專利名稱：四鏈體dna和雙鏈體探針系統(tǒng)的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及核酸多鏈體，更具體地說，涉及雙鏈核酸探針和雙鏈核酸靶序列之間特異性結(jié)合形成四鏈體的方法。
相關(guān)技術(shù)描述雖然核酸雙鏈體是多鏈核酸結(jié)構(gòu)研究最廣泛的類型，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些核酸在某些條件下也形成三鏈體和四鏈體結(jié)構(gòu)。
直到現(xiàn)在，人們?nèi)云毡檎J(rèn)為三條核酸鏈間雜交形成三鏈體是限制在非常有限物種的核酸(例如聚嘌呤或聚嘧啶序列)內(nèi)的。參見例如Floris等，“在混合價鹽溶液中陽離子對嘌呤—嘌呤—嘧啶三螺旋形成的影響”，260 Eur.J.Biochem.，801-809(1999)。另外，人們還認(rèn)為三鏈體的形成或雜交是基于有限種類的相鄰核堿基間的Hoogsteen結(jié)合，而不是沃森—克里克堿基配對。參見例如Floris等和授予Dervan等的美國專利號5,874,555。但是，本發(fā)明人最近已經(jīng)公開了幾個專利申請，其中基于沃森—克里克堿基配對可產(chǎn)生三鏈體核酸，并作為高度準(zhǔn)確和靈敏的特異性結(jié)合測定的基礎(chǔ)。參見美國專利申請?zhí)?9/613,263和09/468,679，兩者分別于2000年7月10日和1999年12月21日提交。
正如三鏈體核酸的情形，對四鏈體核酸的傳統(tǒng)看法是，這樣特殊的結(jié)構(gòu)只是相對窄類型的核酸在相對極端的條件下存在。具體而言，Sen等(Nature 334364-366(1988))公開了富含鳥嘌呤的寡核苷酸可以自發(fā)地在體外自組裝成四鏈螺旋。Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))公開了這些四鏈復(fù)合物可以進(jìn)一步結(jié)合成由8、12或16個寡聚物組成的超級結(jié)構(gòu)。
Marsh等(Biochemistry 3310718-10724(1994)和Nucleic AcidResearch 23696-700(1995))公開了一些富含鳥嘌呤的寡核苷酸也可以偏置、平行的排列組裝，形成長的“G-線”。這些更高級別的結(jié)構(gòu)是通過G-四聯(lián)體(G-quartet)穩(wěn)定的，G-四聯(lián)體是由四個以平面方式排列并通過Hoogsteen堿基配對結(jié)合在一起的鳥苷殘基組成的。根據(jù)Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))，寡聚物內(nèi)的至少三個鄰接的鳥嘌呤對形成這些更高級別的結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。
有人已經(jīng)提出，四鏈DNA在許多生物學(xué)過程中起作用，如抑制HIV-1整合酶(Mazumder等，Biochemistry 3513762-13771(1996))、在減數(shù)分裂過程中形成聯(lián)會(Sen等，Nature 334364-366(1988))，以及維持端粒(Williamson等，Cell 59871-880(1989))；Baran等，Nucleic AcidsResearch 25297-303(1997))。
有人還已提出，控制富含鳥嘌呤四鏈體的產(chǎn)生可能是控制這些生物學(xué)過程的關(guān)鍵。例如授予Hardin等的美國專利號6,017,709暗示，端粒酶活性可以通過抑制鳥嘌呤四聯(lián)體的藥物來控制。
授予Pitner等的美國專利號5,888,739公開了基于G-四聯(lián)體的四鏈體可以在檢測核酸的試驗中使用。在與互補(bǔ)寡核苷酸雜交后，G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)未折疊或線性化，從而增加了G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的不同部分上供體和受體之間的距離，導(dǎo)致它們相互作用降低以及可檢測從該結(jié)構(gòu)中所發(fā)射信號(例如熒光)的變化。
授予Agrawal等的美國專利號5,912,332公開了純化合成的寡核苷酸的方法，其中合成的寡核苷酸特異地與所需的全長寡核苷酸雜交，并且伴隨形成了多聚體聚合物，如四鏈體DNA。然后，利用大小排阻層析技術(shù)分離了含有待純化的寡核苷酸的多聚體聚合物。
盡管有前面的進(jìn)展，但四鏈體核酸的全部潛力既沒有被完全認(rèn)識也沒有被充分開發(fā)。
所有本文引證的參考以其全文引作參考。
發(fā)明概要本發(fā)明提供多鏈體結(jié)構(gòu)，其包括含有核堿基第一序列的第一鏈；含有核堿基第二序列的第二鏈，其中第二鏈與第一鏈以沃森—克里克鍵合相連；含有核堿基第三序列的第三鏈；和含有核堿基第四序列的第四鏈，其中第四鏈與第二鏈和第三鏈通過沃森—克里克鍵合相連。
本發(fā)明還提供用于提供本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)的方法。該方法包括提供含有第一鏈、第二鏈、第三鏈、第四鏈、水、緩沖液和至少一種促進(jìn)劑的雜交介質(zhì)；溫育雜交介質(zhì)，溫育時間能有效將第二鏈與第四鏈雜交以提供多鏈體結(jié)構(gòu)。
另外提供的是利用雙鏈探針對單鏈和雙鏈靶進(jìn)行分析。
附圖的簡要說明本發(fā)明將結(jié)合附圖來說明，其中同樣的參考標(biāo)號表示同樣的元件，以及其中

圖1、2、3、4和5是對各分析樣品以波長為函數(shù)制作的熒光強(qiáng)度的復(fù)合圖。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明不象在上文背景部分中所討論的四鏈體，本發(fā)明優(yōu)選的多鏈體結(jié)構(gòu)至少含有根據(jù)傳統(tǒng)的沃森—克里克結(jié)合法則結(jié)合在一起的四條核酸鏈。
如本文所用，術(shù)語“沃森—克里克鍵合”意要定義在相對的核酸(和/或核酸類似物)鏈對之間通過匹配的相對堿基的特異結(jié)合。本文有時將沃森—克里克四鏈體的形成稱為雜交事件，對于沃森—克里克四鏈體的形成如何可以最好地表征，那僅僅為了方便，并不意謂著限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)優(yōu)選四鏈體。多鏈體的每條鏈獨立地含有核酸或核酸類似物。適當(dāng)?shù)暮怂岚ɡ鏒NA或RNA。優(yōu)選的核酸類似物含有不帶電荷或部分帶電荷的主鏈(即帶有電荷的主鏈，所述電荷不是如天然DNA主鏈那樣陰性的)。
在某些實施方案中，四鏈體第二和第四鏈中的一個含有DNA，而第二和第四鏈中的另一個含有RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA。
在某些實施方案中，第二鏈和第四鏈?zhǔn)窍嗷シ雌叫械?。將這些實施方案定義為具有鏡像互補(bǔ)性。在這些實施方案中，將第一和第二鏈的大溝放置在第三和第四鏈的大溝中。
在其它實施方案中，第二和第四鏈?zhǔn)窍嗷テ叫械?。在這些實施方案中，具有“嵌套互補(bǔ)性”，將第一和第二鏈的大溝放置在第三和第四鏈的小溝中。
