專利名稱：細(xì)胞外記錄電極的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于細(xì)胞外記錄的多電極，其在電生理學(xué)領(lǐng)域中是非常有用的，并用來(lái)測(cè)試與神經(jīng)細(xì)胞的活性有關(guān)的電位的變化。
背景技術(shù)：
近來(lái)，已經(jīng)努力進(jìn)行了神經(jīng)細(xì)胞對(duì)電子設(shè)備的可應(yīng)用性研究，以及醫(yī)學(xué)上的研究。在活動(dòng)狀態(tài)下的神經(jīng)細(xì)胞中產(chǎn)生一個(gè)活動(dòng)電位。神經(jīng)細(xì)胞的離子滲透性的變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的變化，這就是活動(dòng)電位產(chǎn)生的原因。因此，如果測(cè)量神經(jīng)細(xì)胞周圍與離子濃度變化有關(guān)的電位變化，可以監(jiān)測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的活性。
通常通過(guò)借助于顯微操作設(shè)備等在細(xì)胞周圍放置用于測(cè)量細(xì)胞外電位的玻璃或金屬(例如鉑)電極，來(lái)進(jìn)行上述利用細(xì)胞活性的電位測(cè)量。也可以將類似的電極插入細(xì)胞以便測(cè)量細(xì)胞的電活性。這些傳統(tǒng)的技術(shù)具有下列缺點(diǎn)需要電極準(zhǔn)備方面的技能；電極具有高阻抗，因此信號(hào)易受外部噪聲的影響；如果將電極插入細(xì)胞，會(huì)傷害細(xì)胞或組織。因此，傳統(tǒng)的電極不適于長(zhǎng)期監(jiān)視。
為了避免這種問題，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了多電極，所述多電極包含在絕緣襯底上提供的、由導(dǎo)電材料制成的多個(gè)微電極和可以在其上培養(yǎng)細(xì)胞或組織的引線圖形(日本特開No.6-78889和日本特開No.6-296595)。利用此多電極，可以在不傷害細(xì)胞或組織的情況下長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的活性。
在上述多電極中，利用電解方法將多孔鉑黑鍍覆到接觸細(xì)胞的電極的最上表面(日本特開No.6-78889)，或利用淀積方法將金鍍覆到上述表面(日本特開No.6-296595)。在鉑黑鍍覆的情況下，盡管易于將電極的阻抗調(diào)整到一個(gè)實(shí)用的水平，即大約50kΩ或更低，但電極的強(qiáng)度低，因此電極的可循環(huán)使用性低。在通過(guò)淀積形成金的情況下，強(qiáng)度提高了，但難以將阻抗減小到大約50kΩ或更低。
本發(fā)明的公開本發(fā)明要解決上述問題。本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞外記錄電極，具有適于記錄細(xì)胞電信號(hào)的阻抗頻率特性，此細(xì)胞外記錄電極具有低水平的阻抗、對(duì)外界噪聲的抗干擾性、高強(qiáng)度并且易于循環(huán)使用電極。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞外電極的制造中，用于在其最上表面上形成導(dǎo)電材料的電流密度被優(yōu)化，從而得到粗糙的多孔導(dǎo)電材料表面，因此具有增大的表面積，并且對(duì)于細(xì)胞外記錄電極來(lái)說(shuō)，多孔導(dǎo)電材料具有更優(yōu)的特性。本發(fā)明正是基于上述發(fā)現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供了一種用于測(cè)量細(xì)胞的電生理學(xué)特性的多電極。此電極包含襯底上提供的多個(gè)微電極和用于向微電極提供電信號(hào)或從微電極引出電信號(hào)的布線部分。微電極的表面上具有多孔導(dǎo)電材料，此導(dǎo)電材料選自金、氮化鈦、氧化銀和鎢，并且每個(gè)微電極的阻抗為50kΩ或更低。
最好，多孔導(dǎo)電材料是金，并且通過(guò)在1.0-5.0A/dm2的電流密度下導(dǎo)通電流10-360秒來(lái)提供。
本發(fā)明還提供了用于測(cè)量細(xì)胞的電生理學(xué)特性的多電極。此電極包含襯底上提供的多個(gè)微電極和用于給微電極提供電信號(hào)或從微電極引出電信號(hào)的布線部分。根據(jù)具有基本上與微電極相同的阻抗的等效電路的靜電容量而計(jì)算出的微電極的表面積大于或等于微電極的突出面積的至少10倍而小于200倍，，并且每個(gè)微電極的阻抗為50kΩ或更低。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“微電極的突出面積”指的是提供導(dǎo)電材料之前，微電極的最上表面的整個(gè)面積。
最好，利用氣體吸收法測(cè)量出的微電極的表面積小于或等于微電極的突出面積的5×105倍。
