專利名稱：檢測腫瘤細(xì)胞的存在及篩選抗腫瘤劑的方法
本申請要求Xuri LI等于2000年5月17日提請的未決的美國臨時(shí)專利申請60/204,748的優(yōu)先權(quán)。
哺乳動(dòng)物脈管系統(tǒng)的兩種主要組成成分是內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞形成哺乳動(dòng)物所有血管和淋巴管的內(nèi)表面。新血管的形成可通過兩種不同過程發(fā)生，血管發(fā)生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)(參見Risau，W.，自然386671-674(1997))。血管發(fā)生特征在于內(nèi)皮細(xì)胞前體原位分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞及這些細(xì)胞的相結(jié)合形成血管，如發(fā)生在早期胚胎初級血管叢的形成中。相反，血管生成，通過預(yù)先存在的脈管的生長及分支形成血管，在胚胎生長后期是重要的，且負(fù)責(zé)成體中發(fā)生的血管生長。血管生成是一種復(fù)雜生理過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖，胞外基質(zhì)降解，血管分支，及隨后的細(xì)胞粘附。在成體中，在正常環(huán)境下血管生成被緊密控制并限制在雌性生殖系統(tǒng)中。然而血管生成可在組織損傷的情況下激活。另外實(shí)體腫瘤也能誘導(dǎo)周圍組織中血管生成，因此維持腫瘤生長及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的形成(Folkman，J.，自然醫(yī)學(xué)127-31，(1995))。復(fù)雜的血管生成的分子機(jī)制還遠(yuǎn)未了解。
血管生成還參與許多病理情況，其在疾病的不同后遺癥中起作用或直接參與其中。一些血管生成例如包括與各種肝臟疾病相關(guān)的新血管生成，糖尿病的新血管生成后遺癥，高血壓的新血管生成后遺癥，外傷后的新血管生成，由于頭部外傷所致新血管生成，慢性肝臟感染(如慢性肝炎)中的新血管生成，由于燙傷或凍傷所致的新血管生成，與激素過量相關(guān)的功能異常，血管瘤的產(chǎn)生及血管成形術(shù)后的再狹窄。在關(guān)節(jié)炎中，新的毛細(xì)管侵襲關(guān)節(jié)并破壞關(guān)節(jié)軟骨。在糖尿病中，視網(wǎng)膜內(nèi)的新毛細(xì)管侵襲玻璃體，導(dǎo)致出血和失明(Folkman，J.和Shing，Y.，J.生物化學(xué)26710931-10934(1992))。血管生成因子在這些和其它疾病中的作用還未明確確定。
由于血管生成在如此多的生理和病理過程中的重要作用，參與控制血管生成的因子已經(jīng)深入研究。許多生長因子已示出可調(diào)節(jié)血管生成；這些因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)，和肝細(xì)胞生長因子(HGF)。見例如Folkman等，生物化學(xué)雜志26710931-10934(1992)所述。
已提示內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子的特殊家族—血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)，及其相應(yīng)的受體，主要負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的刺激，以及分化的細(xì)胞的一些功能。這些因子是PDGF/VEGF家族的成員，并呈現(xiàn)通過內(nèi)皮受體酪氨酸激酶(RTKs)起作用。生長因子的PDGF/VEGF家族屬于生長因子胱氨酸結(jié)超家族，該超家族還包括神經(jīng)營養(yǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長因子β。
在PDGF/VEGF家族中已鑒別8種不同的蛋白質(zhì)，有2種PDGF(A和B)，VEGF和5種與VEGF密切相關(guān)的成員。這5種與VEGF密切相關(guān)的成員是VEGF-B，見于Ludwig癌癥研究所和Helsinki大學(xué)的國際專利申請PCT/US96/02957(WO 96/26736)和美國專利5840693及5607918所述；VEGF-C或VEGF2，見于Joukov等，EMBO雜志15290-298(1996)，Lee等，美國科學(xué)院院報(bào)931988-1992，和人體基因組科學(xué)有限公司的美國專利5932540和5935540所述；VEGF-D，見于國際專利申請No.PCT/US97/14696(WO 98/07832)，和Achen等，美國科學(xué)院院報(bào)95548-553(1998)所述；胎盤生長因子(P1GF)，見于Maglione等，美國科學(xué)院院報(bào)889267-9271(1991)；和VEGF3，見于人體基因組科學(xué)有限公司的國際專利申請No.PCT/US95/07283(WO 96/39421)所述。每個(gè)VEGF家族成員與VEGF有30％-45％的氨基酸序列相同性。VEGF家族成員共同具有一個(gè)VEGF同源結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有形成胱氨酸—結(jié)基序的8個(gè)半胱氨酸殘基。在它們的活性生理狀態(tài)，所述蛋白質(zhì)是在八個(gè)半胱氨酸殘基通過二硫鍵(分子內(nèi)或分子間鍵)形成的二聚體。VEGF家族的功能特點(diǎn)包括改變內(nèi)皮細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞的促分裂原性，誘導(dǎo)血管通透性及血管生成和淋巴管生成性。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種同二聚體糖蛋白，其已從若干種來源分離出。VEGF在胚胎血管發(fā)生期間的新血管形成中及在成體生活期間的血管發(fā)生中具有重要的調(diào)節(jié)作用(Carmeliet等，自然380435-439，(1996)；Ferrara等，自然380439-442，(1996)；參見Ferrara和Davis-Smyth，內(nèi)分泌研究184-25，(1997))。VEGF發(fā)揮的作用的重要性已經(jīng)在研究中證實(shí)，研究顯示失活一個(gè)單VEGF等位基因?qū)е屡咛ニ劳觯@歸因子脈管不能發(fā)育(Carmeliet等，自然380435-439，(1996)；Ferrara等，自然380439-442，(1996))。VEGF的分離和性質(zhì)參見Ferrara等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志47211-218，(1991)和Connolly，細(xì)胞生物化學(xué)雜志47219-223，(1991)。