在某些實施方案中，每個核堿基結(jié)合了不超過兩個的其它核堿基。在一些其中的實施方案中，第二鏈的堿基特異地(通過沃森—克里克法則)結(jié)合第一鏈的匹配的堿基，和結(jié)合第四鏈的匹配的堿基，以及第四鏈的堿基特異地結(jié)合(通過沃森—克里克法則)第三鏈的匹配的堿基，和結(jié)合第二鏈的匹配的堿基，其中第一和第三鏈的堿基結(jié)合不超過一個其它的各個堿基。所以，除了傳統(tǒng)的沃森—克里克堿基對以外，這樣的實施方案包括下面的沃森—克里克堿基三聯(lián)體A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G，和/或C-G-C(包括C+G-C，和/或其它離子化的堿基物種)。
在某些實施方案中，相信第一和第三鏈的相對堿基也相互結(jié)合，除了下列結(jié)合以外(a)在第一和第二鏈的相對堿基之間的結(jié)合；(b)在第三和第四鏈的相對堿基之間的結(jié)合；和(c)在第二和第四鏈的相對堿基之間的結(jié)合。
在本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)的某些實施方案中，沒有鏈?zhǔn)桥c另一條鏈鄰接的。也就是說，至少存在四條獨立的鏈。雖然折疊的構(gòu)型等(例如發(fā)夾轉(zhuǎn)角等)是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的，但是單鏈的折疊部分不使鏈計數(shù)一次以上，接近四個單獨的鏈的最小值。
本發(fā)明的多鏈體優(yōu)選地不依賴于Hoogsteen鍵合或G-G四聯(lián)體來維持多鏈體結(jié)構(gòu)，盡管可能存在不顯著量的Hoogsteen鍵合和/或G-G四聯(lián)體。即，本發(fā)明的多鏈體結(jié)構(gòu)優(yōu)選地基本上無Hoogsteen鍵合，并且基本上無G-G四聯(lián)體。
在某些實施方案中，多鏈體的第一和第二鏈長度為5-50個堿基(更優(yōu)選地是5-30個堿基)，以及第三和第四鏈長度為8-3.3×109堿基對。例如，第一和第二鏈可以構(gòu)成雙鏈探針，第三和第四鏈可以構(gòu)成雙鏈靶，如基因組DNA，其可以含有單元型。
在實施方案中，第三鏈和第四鏈?zhǔn)荘CR擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明的多鏈體可以在體外或體內(nèi)存在于溶液中，存在于固相支持物上。固相支持物可以是電傳導(dǎo)(例如電極)或非傳導(dǎo)的。
根據(jù)本發(fā)明的四鏈體形成適用于各種用途。例如，共價地結(jié)合雙鏈核酸切割劑的雙鏈探針可以用于特異性切割雙鏈核酸的靶序列。共價地結(jié)合化療劑的雙鏈探針可以用于特異性治療雙鏈核酸的靶序列。所以，本發(fā)明包括多鏈體結(jié)構(gòu)，其進(jìn)一步包括與第一、第二、第三和第四鏈中的至少一個結(jié)合的治療劑、預(yù)防劑或診斷劑。
另外，本發(fā)明的多鏈體適用于納米工程，如提供分子水平(即納米級)上的電路。關(guān)于納米工程與核酸的其它細(xì)節(jié)可以在授予Sen等的美國專利號5,948,897中找到，文獻(xiàn)在此引入?yún)⒖肌?br> 本發(fā)明的多鏈體可以通過一個方法來提供，該方法包括提供含有第一鏈、第二鏈、第三鏈、第四鏈、水、緩沖液和促進(jìn)劑的雜交介質(zhì)，并且溫育雜交介質(zhì)，溫育時間能有效使第二鏈與第四鏈雜交。
雜交介質(zhì)可以包括任何已知適用于保護(hù)核苷酸的常規(guī)介質(zhì)。參見例如Sambrook等，“分子克隆實驗室手冊”，第二卷(1989)。例如，介質(zhì)可以包括核苷酸、水、緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)的鹽濃度。當(dāng)二價陽離子專門用于促進(jìn)四鏈體的形成時，螯合劑如EDTA或EGTA不應(yīng)該包括在反應(yīng)混合物中。
互補(bǔ)堿基間的特異性結(jié)合發(fā)生在溫度、鹽濃度、靜電強(qiáng)度和緩沖液組成變化的各種條件下。這些條件和利用它們的方法的例子是本領(lǐng)域已知的。
不象許多Hoogsteen類型的多鏈體，它們在pH值約7.6以上時是不穩(wěn)定或不存在的，本發(fā)明的沃森—克里克多鏈體在大范圍的pH水平下是穩(wěn)定的，優(yōu)選從約pH5到約pH9。
另外，本發(fā)明的多鏈體不需要同型嘧啶序列或同型嘌呤序列的存在，如同在某些現(xiàn)有技術(shù)的四鏈體中。例如，靶序列可以含有任何順序的25％-75％的嘌呤堿基和75％-25％的嘧啶堿基。
優(yōu)選地，多鏈體是在約5℃到約25℃的溫度下反應(yīng)約2小時或更少的時間形成的。即使在室溫下溫育時間優(yōu)選少于5分鐘。更長的反應(yīng)時間是不需要的，但在大多數(shù)情況中，溫育長達(dá)24小時不會對四鏈體有不利影響。本發(fā)明的沃森—克里克四鏈體的快速結(jié)合時間與Hoogsteen四鏈體的更長的結(jié)合時間形成對照。
在雜交介質(zhì)中的促進(jìn)劑優(yōu)選地是嵌入劑或陽離子。嵌入劑可以是例如熒光團(tuán)，如選自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2和吖啶。
合適的陽離子包括例如，單價陽離子，如Na+(優(yōu)選濃度在50mM-125mM)、K+和其它堿金屬離子；二價陽離子，如堿土金屬離子(例如Mg+2和Ca+2)和二價過渡金屬離子(例如Mn2+、Ni+2、Cd+2、Co+2和Zn+2)；和具有至少三價正電荷的陽離子，如Co(NH3)6+3，三價亞精胺和四價精胺。Mn+2優(yōu)選地提供的濃度是10mM-30mM。Mg+2優(yōu)選地提供的濃度15mM-20mM。Ni+2優(yōu)選地提供的濃度是約20mM。在實施方案中，Mg+2和Mn+2提供的組合濃度各為10mM、15mM、20mM、25mM或30mM(即各10-30mM)。
陽離子向其中形成多鏈體的介質(zhì)中的加入量依賴于許多因素，包括陽離子的性質(zhì)、探針的濃度、靶的濃度、其他陽離子的存在和探針和靶的堿基含量。優(yōu)選的陽離子濃度和混合物通?？赏ㄟ^實驗找到。
雖然不需要，其它促進(jìn)劑包括例如，單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)如Rec A蛋白質(zhì)、T4基因32蛋白質(zhì)、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)、大或小核酸溝結(jié)合蛋白質(zhì)、紫羅堿和其它嵌入物質(zhì)如放線菌素D、補(bǔ)骨脂內(nèi)酯和當(dāng)歸根素。這樣的促進(jìn)試劑可以證明在極端操作條件下是有用的，例如在異常pH水平或極端高溫下。
本發(fā)明也實現(xiàn)一個方法，其中第二鏈與第四鏈的雜交使與第三鏈和第四鏈中的至少一種相關(guān)的活性失活。所以，第一鏈和第二鏈中的至少一種進(jìn)一步包括藥劑，其中第二鏈與第四鏈的雜交將藥劑放置于第三鏈、第四鏈或與第三鏈和第四鏈中的至少一種相關(guān)的另一種分子上的靶的有效距離內(nèi)。藥劑優(yōu)選地選自設(shè)計成與臨床相關(guān)基因啟動子序列結(jié)合的核酸、設(shè)計成與臨床相關(guān)基因結(jié)合的核酸或設(shè)計成與病原體的復(fù)制位點的起點結(jié)合的核酸。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了快速、靈敏、環(huán)保和安全的方法，用于測定單鏈或雙鏈靶和雙鏈探針之間的結(jié)合，其中該靶包括核酸序列或核酸類似物序列，以及該探針包括核酸序列或核酸類似物序列。
