專利名稱：從體積較大的樣品中制備要分析的樣品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析存在于液體介質(zhì)中的污染物的領(lǐng)域，該分析要求對處于稀釋狀態(tài)的、含有大量不同大小的微生物(病毒、細(xì)菌、寄生蟲)以及各種有機(jī)或無機(jī)大分子的大體積樣品進(jìn)行處理，以獲得呈濃縮狀態(tài)的、含有實際上相同的相應(yīng)組分的污染物的小體積最終液體樣品。
采用生化或生物分析技術(shù)，尤其是免疫檢測和分子生物學(xué)技術(shù)(例如多樣品檢測)，使得這種污染物(具體是微生物)的富集和小體積分析的要求成為必要。
已知采用例如吸附的方法分離和濃縮微生物，尤其是病毒。除了這些方法不能保證這些微生物的存活力以外，它們還不可能獲得與上述分析技術(shù)相匹配的體積的樣品。
用于收集液體介質(zhì)中的微生物的其它方法需要過濾方法，并需要對僅僅一種類型的微生物進(jìn)行分析，但不總會提供要獲得的定量結(jié)果。
例如，對于細(xì)菌和寄生蟲的例子，可按照標(biāo)準(zhǔn)化方法的建議，根據(jù)種類使用孔徑為0.2-1μm的平面薄膜。
FR-B-2693474中描述了一種以切線超濾為基礎(chǔ)的技術(shù)，該技術(shù)以常規(guī)的方式使用一種或多種膜，使各種大小的微生物得以分離，而同時確保了這些微生物的存活力。
但是，對于最終液體樣品的體積的要求使得該技術(shù)不可能用于制備采用生化或生物學(xué)分析技術(shù)進(jìn)行分析的樣品。
對于微過濾膜的性能，還可從Otaki等〔《水科學(xué)技術(shù)》(Wat.Sci.Tech.)，37，10，107-116，1998〕的方法得到證實，該方法是以連續(xù)和切線模式在空心纖維上使用超濾裝置，通過從供應(yīng)源(分別為濾液和濃縮物)抽取樣品，周期性地對抽取物進(jìn)行分析。
切線式過濾和超濾方法的采用要求存在一種線路，該線路使全部或一些濃縮物再環(huán)流，以便在膜上維持一種切向速度，使懸浮液中的顆粒被過濾，而同時避免所使用的膜發(fā)生快速的堵塞〔《微過濾和超濾——原理和應(yīng)用》(Microfiltration andUltrafiltration-Principles and Applications)，Leos J.Zwman，Andrew L.Zydney，Marcel Dekker，Inc.，紐約—巴塞爾—香港，1996〕。
過濾液體的再循環(huán)使過濾時間延長，而且還會產(chǎn)生額外的體積，該體積中的一些濃縮物和微生物又不能以不影響最終體積的方式收集。
由于管道系統(tǒng)的體積以及洗脫液的體積而產(chǎn)生的大體積濃縮物需要抽提可能仍留在壁上的微生物，過濾時間的延長也使得這些技術(shù)不適合于要求進(jìn)行小體積分析以及迅速獲得結(jié)果的分析方法，例如，答復(fù)有關(guān)飲用水或人用的其它任何液體的污染的詢問。
本發(fā)明的目的是使用一種過濾裝置，使其可能在有限長的時間內(nèi)從大且預(yù)定的體積的起始液體樣品中獲得用于分析的樣品，該用于分析的樣品的體積小到足以采用生化的或生物學(xué)的分析技術(shù)進(jìn)行分析(例如多樣品檢測)，尤其是免疫檢測和分子生物學(xué)技術(shù)，而同時又能確保這些微生物的存活力。
本發(fā)明的過濾裝置的基礎(chǔ)是以正向模式在空心纖維上進(jìn)行的超濾技術(shù)。