另外，VEGF對單核細(xì)胞具有強(qiáng)趨化性，可以在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)血纖維蛋白溶酶原激活劑和血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑，而且還可以誘導(dǎo)微血管通透性。由于后一活性，其有時(shí)也稱為血管通透性因子(VPF)。VEGF對某些造血細(xì)胞也具有趨化性。近來的文獻(xiàn)表明VEGF阻斷樹狀細(xì)胞成熟，并從而降低對腫瘤的免疫應(yīng)答的效力(許多腫瘤分泌VEGF)(Gabrilovich等，血液924150-4166，(1998)；Gabrilovich等，臨床癌癥研究52963-2970，(1999))。
血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-B)是一種非糖基化的，高堿性生長因子。VEGF-B具有相似于VEGF的血管發(fā)生和其它性質(zhì)，但其在組織中的分布和表達(dá)不同于VEGF。具體地，VEGF-B在心臟中強(qiáng)烈表達(dá)，而且在肺中只微弱表達(dá)，而VEGF正相反(Olofsson，B.等，美國科學(xué)院院報(bào)932576-2581(1996))。RT-PCR分析已經(jīng)證實(shí)VEGFB mRNA存在于黑素瘤，正常皮膚和肌肉中。這提示VEGF和VEGF-B盡管在許多組織中共同表達(dá)，但它們的功能可能不同?；蚨ㄏ蜓芯渴境鯲EGF-B缺乏會導(dǎo)致溫和的心臟病表型，并損傷冠狀動(dòng)脈(Bellomo等，心血管研究86E29-35(2000))。
人VEGF-B是使用酵母共雜交相互作用誘捕篩選方法分離的，通過篩選可以與I型細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白(CRABP-1)相互作用的細(xì)胞蛋白而分離。對人和小鼠VEGF-B包括核苷酸和氨基酸序列的分離和定性詳見于Ludwig癌癥研究所和赫爾辛基大學(xué)的PCT/US96/02957，美國專利5,840,693和5,607,918，及Olofsson等，美國科學(xué)院院報(bào)932576-2581(1996)所述。國際專利申請PCT/US97/14696(WO 98/07832)，美國專利No.5,840,693和美國專利5,607,918在此以其全文并入?yún)⒖肌?br> 小鼠和人的VEGF-B基因幾乎是相同的，且均跨越大約4kb的DNA。此基因由7個(gè)外顯子組成，且它們的外顯子—內(nèi)含子組構(gòu)類似于VEGF和P1GF基因(Grimmond等，基因組研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化學(xué)雜志27119310-19317(1996)Townson等，生物化學(xué)生物生理學(xué)研究綜述220922-928(1996))。
VEGF-C是從PC-3前列腺腺瘤細(xì)胞系(CRL1435)的條件培養(yǎng)基中分離的，通過篩選所述培養(yǎng)基產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)的酪氨酸磷酸化的能力進(jìn)行分離，使用轉(zhuǎn)染而表達(dá)VEGFR-3的細(xì)胞。VEGF-C是用重組VEGFR-3通過親和層析純化的，而且從PC-3 cDNA文庫中克隆到。其分離和定性詳見于Joukov等，EMBO雜志15290-298，(1996)。
VEGF-D是從商購自Clontech的人乳腺cDNA文庫中分離的，通過用得自稱為“Soares Breast 3NbHBst”的人cDNA文庫的一個(gè)表達(dá)序列標(biāo)記作雜交探針進(jìn)行篩選而分離到(Achen等，美國科學(xué)院院報(bào)95548-553，(1998))。其分離和定性詳見于國際專利申請PCT/US97/14696(WO98/07832)所述。在PCT/US97/14696中，也闡述了VEGF-D的生物活性片段的分離。這個(gè)片段由VEGF-D的第93-201位氨基酸殘基組成。
所述VEGF-D基因在成人中廣泛表達(dá)，但不是遍在表達(dá)的。VEGF-D在心臟，肺和骨骼肌中強(qiáng)烈表達(dá)。VEGF-D在脾，卵巢，小腸和結(jié)腸中中等水平表達(dá)，在腎，胰腺，胸腺，前列腺和睪丸中低水平表達(dá)。在來自腦，胎盤，肝或周圍血白細(xì)胞的RNA中檢測不到VEGF-D mRNA。
P1GF是從一個(gè)胎盤cDNA文庫中分離的。其分離和定性詳見于Maglione等，美國科學(xué)院院報(bào)889267-9271，(1991)所述。目前其生物學(xué)功能還不十分清楚。
VEGF3是從衍生自結(jié)腸組織的一個(gè)cDNA文庫中分離的。據(jù)信VEGF3與VEGF具有大約36％的相同性和大約66％相似性。分離編碼VEGF3的基因的方法還不清楚，而且未揭示其生物活性的鑒定。
兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相似性是通過將一個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和保守氨基酸取代與另一個(gè)蛋白質(zhì)的序列對比確定的，而相同性是不包括保守氨基酸取代而對比確定的。