本發(fā)明的分析可以用于例如鑒定折疊的核苷酸序列中可達(dá)到的區(qū)域、確定雜交復(fù)合物中錯配堿基對的數(shù)目，以及對基因組作圖。
本發(fā)明不僅檢測特異性探針—靶結(jié)合的存在，而且提供關(guān)于探針和靶之間相互作用性質(zhì)的定性和定量的信息。所以，本發(fā)明能夠使試驗員區(qū)別完全匹配、一個堿基對的錯配、兩個堿基對的錯配、三個堿基對的錯配、一個堿基對的缺失、兩個堿基對的缺失和三個堿基對的缺失，這些錯配和缺失是在雙鏈探針中的序列和在雙鏈靶中的序列之間發(fā)生的。
本發(fā)明的實施方案包括以與相同的靶結(jié)合的其它探針?biāo)@示的相同類型的信號來校準(zhǔn)第一探針—靶混合物的測定信號(例如熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光或電特性)，其中其它各個探針與第一探針至少有一個堿基的不同。
可以產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線，其中測量信號大小(例如熒光強(qiáng)度)是靶和探針之間的結(jié)合親合力的函數(shù)。當(dāng)靶和多個不同探針之間的結(jié)合親合力隨著錯配堿基的數(shù)目、錯配的性質(zhì)(A-G對A-C對T-G對T-C等)、四鏈體內(nèi)錯配的位置等而變化時，本發(fā)明的分析可以用于對靶測序。
在實施方案中，測量的信號可以是測試樣品中包括的熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度。在這樣的實施方案中，根據(jù)是否通過信號猝滅或信號擴(kuò)增進(jìn)行熒光團(tuán)信號雜交，在探針和靶之間的結(jié)合親合力可以與強(qiáng)度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。在選定的條件下，嵌入劑產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度可以與探針—靶結(jié)合親合力正相關(guān)，然而利用與探針共價結(jié)合的非嵌入熒光團(tuán)的優(yōu)選的實施方案的強(qiáng)度可以與探針—靶結(jié)合親合力負(fù)相關(guān)。優(yōu)選地在0-2(含)個錯配和/或缺失的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在0-3(含)個錯配和/或缺失的范圍內(nèi)，隨著探針和靶之間錯配的程度提高，非嵌入熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度下降。
本發(fā)明能夠定量測定探針和靶之間的結(jié)合親合力。這樣的信息可能在各種用途中有價值，包括設(shè)計具有最佳結(jié)合特性的反義藥物。
本發(fā)明的分析是優(yōu)選均一的。在檢測測量的信號的量值之前，無需從游離的探針和游離的靶中分離探針—靶復(fù)合物，就可以進(jìn)行分析。分析不需要凝膠分離步驟，從而允許大大增加測試流通量。定量分析是簡單而準(zhǔn)確的。結(jié)果，結(jié)合測定節(jié)省了許多時間和費用，并可以容易地自動化。另外，它能使結(jié)合變量如緩沖液、pH、離子濃度、溫度、溫育時間、探針和靶序列的相關(guān)濃度、嵌入劑濃度、靶序列的長度、探針序列的長度和可能的輔因子(即促進(jìn)劑)的要求得到快速地確定。
分析可以在例如不可滲透的表面或在生物芯片上的孔或微型通道內(nèi)的溶液中進(jìn)行。在某些實施方案中，在第一和第二鏈之前將第三和第四鏈提供在雜交介質(zhì)中，第一和第二鏈在通過與雜交介質(zhì)接觸再水合之前以去水化形式提供。
另外，本發(fā)明的分析優(yōu)選地是無需在靶或探針上提供信號猝滅劑而進(jìn)行的。
雖然本發(fā)明人已經(jīng)在前面公開了雜交的熒光強(qiáng)度測定的優(yōu)點(參見例如，1998年12月31日遞交的美國專利申請?zhí)?9/224,505)，本發(fā)明分析的某些實施方案檢測了探針和雙鏈靶的四鏈體，所以排除變性靶的需要。令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)能夠特異性測定在雙鏈探針和雙鏈靶之間形成的四鏈體，其中探針和靶之間的相互作用是基于沃森—克里克堿基配對的(至少在A結(jié)合T(或U，在RNA的情況中)和G結(jié)合C的意義上)，而不是非常有限的四鏈體雜交的Hoogsteen模型，如Pitner等，同上。
用于本發(fā)明分析中的合適的探針包括例如dsDNA、dsRNA、DNA:RNA雜合體、dsPNA、PNA:DNA雜合體，和具有不帶電荷或帶部分電荷的主鏈的其它雙鏈核酸類似物。具有8-20個堿基長度的探針序列是優(yōu)選的，因為這是發(fā)現(xiàn)原核生物和真核生物最小的獨特的DNA序列的范圍。在實施方案中，5-30個堿基的探針是最優(yōu)選的。但是，可以利用多個更短的探針來檢測其中具有多個非獨特的靶序列的核苷酸序列，將它們組合來獨特地鑒定該核苷酸序列?？蛇x擇探針的長度來匹配靶的長度。
本發(fā)明不需要使用放射性探針，它們在使用中是危險、麻煩和耗時的，并需要不斷地再生。本發(fā)明的探針優(yōu)選使用時是安全的，并且長年穩(wěn)定。因此，探針可以大量制造或定購和儲存。
在實施方案中，用多分子的發(fā)信號復(fù)合物或氧化還原對，或用引發(fā)化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光特性的標(biāo)記來標(biāo)記探針。
當(dāng)熒光嵌入劑不存在于雜交介質(zhì)中時，優(yōu)選地，探針或靶(優(yōu)選探針)具有與其共價結(jié)合的熒光標(biāo)記。該標(biāo)記優(yōu)選地是非嵌入熒光團(tuán)或嵌入熒光團(tuán)。在這樣的實施方案中，熒光團(tuán)優(yōu)選地在任意末端與探針結(jié)合。優(yōu)選的熒光標(biāo)記包括生物素、羅丹明、吖啶和熒光素，和其它當(dāng)用激發(fā)能輻射時發(fā)熒光的標(biāo)記。
選擇激發(fā)波長(通過常規(guī)實驗和/或常識)，以對應(yīng)于使用熒光團(tuán)的激發(fā)最大值，優(yōu)選地是200-1000nm。優(yōu)選地，選擇熒光團(tuán)具有200-1000nm的發(fā)射波長。在優(yōu)選的實施方案中，利用氬離子激光器輻射熒光團(tuán)，光的波長范圍是400-540nm，在500-750nm的范圍內(nèi)檢測熒光的發(fā)射。
本發(fā)明分析可以在各種溫度下進(jìn)行，如5-85℃?，F(xiàn)有技術(shù)的一些分析需要提高的溫度、增加成本和延遲測定。另一方面，本發(fā)明在室溫或低于室溫(例如低于25℃)下進(jìn)行。
本發(fā)明的可靠性不依賴于所述靶中的鳥嘌呤和胞嘧啶的含量。因為G-C堿基對形成了三個氫鍵，而A-T堿基對僅形成了兩個氫鍵，具有更高的G或C含量的靶和探針序列更穩(wěn)定，具有更高的熔化溫度。結(jié)果，提高存在于完全匹配的雜合體中的雜交探針和靶區(qū)域的GC含量的堿基對錯配可以抵銷與錯配探針相關(guān)的結(jié)合減弱。
