專利名稱：發(fā)光檢測裝置、發(fā)光檢測用微陣列板的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物試樣中的核酸或蛋白質的發(fā)光檢測方法，特別涉及適用于微量試樣中的基因或蛋白質的測定技術。
背景技術：
近年來，基因或蛋白質的測定件數越發(fā)增加，強烈要求測定的自動化，簡單化。不過，測定試樣是貴重的，因此希望計測用量要少。并且，在這樣的試樣中，測定對象物質的濃度大多也較低，希望是高靈敏度的測定。稱作化學發(fā)光或生物發(fā)光的發(fā)光檢測方法與熒光法或吸光法相比靈敏度可提高一位以上。過去，對于發(fā)光檢測方法大多使用微型板或光學元件(日本特開平6-225752號公報，特開平6-102182號公報)?？墒?，近年來，在稱作微陣列的載片上將從百到數萬種類的DNA或蛋白質作為點加以固定，以捕捉和檢測特定的核酸或蛋白質的技術已經出臺(參照M.Schena編《微陣列生物芯片技術》“Microarray BiochipTechnology”，Eaton Publishing(Sunnyvale，USA)2000年)。
微陣列為固定特定的核酸或蛋白質的區(qū)域大小的直徑為100～1000μm左右，分布在載片上的寬度為10～30mm、長度為20～50mm左右的面積上，并且以等間隔設置點的區(qū)域。對于這樣的微陣列上的點，采用熒光檢測技術雖比較適宜，但由于是觀測微小區(qū)域的表面所產生的熒光，存在著靈敏度不足的問題，從靈敏度方面考慮，希望采用優(yōu)于熒光法的發(fā)光法的檢測方法。
可是，發(fā)光計測時，對于從微小區(qū)域發(fā)出的光很難實現位置精度良好的計測，受來自周圍的雜散光的干擾也較大。盡管也有采用CCD攝像或照相軟片計測微陣列板全體的計測方法(參照D.L.Wiedbrauk andD.H.Farkas編《用于病毒檢測的分子方法》“Molecular methods for virusdetection”第7章‘Detection Methods Using Chemiluminescence’，AcademicPress(San Diego，USA)、1995年)，但如微陣列那樣的直徑為1mm以下的微小點在一定面積內以多個鄰接并列設置時，要精度良好地計測各個微小區(qū)域的發(fā)光強度是困難的。另一方面，如加大微小點間的距離，來自周圍微小發(fā)光區(qū)域的影響雖減小，但對于將數千處以上的大量微小反應區(qū)域設置在同一載片上的微陣列來說，通過減少微小反應區(qū)域的數目，就在盡可能多的微小反應區(qū)域中要同時進行捕捉雜交反應的目的而言是不適宜的。另外，為了提高處理能力，當要在多個微小區(qū)域同時進行發(fā)光反應時，同樣必須使來自相鄰接的微小發(fā)光區(qū)域的影響減少。然而，由于化學發(fā)光其發(fā)光的壽命時間也短，在添加發(fā)光基質后，必須在短時間內進行計測，采用發(fā)光反應開始后的微小區(qū)域掃描方式的計測精度不佳。
為了解決這些現有技術方法的問題，本發(fā)明是在對來自直徑為20～500μm的多個微小區(qū)域內的光同時以高靈敏度進行高精度的檢測的方法進行研究后提出來的技術方案。本發(fā)明的目的尤其在于提供一種適用于微陣列的、用于將發(fā)光反應開始后周邊干擾發(fā)光的影響降低的同時進行測定的技術。本發(fā)明的另一目的在于提供一種與微型板那樣的直徑數mm的凹坑相比在以化學發(fā)光法等的發(fā)光法檢測直徑在其1/10以下的微小反應區(qū)域方面很好的技術。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)光反應是在設置于微陣列板上的微小凹坑內進行的，并且使用光導管接收發(fā)光，光導管的受光端與反應面的距離非常小，可減少檢測發(fā)光光量的損失的同時，可降低來自周圍的其他的微小凹坑的發(fā)光的干擾。使用與微小凹坑相對應的細的光導管(利用光纖)，通過將光導管前端面與微小凹坑內的反應面的距離設置得很窄，可降低發(fā)光的損失，并且可用少量的試劑進行檢測。