如上所述，PDGF/VEGF家族成員主要通過結(jié)合受體酪氨酸激酶起作用。通常地，受體酪氨酸激酶是糖蛋白，其由能結(jié)合一種特異性生長因子的一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，通常是所述蛋白質(zhì)的α螺旋部分的一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，一個(gè)近膜結(jié)構(gòu)域(在此處所述受體可例如通過蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)節(jié))，作為所述受體的酶成分的一個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，及一個(gè)羧基末端尾部(其在許多受體中參與識別和結(jié)合酪氨酸激酶底物)組成。
已經(jīng)鑒別了五種內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶，屬于兩種獨(dú)特的亞類三種血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體，VEGFR-1(Flt-1)，VEGFR-2(KDR/Flk-1)，VEGFR-3(Flt4)，和兩種Tie家族受體，Tie和Tie-2(Tek)。這些受體的特異性和親和性不同。所有這些均具有固有的酪氨酸激酶活性，這是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。
已知結(jié)合VEGFs的最好的受體酪氨酸激酶是VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2與VEGF高親和性結(jié)合，VEGFR-1還結(jié)合P1GF。VEGF-B與VEGFR-1高親和性結(jié)合，但與VEGFR-2或-3不結(jié)合(Olofsson等，美國科學(xué)院院報(bào)9511709-11714(1998))。VEGF-C已經(jīng)示出是VEGFR-3的配體，而且其還激活VEGFR-2(Joukov等，EMBO雜志15290-298(1996))。VEGF-D結(jié)合VEGFR-2和VEGFR-3(Achen等，美國科學(xué)院院報(bào)95548-553(1998))。Tek/Tie-2的配體見于Regeneron藥品公司的國際專利申請PCT/US95/12935(WO 96/11269)所述。Tie的配體還未鑒別。
近來，已純化和克隆了一種新的130-135kDa的VEGF同種型特異性受體(Soker等，細(xì)胞92735-745(1998))。發(fā)現(xiàn)VEGF受體通過外顯子7編碼的序列特異地結(jié)合VEGF165，其示出與肝素的微弱親和性(Soker等，細(xì)胞92735-745(1998))。令人驚奇地，此受體示出與人neuropilin-1(NP-1)相同，NP-1是一種參與早期神經(jīng)形態(tài)發(fā)生中的一種受體。P1GF-2也呈現(xiàn)與NP-1相互作用(Migdal等，生物化學(xué)雜志27322272-22278(1998))。
VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3是通過內(nèi)皮細(xì)胞不同表達(dá)的。通常地，VEGFR-1和VEGFR-2均在血管內(nèi)皮中表達(dá)(Oelrichs等，癌基因811-18(1992)；Kaipainen等，實(shí)驗(yàn)方法雜志1782077-2088(1993)；Dumont等，Dev.Dyn.20380-92(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))，VEGFR-3主要在成體組織的淋巴內(nèi)皮中表達(dá)(Kaipainen等，美國科學(xué)院院報(bào)93566-3570(1995))。VEGFR-3還在腫瘤周圍的血管中表達(dá)。
盡管VEGFR-1在發(fā)育期間主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但在胚胎發(fā)生的早期階段也發(fā)現(xiàn)其在造血前體細(xì)胞中(Fong等，自然37666-70(1995))。在成體中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也表達(dá)此受體(Barleon等，血液873365-3343(1995))。在胚胎中，VEGFR-1由大多數(shù)血管表達(dá)(Breier等，Dev.Dyn.204228-239(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))。
自鑒別和定性VEGF以來，針對于血管發(fā)生因子的活性和新因子的闡述有許多重要發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)示出血管發(fā)生是正常發(fā)育和生理學(xué)所必需的。如胚胎發(fā)育，創(chuàng)傷修復(fù)，和黃體形成等過程，均包含血管發(fā)生和血管發(fā)生因子。例如在創(chuàng)傷修復(fù)期間，VEGF mRNA水平提高提示VEGF表達(dá)和修復(fù)過程之間的直接關(guān)系。同樣，VEGF調(diào)節(jié)中的失?？梢耘c創(chuàng)傷修復(fù)失調(diào)相關(guān)(Frank，S.，等生物化學(xué)雜志270512607-12613(1995))。
另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)涉及血管發(fā)生與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)。腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是血管發(fā)生依賴性過程(Folkman，J.和Shing，Y.，生物化學(xué)雜志26710931-10934(1992))。例如，當(dāng)將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物時(shí)，VEGF mRNA的表達(dá)模式表明在壞死的腫瘤生長區(qū)域外周的細(xì)胞中最高水平表達(dá)。在這些區(qū)域中鑒別了許多血管。VEGF在這些區(qū)域中的表達(dá)提示低氧血癥，一種氧化不足的狀態(tài)，引發(fā)壞死腫瘤中VEGF表達(dá)和釋放。VEGF-B的表達(dá)也與腫瘤生長直接關(guān)聯(lián)(見美國專利No.5,840,693)。VEGF-B表達(dá)在腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞中尤其是正調(diào)節(jié)的，在卵巢上皮腫瘤中也是這樣(Sowter等，實(shí)驗(yàn)室研究77607-14，(1997))。VEGF-B mRNA可以在在大多數(shù)研究的腫瘤細(xì)胞系中檢測到，包括腺癌，乳腺癌，淋巴瘤，鱗狀上皮細(xì)胞癌，黑素瘤，纖維肉瘤和許旺氏細(xì)胞瘤(Schwannoma)(Salven等，Am J Pathol.153103-8(1998))。