本發(fā)明分析是非常靈敏的，從而排除了對靶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的需要。例如，分析具有約20微升體積的測試樣品是可能的，其含有約10fmol的靶和約10fmol的探針。本發(fā)明的實施方案是足夠靈敏的，可測定濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過5×10-10M的靶。本發(fā)明的實施方案是靈敏的，足以利用濃度為5×10-9M、優(yōu)選不超過5×10-10M的探針。不用說，前面的值并非暗示該方法不能檢測更高的濃度。
探針(例如第一和第二鏈)與靶(例如第三和第四鏈)的比例是30∶1到1∶1，優(yōu)選地是約10∶1。
參考下面的實施例，本發(fā)明將以更詳細(xì)的方式來說明，但應(yīng)該理解，本發(fā)明并不局限于此。
實施例實施例1有義和反義50-聚體ssDNA靶序列從人囊性纖維化基因的外顯子10派生(Nature 380，207(1996))，并經(jīng)修飾使GC含量從30％變?yōu)?2％，這樣的靶序列在DNA合成儀(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成，然后通過HPLC純化。將等摩爾量的互補(bǔ)寡核苷酸在95℃下變性10分鐘，并且隨著溫度冷卻到21℃，允許退火1.5小時以上。在雙蒸餾水中溶解dsDNA寡核苷酸，濃度為1pmol/l。
野生型dsDNA靶A的有義鏈的序列(SEQ ID NO1)為5’-GAGCAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGATGA CTC TG-3’。
野生型dsDNA靶A的反義鏈的序列(SEQ ID NO2)為5’-CAGAGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCATGG TGC TC-3’。
除了在有義和反義鏈上有一個堿基對突變(下劃線)外，靶B是與野生型靶DNA相同的50聚體的突變dsDNA靶，其中野生型堿基CAT和ATG分別被堿基CGT和ACG取代。
突變體靶B的有義鏈的序列(SEQ ID NO3)為5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。
突變體靶B的反義鏈的序列(SEQ ID NO4)為5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGACGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。
除了在有義和反義鏈上有一個堿基對的突變(下劃線)外，靶C是與野生型靶DNA相同的50聚體的突變dsDNA靶，其中野生型堿基CAT和ATG分別被CTT和AAG取代。
突變體靶C的有義鏈的序列(SEQ ID NO5)為5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。
突變體靶C的反義鏈的序列(SEQ ID NO6)為5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGAAGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。
除了在有義和反義鏈上有一個堿基對突變(下劃線)外，靶D是與野生型DNA相同的50聚體的突變dsDNA靶，其中野生型堿基CTC和GAG分別被堿基CTT和AAG取代。
突變體靶D的有義鏈的序列(SEQ ID NO7)為5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT CTTTGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。
突變體靶D的反義鏈的序列(SEQ ID NO8)為5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAAAGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。
除了在有義和反義鏈上有一個堿基對的突變(下劃線)外，靶E是與野生型DNA相同的50聚體的突變dsDNA靶，其中野生型堿基CTC和GAG分別被堿基CCC和GGG取代。
突變體靶E的有義鏈的序列(SEQ ID NO9)為5’-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3’。
突變體E的反義鏈的序列(SEQ ID NO10)為5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAGGGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。
探針A是在每個5’位置具有附帶的熒光素部分的15聚體dsDNA探針，并且設(shè)計成與靠近50聚體野生型靶A的中心的有義鏈和反義鏈的15個核苷酸區(qū)段鏡像互補(bǔ)。探針的鏈?zhǔn)窃谇懊嫣岬降腄NA合成儀上合成的，并且通過HPLC純化。在95℃下變性等摩爾量的探針鏈10分鐘，隨著溫度冷卻到21℃，允許退火1.5小時以上。在雙蒸餾水中溶解ds DNA探針，濃度為1pmol/μl。
探針A的有義鏈的序列(SEQ ID NO11)為5’-Flu-CTG TCA TCTCTG GTG-3’。
探針A的反義鏈的序列(SEQ ID NO12)為5’-Flu-CAC CAG AGATGA CAG-3’。
各個雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol靶dsDNA、4pmol 5’熒光素標(biāo)記的dsDNA探針、10mM Tris-HCl、pH7.5和100mMKCl。在室溫下(21℃)溫育反應(yīng)混合物1小時，預(yù)先不變性。在石英杯中放置樣品，用具有波長488nm的氬離子激光束輻射，檢測熒光的發(fā)射。在熒光素的發(fā)射波長525nm處，出現(xiàn)最大的熒光強(qiáng)度。圖1表示對各個分析樣品以波長為函數(shù)作圖的熒光強(qiáng)度。
在沒有KCl時，沒有檢測到dsDNA靶和探針A之間的雜交，導(dǎo)致當(dāng)野生型dsDNA靶A或突變dsDNA靶D與dsDNA探針A混合或只有dsDNA探針A存在時，觀察到了相似的熒光強(qiáng)度(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
在存在100mM KCl時，在21℃溫育1小時后，由dsDNA靶A和dsDNA探針A上的完全互補(bǔ)序列組成的dsDNA靶dsDNA-F四鏈體很容易地形成，導(dǎo)致與只由dsDNA探針A所發(fā)射(標(biāo)記dsDNA-F)的相比，熒光發(fā)射的強(qiáng)度下降62％(圖1)。相反，在這些反應(yīng)條件下，不完全互補(bǔ)dsDNA靶D:dsDNA-F探針A四鏈體含有1個堿基對G-T錯配，是較不穩(wěn)定的，與只由dsDNA探針A所表現(xiàn)的相比，僅產(chǎn)生18％的熒光強(qiáng)度的下降。