在此發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，以矩陣的形式在襯底上排列微電極。布線部分包含與微電極連接的引線和與引線的端部連接的電節(jié)點(diǎn)，并且至少用絕緣層覆蓋引線的表面。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可以通過(guò)蝕刻例如RIE(反應(yīng)離子蝕刻)和ICPRIE(感應(yīng)耦合等離子RIE)來(lái)提供多孔導(dǎo)電材料。
本發(fā)明還提供了一種包含上述多電極的一體化的細(xì)胞支座(installer)。此一體化的細(xì)胞支座具有用于在多電極的襯底上放置細(xì)胞或組織的細(xì)胞安置區(qū)。
本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞電位測(cè)量裝置，包含上述一體化的細(xì)胞支座、一個(gè)與微電極連接并用于處理由細(xì)胞或組織的電生理學(xué)活性而引起的輸出信號(hào)的輸出信號(hào)處理器和一個(gè)用于有選擇地向細(xì)胞或組織提供電激勵(lì)的激勵(lì)信號(hào)供應(yīng)器。
本發(fā)明還提供了細(xì)胞電位測(cè)量系統(tǒng)，包括上述細(xì)胞電位測(cè)量裝置、用于光學(xué)監(jiān)視細(xì)胞或組織的光學(xué)監(jiān)視裝置和/或用于控制細(xì)胞或組織的培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1a是放大2500倍的顯微照片，顯示了在比較例中在1.0A/dm2的電流密度下通過(guò)電解形成在微電極表面上的金鍍層，圖中的比例尺為50μm。
圖1b是顯微照片，顯示了根據(jù)本發(fā)明在1.5A/dm2的電流密度下通過(guò)電解形成在微電極表面上的金鍍層，圖中的比例尺為50μm。
圖1c是顯微照片，顯示了根據(jù)本發(fā)明在2.0A/dm2的電流密度下通過(guò)電解形成在微電極表面上的金鍍層，圖中的比例尺為50μm。
圖2a顯示了比較例中相對(duì)于恒定的電流激勵(lì)，金鍍覆微電極上的細(xì)胞的64個(gè)通道的電位變化響應(yīng)的計(jì)算機(jī)屏幕打印輸出圖，所述金鍍覆微電極是在1.0A/dm2的電流密度下通過(guò)電解得到的。一個(gè)激勵(lì)信號(hào)被施加給通道29。
圖2b顯示了在不存在細(xì)胞的情況下，圖2a所示的金鍍覆微電極的64個(gè)通道的噪聲水平的計(jì)算機(jī)屏幕的打印輸出圖。
圖2c顯示了根據(jù)本發(fā)明，相對(duì)于恒定的電流激勵(lì)，在金鍍覆微電極上的細(xì)胞的64個(gè)通道的電位變化響應(yīng)的計(jì)算機(jī)屏幕的打印輸出圖，所述金鍍覆微電極是在1.5A/dm2的電流密度下通過(guò)電解得到的。
圖2d顯示了在不存在細(xì)胞的情況下，圖2c所示的金鍍覆微電極的64個(gè)通道的噪聲水平的計(jì)算機(jī)屏幕的打印輸出圖。
圖2e顯示了根據(jù)本發(fā)明，相對(duì)于恒定的電流激勵(lì)，在金鍍覆微電極上的細(xì)胞的64個(gè)通道的電位變化響應(yīng)的計(jì)算機(jī)屏幕的打印輸出圖，所述金鍍覆微電極是在2.0A/dm2的電流密度下通過(guò)電解得到的。
圖2f顯示了在不存在細(xì)胞的情況下，圖2e所示的金鍍覆微電極的64個(gè)通道的噪聲水平的計(jì)算機(jī)屏幕的打印輸出圖。
圖3顯示了本發(fā)明的微電極的阻抗特性圖。
圖4a顯示了本發(fā)明的微電極的等效電路圖。
圖4b顯示了本發(fā)明的微電極的等效電路圖。
圖5顯示了本發(fā)明的微電極的等效電路的阻抗特性圖。
圖6顯示了本發(fā)明的微電極的等效電路的阻抗特性圖。
圖7顯示了比較例的微電極的阻抗特性圖。
圖8顯示了比較例的微電極的等效電路的阻抗特性圖。
圖9顯示了比較例的微電極的阻抗特性圖。
圖10顯示了比較例的微電極的等效電路的阻抗特性圖。
圖11顯示了在重復(fù)使用性方面，本發(fā)明的電解金鍍覆微電極與傳統(tǒng)產(chǎn)品相比較的壽命測(cè)試結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
(用于微電極的多孔導(dǎo)電材料的制備)根據(jù)本發(fā)明用于細(xì)胞外記錄的多電極包含設(shè)置在絕緣襯底上的多個(gè)微電極。將細(xì)胞放置在微電極上以測(cè)量細(xì)胞的電活性。
本發(fā)明的多電極尤其包含微電極最上表面上的多孔導(dǎo)電材料。此微電極的阻抗為50kΩ或更小。微電極的阻抗優(yōu)選為35kΩ或更小，更優(yōu)選為25kΩ或更小，10kΩ或更小最好。這里所用的阻抗定義為在1kHz的頻率和50mV的端子間電壓下測(cè)得的值。本發(fā)明的阻抗下限值沒有特別的限定，但根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)最好盡可能的低。