與切向模式相對，正向模式是指使用上述過濾裝置使起始液體樣品以單通路的方式通過，而沒有至少一些相同的樣品循環(huán)回到上述過濾裝置的入口。
采用這種正向模式超濾方法使獲得小體積濃縮物成為可能，可以在1小時的時間范圍內(nèi)以單通路的方式濃縮樣品，而同時確保微生物的存活力、多次收集以及100％級別的得率。
“多次收集”指從最終樣品中收集實際上存在于起始樣品中的所有不同類型或種類的微生物的可能性。
由于在如其它裝置上存在輔助管道系統(tǒng)(如循環(huán)管道系統(tǒng))和沿著空心纖維總長度的孔隙度的可靠性而不存在稱為死體積的體積的緣故，故獲得了這些高得率。
在閱讀結(jié)合附圖進(jìn)行描述的說明書之后，將會理解所采用的過濾裝置的特征，其中，

圖1以縱剖面示意性地描述本發(fā)明的過濾裝置，圖2描述了相同過濾裝置橫截面的放大圖。纖維的尺寸被故意放大，以利于理解本發(fā)明。
該過濾裝置包括室(2)，在室(2)中有許多相互平行排列著的空心纖維(3)，這些纖維的多孔壁(3a)限定了孔(4)，這樣所述裝置包括由所述各個空心纖維的許多平行的孔(4)組成的內(nèi)部通路(A)和對應(yīng)于這些纖維和該室之間的有效體積的外部通路(B)。
根據(jù)本發(fā)明，這個裝置用于處理呈稀釋狀態(tài)的、含有多種不同大小的微生物的大體積起始液體樣品，以獲得呈濃縮狀態(tài)的、含有相同組成的微生物的小體積最終液體樣品。
在使用這種裝置時，要進(jìn)行至少一個濃縮步驟，其中a)采用單過濾裝置；b)以正向模式使用所述過濾裝置；c)確定纖維的多孔壁(3a)的截留閾值，以留住起始樣品中尺寸最小的微生物；并間斷地進(jìn)行以下步驟d)在過濾階段，通過過濾裝置的通路(A，B)導(dǎo)入所有的起始液體樣品，通過該過濾裝置的其它通路(B，A)移出濾液，濃縮物在導(dǎo)入液體樣品的通路中積聚；e)在收集階段，在使所有的樣品通過后，起始液體樣品在所述過濾裝置(1)中從所述通路到所述其它通路的流通停止，從濃縮物獲得出口液體樣品。
采用重力作用的簡單方法或者使用壓縮氣體或通過物理攪拌所述過濾裝置，可收集由濃縮物形成的出口液體樣品，但也可使用任何適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)進(jìn)行洗脫，從而進(jìn)行收集，如使用PBS鹽水溶液(如，120mmol NaCl，2.7mmol KCl，10mmolNaH2PO4)的微生物例子中，該溶液中可能含有去污劑TWEEN 20和或表面活性劑BSA(牛血清白蛋白)。
根據(jù)另一實施例，對由濃縮物形成的出口液體樣品進(jìn)行第二個濃縮步驟，在此第二濃縮階段中，該出口液體樣品為起始液體樣品。
空心纖維的壁(3a)可由能制造確定的孔隙度的空心纖維的任何材料制成，如有機(jī)膜，如乙酸纖維素、乙基纖維素、聚醚砜或聚丙烯腈，或者是無機(jī)膜，如陶瓷。
確定這些纖維的多孔壁(3a)的截留閾值，以留住起始樣品中尺寸最小的微生物。因此，所使用的纖維，對于超濾而言，其孔隙度為10-100nm，這樣濃縮物中將包含尺寸超過病毒的所有微生物，其中也包括病毒。但是，如果對所尋找的顆粒的尺寸有特殊要求，尤其是在顆粒小于10nm的情況中，則可使用用于納米級過濾的孔隙度為1-10nm的纖維。
根據(jù)一個實施例，導(dǎo)入起始樣品的通路是內(nèi)部通路(A)，抽提出口樣品的通路是外部通路(B)，這樣微生物在纖維內(nèi)積聚，形成濃縮物，而濾液沿著纖維和室(B)之間的有效體積中的纖維外部流過。
由閥門(C)將由體積為如10-100升的收回樣品的水溶液組成的要處理的樣品導(dǎo)入組件的空心纖維中，由蠕動式泵或者其它任何裝置〔如由濾液一側(cè)閥門(E)產(chǎn)生的低壓〕的吸入作用而帶走，而閥門(D)和閥門(F)仍保持關(guān)閉。