已經(jīng)示出VEGF/PDGF家族成員產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄物。已經(jīng)示出VEGF由于可變剪接而展示不同的轉(zhuǎn)錄物。人VEGF基因具有5種不同的mRNA種類(Neufeld等，F(xiàn)ASEB雜志139-22(1999))，產(chǎn)生分子量和生物學(xué)性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)(Carmeliet，P.，自然醫(yī)學(xué)6389-395(2000))。VEGF-A165同種型在大多數(shù)組織中是主要的轉(zhuǎn)錄物，產(chǎn)生除了結(jié)合VEGFR1和VEGFR2之外，與神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1)具有獨(dú)特親和性的一種多肽。VEGF121和VEGF189在正常組織中低水平表達(dá)。同種型特異性VEGF定向?qū)嶒?yàn)已經(jīng)示出VEGF164和VEGF188對心血管系統(tǒng)出生后的生長和正常功能的維持是更重要的，而VEGF120起動(dòng)和促進(jìn)脈管發(fā)生(Carmeliet等，自然醫(yī)學(xué)5495-502(1999))。VEGF206主要在胚胎組織中表達(dá)(Houck分子內(nèi)分泌學(xué)51806-14(1991))，而VEGF145只可見于腫瘤細(xì)胞系中(Poltorak等，生物化學(xué)雜志2727151-8(1997))。另外，在病理?xiàng)l件下VEGF還以同種型特異性方式調(diào)節(jié)。在肺和結(jié)腸癌中，VEGF165和VEGF121是正調(diào)節(jié)的，而VEGF189無變化，提示VEGF在惡性腫瘤中的同種型特異性作用(Cheung等，人體病理學(xué)29910-4(1998))。
胎盤生長因子(P1GF)具有3種不同的同種型，其以組織和發(fā)育特異性方式表達(dá)(Maglione等，致癌基因8925-31(1993)；Cao等生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊235493-8(1997))。
目前已識別通過mRNA的可變剪接產(chǎn)生的VEGF-B的兩種同種型(Grimmond等，基因組研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化學(xué)雜志27119310-19317(1996)；Townson等，生物化學(xué)生物生理學(xué)研究綜述220922-928(1996))。它們是167個(gè)氨基酸殘基的細(xì)胞結(jié)合形式(VEGF-B167)和186個(gè)氨基酸殘基的分泌形式(VEGF-B186)。這些同種型具有相同的115個(gè)氨基酸殘基的N末端結(jié)構(gòu)域，不包括信號序列，而C末端結(jié)構(gòu)域不同。通常N末端結(jié)構(gòu)域由外顯子1-5編碼。剩余的3個(gè)外顯子的不同用途產(chǎn)生兩種剪接同種型。通過使用外顯子6中的可變剪接受體位點(diǎn)，導(dǎo)入一個(gè)101bp的插入引起讀框移位，和VEGF-B167cDNA編碼區(qū)的終止。因此，這兩種VEGF-B同種型具有不同的C末端結(jié)構(gòu)域。
VEGF-B的兩種剪接同種型的不同C末端結(jié)構(gòu)域影響它們的生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)。VEGF-B167的C末端結(jié)構(gòu)域與VEGF中相應(yīng)區(qū)域在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，具有一些保守的半胱氨酸殘基和若干段堿性氨基酸殘基序列。因此，此結(jié)構(gòu)域是高度親水的和堿性的，且因此VEGF-B167在分泌時(shí)將保持細(xì)胞結(jié)合形式，除非生產(chǎn)細(xì)胞是用肝素或高鹽濃度處理的。結(jié)合VEGF-B167的細(xì)胞結(jié)合形式的分子可以是細(xì)胞表面或細(xì)胞外周硫酸肝素蛋白聚糖。此同種型的細(xì)胞結(jié)合形式通過其獨(dú)特的堿性C末端區(qū)發(fā)生。
VEGF-B186的C末端結(jié)構(gòu)域與數(shù)據(jù)庫中已知氨基酸序列無明顯相似性。VEGF-B186的C末端結(jié)構(gòu)域的疏水性與VEGF-B167的親水性和堿性C末端的性質(zhì)相反。這可通過觀測到VEGF-B186在分泌時(shí)不保持細(xì)胞結(jié)合形式而證實(shí)。近來的研究結(jié)果表明此同種型是經(jīng)蛋白酶解加工的，其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)(Olofsson等，美國科學(xué)院院報(bào)9511709-11714(1998))。
關(guān)于人和小鼠VEGF-B同種型的分離詳見于路德維格癌癥研究所和赫爾辛基大學(xué)的PCT/US96/02957，美國專利5840693和5607918及Olofsson等，美國科學(xué)院院報(bào)932576-2581(1996)所述。