可以確信的是這種低阻抗歸因于在電極上提供的導(dǎo)電材料的多孔結(jié)構(gòu)。這里所用的多孔性指的是導(dǎo)電材料表面粗糙的或具有微小的突起和凹陷的狀態(tài)。當(dāng)通過(guò)光學(xué)顯微鏡放大觀察時(shí)，本發(fā)明的多孔導(dǎo)電材料表面呈現(xiàn)為大約0.01-25μm直徑的小顆粒的密集粘結(jié)。當(dāng)電極的最上表面具有這種多孔結(jié)構(gòu)時(shí)，顯著增加了表面積。結(jié)果，可以實(shí)現(xiàn)低水平的阻抗，否則在通過(guò)傳統(tǒng)的淀積提供的光滑的金表面的情況下，不會(huì)得到這種低阻抗。
如上所述，電極的最上表面的多孔結(jié)構(gòu)可以由電極的最上表面的表面積來(lái)限定。例如，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的利用氣體吸收的BET法來(lái)限定電極的最上表面的表面積。阻抗還可以基于電路的等效電路的靜電容量來(lái)計(jì)算，所述電路代表微電極和溶液之間的界面模型。
典型的情況是利用過(guò)電流密度下的電鍍來(lái)制造本發(fā)明的多孔導(dǎo)電材料。過(guò)電流密度優(yōu)選指的是1.2A/dm2范圍內(nèi)的電流密度，1.0-5.0A/dm2范圍內(nèi)更好，1.4-2.1A/dm2范圍內(nèi)最好。這是與一般的導(dǎo)電材料的工業(yè)電鍍即電流密度為大約1.0A/dm2或更小相比較而言的。需要注意的是甚至當(dāng)采用大于3.0A/dm2的電流密度時(shí)也能進(jìn)行多孔導(dǎo)電材料的鍍覆。如果電流密度極大，表面非常粗糙以至于難以保持想要的微電極的形狀(例如正方形)。在本發(fā)明中，可以通過(guò)在過(guò)電流密度下一般通以電流10-360秒、比較好的是30-240秒的情況下來(lái)制造導(dǎo)電材料鍍層。如果電流的導(dǎo)通時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)電材料鍍層不能充分地形成在微電極上。如果電流的導(dǎo)通時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微電極上導(dǎo)電材料的生長(zhǎng)不均勻，以至于一部分導(dǎo)電材料鍍層迅速生長(zhǎng)而其它部分生長(zhǎng)緩慢，電極的形狀很可能偏離正方形。
上述電鍍條件僅僅是為了便于說(shuō)明起見。根據(jù)所用的電鍍?cè)O(shè)備的限制或操作程序的需要，可以在能夠?qū)崿F(xiàn)上述低阻抗的范圍內(nèi)有選擇地修改上述電鍍條件。
本發(fā)明的多孔導(dǎo)電材料也可以通過(guò)蝕刻來(lái)得到。例如，可以采用使用氧化劑和增溶劑的化學(xué)蝕刻、在包含酸作為主成分的電解質(zhì)溶液中利用直流電或交流電進(jìn)行電解的電化學(xué)蝕刻等，從而可以增加表面積。
本發(fā)明的微電極的最上表面具有上述多孔結(jié)構(gòu)。此外，作為例子，用于最上表面的材料為金，從而可以實(shí)現(xiàn)高強(qiáng)度以及低阻抗特性。因此，微電極的重復(fù)使用效率高，得到了高的成本效能。這是與大量用在傳統(tǒng)電極中的鉑黑的電鍍層相比較而言的，所述傳統(tǒng)電極具有低的阻抗，但具有非常低的強(qiáng)度，以致于不能進(jìn)行循環(huán)使用。尤其是，當(dāng)在與下述實(shí)施例5中的條件基本一樣的條件下進(jìn)行壽命測(cè)試時(shí)，20個(gè)循環(huán)之后，本發(fā)明的電極的阻抗相對(duì)于原始阻抗的增加率一般是30％或更低，較好的是20％或更低，更好的是15％或更低。
在本發(fā)明的微電極的最上表面上提供上述多孔導(dǎo)電材料。為多孔導(dǎo)電材料打底的電極材料可以是能夠與多孔導(dǎo)電材料充分粘接的任何材料。為多孔導(dǎo)電材料打底的電極材料的例子包含最好是非電鍍或電鍍的鎳、通常采用的非電鍍金等，但不限于上述材料。這些打底的層的厚度沒有特別的限制。例如，鎳鍍層的厚度大約為3000-7000埃?？梢栽阪囧儗由咸峁┖穸却蠹s為300-700埃的非電鍍金。
在本發(fā)明的多電極中，有代表性的是，在襯底上以下列方式提供多個(gè)微電極即使得多個(gè)微電極以矩陣的形式放置在格線的交點(diǎn)處。在此排列中，多個(gè)電極可以等間距設(shè)置。因此，可以將相鄰的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞體放置在相鄰的電極上，以檢測(cè)細(xì)胞體之間電信號(hào)的傳輸。
每個(gè)微電極均外供電信號(hào)?？梢赃x擇的是，將電信號(hào)從每個(gè)微電極引到外側(cè)的布線部分與每個(gè)電極連接。典型的是，布線部分包含與每個(gè)微電極連接并從電極向襯底的周邊引出的引線。布線部分還可以包含一般位于襯底的周邊并且與引線的端點(diǎn)連接的電節(jié)點(diǎn)。用于布線部分的材料的例子最好包含氧化銦錫(ITO)。需要注意的是上述阻抗是微電極和布線部分的總的特性值。實(shí)際上，與由電極最上表面的材料和尺寸限定的值相比，上述布線部分的阻抗值是可以忽略的。因此，用于電極的打底層和布線部分的材料的選擇基本上對(duì)阻抗沒有影響。
典型的是，引線的表面用絕緣層覆蓋。絕緣層可以只設(shè)置在引線上，但最好除了微電極和電節(jié)點(diǎn)附近之外，在襯底的幾乎整個(gè)上表面上都設(shè)置絕緣層。絕緣層的例子最好包含易于加工的聚丙烯樹脂或光敏聚酰亞胺。