當(dāng)所有要處理的體積通過該組件時，停止泵的運轉(zhuǎn)，關(guān)閉閥門(C)，使其與樣品源分離。
然后如通過閥門(F)給該組件施加大氣壓〔如打開閥門(E)〕，然后增加壓力，例如增加到0.5bar的壓縮空氣，然后再次關(guān)閉閥門(E)，從而排空該室，移出濾液。
然后打開閥門(C)，在重力作用下從閥門(D)收集濃縮物，以關(guān)閉閥門(C)和將壓縮空氣注入纖維中來終止收集。
根據(jù)另一實施例，導(dǎo)入起始樣品的通路是外部通路(B)，抽提出口樣品的通路是內(nèi)部通路(A)，這樣微生物在纖維和室之間的有效體積中的纖維外部積聚，形成濃縮物，濾液則沿著纖維的內(nèi)部流過而被去除。
通過閥門(E)將由體積為如10-100升的收回樣品的水溶液組成的要處理的樣品導(dǎo)入室中，通過施加例如由蠕動式泵或其它任何裝置進(jìn)行的吸入作用產(chǎn)生的低壓而帶走，這種低壓是由如閥門(D)施加在空心纖維內(nèi)的濾液一側(cè)上，而閥門(C)仍保持關(guān)閉。
當(dāng)所有要處理的體積通過該組件時，保持該泵運轉(zhuǎn)，使閥門(E)與樣品源斷開，以減少該組件的室中含有的濃縮物的體積，這種減少可以是完全的或者是部分的減少。
當(dāng)達(dá)到所需濃縮物的濃度水平時，使泵停止運轉(zhuǎn)，將閥門(D)和其它所有的閥門一起關(guān)閉。
可將洗脫液導(dǎo)入室中，然后攪拌該組件，之后通過閥門(F)收集濃縮物或洗脫物，也可以從閥門(E)注入壓縮空氣而終止收集。
為了限制吸附現(xiàn)象，可預(yù)先用如TWEEN型去污劑和/或BSA(牛血清白蛋白)型表面活性劑處理纖維。
根據(jù)一實施例，如果有可能分析液體的懸浮物含量的話，那么進(jìn)行過濾階段(C)，起始液體樣品無需預(yù)過濾。
在通過內(nèi)部通路(A)導(dǎo)入的方法中，所獲得的濃縮物的體積與過濾裝置的尺寸直接相關(guān)；對于通過外部通路(B)導(dǎo)入的方法，所述濃縮物的體積并不依賴于過濾裝置的尺寸，而依賴于室中剩下的體積和/或?qū)朐撌抑械南疵摲诺捏w積。
限定過濾裝置的大小，以使起始樣品的體積和所獲得的濃縮物的體積之比至少等于50，較佳在150-500之間，過濾時間在20分鐘到一小時之間。
如果可以如此應(yīng)用，則該組件可在反洗或用去污染劑處理后再次使用，例如使用50ppm的氯溶液以及可能的酶處理。
根據(jù)導(dǎo)入樣品的通路是內(nèi)部通路(A)還是外部通路(B)，可采用兩種反洗方法，以與用于分析的樣品導(dǎo)入的流向相對的方向?qū)胂礈焖?br> 當(dāng)樣品是通過閥門(C)由內(nèi)部通路(A)導(dǎo)入時，可使用傳送裝置〔如放置于水源和所述閥門之間的蠕動式泵〕由閥門(F)導(dǎo)入自來水，進(jìn)行反洗，關(guān)閉閥門(D)，而閥門(E)暫時保持開啟。
當(dāng)室被充滿時，關(guān)閉閥門(E)，壓迫水沿著纖維的內(nèi)側(cè)流過，然后從閥門(C)或(D)流出。
當(dāng)導(dǎo)入樣品的通路是外部通路(B)時，則通過閥門(D)導(dǎo)入自來水進(jìn)行反洗，而關(guān)閉閥門(E)和(F)。
當(dāng)纖維中充滿水時，即不再看到起泡從閥門(C)中逸出時，關(guān)閉此閥門，強(qiáng)迫水通過室中的纖維的外周，以通過閥門(E)或閥門(F)流出。
也可單次使用該組件，可進(jìn)行如γ射線滅菌處理對其進(jìn)行初始的滅菌。