VEGF-B的兩種同種型也與VEGF形成異源二聚體，與參與PDGF類蛋白的分子間和分子內(nèi)二硫鍵內(nèi)的8個(gè)半胱氨酸殘基的保守形式一致。另外，VEGF-B和VEGF在許多組織中的共表達(dá)提示，VEGF-B-VEGF異源二聚體是天然發(fā)生的。VEGF-B167-VEGF異源二聚體保持細(xì)胞結(jié)合形式。相反，VEGF-B186和VEGF異源二聚體在培養(yǎng)基中自由地從細(xì)胞中分泌。VEGF還與P1GF形成異源二聚體(DiSalvo等，生物化學(xué)雜志2707717-7723(1995))。生長因子此家族的成員之間異源二聚體復(fù)合物的生成可提供血管生成或調(diào)節(jié)分子的多樣性排列的基礎(chǔ)。
在先前關(guān)于VEGF-B表達(dá)調(diào)節(jié)的研究中，所述兩個(gè)同種型未進(jìn)行單獨(dú)研究。在通過RT-PCR進(jìn)行分別研究的情況中，未準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)錄水平。先前的數(shù)據(jù)已經(jīng)示出VEGF-B在不同腫瘤和細(xì)胞系中高水平表達(dá)(Sowter等，實(shí)驗(yàn)室研究77607-14，(1997)；Salven等，Am JPathol.153103-8(1998)；and Enholm等，致癌基因14247583(1997))。然而，大多數(shù)研究是基于免疫組織化學(xué)進(jìn)行的，不能區(qū)分所述兩個(gè)同種型。因此，VEGF-B167和VEGF-B186的表達(dá)模式和調(diào)節(jié)仍不清楚。關(guān)于VEGF-B167和VEGF-B186的表達(dá)模式和調(diào)節(jié)的研究，對進(jìn)一步了解VEGF-B在生理和病理?xiàng)l件下所起的作用是特別重要的。
在本文所提及的所有參考文獻(xiàn)均并入?yún)⒖肌?br> 本發(fā)明一方面提供了檢測懷疑患有腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的一種方法。所述方法包括從所述動(dòng)物體獲得一種樣品；并檢測來自所述樣品的VEGF-B186的表達(dá)，由此檢測到VEGF-B186表達(dá)則表示存在腫瘤細(xì)胞。
或者，所述方法包括從所述動(dòng)物體獲得一種樣品；測定來自所述樣品的VEGF-B186表達(dá)水平；并將得自所述樣品的表達(dá)水平與由這種特定樣品正常表達(dá)的VEGF-B186表達(dá)水平相對比，從而測定到VEGF-B186的表達(dá)水平提高超過正常表達(dá)水平則表示存在腫瘤細(xì)胞。
所述樣品可以是血漿，血清或組織樣品。
VEGF-B186可以使用免疫分析檢測，例如放射免疫分析或酶聯(lián)免疫吸附測定，及使用一種經(jīng)可檢測標(biāo)記而標(biāo)記的VEGF-B186的單克隆抗體。這些分析可包括使用可溶的或固定的VEGFR-1和/或特異性抗體。所述抗體可以是偶聯(lián)于適當(dāng)?shù)某判?，順磁性，電子致密的，生態(tài)的或放射活性的或非放射活性的制劑以顯影。放射性制劑/標(biāo)記例如包括一種放射性原子或基團(tuán)，如125I或32P。非放射性制劑/標(biāo)記例如包括酶標(biāo)記，如辣根過氧化物酶，或熒光標(biāo)記如5-異硫氰酸熒光素(FITC)?？梢灾苯踊蜷g接，共價(jià)或非共價(jià)進(jìn)行標(biāo)記。
VEGF-B186的表達(dá)水平可以通過如RNASE保護(hù)分析這樣的方法測定。
應(yīng)知的是，來自一種特定樣品的表達(dá)水平與由該樣品正常表達(dá)的VEGF-B186的表達(dá)水平的對比意味著具有正常表達(dá)水平的所述樣品是與得自懷疑患有腫瘤的動(dòng)物樣品相同類型(例如肺組織)和相同物種(例如人)的樣品。
本發(fā)明另一方面提供了一種檢測動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的試劑盒。所述試劑盒包含一個(gè)適于接受樣品的容器；和一種檢測來自樣品的VEGF-□□□□的表達(dá)的手段，由此檢測到VEGF-B186表達(dá)則表示腫瘤的生長。
或者，所述試劑盒包含一個(gè)適于接受樣品的容器；一種測定來自所述樣品的VEGF-B186的表達(dá)水平的手段；和一種測定來自這個(gè)特定樣品的VEGF-B186的正常表達(dá)水平的手段，由此測定到VEGF-B186表達(dá)水平高過正常表達(dá)水平則表示腫瘤生長。
所述檢測手段優(yōu)選是如上所述用可檢測標(biāo)記標(biāo)記的一種針對VEGF-B186的單克隆抗體。
應(yīng)理解的是，術(shù)語“來自這個(gè)特定樣品的VEGF-B186的正常表達(dá)水平”，意味著所述表達(dá)水平是從與得自懷疑患有腫瘤的動(dòng)物的樣品相同類型(例如肺組織)和相同物種(例如人)的、但在所述特定樣品中沒有腫瘤生長的樣品中測定的。
所述測定手段可以是任何方法如RNASE保護(hù)分析，其可以用于測定一種特定多肽的表達(dá)水平，或者其可以是一個(gè)提供如上所述來自這個(gè)“特定”樣品的VEGF-B186的正常表達(dá)水平的圖表或列表。
本發(fā)明再一方面是提供了一種篩選抗腫瘤劑的方法。這個(gè)方法包括將一種測試劑應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞；并通過任何適當(dāng)手段檢測VEGF-B186在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平的降低。


圖1是用于RNASE保護(hù)分析中的小鼠VEGF-B的兩個(gè)同種型的RNA探針的圖示。
圖2示出使用30μg總細(xì)胞RNA測定兩個(gè)小鼠VEGF-B同種型的分布和表達(dá)水平的RNASE保護(hù)分析的結(jié)果。
圖3提供了分別使用30μg和100μg總細(xì)胞RNA測定的來自各種組織的小鼠VEGF-B167和VEGF-B186的表達(dá)水平，以及各種組織的VEGF-B186與VEGF-B167表達(dá)水平比率的列表。
圖4示出使用從不同發(fā)育階段的胚胎和其它胚胎組織中提取的30μg總細(xì)胞RNA，測定兩個(gè)小鼠VEGF-B同種型的表達(dá)水平的RNASE保護(hù)分析結(jié)果。