(多電極的結(jié)構(gòu))對(duì)于本發(fā)明的多電極的詳細(xì)設(shè)計(jì)，可以使用已知多電極的任何結(jié)構(gòu)特征(例如，日本特開No.6-78889)，只要不影響上述多孔導(dǎo)電材料的形成和功能即可。在下文中，將顯示出多電極的典型例子的結(jié)構(gòu)。考慮各種因素，例如將測(cè)量的神經(jīng)細(xì)胞的特性、將測(cè)量的數(shù)據(jù)特性等，可以對(duì)這里所描述的實(shí)施例有選擇地修改。
細(xì)胞培養(yǎng)之后，為了光學(xué)監(jiān)視，包含在多電極中的襯底最好由透明的絕緣材料制成。這種材料的例子包含玻璃，例如氧化硅玻璃、鉛玻璃和硼砂玻璃；無(wú)機(jī)物質(zhì)，例如石英；有機(jī)玻璃或共聚物；和透明的有機(jī)物質(zhì)，例如聚苯乙烯和聚對(duì)苯二甲酸乙二酯。最好是具有機(jī)械強(qiáng)度和透明度的無(wú)機(jī)物質(zhì)。
位于襯底上的用于電極的材料的例子包含氧化銦錫(ITO)、氧化錫、鉻(Cr)、金(Au)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鋁(Al)和鉑(Pt)。在這些材料中，較好的是ITO和氧化錫。最好是具有透明度和高電導(dǎo)率的ITO。上述微電極一般是通過(guò)在具有所需要的位置和形狀的電極材料的一部分的最上表面上提供多孔導(dǎo)電材料鍍層來(lái)制造的。
一般，多個(gè)微電極等間隔設(shè)置，使得相鄰的電極之間的距離彼此全都相等。相鄰電極之間的距離通?？梢栽诖蠹s10-1000μm的范圍內(nèi)。一般，電極的形狀基本上是正方形或圓形，其邊長(zhǎng)或直徑在大約20-200μm的范圍內(nèi)。具有了上述設(shè)置，如果將要測(cè)量的神經(jīng)細(xì)胞(即，細(xì)胞體、樹突和軸突)的細(xì)胞體位于電極上，很可能與前述細(xì)胞體的樹突連接的另一個(gè)細(xì)胞體位于相鄰的電極上。
與微電極連接的引線可以用與上述的電極材料一樣的電極材料制成。在這種情況下，還是最好是ITO。一般，在襯底上淀積這種電極材料。此后，利用光致抗蝕劑進(jìn)行蝕刻，從而形成所需要的微電極的最下層和包含引線的布線部分成一體的圖形。在這種情況下，微電極的最下層和布線部分的厚度大約為500-5000埃。
引線一般設(shè)置為基本上從每個(gè)微電極呈放射狀延伸。與此基本上放射狀的設(shè)置相結(jié)合，多個(gè)微電極最好設(shè)置為使得其中心置于8×8格線的各個(gè)交點(diǎn)上。
覆蓋引線的絕緣層材料的例子包含透明樹脂，例如聚酰亞胺(PI)樹脂和環(huán)氧樹脂。較好的是光敏樹脂，例如負(fù)相光敏聚酰亞胺(NPI)。例如，當(dāng)采用光敏樹脂作為絕緣層材料時(shí)，通過(guò)利用光刻形成的圖形，在微電極上的絕緣層部分中形成開口，可以只露出電極。如上所述，以這種方式設(shè)置絕緣層，以便基本上覆蓋絕緣襯底的除了電極附近和具有外電路的電節(jié)點(diǎn)之外的整個(gè)表面。這在生產(chǎn)效率等方面是較好的。
(用于測(cè)量細(xì)胞電位的裝置和系統(tǒng))對(duì)于有效地利用本發(fā)明的多電極以測(cè)量神經(jīng)細(xì)胞等的系統(tǒng)的各個(gè)元件的詳細(xì)設(shè)計(jì)來(lái)說(shuō)，只要不影響上述多孔導(dǎo)電材料的形成和功能，可以采用已知的用于測(cè)量細(xì)胞電位的系統(tǒng)的任何結(jié)構(gòu)特征(例如，日本特開No.8-62209)。
一般，本發(fā)明的多電極另外配置有便于在多電極上進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)，并且可以選擇配置便于操縱多電極的其它結(jié)構(gòu)。得到的多電極可以設(shè)置為一體化的細(xì)胞支座。
為了在多電極上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，典型地，可以通過(guò)襯底上的絕緣層提供能夠保持培養(yǎng)基的結(jié)構(gòu)部件，所述襯底基本上被絕緣層整個(gè)覆蓋。例如，可以在襯底上固定由聚苯乙烯制成的筒狀框架，使其圍繞多個(gè)電極，從而得到上述保持結(jié)構(gòu)。在這種情況下，聚苯乙烯框架的內(nèi)側(cè)限定了細(xì)胞保持區(qū)。在提供保持結(jié)構(gòu)之前或之后，可以將本發(fā)明的多孔導(dǎo)電材料鍍層形成在微電極的表面上。
例如，為了便于在細(xì)胞測(cè)量中操縱多電極，可以使用印刷電路板。此印刷電路板具有與多個(gè)電極上的電節(jié)點(diǎn)電連接的導(dǎo)體圖形，從而起著延伸電連接的作用，這種電連接是由微電極到電節(jié)點(diǎn)、到外側(cè)而建立的。例如，可以采用具有適當(dāng)形狀的保持器，如夾著多電極的兩部分分開的保持器，以便在其間保持電連接的同時(shí)，用多電極可靠地固定印刷電路板。
一體化的細(xì)胞支座還可以與激勵(lì)信號(hào)供應(yīng)器和輸出信號(hào)處理器結(jié)合，從而得到用于在多電極上電激勵(lì)細(xì)胞并處理響應(yīng)于激勵(lì)的輸出信號(hào)的細(xì)胞電位測(cè)量裝置。