在另一實施例中，可使用無密封的組件，因為這可以避免外部污染的任何風(fēng)險(組件外部的流體，如周圍的空氣)；這也可避免從濃縮物穿過污染物的密封到達(dá)濾液的任何通道。如圖1所示，將空心纖維的兩端埋植在樹脂中可以實現(xiàn)密封，從而可防止污染物的任何泄漏，有些并不是具有密封的系統(tǒng)中發(fā)生的情況。
在另一實施例中，為了獲得與所采用的分析方法向適應(yīng)的濃縮物的體積，可對所獲得的濃縮物進(jìn)行第二次濃縮步驟。
在這個第二次濃縮步驟中，所使用的過濾裝置可以與第一次步驟所使用的裝置相同，但其體積較小，這個體積是根據(jù)起始體積和所需的濃縮物體積之間的比值計算得到的。
由于所處理的體積是一百毫升級別的，所以可使用已知的裝置，如采用離心分離技術(shù)的過濾裝置，如Millipore銷售的名為Centricon-Plus 80的裝置。
這些過濾裝置是被加工成所需尺寸，并且處理進(jìn)行的時間長度是確定的，這樣起始樣品的體積和最終樣品的體積之間的比值至少等于5000，較佳在15000到100000之間。
因此，使用本發(fā)明的過濾裝置具有以下的優(yōu)點可進(jìn)行多次收集，每次收集存在于用于分析的大體積液體中的微生物的得率接近100％，并確保由此收集得到的微生物的存活力，所進(jìn)行的多次收集的時間至多為1小時，這適合于如連續(xù)的健康監(jiān)測的需求，并且獲得的用于分析的濃縮物的體積可用于生化或生物學(xué)分析技術(shù)，尤其是免疫檢測和分子生物學(xué)技術(shù)。
下面的實施例非限制性地闡述了本發(fā)明過濾裝置的使用。實施例1裝置和方法使用的過濾裝置包括1m2的過濾面積，該面積由空心的乙酸纖維素纖維構(gòu)成；通過內(nèi)部通路導(dǎo)入由摻入MS2噬菌體的50升的自來水組成的樣品；在重力和壓力作用下收集濃縮物；采用溶菌斑技術(shù)，定量(在連結(jié)十倍稀釋樣品后)或定性(在由MS-2敏感的細(xì)菌培養(yǎng)物的感染進(jìn)行生物學(xué)擴(kuò)增后)測量噬菌體的存活力和感染性，從而分析該濃縮物。
步驟先對接種物進(jìn)行超聲波處理，然后將其加入從水箱中取出的自來水中，以解集病毒顆粒。
加入20mg/l的硫代硫酸鈉〔STS(Merck 106516)，即在50升中含有1g的量〕之后，在樣品中加入MS2。
進(jìn)行第一次過濾循環(huán)，然后排空該室，并將其密封，放置在空氣壓下(0.5b)。接著，在重力作用下收集濃縮物。然后還將壓縮空氣(0.5b)注入纖維中，以收集保留在纖維中的最后毫升級的濃縮物。
先對濃縮物進(jìn)行超聲波處理，然后采用溶菌斑技術(shù)使用大腸桿菌(E.coli)Hfr敏感株進(jìn)行計數(shù)。接種物的制備
SPW＝鹽水蛋白胨水；PFU＝噬斑形成單位(感染病毒單位)；I10x＝含有10xPFU/ml的接種物。
過濾過濾50升的STS中和的自來水，排空該室后，收集到濃縮物，該濃縮物構(gòu)成空白對照(即空白對照1，B1)。
在反洗以洗凈膜后，過濾50升STS中和的自來水，然后，在排空該室后，收集濃縮物，該濃縮物為空白對照2(B2)。
在反洗以洗凈膜后，用STS中和50升自來水。
等待15分鐘后，取出1升水稀釋接種物供水箱用。
使用1升的水稀釋1ml的I10(10PFU)。
在一個過濾循環(huán)后，收集濃縮物(C10)。
進(jìn)行反洗。
在這個實施例中，用至少20升的水進(jìn)行反洗。
然后重復(fù)相同的步驟，加入1ml的I104(104PFU)。