在本發(fā)明的其他實施例中，使用平坦的微陣列板基板，在其上粘貼有以規(guī)定的排列設置有貫通孔的不透明薄片，通過將薄片的貫通孔部分用作微小凹坑，在微小反應區(qū)域間設有隔壁，可降低干擾光。貫通孔的直徑接近于光導管的尺寸時，可進一步降低來自周圍的干擾發(fā)光的影響。通過改變貫通孔的形狀或尺寸，并且組合不同尺寸的貫通孔，可實現根據需要的多種類的計測。
具有微小凹坑的微陣列板雖可通過像加工顯微鏡載片那樣來制造，但并不限于此。微小反應區(qū)域(微小凹坑)間的隔壁的作用在于防止化學發(fā)光反應液的擴散的同時，還起到遮擋微小反應區(qū)域間的發(fā)光，并降低干擾發(fā)光的混入的作用。對于分別測定如此限定的微小空間的發(fā)光，最好使用光纖、光纜的光導管。
對于發(fā)光反應雖具有標識化學發(fā)光物質的方法，酵素標識并且產生發(fā)光性的反應產物的方法，通過酵素反應產生生物發(fā)光的方法等，但本發(fā)明可適用于上述任何一種方法。利用酵素反應發(fā)光的情況下，反應生成物在水溶液中擴散，利用通常的平坦的微陣列雖不能特定發(fā)光區(qū)域，但如具有隔壁，則可防止擴散，容易實現點的特定。
微小凹坑雖做成圓形是最簡單的，但并不限于圓形。并且，通過在微小凹坑內使許多數微米以下的磁性微粒子分散，并將反應性的核酸或蛋白質固定在其表面，則可設定微小反應區(qū)域。為了防止發(fā)光向凹坑外散射，最好是凹坑開口端具有銳利的角度，凹坑的肩部具有平滑的表面。
另外，考慮到發(fā)光的時間的衰減，將發(fā)光壽命長的發(fā)光物質與短的發(fā)光物質分別用作不同的對象的標識，在一定的時間間隔中，測定多個發(fā)光圖象時，可容易區(qū)別不同的核酸鏈或蛋白質分子。作為化學發(fā)光標識物質，為魯米諾試劑、丫啶鎓酯、酵素，西洋辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等可用于發(fā)光反應中。作為進一步提高靈敏度的方法，還可使用在標識中使用螢·熒光素酶的生物發(fā)光法。
本發(fā)明為一種發(fā)光檢測裝置，它是檢測在多個微小凹坑以規(guī)定間隔排列的微陣列板的上述微小凹坑中捕捉的發(fā)光反應物質的發(fā)光檢測裝置，其特征在于，具有保持上述微陣列板的保持機構；具有與形成于上述微陣列板上的微小凹坑的間隔相同的間隔、其前端可插入上述微小凹坑中的多根光導管，和與上述光導管組合、用于將發(fā)光反應的基質溶液導入各個微小凹坑中的基質溶液注入機構，并且位于上述保持機構的上方、可相對上述保持機構上下動作的發(fā)光檢測組件；相對上述保持機構朝上下方向驅動上述發(fā)光檢測組件的驅動機構；將通過上述驅動機構向下驅動的發(fā)光檢測組件停止在上述光導管的前端插入上述微陣列板的微小凹坑中、并且不與上述微小凹坑的底面接觸的規(guī)定位置的機構；以及可分別檢測由上述發(fā)光檢測組件接收的、來自上述微小凹坑的發(fā)光的檢測機構。
光導管間的中心間隔在40～2000μm范圍內。
前述裝置，具有停止在光導管的前端插入微陣列板的微小凹坑中，并且不與微小凹坑的底面接觸的規(guī)定位置后，通過基質溶液注入機構將發(fā)光基質溶液添加到微小凹坑中，以計測發(fā)光強度的控制機構。