激勵(lì)信號(hào)供應(yīng)器可以給多個(gè)微電極之外的任何電極對(duì)提供激勵(lì)信號(hào)。當(dāng)細(xì)胞響應(yīng)于激勵(lì)信號(hào)時(shí)，另一個(gè)電極檢測(cè)所引起的電位變化并且將與此變化相對(duì)應(yīng)的輸出信號(hào)輸出給信號(hào)處理器。例如，輸出信號(hào)通過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚韨鬏斀o顯示裝置等。注意可以同樣測(cè)量在沒有收到激勵(lì)信號(hào)的情況下細(xì)胞中產(chǎn)生的自發(fā)電位。
一般通過(guò)具有適當(dāng)?shù)臏y(cè)量軟件的單個(gè)計(jì)算機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)激勵(lì)信號(hào)供應(yīng)器和輸出信號(hào)處理器。在計(jì)算機(jī)屏幕上，測(cè)量軟件提供了用于設(shè)置激勵(lì)條件等的參數(shù)設(shè)置窗口、用于記錄從細(xì)胞檢測(cè)的電位變化并且實(shí)時(shí)地通過(guò)多通道顯示數(shù)據(jù)的記錄窗口和用于分析所記錄的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)分析窗口等。較好的是，將來(lái)自計(jì)算機(jī)的激勵(lì)信號(hào)通過(guò)D/A轉(zhuǎn)換器傳輸給多電極，同時(shí)來(lái)自于細(xì)胞的輸出信號(hào)通過(guò)A/D轉(zhuǎn)換器傳輸給計(jì)算機(jī)。
細(xì)胞電位測(cè)量裝置還可以與光學(xué)監(jiān)視裝置和細(xì)胞培養(yǎng)裝置相結(jié)合，從而得到用于長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞并且穩(wěn)定和精確地測(cè)量神經(jīng)細(xì)胞的電生理活性的細(xì)胞電位測(cè)量系統(tǒng)。光學(xué)監(jiān)視裝置可以包含翻轉(zhuǎn)顯微鏡以及包含高清晰顯示器和圖像文件存儲(chǔ)裝置的用于顯微鏡的SIT攝像機(jī)。作為細(xì)胞培養(yǎng)裝置，可以采用能夠控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、培養(yǎng)基循環(huán)、空氣和二氧化碳的氣體混合物的供應(yīng)等的任何裝置或其組合。
舉例下面將通過(guò)說(shuō)明性的例子來(lái)具體描述本發(fā)明。本發(fā)明并不限于這些例子。
(例1)在各種電流密度下用電解的金鍍層鍍覆平的多電極表面(具有50×50μm尺寸的每個(gè)電極的中心部分位于8×8格線的交點(diǎn)之一處。因此微電極的整個(gè)表面積(突出面積)為50×50×64＝160000μm2)。
尤其是，在1.0A/dm2、1.5A/dm2和2.0A/dm2的電流密度下形成電解的金鍍層。在1kHz頻率、50mV的端子間電壓的條件下測(cè)量具有在各個(gè)電流密度下形成的金鍍層的微電極的阻抗，并計(jì)算5個(gè)測(cè)量結(jié)果的平均值。結(jié)果示于表1。當(dāng)電流密度增加時(shí)，每個(gè)微電極的平均阻抗將降低。
表1電流密度和平均阻抗

用光學(xué)顯微鏡觀察微電極的鍍金表面。顯微照片示于圖1a至1c。圖1a、1b和1c是鍍覆表面的顯微照片，此鍍覆表面分別是在1.0A/dm2、1.5A/dm2和2.0A/dm2的電流密度下得到的。在1.0A/dm2的電流密度情況下，得到了基本上光滑的鍍覆表面。相反，當(dāng)電流密度增加時(shí)，鍍金表面的孔隙更顯著，電極表面的面積增加。
(例2)實(shí)際上采用例1中得到的微電極表面和老鼠海馬(hippocampus)(大腦)的切片來(lái)測(cè)量所引發(fā)的電位和噪聲。海馬切片是由老鼠得到的。用Fluothane給五個(gè)星期大的雄性c57黑6鼠施加麻醉，并且實(shí)施斷頭術(shù)以取出整個(gè)腦。取出的腦立即在冰上的林格氏溶液中冷卻。解剖僅包含海馬的腦區(qū)。此后，用組織切片刀切割得到腦區(qū)，得到厚250μm的切片。將此切片放在微電極上并且在微電極上測(cè)試。
在施加10μA恒定電流的情況下，測(cè)量引發(fā)的電位和噪聲，所述恒定電流具有雙極性脈沖(脈沖寬度為100微妙)。在激勵(lì)之后，從激勵(lì)之前5毫秒到激勵(lì)之后45毫秒測(cè)量64個(gè)電極的響應(yīng)，并且顯示在具有64通道的計(jì)算機(jī)屏幕上。結(jié)果示于圖2a至2f。圖2a、2c和2e顯示了相對(duì)于上述恒定電流激勵(lì)，鍍金微電極上細(xì)胞的電位變化響應(yīng)(即，引發(fā)的電位)。圖2a顯示了在1.0A/dm2的電流密度下通過(guò)電解而得到的電極的引發(fā)電位。圖2c顯示了在1.5A/dm2的電流密度下通過(guò)電解而得到的電極的引發(fā)電位。圖2e顯示了在2.0A/dm2的電流密度下通過(guò)電解而得到的電極的引發(fā)電位。