取出過濾期間的濾液樣品，得到樣品(F)。過濾結(jié)束時，收集濃縮物(C104)。
將1ml的I104(104PFU)加到100ml的B1組分中，得到摻入的空白對照樣品(BD104)。
分析——I100、I10、I1、C104、BD104的定量分析將各份純樣品和接種物的等分試樣加到試管中，進(jìn)行超聲波處理，然后稀釋。
采用溶菌斑技術(shù)給感染顆粒計數(shù)，步驟如下將2ml熔融(44℃)的軟頂層瓊脂(0.95％)與1ml的病毒懸浮液和0.3ml的指數(shù)生長期的大腸桿菌Hfr培養(yǎng)物混合?？焖俸洼p微攪拌該混合物，然后將其倒入培養(yǎng)皿中的硬營養(yǎng)瓊脂的整個表面上。37℃培育后，在第二天讀取溶菌斑。所得結(jié)果
例如，C10410-1表示從摻入104PFU的樣品中獲得的濃縮物的1/10稀釋度。
定性測定檢測I107(陽性對照＝T+)、F(1份50ml的樣品)、B2(6×50ml+剩余物，以涵蓋整個樣品)、C10(6×50ml+剩余物，以涵蓋整個樣品)上噬菌體的存在或缺乏。
將1體積的樣品與1體積兩倍濃縮的營養(yǎng)肉湯混合。37℃培育30分鐘后，用指數(shù)生長期的大腸桿菌Hfr培養(yǎng)液接種。37℃過夜培育后(病毒繁殖期)，在培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)瓊脂上平板培養(yǎng)大腸桿菌Hfr的指數(shù)生長期培養(yǎng)液，并使其干燥。沉積出病毒擴(kuò)增肉湯，使其在37℃至少培育6小時。
在肉湯沉積點上鋪滿或多或少的溶菌斑的存在揭示了感染的顆粒的存在。
在感染顆粒不存在的例子中，大腸桿菌Hfr的生長在沉積的位置上產(chǎn)生厚厚一層的細(xì)胞。
N陰性；P陽性；na不適用結(jié)果的解釋空白對照(B2)含有未感染的噬菌體，因此該組件之前并未受到MS2的污染，之后進(jìn)行的10PFU的濃縮是有效的。
濃縮104PFU期間采集的濾液樣品(50ml)含有不可檢測的MS2，因此膜有效地保留了這種直徑為25nm的病毒。
由于在C10中檢測到4個感染單位，所以其檢測閾值低于10PFU。
因為測量涉及噬菌體的感染性，所以在沒有任何具體的收集方法的情況下(沒有攪拌和洗脫)加入104PFU時實際的得率(即涉及接種物的測量滴度C/I)為60％，并且考慮到存活力。
C/BD的比值非常接近該實際得率，這證明由于濃縮的緣故而沒有干擾。實施例2裝置和方法
使用包括0.6m2的過濾面積的過濾裝置，該面積由乙酸纖維素空心纖維制成。
樣品由加了寄生蟲小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)的卵母細(xì)胞的50升自來水組成。它由外部通路導(dǎo)入。
在重力作用和壓力下攪拌和收集濃縮物。
采用IMS-IFA(免疫磁性分離-免疫熒光檢測技術(shù)，ImmunoMagneticSeparation-ImmunoFluorescence Assay技術(shù)，參見美國環(huán)境保護(hù)機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)方法1622——EPA-EPA-821-R-99-001)，使用Dynal抗隱孢子蟲屬Dynabeads試劑盒(參考號730.01，與卵母細(xì)胞的完整性有關(guān))進(jìn)行分析。
步驟從水箱中取得自來水后，加入20mg/l的硫代硫酸鈉(STS，Merck 106516)，即1g/50升；在樣品中加入小隱孢子蟲(C.parvum)的卵母細(xì)胞；采用外部通路方法進(jìn)行過濾；對室進(jìn)行部分排空后，攪拌該組件，以依靠留在室中的液體收集纖維外表面上所有的卵母細(xì)胞，在重力作用下收集濃縮物，然后將壓縮空氣(0.5b)注入室中收集。