本發(fā)明的一種發(fā)光檢測用微陣列板，其特征在于，具有帶有平坦表面的基板，有以規(guī)定間隔排列的多個貫通孔并且粘接在上述基板的平坦表面上的不透明薄片，在上述不透明薄片的貫通孔的底上露出的上述基板表面上設定反應性物質固定區(qū)域。
最好不透明薄片具有疏水性。貫通孔的直徑范圍為10μm～1000μm。
另外，本發(fā)明的一種目標生物高分子的檢測方法，其特征在于，包含如下步驟將捕捉目標生物高分子的反應性物質固定在以規(guī)定的間隔形成多個微小凹坑的微陣列板的上述微小凹坑中的微粒子群沉降的步驟，將試樣溶液分注入上述微小凹坑中的步驟，將分注有上述試樣的微陣列板保持在規(guī)定的時間、規(guī)定的溫度下的步驟，將與上述目標生物高分子結合的發(fā)光標識測試物核酸鏈添加到上述微小凹坑中的步驟，將發(fā)光反應的基質溶液添加到上述微小凹坑中，以檢測發(fā)光的步驟。
目標生物高分子為具有特定的堿基排列的核酸或特定的蛋白質，特定的蛋白質可以是例如抗體、抗原、受體、植物凝血素的任意一種。
采用本發(fā)明，可高精度、高靈敏度地測定微陣列板的微小反應區(qū)域的各發(fā)光量。


圖1為表示本發(fā)明使用的發(fā)光檢測用微陣列板的一例的說明圖，圖1(a)為透視圖，圖1(b)為沿圖1(a)的A-A線的剖面圖。
圖2為表示本發(fā)明使用的發(fā)光檢測用微陣列板的另一例的說明圖，圖2(a)為透視圖，圖2(b)為沿圖2(a)的A-A線的剖面圖。
圖3為示意地表示本發(fā)明的發(fā)光檢測裝置的一個例子圖。
圖4為檢測接近微陣列板來自發(fā)光區(qū)域的發(fā)光的發(fā)光檢測組件的模式圖。
圖5為將光導管和基質注入毛細管做成一體的1根發(fā)光檢測組件插入微小凹坑狀態(tài)下的橫剖面圖。
圖6為圖5的側剖視圖。
圖7為表示標識測試物、試樣核酸鏈、捕捉測試物的相互關系的反應模式圖。
圖8為使用本發(fā)明的微陣列板和發(fā)光計測裝置的另外的實驗例的說明圖。
具體實施例方式
下面，根據附圖更詳細地說明本發(fā)明。
圖1為表示本發(fā)明使用的發(fā)光檢測用微陣列板的一例的說明圖，圖1(a)為透視圖，圖1(b)為沿圖1(a)的A-A線的剖面圖。
圖1所示的微陣列板10是在如載片那樣的玻璃板的表面的一部分形成淺的矩形凹部(試樣導入區(qū)域)11，還在其矩形凹部的底面上形成陣列狀的多個圓形凹坑(微小凹坑)12。多個微小凹坑12分別具有平坦的底部，其底部的一部分成為固定試樣中的目標核酸和雜交的核酸測試物的反應分子固定化區(qū)域。為了將含有多種成分的1種試樣同時分注于聚合在該區(qū)域內的所有的微小凹坑12中而設置了試樣導入區(qū)域11。可將一定量的試樣分注到每個微小凹坑12中的情況下，則無需試樣導入區(qū)域11。
試樣導入區(qū)域及微小凹坑的尺寸沒有特別的限定，但舉一例為，試樣導入區(qū)域為縱15mm×橫15mm×深0.2mm，底面上設有核酸測試物固定用的反應分子固定化區(qū)域的微小凹坑的直徑約為150μm的圓形，深度約為100μm。圓形的微小凹坑的中心間距為300μm。
微陣列板10的材質除玻璃外，可以是塑料或硅等。另外，與其說不必是透明的，不如著色為黑色等吸收光線的顏色，還可減少光的反射，防止鄰接的反應分子固定化區(qū)域的發(fā)光相互干涉，比較適用。微小凹坑12可由切削加工或化學蝕刻形成，也可由成型模加工而成。
圖2為表示本發(fā)明使用的發(fā)光檢測用微陣列板的另一例的說明圖，圖2(a)為透視圖，圖2(b)為沿圖2(a)的A-A線的剖面圖。