圖2b、2d和2f顯示了在圖2a、2c和2e中顯示的各個(gè)鍍金微電極中出現(xiàn)的噪聲水平。
從圖2a、2c和2e可以看出，與通過(guò)在1.0A/dm2的電流密度下的電解而得到的金鍍層(圖2a)相比，具有利用更高的電流密度得到的多孔金鍍層的電極對(duì)施加的激勵(lì)信號(hào)具有清晰的響應(yīng)，并且能夠以有效的方式給電極施加恒定的電流激勵(lì)(圖2c和2e)。特別是，具有在1.5A/dm2的電流密度下得到的鍍層的微電極具有低的阻抗值和另人滿意的表面狀態(tài)。
對(duì)于噪聲水平，在2.0A/dm2的電流密度下得到的鍍層(圖2f)具有最低值，在1.5A/dm2的電流密度下得到的鍍層(圖2d)具有第二低的值?？墒?，在1.0A/dm2的電流密度下得到的鍍層(圖2b)具有明顯的噪聲水平，其難以高精度地測(cè)量神經(jīng)細(xì)胞的電位變化。
(例3)將在各種電流密度下得到的鍍有電解金鍍層的平坦微電極表面的頻率特性與傳統(tǒng)的產(chǎn)品進(jìn)行比較。具有分別在2.0A/dm2和1.5A/dm2的電流密度下得到的多孔鍍金表面的電極具有與傳統(tǒng)電極相似的頻率特性，所述傳統(tǒng)電極具有通過(guò)電解得到的鉑黑鍍層。然而，在1.0A/dm2的電流密度下得到的金鍍層具有明顯劣于傳統(tǒng)產(chǎn)品的頻率特性。
(例4)通過(guò)下列方法測(cè)量或計(jì)算微電極表面積。
1.通過(guò)氣體吸收法測(cè)量利用CO氣體通過(guò)氣體吸收法測(cè)量具有多孔鍍金表面的微電極的表面積，所述多孔鍍金表面是在例1中在1.5A/dm2的電流密度下得到的。作為將要測(cè)量的樣品，采用在1.3mm×1.3mm×1.1mm的玻璃襯底(下文稱為鍍金微電極塊)上提供的64個(gè)鍍金微電極。單個(gè)的微電極太小而不能作為將用氣體吸收法測(cè)量的樣品。另外，使用在如上所述的玻璃襯底上提供的64個(gè)鉑黑鍍覆微電極(下文稱為鉑黑鍍覆微電極塊)作為比較樣品，所述鉑黑鍍覆微電極具有通過(guò)用傳統(tǒng)方法(電解鍍覆)代替金鍍覆的鉑黑鍍層。注意每個(gè)樣品塊重0.004克。測(cè)量的結(jié)果示于表2。
表2具有鍍金表面的電極的表面積的測(cè)量結(jié)果

鍍金微電極塊或鉑黑鍍覆微電極塊的整個(gè)表面積表示如下S’＝(S-s)+αs其中S’代表鍍金微電極塊或鉑黑鍍覆微電極塊(下文稱為微電極塊)的整個(gè)表面積；S代表在1.3mm×1.3mm×1.1mm的玻璃襯底上形成鍍層之前微電極塊的整個(gè)表面積；s代表鍍覆之前微電極的表面積(突出面積)，S’代表鍍金微電極塊或鉑黑鍍覆微電極塊的整個(gè)表面積；αs代表經(jīng)過(guò)鍍覆的微電極的表面積s增加到α倍；S-s，即除了微電極之外的微電極塊的表面積不變化，只有微電極的表面積通過(guò)鍍覆增加了。α值通過(guò)下式計(jì)算α＝(S’-S)/s+1。
在本例中，S值是1.3mm×1.3mm×1.1mm矩形平行六面體的表面積即7.41mm2。s(突出面積)的值是每個(gè)電極具有50μm×50μm的尺寸的64個(gè)電極的表面積，即0.16mm2，。因此，根據(jù)表2所示的S’的測(cè)量結(jié)果，計(jì)算的鉑黑鍍覆微電極的α值為504955。注意，鍍金電極的α值(表面積的增加)低于氣體吸收法的檢測(cè)限制，估計(jì)低于455。
2.微電極的表面積的計(jì)算2.1.鍍金電極的阻抗特性通過(guò)頻率從1Hz到100kHz連續(xù)變化，測(cè)量例1中的具有在1.5A/dm2的電流密度下得到的多孔鍍金表面的微電極的阻抗。在本測(cè)量中，采用0.3mmφ的鉑線作為反電極，在1.4wt％NaCl水溶液中進(jìn)行測(cè)量。偏壓為0伏，測(cè)量電壓的振幅為50mV。結(jié)果示于圖3。圖3是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的伯德圖，顯示了阻抗測(cè)量的結(jié)果，其示出了測(cè)量的阻抗Z的絕對(duì)值的對(duì)數(shù)(即log|Z|)和相角(θ)關(guān)于頻率f的對(duì)數(shù)的關(guān)系?；诓聢D，用等效電路表示測(cè)量系統(tǒng)，從而量化微電極的表面積。
可以推算包含微電極的測(cè)量系統(tǒng)與一個(gè)電路等效，此電路除了包含以串聯(lián)和并聯(lián)形式復(fù)雜連接的溶液的電阻、ITO電路圖形的電阻、微電極表面中的電雙層的電容等之外，實(shí)際上還包含在ITO電路圖形部分和溶液之間產(chǎn)生的電容、在微電極界面上產(chǎn)生的電阻等。例如，圖4a顯示了包含微電極的測(cè)量系統(tǒng)的等效電路。圖4a所示的整個(gè)等效電路的綜合阻抗Z可以表示如下…[I]Z=R1+(R2+R3)(1-ω2R2R3C1C2)+ω2R2R3C1{R3C1+(R2+R2)C2}(1-ω2R2R3C1C2)2+[ω{R3C1+(R2+R3)C2}]2]]>-jω(R2+R3){R3C1+(R2+R3)C2}-R2R3C1(1-ω2R2R3C1C2)(1-ω2R2R3C1C2)2+[ω{R3C1+(R2+R3)C2}]2]]>其中R1代表ITO電路圖形部分(不接觸溶液)的電阻；R2代表ITO電路圖形部分的電阻和溶液的電阻；R3代表微電極表面的電阻；C1代表微電極表面的電雙層的電容；C2代表ITO電路圖形部分和溶液之間通過(guò)絕緣膜產(chǎn)生的電容；和ω＝2πf(ω角頻率，f頻率)。上述綜合阻抗的絕對(duì)值|Z|和相角θ分別表示為|Z|＝(ZRe2+ZIm2)1/2和θ＝tan-1(-ZIm/ZRe)(其中ZRe是Z的實(shí)部，ZIm是Z的虛部)。