在特定濃度下，單價陽離子如K+的存在足以允許在沒有預(yù)變性時，dsDNA靶和標(biāo)記有熒光素的dsDNA探針之間形成四鏈體。在沃森—克里克堿基對親合力的基礎(chǔ)上發(fā)生四鏈體的形成，在完全互補(bǔ)的同源雙鏈體鏈之間形成了可測量的和顯著更大量的四鏈體。另外，反應(yīng)是在1小時的溫育時間內(nèi)、室溫下、探針與靶的比例為10-1、利用天然dsDNA時發(fā)生的。在本實施例中利用的dsDNA靶和dsDNA探針是同源的，含有53％的GC含量，并且在任何DNA鏈上都不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸。盡管有推論認(rèn)為這種形成需要雙鏈體探針放棄它的右手手性，但DNA四鏈體還是容易形成的。利用dsDNA探針，本發(fā)明分析能夠鑒定完全互補(bǔ)的dsDNA序列和含有錯配堿基對的那些序列。
實施例2在實施例1中進(jìn)行的四鏈體DNA分析是通過在反應(yīng)混合物中加入單價陽離子來促進(jìn)的。利用二價陽離子來促進(jìn)具有53％GC含量的dsDNA靶和dsDNA-F探針的四鏈體DNA的形成，進(jìn)一步檢測分析的特異性。
各個雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol靶dsDNA、4pmol 5’-熒光素標(biāo)記的dsDNA探針、10mM Tris-HCl、pH 7.5和20mMMnCl2和20mM MgCl2。在室溫(21℃)下溫育反應(yīng)混合物1小時，無需預(yù)變性。在石英杯中放置樣品，用具有波長488nm的氬離子激光束輻射，并且檢測熒光發(fā)射。圖2表示對各個分析樣品以波長為函數(shù)作圖的熒光強(qiáng)度。
在存在20mM MnCl2和20mM MgCl2時，當(dāng)將dsDNA-F探針A(具有53％的GC含量)與50聚體的野生型dsDNA靶A或突變體dsDNA靶D一起溫育時，在室溫以及非變性條件下形成四鏈體。當(dāng)完全匹配的DNA四鏈體的熒光強(qiáng)度最大下降34％時，較不好的含有1bp T-G錯配的dsDNA:dsDNA-F四鏈體(dsDNA靶D+dsDNA探針A)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與只由dsDNA探針A所觀察到的大致相同(圖2)。
二價陽離子如Mn+2和Mg+2的存在，在非變性條件下促進(jìn)了四鏈體的形成，從而允許準(zhǔn)確區(qū)別鏡像互補(bǔ)的同源dsDNA靶和dsDNA探針?biāo)逆滙w，和含有錯配的堿基對的四鏈體序列。
二價陽離子促進(jìn)了鏡像互補(bǔ)的沃森—克里克四鏈體的形成，盡管有推論認(rèn)為這一形成需要雙鏈體探針放棄它的右手手性。
實施例3在實施例1和2中進(jìn)行的四鏈體DNA分析是通過在反應(yīng)混合物中加入單價陽離子或二價陽離子來促進(jìn)的。下面的實施例證明，當(dāng)利用DNA嵌入劑時，四鏈體DNA分析具有特異性。
探針B是與探針A相同的15聚體dsDNA探針，其不附帶熒光素標(biāo)記，并可以相似方式制備。
各個雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下面的成分0.4pmol dsDNA靶、4pmol dsDNA探針B、0.5×TBE和100nM DNA嵌入劑YOYO-1(分子探針，Eugene，OR，USA)。在21℃溫育反應(yīng)混合物5分鐘，然后測定。在石英杯中放置樣品，用具有波長488nm的氬離子激光束輻射。在波長535nm處存在最大的熒光強(qiáng)度，表明嵌入了YOYO-1。
當(dāng)沒有靶或探針存在時(只有YOYO-1存在)觀察到的熒光強(qiáng)度顯示在圖3中。圖3還表明，當(dāng)反應(yīng)混合物組合了dsDNA探針B與含有同源序列的野生型50聚體dsDNA靶A，或與其他四個dsDNA靶時所觀察到的熒光強(qiáng)度，所述其他四個dsDNA靶除了有一個錯配堿基對外，含有同源于dsDNA探針B中堿基序列的序列。同源即鏡像互補(bǔ)的野生型靶dsDNA當(dāng)其與dsDNA探針B存在于反應(yīng)混合物中時產(chǎn)生了最大的熒光強(qiáng)度。與由完全匹配的四鏈體所取得的熒光強(qiáng)度比較，錯配的dsDNA靶當(dāng)與dsDNA探針B在反應(yīng)混合物中溫育時產(chǎn)生了更小的熒光強(qiáng)度值，其范圍從dsDNA靶C的少20％到dsDNA靶E的少80％(圖3)。
據(jù)觀察，當(dāng)探針含有完全匹配即鏡像互補(bǔ)序列時比當(dāng)有單個堿基對不同源即不鏡像互補(bǔ)于dsDNA靶中的序列時，在dsDNA靶和dsDNA探針之間更易形成由YOYO-1嵌入所穩(wěn)定的沃森—克里克四鏈體。盡管推測的結(jié)論是四鏈體形成要求雙鏈體探針放棄其右手的手性，但沃森—克里克四鏈體容易形成。
實施例4在該實施例中，將50-聚體dsDNA靶與53％GC 15聚體dsDNA探針C接觸，當(dāng)將雙鏈體探針的大溝放置于雙鏈體靶的小溝中時，它們的沃森—克里克互補(bǔ)性存在于探針鏈的堿基以及靶鏈的堿基之間，本文稱為嵌套互補(bǔ)。雙鏈體探針中的堿基序列是不同源的，但與雙鏈靶中的那些是反向的關(guān)系。
將探針鏈在上述的DNA合成儀上合成，并通過HPLC純化。等摩爾量的探針鏈在95℃下變性10分鐘，并隨著溫度冷卻至21℃，允許退火1.5小時以上。將dsDNA探針溶解于雙蒸餾水中，濃度為1pmol/μl。
dsDNA探針C的有義鏈的序列(SEQ ID NO13)為5’-GAC AGTAGA GAC CAC-3’。
dsDNA探針C的反義鏈的序列(SEQ ID NO14)為5’-GTG GTCTCT ACT GTC-3’。
各個雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有如下成分0.4pmol靶dsDNA、4pmol dsDNA探針、0.5×TBE和100nM的DNA嵌入劑YOYO-1。反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，放置于石英杯中，并用波長488nm的氬離子激光束輻射。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長535nm處，這是YOYO-1嵌入的表征。
圖4說明在缺乏預(yù)變性的情況下，當(dāng)野生型50聚體dsDNA靶A與15聚體dsDNA探針C反應(yīng)時，獲得了最高的熒光強(qiáng)度，這是在嵌套互補(bǔ)基礎(chǔ)上與dsDNA靶A的完全匹配。熒光強(qiáng)度是DNA結(jié)合發(fā)生的表征，在此情形下，是dsDNA靶和嵌套互補(bǔ)dsDNA探針之間的四鏈體形成。
當(dāng)匹配在嵌套互補(bǔ)的反向同源性基礎(chǔ)上進(jìn)行評價時，突變dsDNA靶與雙鏈體探針通過單個堿基錯配，其與dsDNA探針形成可測定的四鏈體復(fù)合體比完全互補(bǔ)的野生型dsDNA靶與dsDNA探針形成的四鏈體復(fù)合體更少。將在實施例3中以鏡像互補(bǔ)為基礎(chǔ)分析的各種錯配在本實施例中以嵌套互補(bǔ)為基礎(chǔ)進(jìn)行分析。
如圖4所示，由1bp錯配的dsDNA靶加dsDNA探針C形成的四鏈體所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比由完全匹配四鏈體(dsDNA靶A+dsDNA探針C)所獲得的要少8-16％。
在實施例3中完全匹配和錯配的四鏈體之間觀察到熒光更大的區(qū)別。這提示完全互補(bǔ)或1bp錯配的dsDNA探針更喜歡以嵌套互補(bǔ)方向而非以鏡像互補(bǔ)方向與dsDNA靶結(jié)合。
該實施例表明在有YOYO-1存在下，在嵌套互補(bǔ)雙鏈DNA之間的沃森—克里克四鏈體結(jié)合容易發(fā)生。這種便利的出現(xiàn)部分是由于下列事實嵌套互補(bǔ)四鏈體結(jié)合使各個相互作用雙鏈體的右手手性得以維持。
