反應(yīng)，用PBS洗滌后重懸；然后加入標(biāo)記有特定熒光素的抗Ig抗體進(jìn)行反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求書7所述的一種多元免疫微球的檢測(cè)方法，其特征在于所述第①步是將表面標(biāo)記有不同特異性抗體的多元免疫微球放入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，棄去上清液，加入足量待測(cè)血清或其他待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行重懸，37℃孵育30分鐘～2小時(shí)，在反應(yīng)過程中應(yīng)使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS洗滌2次，棄去上清液，用PBS進(jìn)行重懸；所述第②步先加入與免疫微球上所標(biāo)記抗體的特異性完全相同的鼠單克隆抗體，37℃孵育10分鐘～60分鐘，在反應(yīng)過程中要使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS洗滌2次，棄去上清液，用PBS進(jìn)行重懸，然后加入標(biāo)記有特定熒光素的抗鼠Ig抗體，37℃孵育10分鐘～60分鐘，在反應(yīng)過程中使用搖床或定時(shí)搖動(dòng)，3000轉(zhuǎn)/分～5000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘～5分鐘，用PBS清洗2次，棄去上清液后，再次用PBS進(jìn)行重懸；所述第③步是加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用領(lǐng)域,具體涉及一種多元免疫微球、該多元免疫微球的制備技術(shù)以及對(duì)該多元免疫微球進(jìn)行檢測(cè)的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是一次檢測(cè)即可獲得待測(cè)樣品中多種抗原或抗體的含量,以便用于各種相關(guān)疾病如腫瘤、各種炎癥以及自身免疫性疾病等的診斷、鑒別診斷或早期發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:將抗原性物質(zhì)或特異性抗體吸附在不同大小的乳膠微球上制成多元免疫微球,與待測(cè)樣品混合,通過抗原抗體反應(yīng),將各種待測(cè)樣本中的特異性抗原或抗體全部吸附到多元免疫微球上,再使用流式細(xì)胞儀分析待測(cè)樣品中相關(guān)抗原和抗體的含量。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1362623SQ0211441
公開日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2002年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月21日
發(fā)明者李軍, 劉永軍, 劉文康, 王偉華, 劉鐳 申請(qǐng)人:陜西超英生物醫(yī)學(xué)研究開發(fā)有限公司