該微陣列板20通過在由形成矩形的凹部(試樣導入區(qū)域)21的玻璃或塑料構成的載片13上粘接貫通孔排列成陣列狀的不透明薄片23，從而做成與圖1所示相同的結構。具體地說，平均厚度約為1mm的載片上形成縱15mm×橫15mm、深度約為0.5mm的矩形凹部，與其不同的是，準備了一塊以規(guī)定的排列形成多個直徑為350μm的貫通孔的縱15mm×橫15mm、厚度約為250μm的含黑碳的聚乙烯制成的薄片23。然后，在聚乙烯制成的薄片23的一面涂上環(huán)氧樹脂系粘接劑，從一端緊密粘貼到形成于載片上的凹部上。如此制造的微陣列板20中，形成于薄片上的貫通孔部分成為底面上設定微小反應區(qū)域的微小凹坑22，存在于微小凹坑間的薄片材料成為遮光壁，由于防止了從鄰接的微小凹坑發(fā)出的光成為干擾光的現象，能夠提高計測的再現性。
作為薄片的材質，希望試樣及基質液不浸潤、疏水性的材料是適宜的。對于吸水性材料，溶液向周圍浸透，會導致計測不良。PTFE(聚四氟乙烯)那樣的氟系高分子材料等較適用本目的。作為薄片表面的顏色，希望黑色那樣的難于發(fā)生散射光的的顏色，但也不必限于黑色。
圖3為示意地表示本發(fā)明的發(fā)光檢測裝置一個例子圖。在此，以使用圖1所示的微陣列板10為例進行說明。
發(fā)光檢測裝置具有上表面保持微陣列板10的微陣列板固定臺31，相對固定臺31可上下動作的發(fā)光檢測組件32，用于使發(fā)光檢測組件32上下動作的發(fā)光檢測組件移動臂33，和支承發(fā)光檢測組件移動臂33的支柱34。另外，還具有裝入發(fā)光基質液的發(fā)光基質液瓶35，用于將發(fā)光基質液從液瓶35送出到微型注射器37中的泵36，用于將微型注射器37中的發(fā)光基質液注入微陣列板10的各微小凹坑中的柱塞下推機構38。這些構件均設置于遮擋外部光線的筐體30中。發(fā)光檢測組件32通過光導管束39與光計算裝置40相連。發(fā)光檢測組件移動臂33、泵36、柱塞下推機構38和光計數裝置40由控制部45控制。
控制部45控制發(fā)光檢測組件移動臂33的升降，反應前，使各光導管41下降到各反應區(qū)域的表面附近，通過操作柱塞下推機構38，添加發(fā)光基質溶液，開始發(fā)光反應。進而，用光計數裝置40計測其發(fā)光強度。之后，清洗各光導管41的前端，洗落基質成分等的污物。接著，移動到微陣列板上的其他微小反應區(qū)域上，使下個區(qū)域中發(fā)生發(fā)光反應，并進行計測。對所有的微小反應區(qū)域反復地進行該反應、計測、清洗，測定其發(fā)光強度，并將數據送到數據處理裝置中。
圖4為接近微陣列板檢測來自發(fā)光區(qū)域的發(fā)光的發(fā)光檢測組件的模式圖。
發(fā)光檢測組件32具有與設置在微陣列板10上的多個微小凹坑12具有相同間隔設置的多個光導管41。多個光導管41固定到間隔一致的發(fā)光檢測組件移動臂33的固定孔中，在其下方位置上，固定到同樣的間隔一致的光導管固定隔片42的固定孔中并成為一體。另外，發(fā)光檢測組件32具有混入光導管41中并從發(fā)光檢測組件移動臂33向下延伸的1根或數根高度控制用的桿狀部件62(參照圖6)。發(fā)光檢測組件32在其光導管41與微陣列板10上設置的多個微小凹坑12的位置吻合的狀態(tài)下，通過使發(fā)光檢測組件移動臂33下降，可將各光導管41的前端插入微小凹坑內。此時，高度控制用的桿狀部件62在與微陣列板10接觸的位置停止發(fā)光檢測組件32的下降，因此，使光導管41的前端不會與微小凹坑12的底面接觸。由發(fā)光檢測組件32的各光導管41的前端接受光面接受的光分別由內藏于光計數裝置40內的多路光電子倍增管檢測出。
圖5為將光導管和基質注入毛細管做成一體的1根發(fā)光檢測組件插入微小凹坑狀態(tài)下的橫剖面圖，圖6為圖5的側剖視圖。