實施例550聚體ssDNA靶序列衍生自人囊性纖維化基因外顯子10(Nature380，207(1996))，并通過修飾使GC含量從30％變?yōu)?2％，將其在DNA合成儀(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上進(jìn)行合成并通過HPLC純化。
50聚體野生型ssDNA靶F的鏈的序列(SEQ ID NO2)為5’-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3’。
除一個堿基突變(下劃線)以外，靶G是與野生型ssDNA靶F相同的50聚體突變ssDNA靶。
突變ssDNA靶G的鏈的序列(SEQ ID NO4)為5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG AGACGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。
除一個堿基突變(下劃線)以外，靶H是與野生型ssDNA靶F相同的50聚體突變ssDNA靶。
突變ssDNA靶H的鏈的序列(SEQ ID NO6)為5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG AGAAGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。
除一個堿基突變(下劃線)以外，靶I是與野生型ssDNA靶F相同的50聚體突變ssDNA靶。
突變ssDNA靶I的鏈的序列(SEQ ID NO8)為5’-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAAAGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3’。
除一個堿基突變(下劃線)以外，靶J是與野生型ssDNA靶F相同的50聚體突變ssDNA靶。
突變ssDNA靶J的鏈的序列(SEQ ID NO10)為5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAGGGA TGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。
除一個堿基突變(下劃線)以外，靶K是與野生型ssDNA靶F相同的50聚體突變ssDNA靶。
突變ssDNA靶K的鏈的序列(SEQ ID NO15)為5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAGCGA TGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。
探針B是15聚體dsDNA探針，除了沒有熒光素標(biāo)記外，與探針A相同，其被相應(yīng)地制備。探針B的一條鏈(即SEQ ID NO11)互補(bǔ)于靠近50聚體野生型ssDNA靶F中心的15個核苷酸區(qū)段。
各個雜交反應(yīng)混合物(40μl)含有下列成分0.4pmol靶ssDNA、4pmol dsDNA探針、0.5×TBE和100nM YOYO-1。反應(yīng)混合物室溫(21℃)下溫育5分鐘，無需預(yù)變性。樣品置于石英杯中，用具有波長488nm的氬離子激光束輻射，并對熒光發(fā)射進(jìn)行監(jiān)測。所有激光輻射的累積時間為80毫秒。最大熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在波長535nm處，這是YOYO-1嵌入的表征。圖5表示了對各個分析樣品以波長為函數(shù)作圖的熒光強(qiáng)度。
在靶ssDNA缺乏下，一些dsDNA探針之間的雜交在鏡像互補(bǔ)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)(圖5)。這種同源雙鏈DNA之間的結(jié)合公開在此前的例子中。只與YOYO-1溫育的ssDNA靶導(dǎo)致強(qiáng)度發(fā)射值降低，其少于只與YOYO-1溫育的dsDNA探針的強(qiáng)度發(fā)射值的一半(數(shù)據(jù)未顯示)。
在有100mM YOYO-1存在下，21℃溫育5分鐘后，ssDNA靶F與dsDNA探針B上的完全互補(bǔ)序列容易形成結(jié)合復(fù)合體，導(dǎo)致與只由dsDNA探針B所發(fā)射的比較熒光發(fā)射強(qiáng)度增加79％(圖5)。與之相反，含有多種一個堿基對錯配的不完全互補(bǔ)的ssDNA靶在這些反應(yīng)條件下是較不穩(wěn)定的，與只由dsDNA探針B所表現(xiàn)的比較，熒光強(qiáng)度僅產(chǎn)生19-31％的增加(圖5)。
在沒有預(yù)變性情況下，嵌入劑YOYO-1的存在足夠使得dsDNA探針和ssDNA靶之間的結(jié)合。結(jié)合發(fā)生在沃森—克里克堿基對親合力基礎(chǔ)之上，在完全互補(bǔ)的鏈之間具有可測定的、顯著更大量的結(jié)合。利用天然DNA，以探針和靶的比例10∶1，室溫下在僅僅溫育5分鐘之內(nèi)就發(fā)生了反應(yīng)。本實施例所用的ssDNA靶和dsDNA探針含有53％GC含量，并在任何DNA鏈上都不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸。利用dsDNA探針，本發(fā)明分析能夠鑒別完全互補(bǔ)的ssDNA序列以及那些含有錯配堿基的序列。
雖然在實質(zhì)程度上完全自我互補(bǔ)即同源鏈序列以及相互之間以鏡像互補(bǔ)方式即大溝與大溝結(jié)合的雙鏈體探針之間結(jié)合發(fā)生，本發(fā)明的分析仍起作用。
當(dāng)本發(fā)明已詳細(xì)描述以及參照其特定實施例，對本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的情形下可進(jìn)行各種變化和修飾將是明顯的。
序列表<110>英詹尼斯公司(INGENEUS CORPORATION)<120>四鏈體DNA和雙鏈體探針系統(tǒng)(QUADRUPLEX DNA SYSTEM AND DUPLEX PROBE SYSTEMS)<130>SCT030685-47<140>US 09/664,827<141>2000-09-19<160>15<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>1gagcaccatg acagacactg tcatctctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>2cagagtcatc gtaggacaca ccagagatga cagtgtctgt catggtgctc50<210>3<211>50<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>3gagcaccatg acagacactg tcgtctctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>4cagagtcatc gtaggacaca ccagagacga cagtgtctgt catggtgctc50<210>5<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>5gagcaccatg acagacactg tcttctctgg tgtgtcctac gatgactctg50<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)