圖5示出使用100μg總細(xì)胞RNA測定兩個(gè)小鼠VEGF-B同種型的分布和表達(dá)水平的RNASE保護(hù)分析結(jié)果。
圖6示出使用30μg總細(xì)胞RNA測定兩個(gè)小鼠VEGF-B同種型在小鼠腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平的RNASE保護(hù)分析結(jié)果。
圖7示出使用30μg總細(xì)胞RNA測定兩個(gè)人VEGF-B同種型在人體腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平的RNASE保護(hù)分析結(jié)果。
圖8是用于RNASE保護(hù)分析中的人VEGF同種型的RNA探針的圖示。
圖9示出測定兩個(gè)人VEGF-B同種型和VEGF-A同種型在人良性和惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中表達(dá)水平的RNASE保護(hù)分析結(jié)果。
圖10示出VEGF-B167和VEGF-B186特異性抗體與其各自的同種型的結(jié)合。
圖11A-11F示出為證實(shí)在B16小鼠黑素瘤細(xì)胞中VEGF-B的蛋白質(zhì)合成而進(jìn)行的mVEGF-B和鈣聯(lián)蛋白的間接免疫熒光顯微鏡檢結(jié)果。
使用RNASE保護(hù)分析(RPA，Ambion)對不同基因在不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行定量。簡而言之，將30μg總細(xì)胞RNA在45℃與所述核糖探針雜交，隨后進(jìn)行RNASE消化。所述總細(xì)胞RNA是使用硫氰酸胍/酸苯酚方法制備的，如Chomczynski和Sacchi，分析生物化學(xué)162156-9(1987)所述，并貯存于-80℃。將消化的產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠上分離，并將所述信號通過磷光計(jì)定量。如圖2所示，RNASE保護(hù)分析示出當(dāng)使用30μg總細(xì)胞RNA時(shí)，只有VEGF-B167同種型可檢測到，這通過存在210和70bp片段而沒有衍生自VEGF-B186的預(yù)期的386bp片段示出。這表明所述VEGF-B167同種型是高度表達(dá)的，而VEGF-B186同種型以非常低水平表達(dá)的。通過磷光計(jì)使用β-肌動(dòng)蛋白(Ambion)作為內(nèi)在對照，定量VEGF-B167的轉(zhuǎn)錄水平。
使用30μg總細(xì)胞RNA測定來自各種組織的VEGF-B167的表達(dá)水平的列表示于圖3。在正常成年小鼠的心臟，骨骼肌和隔組織中見到最高表達(dá)水平，在大多數(shù)其它組織中見到較低水平表達(dá)。所有所述數(shù)值均是根據(jù)內(nèi)在對照(β-肌動(dòng)蛋白)規(guī)化的任意值。
為核實(shí)VEGF-B的表達(dá)模式是否是發(fā)育特異性的，使用從不同發(fā)育階段的胚胎和其它胚胎組織中提取的RNA進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。圖4示出VEGF-B167同種型也是這些組織中的主要轉(zhuǎn)錄物。VEGF-B167是在胚胎和其它組織中表達(dá)的主要同種型，這是通過存在所述210和70bp片段及不存在所述380bp片段表明的。在這個(gè)分析中使用30μg總細(xì)胞RNA。將收集的正常小鼠成體和胚胎組織均進(jìn)行速凍，并貯存在-80℃直至使用。
實(shí)施例2VEGF-B186以組織特異性方式低水平表達(dá)由于使用30μg總細(xì)胞RNA檢測不到VEGF-B186表達(dá)，使用100μgRNA，使用相同探針如實(shí)施例1所述相同方式進(jìn)行RPA分析，以研究VEGF-B186在成體小鼠組織中的表達(dá)。圖5示出當(dāng)使用100μgRNA時(shí)，在一些測試的組織中可微弱檢測到衍生自VEGF-B186的一個(gè)380bp片段。將所述380bp片段通過磷光計(jì)定量，使用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)在對照。VEGF-B186表達(dá)結(jié)果也示于圖3。VEGF-B186在心臟，骨骼肌，膈，結(jié)腸，腎，腦和肺中表達(dá)，在其它組織中檢測不到。應(yīng)注意VEGF-B167同種型在大多數(shù)測試組織中表達(dá)，而VEGF-B186只存在于有限的幾種組織中。因此，VEGF-B186同種型在成體小鼠組織中以組織特異性方式低水平表達(dá)。這些結(jié)果表明VEGF-B的兩個(gè)同種型具有不同的遺傳調(diào)節(jié)作用，而且可能具有不同的生物功能。VEGF-B的兩個(gè)同種型的所述遺傳調(diào)節(jié)作用是組織特異性方式的，而不是發(fā)育特異性的。
為對比所述兩個(gè)同種型的相對表達(dá)水平，通過對比380bp和210bp條帶的密度產(chǎn)生VEGF-B186/VEGF-B167比值。這種對比結(jié)果示于圖3。數(shù)據(jù)示出在心臟，腎和結(jié)腸中見到最高比值，為大約25％。然而，考慮到所述兩個(gè)保護(hù)片段的長度不同，與摻入的放射性成比例，因此在最高表達(dá)組織中VEGF-B186的表達(dá)水平是VEGF-B167的大約14％，在其它器官中更低。
實(shí)施例3VEGF-B186在小鼠腫瘤細(xì)胞系中是正調(diào)節(jié)的為研究VEGF-B的兩個(gè)同種型在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)模式，將提取自不同小鼠腫瘤細(xì)胞系的總細(xì)胞RNA(均30μg)用于這項(xiàng)研究，所述細(xì)胞系包括纖維肉瘤(T241)，黑素瘤(B16)，Lewis肺癌(LLC)和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤(BT4C)。以實(shí)施例1相同方式進(jìn)行RPA分析。令人驚奇地，VEGF-B186同種型在所有測試的細(xì)胞系中均高水平表達(dá)，表明VEGF-B186同種型的正調(diào)節(jié)(見圖6)。使用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)在對照以進(jìn)行定量。VEGF-B186/VEGF-B167的相對比值高于50％，比在正常組織中觀測到的那些比值高許多。