這里，通過(guò)改變R1、R2、C1和C2以選擇R1、R2、R3、C1和C2的組合，提供最接近圖3所示的伯德圖，通過(guò)計(jì)算等效電路的綜合阻抗來(lái)模擬圖4a所示的等效電路。圖5是R1＝200Ω、R2＝5kΩ、R3＝5MΩ、C1＝0.01μF和C2＝100pF的伯德圖。很顯然，圖5所示的結(jié)果在很大程度上與圖3所示的實(shí)際測(cè)量一致。
這里，在包含微電極的測(cè)量系統(tǒng)中，R3＞＞R1、R3＞＞R2和C2＜＜C1。因此，如果假設(shè)R3→∞和C2→0，上述表達(dá)式[I]可以近似為limR3→∞limC2→0Z=R1+R2-j1ωC1=R1+R2+1jωC1...[II]]]>如果R1+R2＝R和C1＝C，包含微電極測(cè)量系統(tǒng)可以近似為圖4b所示的簡(jiǎn)單電路。下文，利用圖4b所示的等效電路進(jìn)一步進(jìn)行了分析。
圖4b所示的整個(gè)等效電路的綜合阻抗表示為Z＝R+(jωc)-1，其中R代表電路圖形的電阻；C代表微電極表面的電雙層的電阻；ω＝2πf(ω代表角頻率，f代表頻率)。上述綜合阻抗的絕對(duì)值|Z|和相角θ分別表示為|Z|＝(R2+(1/ωc)2)1/2和θ＝tan-1(-ωc/R)。
通過(guò)改變R和C以選擇R和C的組合，提供最接近于圖3所示的伯德圖，通過(guò)計(jì)算等效電路的綜合阻抗模擬圖4b所示的等效電路。圖6是R＝5kΩ和C＝0.01μF的伯德圖。很顯然圖6所示的結(jié)果在很大程度上與圖3所示的實(shí)際測(cè)量一致。
然后，圖7是顯示用做控制的微電極的阻抗的實(shí)際測(cè)量值曲線圖，該微電極不具有鍍金表面。測(cè)量條件與用于測(cè)量具有上述鍍金表面(圖3)的多電極阻抗的條件一樣。
然后，圖8顯示了通過(guò)模擬圖4b所示的等效電路(其中R＝5kΩ和C＝250Pf)得到的等效電路的綜合阻抗的結(jié)果。很顯然圖8所示的結(jié)果在很大程度上與圖7所示的實(shí)際測(cè)量結(jié)果一致。
這里，假設(shè)具有鍍金表面的微電極的電雙層的電容用CA來(lái)表示，鍍金處理之前的微電極的電雙層的電容用CB表示。根據(jù)上述模擬結(jié)果，微電極的靜電容量CA和CB分別為0.01μF和250pF，從而得到關(guān)系CA＝40 CB。這里，通常靜電容量Cap表示為Cap＝ε0εrS/d(ε0真空的介電常數(shù)；εr介電材料的相對(duì)介電常數(shù)；S電極的表面積；和d介電材料的厚度)。靜電容量Cap值正比于電極的表面積。因此，上述關(guān)系表明通過(guò)提供金鍍層，具有鍍金表面的微電極的表面積增加到40倍。
圖9以與具有鍍金表面的微電極一樣的方式顯示了具有鉑黑鍍覆表面的微電極的阻抗的實(shí)際測(cè)量值的曲線圖。測(cè)量條件與在具有鍍金表面的微電極的阻抗測(cè)量(圖3)中所用的條件一樣。然后，圖10顯示了通過(guò)模擬(其中R＝5kΩ，C＝0.05μF)得到的圖4b所示的等效電路的綜合阻抗的結(jié)果。很顯然，圖10所示的結(jié)果在很大程度上與圖9所示的實(shí)際測(cè)量結(jié)果一樣。
同樣地，這里假設(shè)具有鍍金表面的微電極的電雙層的電容用CA表示，金鍍覆處理之前的微電極的電雙層的電容用CB來(lái)表示。根據(jù)上述模擬結(jié)果，微電極的靜電容量CA和CB分別為0.01μF和0.05pF，從而得到關(guān)系CA＝200CB。此關(guān)系表明通過(guò)提供金鍍層，具有鍍金表面的微電極的表面積增加200倍。
根據(jù)此模擬，為了得到作為微電極的阻抗極限的50kΩ或更低的阻抗，與突出面積相比，需要利用金鍍層將表面積增加10倍或更多。
(例5)與傳統(tǒng)電極(鉑黑鍍層)相比較，對(duì)具有多孔金鍍層的平的多電極進(jìn)行壽命測(cè)試，所述多孔金鍍層是在1.5A/dm2的電流密度下通過(guò)電解得到的。在此壽命測(cè)試中，重復(fù)與一般的嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)類似的實(shí)驗(yàn)。特別是重復(fù)例2所描述的實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，用膠原酶(20u/ml)處理電極一個(gè)晚上，剝?nèi)ゼ?xì)胞切片樣本，接著用蒸餾水沖洗。然后，測(cè)量微電極的阻抗。圖11的曲線圖示出了每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后阻抗的變化。根據(jù)此結(jié)果，隨著使用次數(shù)的增加，阻抗的增加和變化比傳統(tǒng)的鍍層(鉑黑鍍層)小。