<400>6cagagtcatc gtaggacaca ccagagaaga cagtgtctgt catggtgctc50<210>7<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>7gagcaccatg acagacactg tcatctttgg tgtgtcctac gatgactctg50<210>8<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>8cagagtcatc gtaggacaca ccaaagatga cagtgtctgt catggtgctc50<210>9<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>10<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>11ctgtcatctc tggtg 15<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>12caccagagat gacag 15<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>13gacagtagag accac 15<210>14<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>14gtggtctcta ctgtc 15<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>衍生自人囊性纖維化基因的外顯子10(derived from exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>15cagagtcatc gtaggacaca ccagcgatga cagtgtctgt catggtgctc50
權(quán)利要求
1.一種多鏈體結(jié)構(gòu)，其包括第一鏈，其含有核堿基第一序列；第二鏈，其含有核堿基第二序列，其中所述第二鏈與所述第一鏈通過沃森—克里克鍵合相連；第三鏈，其含有核堿基第三序列；以及第四鏈，其含有核堿基第四序列，其中所述第四鏈與所述第二鏈和所述第三鏈通過沃森—克里克鍵合相連。
2.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述多鏈體結(jié)構(gòu)是分離、純化、人工或合成的四鏈體。
3.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中各個所述鏈獨立地包含核酸或核酸類似物。
4.權(quán)利要求3所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中各個所述鏈獨立地包含DNA或RNA。
5.權(quán)利要求3所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中各個所述鏈獨立地包括含有不帶電荷或帶部分電荷的主鏈的核酸類似物。
6.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第二鏈或所述第四鏈中的一種包含DNA，而所述第二鏈或所述第四鏈中的另一種包含RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA或cDNA。
7.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第二鏈和第四鏈相互反平行。
8.權(quán)利要求7所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中將所述第一鏈和所述第二鏈的大溝放置于所述第三鏈和所述第四鏈的大溝中。
9.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第二鏈和所述第四鏈相互平行。
10.權(quán)利要求9所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中將所述第一鏈和所述第二鏈的大溝放置于所述第三鏈和所述第四鏈的小溝中。
11.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中各個核堿基與不超過2個的其他核堿基結(jié)合。
12.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中沒有一條鏈與另一條鏈相鄰。
13.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述多鏈體結(jié)構(gòu)基本上不含有Hoogsteen鍵合。
14.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述多鏈體結(jié)構(gòu)基本上不含有G-G四聯(lián)體。
15.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第一鏈和所述第二鏈的長度為5-50個堿基對。
16.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第三鏈和所述第四鏈為基因組DNA。
17.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第三鏈和所述第四鏈包括基因組DNA中的單元型。
18.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第三鏈和所述第四鏈為PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
19.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述多鏈體結(jié)構(gòu)不含有固相支持物。
20.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述多鏈體結(jié)構(gòu)與固相支持物結(jié)合。
21.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述固相支持物不是電傳導(dǎo)的。
22.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述固相支持物是電傳導(dǎo)的。
23.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其進(jìn)一步包括與所述第一鏈、所述第二鏈、所述第三鏈和所述第四鏈中的至少一種相結(jié)合的治療劑、預(yù)防劑或診斷劑。
24.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第一鏈和所述第二鏈的長度各為5-30個堿基以及所述第三鏈和所述第四鏈的長度各為8到3.3×109個堿基對。
25.權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)，其中所述第四序列含有任意順序的25％-75％的嘌呤堿基和75％-25％的嘧啶堿基。