實(shí)施例4VEGF-B186在人黑素瘤細(xì)胞系中高水平表達(dá)為著眼于VEGF-B的兩個(gè)同種型在人體腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，通過SacI消化產(chǎn)生一個(gè)大約450bp的人VEGF-B(U52819)cDNA片段。將這個(gè)片段克隆并用作模板使用如實(shí)施例1所述策略產(chǎn)生RNASE保護(hù)分析中的RNA探針。使用30μg總細(xì)胞RNA研究22個(gè)不同的人黑素瘤細(xì)胞系。使用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)在對照以進(jìn)行定量。圖7的上組示出在大多數(shù)測試的細(xì)胞系中，VEGF-B186和VEGF-B167均高水平表達(dá)，平均186/167比值為42％(見圖7的對比表)。通過組合這兩個(gè)同種型并根據(jù)內(nèi)在對照(GAPDH)標(biāo)準(zhǔn)化，對總VEGF-B表達(dá)水平進(jìn)行定量。VEGF-B的兩個(gè)同種型均存在于所有所述細(xì)胞系中，在樣品3，6，10和22中表達(dá)水平較高。作為對比，使用一個(gè)大約650bp的人VEGF165同種型(X62568)的cDNA片段研究VEGF-A表達(dá)水平。將此片段克隆并用作模板以產(chǎn)生RNA探針。如圖8所示，VEGF-A165同種型產(chǎn)生兩個(gè)保護(hù)條帶，即充分保護(hù)的VEGF-A165同種型，和來自其它同種型的外顯子1-5區(qū)域。圖8中方框是VEGF-A的各個(gè)外顯子。如圖7下組所示，VEGF-A在所有所述細(xì)胞系中均表達(dá)，具有差別很大的各種轉(zhuǎn)錄水平，這與VEGF-B相反，后者是相對穩(wěn)定的。
VEGF-A在樣品5，7，11，16和20中高水平表達(dá)，在這些樣品中VEGF-B表達(dá)水平低于平均值(見圖7的對比表)。VEGF-A和VEGF-B的這種相反的表達(dá)模式可以表明彼此的潛在互補(bǔ)作用。
實(shí)施例5VEGF-B和VEGF-A在人良性和惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中的表達(dá)在人良性和惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中研究VEGF-B和VEGF-A的同種型特異性表達(dá)，使用如實(shí)施例1和4所述相同方法。圖9上組示出VEGF-B186在良性和惡性腫瘤中均以相似水平或高水平表達(dá)，平均VEGF-B186/VEGF-B167比值為大約49％(見圖9的對比表)。在良性和惡性樣品中，總VEGF-B表達(dá)水平相似，這可表明在惡性腫瘤發(fā)生期間VEGF-B186的先決作用。圖9的下組示出VEGF-A在這兩組中以相似水平表達(dá)。
實(shí)施例6VEGF-B蛋白的兩個(gè)同種型均在B16黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)為證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中VEGF-B的蛋白質(zhì)合成，對B16小鼠黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光顯微鏡檢。將B16小鼠黑素瘤細(xì)胞種植于無菌蓋玻片上的6孔平皿中，密度為100,000個(gè)細(xì)胞/孔，一天后進(jìn)行間接免疫熒光顯微鏡檢。如Andersson等，病毒學(xué)雜志714717-27(1997)所述，進(jìn)行VEGF-B定位。使用抗VEGF-B167和VEGF-B186的不同C末端的同種型特異性抗體。將VEGF-B167和VEGF-B186特異性抗體稀釋為20mg/ml濃度，同時(shí)使用1∶50稀釋度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)特異性標(biāo)記鈣聯(lián)蛋白(Santa Cruz Biotechnology)。使用異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的抗兔IgG抗體觀測所述兔Ig，可見到綠色染色。使用四甲基異硫氰酸(TRITC)-綴合的抗山羊IgG抗體觀測所述山羊Ig，可見到紅色染色。使用Zeiss Axiophot熒光顯微鏡檢測免疫熒光。
如下產(chǎn)生VEGF-B167和VEGF-B186特異性抗體。產(chǎn)生分別編碼VEGF-B167和VEGF-B186的C末端的外顯子6B或外顯子6A-B的PCR片段。針對VEGF-B167，使用有義引物5′ACGTAGATCTAGCCCCAGGATCCTC(SEQ ID NO1)和反義引物5′ACGTGAATTCTCAGCCCCGCCCTTGGCA(SEQ ID NO2)。針對VEGF-B186，使用有義引物5′ACGTAGATCTAGGGTTGCCATACCC(SEQ ID NO3)和反義引物5′ACGTGAATTCTCAGTTGACGGCGCTGGGT(SEQ ID NO4)。所述有義引物包括一個(gè)BglII限制位點(diǎn)，反義引物具有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)以用于克隆。將所述片段克隆入載體pGEX-2T(Pharmacia)中。GST融合蛋白是根據(jù)廠商指導(dǎo)(Pharmacia)制備的。將純化的蛋白質(zhì)用于免疫接種兔，如Aase等，Dev Dyn.，21512-25(1999)所述。VEGF-B167抗體是抗GST融合蛋白親和純化的，VEGF-B186抗體是抗桿狀病毒衍生的蛋白親和純化的。通過免疫印跡測試親和純化的VEGF-B抗體的特異性，使用通過桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞產(chǎn)生的并通過12.5％SDS-PAGE分離的還原的VEGF-B167和VEGF-B186蛋白質(zhì)進(jìn)行測試，如Aase等，Dev Dyn.，21512-25(1999)所述。圖10示出VEGF-B167和VEGF-B186特異性抗體只與其各自的同種型反應(yīng)。