相反，如圖11所示，在17-18個(gè)循環(huán)之后，通過(guò)電解方法具有鉑黑鍍覆表面的傳統(tǒng)產(chǎn)品的阻抗顯著增加。如上所述，具有多孔金鍍層的電極具有更高水平的可再循環(huán)使用性，并且與傳統(tǒng)產(chǎn)品相比，可以穩(wěn)定地測(cè)量電極的電位變化。
盡管參考上述例子描述了本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些例子。在不離開本發(fā)明的范圍的情況下，基于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)，可以在實(shí)施本發(fā)明時(shí)修改、提高和改變實(shí)施例。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了用于細(xì)胞外記錄的多電極，此多電極具有高強(qiáng)度，能長(zhǎng)時(shí)間記錄神經(jīng)細(xì)胞的電活性，并易于循環(huán)使用。通過(guò)利用多孔金鍍層，包含在多電極中的多個(gè)微電極在不喪失強(qiáng)度的情況下具有低的阻抗。因此，易于給多電極施加恒定的電流激勵(lì)，最好使多電極適于監(jiān)視培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)電激勵(lì)的響應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)量細(xì)胞的電生理學(xué)特性的多電極，此電極包括位于襯底上的多個(gè)微電極；用于給微電極提供電信號(hào)或從微電極引出電信號(hào)的布線部分，其特征在于，微電極具有在其表面上的多孔導(dǎo)電材料，此導(dǎo)電材料選自金、氮化鈦、氧化銀和鎢，每個(gè)微電極的阻抗為50kΩ或更低。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多電極，其特征在于，多孔導(dǎo)電材料是金，并且通過(guò)在1.0-5.0A/dm2的電流密度下導(dǎo)通電流10-360秒來(lái)提供。
3.一種用于測(cè)量細(xì)胞的電生理學(xué)特性的多電極，此電極包括位于襯底上的多個(gè)微電極；用于給微電極提供電信號(hào)或從微電極引出電信號(hào)的布線部分，其特征在于，從具有基本上與微電極一樣的阻抗的等效電路的靜電容量計(jì)算的微電極的表面積大于或等于微電極的突出面積的至少10倍，而小于200倍，且每個(gè)微電極的阻抗為50kΩ或更低。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多電極，其特征在于，通過(guò)氣體吸收法測(cè)量的微電極的表面積小于或等于微電極的突出面積的5×105倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一個(gè)權(quán)利要求的多電極，其特征在于，以矩陣的形式在襯底上排列微電極，布線部分包含與微電極連接的引線和與引線的端部連接的電節(jié)點(diǎn)，至少用絕緣層覆蓋引線的表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4和5的任一個(gè)權(quán)利要求的多電極，其特征在于，通過(guò)蝕刻提供多孔導(dǎo)電材料。
7.一種包括根據(jù)權(quán)利要求1至6任一個(gè)的多電極的一體化的細(xì)胞支座，其特征在于，一體化的細(xì)胞支座具有用于在多電極的襯底上放置細(xì)胞或組織的細(xì)胞安置區(qū)。
8.一種細(xì)胞電位測(cè)量裝置，包括根據(jù)權(quán)利要求7的一體化的細(xì)胞支座；與微電極連接并用于處理由于細(xì)胞或組織的電生理學(xué)活性而產(chǎn)生的輸出信號(hào)的輸出信號(hào)處理器；和用于有選擇地給細(xì)胞或組織提供電激勵(lì)的激勵(lì)信號(hào)供應(yīng)器。
9.一種細(xì)胞電位測(cè)量系統(tǒng)，包括根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞電位測(cè)量裝置；用于光學(xué)監(jiān)視細(xì)胞或組織的光學(xué)監(jiān)視裝置；和/或用于控制細(xì)胞或組織的培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
全文摘要
多電極包含位于襯底上的多個(gè)微電極和用于給微電極提供電信號(hào)或從微電極引出電信號(hào)的布線部分。每個(gè)微電極具有其表面上的多孔導(dǎo)電材料，微電極的阻抗為50kΩ或更低。最好，多孔導(dǎo)電材料是金，并且通過(guò)在1.0－5.0A/dm
文檔編號(hào)G01N27/30GK1440505SQ01812189
公開日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2001年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月20日
發(fā)明者岡弘章, 行政哲男, 小川龍?zhí)? 杉原宏和, 辻克之, 吉元幸文 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社