26.一種提供權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括提供雜交介質(zhì)，其包含所述第一鏈、所述第二鏈、所述第三鏈、所述第四鏈、水、緩沖液和至少一種促進(jìn)劑；以及將所述雜交介質(zhì)溫育，溫育時間能有效使所述第二鏈與所述第四鏈雜交以提供所述多鏈體結(jié)構(gòu)。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述雜交介質(zhì)被緩沖至pH為約5到約9。
28.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑是嵌入劑。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑是嵌入熒光團(tuán)，以及含有所述多鏈體結(jié)構(gòu)的測試介質(zhì)的熒光強(qiáng)度與所述第二鏈對所述第四鏈的結(jié)合親合力正相關(guān)。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述嵌入熒光團(tuán)選自YOYO-1、TOTO-1、溴化乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2和吖啶。
31.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑被限制于所述第一鏈、所述第二鏈、所述第三鏈和所述第四鏈中的至少一種的范圍內(nèi)。
32.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑為單價陽離子。
33.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑為一價以上的陽離子。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述陽離子選自堿金屬陽離子、堿土金屬陽離子、過渡金屬陽離子、Co(NH3)6+3、三價亞精胺和四價精胺中的至少一種。
35.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述陽離子是以濃度50mM-125mM提供的K+或Na+。
36.權(quán)利要求26所述的方法，其中在所述第一鏈和所述第二鏈前將所述第三鏈和所述第四鏈提供在所述雜交介質(zhì)中，以及其中所述第一鏈和所述第二鏈在通過與所述雜交介質(zhì)接觸再水合前以去水化形式提供。
37.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述溫育時間不多于約2小時。
38.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述溫育在室溫下進(jìn)行。
39.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第二鏈與所述第四鏈的雜交以熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光或電信號的變化來進(jìn)行檢測。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述信號的強(qiáng)度與所述第二鏈和所述第四鏈之間的結(jié)合親合力相關(guān)。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述第一鏈和所述第二鏈中的至少一種用非嵌入熒光團(tuán)共價標(biāo)記，以及所述強(qiáng)度與所述結(jié)合親合力負(fù)相關(guān)。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述非嵌入熒光團(tuán)選自生物素、羅丹明和熒光素。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述方法是無需在所述靶序列或所述探針上提供信號猝滅劑所進(jìn)行的均一分析。
44.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第二鏈與所述第四鏈的雜交使與所述第三鏈和所述第四鏈中的至少一種相關(guān)的活性失活。
45.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一鏈和所述第二鏈中的至少一種進(jìn)一步包含藥劑，以及其中所述第二鏈與所述第四鏈的雜交將所述藥劑放置在所述第三鏈、所述第四鏈或與所述第三鏈和所述第四鏈中的至少一種相連的另一種分子上的靶的有效距離內(nèi)。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述藥劑選自設(shè)計成與臨床上相關(guān)基因的啟動子序列結(jié)合的核酸、設(shè)計成與臨床上相關(guān)基因結(jié)合的核酸或設(shè)計成與病原體復(fù)制位點的起點結(jié)合的核酸。
47.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一鏈和所述第二鏈與所述第三鏈和所述第四鏈的比例約為10∶1。
48.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一鏈、所述第二鏈、所述第三鏈和所述第四鏈的濃度各為不大于5×10-10M。
49.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種促進(jìn)劑為小溝核酸結(jié)合分子，其以非嵌入方式結(jié)合以及結(jié)合的締合常數(shù)為至少103M-1。
50.權(quán)利要求1所述的多鏈體，其中所述第一鏈與所述第三鏈通過沃森—克里克鍵合相連。
51.一種電路，其包括權(quán)利要求1所述的多鏈體結(jié)構(gòu)。
52.一種分析結(jié)合的方法，所述方法包括提供靶核酸或具有靶序列的核酸類似物，其中所述靶序列含有至少一個嘌呤堿基和至少一個嘧啶堿基；提供包含核酸序列或核酸類似物序列的雙鏈探針；提供雜交促進(jìn)劑；向介質(zhì)中加入所述探針、所述靶和所述雜交促進(jìn)劑以提供含有包括與所述靶序列結(jié)合的所述探針的沃森—克里克三鏈體或四鏈體的測試樣品；用激發(fā)輻射照射所述測試樣品以誘發(fā)測試樣品發(fā)射熒光輻射；檢測所述熒光輻射的強(qiáng)度，其中所述強(qiáng)度與所述探針和所述靶序列之間的結(jié)合親合力相關(guān)；以及從所述強(qiáng)度中確定所述探針和所述靶序列之間匹配的程度。
全文摘要
如核酸四鏈體的多鏈體結(jié)構(gòu)包括含有核堿基第一序列的第一鏈；含有核堿基第二序列的第二鏈，其中第二鏈與第一鏈通過沃森—克里克鍵合相連；含有核堿基第三序列的第三鏈；以及含有核堿基第四序列的第四鏈，其中第四鏈與第二鏈和第三鏈通過沃森—克里克鍵合相連。多鏈體結(jié)構(gòu)的形成受到單價陽離子(例如鈉和鉀)、二價陽離子、多價陽離子、嵌入劑和/或已知在核酸小溝內(nèi)結(jié)合的分子的促進(jìn)。多鏈體結(jié)構(gòu)及其形成方法具有診斷、治療、預(yù)防和納米工程的用途。
文檔編號G01N33/483GK1535318SQ01817230
公開日2004年10月6日 申請日期2001年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月19日
發(fā)明者亞斯曼·I·戴克斯, 格倫·H·埃里克森, H 埃里克森, 亞斯曼 I 戴克斯 申請人:英詹尼斯公司