光導管41由芯部41a、包層41b和被覆1c構成。芯部41a的直徑約為50μm，被覆41c的外徑約為120μm。在光導管41上分別設有與之成一體的基質注入毛細管51。基質注入毛細管51例如是外徑為30μm、內徑為20μm的玻璃細管，通過粘接劑層52固定到光導管41的被覆表面上。每個基質注入毛細管51的上端通過硅橡膠管等與微型注射器37相連，由柱塞下推機構38對該微型注射器37的柱塞稍微施加一定的壓力，則可將發(fā)光反應基質液從注入毛細管51的下端注入微小凹坑12中。注入毛細管51的前端與光導管41的前端面對齊，發(fā)光反應基質液傳遞到表面，并使其浸透于與設置在微小凹坑12底面上的反應分子固定化區(qū)域61之間的間隙中。圖6表示在微陣列板10的微小凹坑12中存留有從基質溶液注入毛細管注入的化學發(fā)光反應的基質溶液65的狀態(tài)。
高度控制用的桿狀部件62用于將光導管41和基質溶液注入毛細管51的前端停止在距微小凹坑12的底面的一定高度處。當光導管41的前端面與微小凹坑12內的反應分子固定化區(qū)域61接觸時，由于氣泡、空隙等，化學發(fā)光反應基質溶液65很難與標識酵素等接觸，因此，在反應分子固定化區(qū)域61的表面與光導管41的前端面之間希望設有一定的距離。在圖示例子的情況下，高度控制用的桿狀部件62設置成，其前端與光導管41的前端比處于更上方，在各光導管41的前端整列插入微小凹坑時，在微小凹坑外的位置上，與微陣列板表面接觸。在該例中，高度控制用桿狀部件62的前端部在與微陣列板表面接觸的狀態(tài)下，使光導管41的前端面與凹坑底面間產生的間隙設定為約20μm。由此，可在多個微小反應區(qū)域同時進行測定，可大幅度地提高處理能力。
高度控制用管也可由光導管構成。此時，來自檢測用光源通過高度控制用光導管導入的光由微小凹坑12的底面反射，通過使再次返回高度控制用光導管的反射光強度發(fā)生較大的變化，可檢測出高度控制用光導管的前端面與微陣列板接觸的情況。高度控制除了以反射光進行檢測外，還可進行機械的上下移動距離測定。另外，高度控制用部件也可設置成與微小凹坑12的底面接觸。此時，使高度控制用部件的前端突出于光導管41的下方。
下面，對使用本發(fā)明的微陣列板和發(fā)光計測裝置的實驗例進行說明。
將圖1所示的微陣列板10清洗后，在各微小凹坑12的底面使具有氫硫(SH)基的硅烷化學劑進行反應，將SH基導入表面。接著，將含有氨基導入末端的捕捉用核酸測試物的溶液與m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酸亞胺酯溶液混合、反應后，使用微陣列生成裝置(排列器)在各點區(qū)域一次點入1nl，與設定在微小凹坑12底面上的反應分子固定化區(qū)域61中央導入的SH基反應，并固定化。固定化捕捉用核酸測試物在干燥后，用純水清洗與沒有固定的不需要的試劑共存的成分，做成清潔的微陣列板。
在含微小凹坑12的試樣導入區(qū)域11(縱15mm×橫15mm×深度0.2mm)全體中同樣分注入被驗試樣40μl，與各微小凹坑內的固定化捕捉用核酸測試物反應。作為測定對象使用B型肝炎病毒(HBV)的基因組DNA。捕捉用和標識用的核酸測試物使用合成的各種低聚核苷酸(堿基長50bp)。雜交反應在密封微陣列板、靜置于加熱到約45℃的保溫箱內進行約5小時。
使用2種類的測試物以多層測定法捕捉并計測作為測定對象的核酸鏈。與作為測定對象的目標核酸鏈與捕捉測試物未結合部位反應的標識核酸測試物按通常方法預先與西洋辣根過氧化酶結合。雜交后，未結合的標識核酸測試液由微型滴管吸上，接著，分數次反復地注入和排出清洗液40μl。之后，添加與標識測試物結合的核酸測試物，再保溫5小時。在雜交后，用微型滴管吸上未結合的核酸測試液，接著分數次用微型滴管反復注入和排出清洗液40移液l。
圖7為表示標識測試物、試樣核酸鏈、捕捉測試物的相互關系的反應模式圖。