圖11A-11F示出mVEGF-B和鈣聯(lián)蛋白雙免疫熒光染色的間接免疫熒光顯微鏡檢的結(jié)果。圖11A和11D示出在B16細(xì)胞中這兩種同種型的強(qiáng)染色。圖11b和11E示出ER特異性標(biāo)記鈣聯(lián)蛋白的染色。圖11C和11F示出用鈣聯(lián)蛋白共同定位的VEGF-B的表達(dá)。因此，這表明VEGF-B蛋白的兩個(gè)同種型均在B16黑素瘤細(xì)胞細(xì)胞中表達(dá)。
總之，考慮到VEGF-B167在正常組織中高水平表達(dá)及VEGF-B186同種型在腫瘤細(xì)胞系中的正調(diào)節(jié)，這些結(jié)果表明在腫瘤細(xì)胞系中VEGF-B167的維持作用和VEGF-B186潛在生長促進(jìn)作用。
以上的描述和實(shí)施例只是例證了本發(fā)明而無限制之意。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)內(nèi)可對所揭示的實(shí)施方案加以修改，因此本發(fā)明應(yīng)包括在所附權(quán)利要求及其等價(jià)物范圍內(nèi)的各種變化。
序列表<110>路德維格癌癥研究所<120>檢測腫瘤細(xì)胞的存在及篩選抗腫瘤劑的方法<130>1064/48885PC<150>US 60/204,748<151>2000-05-17<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>25<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>1acgtagatct agccccagga tcctc 25<210>2<211>28<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>2acgtgaattc tcagccccgc ccttggca 28<210>3<211>25<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>3acgtagatct agggttgcca taccc 25<210>4<211>29<212>DNA<213>Murinae gen.sp.<400>4acgtgaattc tcagttgacg gcgctgggt 29
權(quán)利要求
1.一種檢測懷疑患有腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的方法，包括以下步驟從所述動(dòng)物中獲得樣品；檢測來自所述樣品的VEGF-B186的表達(dá)，其中檢測到VEGF-B186表達(dá)是存在腫瘤細(xì)胞的指征。
2.一種檢測懷疑患有腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的方法，包括以下步驟從所述動(dòng)物中獲得樣品；測定所述樣品中VEGF-B186的表達(dá)水平；測定來自未懷疑患有腫瘤的動(dòng)物的等價(jià)樣品中VEGF-B186的對照表達(dá)水平；以及將所述測定的表達(dá)水平與對照表達(dá)水平相對比，其中確定VEGF-B186表達(dá)水超過對照表達(dá)水平則表示存在腫瘤細(xì)胞。
3.一種檢測懷疑患有腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的方法，包括以下步驟從所述動(dòng)物中獲得樣品；測定所述樣品中VEGF-B186的表達(dá)水平；測定所述樣品中VEGF-B167的表達(dá)水平；以及將所述的VEGF-B186的表達(dá)水平與所述的VEGF-B167的表達(dá)水平相對比，其中對比表明VEGF-B186與VEGF-B167的相對比率高于或等于28％則表示存在腫瘤細(xì)胞。
4.一種檢測懷疑患有腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的方法，包括以下步驟從所述動(dòng)物中獲得樣品；測定所述樣品中VEGF-B186的表達(dá)水平；測定所述樣品中VEGF-B167的表達(dá)水平；以及將所述的VEGF-B186的表達(dá)水平與所述的VEGF-B167的表達(dá)水平相對比，其中對比表明VEGF-B186與VEGF-B167的相對比率高于或等于50％則表示存在腫瘤細(xì)胞。
5.一種檢測動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的試劑盒，其包含一種適于接受樣品的容器；和一種用于檢測所述樣品中VEGF-B186的表達(dá)的手段，由此檢測到VEGF-B186表達(dá)則表示存在腫瘤細(xì)胞。
6.一種檢測動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在情況的試劑盒，其包含一種適于接受樣品的容器；一種用于檢測樣品中VEGF-B186的表達(dá)的手段；和一種用于將所述VEGF-B186表達(dá)水平與在無腫瘤動(dòng)物中VEGF-B186的對照水平相對比的手段，其中測定到VEGF-B186表達(dá)水平高過對照表達(dá)水平則表示存在腫瘤細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物是人。
9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。
10.一種篩選抗腫瘤劑的方法，包括將一種測試劑應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞；以及通過任何適當(dāng)手段檢測VEGF-B186在所述腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)的降低。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過檢測VEGF－B
文檔編號G01N33/50GK1441849SQ01812531
公開日2003年9月10日 申請日期2001年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月17日
發(fā)明者李旭日, 卡琳·奧瑟, 烏爾夫·埃里克松 申請人:路德維格癌癥研究所