在設置于微小凹坑12中的反應分子固定化區(qū)域的表面71上，設有露出SH基的測試物固定部72，在此固定捕捉用核酸測試物73。試樣中的目標核酸74通過雜交反應與核酸測試物73雜交。目標核酸74屗捕捉測試物的未結合部位，與結合了發(fā)光標識物質76的標識核酸測試物75結合。
吸上最后的清洗液后，將微陣列板10置于圖3所示的發(fā)光檢測裝置的微陣列板固定臺31上。將發(fā)光檢測組件32定位于微陣列板10的微小凹坑(直徑為150μm)中，驅動發(fā)光檢測組件移動臂33，使發(fā)光檢測組件32下降。在圖示例子的發(fā)光檢測組件32中，裝配進16根光導管41。在發(fā)光檢測組件32中的高度控制用桿狀部件62的前端與微陣列板10的表面接觸處，停止發(fā)光檢測組件32的動作。在該狀態(tài)下，發(fā)光檢測組件32的光導管41和基質注入毛細管51插入微小凹坑12內，其前端停止在距微小凹坑12的底面為20μm的高度處。接著，在各光導管41的下表面與微小凹坑12的反應分子固定化區(qū)域61間的間隙中，使用注入毛細管51添加約1nl含酵素反應基質魯米諾試劑和過氧化氫的反應液，開始發(fā)光反應，從反應液注入時刻起到經過10秒后的發(fā)光強度由內藏有16路光電子倍增管(濱松ホトニクス社)的光計數裝置40測定。
結果，使含濃度為10pmol/l的目標核酸鏈的試樣溶液反應的點中，與不含這些目標核酸鏈的試樣相比，可獲得約60倍的相對發(fā)光強度。另外，在含有濃度為10pmol/l的鄰接的微小區(qū)域中反應的目標核酸鏈的試樣溶液的發(fā)光強度的影響為5％以下，可忽略不計。微陣列板全體的發(fā)光強度分布通過將來自各光導管的輸出圖表化可見。
另外，作為微陣列板除了使用圖2所示的以外，在與上述同樣的試劑反應條件下計測發(fā)光。結果，在使含10pM的目標核酸鏈的試樣溶液反應的點上，與不含這些目標核酸鏈的試樣的發(fā)光強度相比，可獲得約50倍的相對發(fā)光強度。
作為標識酵素可使用堿性磷酸酶代替西洋辣根過氧化酶進行與上述同樣的實驗。作為基質，例如當使用二惡烷化合物的Lumigen APS-5(Lumigen社)時，可實現長壽命的發(fā)光計測，在同一時間內可獲得以往基質的約10倍的光量。
下面，對使用本發(fā)明的微陣列板和發(fā)光計測裝置的另外的實驗例進行說明。
在粒徑平均為4.0μm的0.01％(W/W)的硅石粒子懸濁液中添加1/10量的1％γ-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，在60℃下保溫3小時，將氨基導入表面。將卵白素蛋白質溶液添加到實施氨基化處理的硅石粒子中，添加1％的戊二醛并固定。接著，準備各種末端進行生物素修飾的捕捉用測試物核酸鏈，與分割的卵白素固定硅石粒子懸濁液反應，以制作捕捉測試物核酸鏈固定硅石粒子。
使用圖2所示的微陣列板20，如圖8所示，一次1nl地將不同的核酸鏈固定化硅石粒子81分注入微小凹坑22中。本例的微陣列板20完全不固定到各微小凹坑22的底面上。空氣干燥硅石微粒子懸濁液后，將含有測定對象核酸的試樣40μl注入到微陣列板的試樣導入區(qū)域21中，分注入各微小凹坑中，使測定對象核酸鏈與要捕捉它的硅石微粒子結合。在40℃下經過12小時的雜交后，充分地進行清洗。
接著，將微陣列板設置于圖3所示的發(fā)光檢測裝置上，在各微小凹坑中加入與發(fā)光標識酵素堿性磷酸酶結合的發(fā)光標識測試物核酸鏈，與前述同樣地，檢測出來自各微小凹坑的發(fā)光。結果，根據含1nM濃度的作為測定對象的DNA鏈的試樣，與不含有作為對象的DNA鏈的試樣相比，可獲得約30倍的發(fā)光強度。在該例的情況下，設置硅石粒子的反應分子固定化區(qū)域的場所可在多個微小凹坑中自由地設定和變更。另外，也可使注入硅石粒子量變化，也可容易地改變捕捉容量。此外，如進一步洗落硅石微粒子，也可再利用微陣列板。
根據本發(fā)明，在具有多個反應分子固定化區(qū)域的微陣列的發(fā)光檢測之際，通過將圍住反應區(qū)域的隔壁設置在各反應分子固定化區(qū)域的周圍，可高靈敏度、高精度地低試劑成本地檢測來自各個微小區(qū)域的發(fā)光強度。
權利要求
1.一種發(fā)光檢測裝置，它是檢測在多個微小?？右砸?guī)定間隔排列的微陣列板的上述微小凹坑中捕捉的發(fā)光反應物質的發(fā)光檢測裝置，其特征在于，具有保持上述微陣列板的保持機構；具有與形成于上述微陣列板上的微小凹坑的間隔相同的間隔、其前端可插入上述微小凹坑中的多根光導管，和與上述光導管組合、用于將發(fā)光反應的基質溶液導入各個微小凹坑中的基質溶液注入機構，并且位于上述保持機構的上方、可相對上述保持機構上下動作的發(fā)光檢測組件；相對上述保持機構朝上下方向驅動上述發(fā)光檢測組件的驅動機構；將通過上述驅動機構向下驅動的發(fā)光檢測組件停止在上述光導管的前端插入上述微陣列板的微小凹坑中、并且不與上述微小凹坑的底面接觸的規(guī)定位置的機構；以及可分別檢測由上述發(fā)光檢測組件接收的、來自上述微小凹坑的發(fā)光的檢測機構。
2.按照權利要求1所述的發(fā)光檢測裝置，其特征在于，鄰接的上述光導管間的中心間隔在40～2000μm的范圍內。
3.按照權利要求1或2所述的發(fā)光檢測裝置，其特征在于，還具有停止在上述光導管的前端插入上述微陣列板的微小凹坑中，并且不與上述微小凹坑的底面接觸的規(guī)定位置后，通過基質溶液注入機構將發(fā)光基質溶液添加到上述微小凹坑中，以計測發(fā)光強度的控制機構。
4.一種發(fā)光檢測用微陣列板，其特征在于，具有帶有平坦表面的基板，有以規(guī)定間隔排列的多個貫通孔并且粘接在上述基板的平坦表面上的不透明薄片，在上述不透明薄片的貫通孔的底上露出的上述基板表面上設定反應性物質固定區(qū)域。
5.按照權利要求4所述的發(fā)光檢測用微陣列板，其特征在于，上述不透明薄片具有疏水性。
6.按照權利要求4或5所述的發(fā)光檢測用微陣列板，其特征在于，上述貫通孔的直徑范圍為10μm～1000μm。
7.一種目標生物高分子的檢測方法，其特征在于，包含如下步驟將捕捉目標生物高分子的反應性物質固定在以規(guī)定的間隔形成多個微小凹坑的微陣列板的上述微小凹坑中的微粒子群沉降的步驟，將試樣溶液分注入上述微小凹坑中的步驟，將分注有上述試樣的微陣列板保持在規(guī)定的時間、規(guī)定的溫度下的步驟，將與上述目標生物高分子結合的發(fā)光標識測試物核酸鏈添加到上述微小凹坑中的步驟，將發(fā)光反應的基質溶液添加到上述微小凹坑中，以檢測發(fā)光的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物試樣中的核酸或蛋白質的發(fā)光檢測方法，特別涉及適用于微量試樣中的基因或蛋白質的測定技術。本發(fā)明提供一種適用于利用發(fā)光反應的發(fā)光用微陣列板和使用該微陣列板的發(fā)光檢測裝置。在各個微陣列的微小反應區(qū)域的周圍設有隔壁，防止周圍發(fā)光的干擾，通過用光導管檢測該微小區(qū)域的發(fā)光，可減少來自周圍的發(fā)光的干擾，提高了檢測精度和靈敏度。
文檔編號G01N21/76GK1539080SQ0182351
公開日2004年10月20日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權日2001年9月28日
發(fā)明者保田健二, 高橋智 申請人:株式會社日立制作所