采用IMS-IFA給卵母細(xì)胞的原液和濃縮物的原液計數(shù)。
過濾方法過濾50升的STS中和的自來水，然后排空，收集濃縮物(空白對照，B)，此過濾結(jié)束后進(jìn)行反洗，以清潔膜；然后用STS中和50升的自來水，之后加入I10稀釋度的卵母細(xì)胞原液(即約10個卵母細(xì)胞)。
過濾后進(jìn)行排空，然后收集濃縮物(C10)；此過濾結(jié)束后用至少10升水反洗。
然后重復(fù)相同的步驟，加入I100(大約100個卵母細(xì)胞)，得到濃縮物C100，然后加入I1000(大約1000個卵母細(xì)胞)，得到濃縮物C1000。分析—采用IMS/IFA進(jìn)行I10、I100、I1000、B、C10、C100和C1000計數(shù)。結(jié)果
不應(yīng)對高于測量接種物所得的值的C10和C100的結(jié)果有多大的驚訝在顯微鏡下計算卵母細(xì)胞數(shù)量的樣品具有波動，與在計數(shù)為1以上、且相同的樣品被倍增的情況下所看到的一樣。這種現(xiàn)象在卵母細(xì)胞稀少時更顯著。
因此，對于C10和C100，在過濾恒定后必須考慮放大的倍數(shù)。
對于C1000，也可以談到得率。
結(jié)果的解釋采用外部通路進(jìn)行的過濾方法對10個或10個以下的卵母細(xì)胞具有敏感性。
對于1000個卵母細(xì)胞的接種，所得的得率是70％，這個結(jié)果沒有最佳化。實施例3除了過濾裝置外，本實施例中的其它步驟和方法與實施例1中的相同。
使用由乙酸纖維素空心纖維制成的過濾面積為0.6m2的過濾裝置過濾。
該樣品由摻入MS2噬菌體的50升自來水組成；通過內(nèi)部通路(A)導(dǎo)入。
在重力作用下和壓力下收集濃縮物。
僅產(chǎn)生一個空白對照(B1)，連續(xù)加入1、10和100PFU。
如實施例1，采用溶菌斑技術(shù)進(jìn)行分析。
根據(jù)下面所述的步驟進(jìn)行過濾從前述過濾步驟中得到的濃縮物的第二步。
將空白對照濃縮物(B1)和各個噬菌體濃縮物(C11、C110、C1100)(每份大約230ml)等分成3份相同的試樣(70-80ml)，以用于在3個市售的Centricon-Plus 80組件(Millipore，參考號UFC5LGC08)中進(jìn)行第二次濃縮。
混合由此獲得的各加入物的3份濃縮物C2(＜1ml)，然后采用溶菌斑技術(shù)定量分析滴度。對從濃縮物B1得到的3份空白對照濃縮物(B2)采用相同的步驟。
結(jié)果—接種物的滴度I100＝144PFU(與實施例1一樣，是總的平均值)；—在第二次過濾后獲得的濃縮物的滴度
例如，C21表示加了1PFU的初始樣品在進(jìn)行第二步濃縮結(jié)束時所獲得的3份濃縮物的混合物。
結(jié)果的解釋通過這兩個濃縮步驟，將樣品的體積從50升減少到3ml以下，其敏感性接近1PFU。
當(dāng)然，本發(fā)明并不限于所述和/或敘述的示范性例子，而包括所有的屬于附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)的可交換的形式(尤其關(guān)于用于濃縮樣品的膜的性質(zhì)和特征方面)。實施例4裝置和方法使用包括第一過濾階段中使用的由乙酸纖維素空心纖維制成的過濾面積為0.12m2的過濾裝置，和用于第二過濾階段的Vivacel170消耗品(SartoriusVivasciences，參考號VS6002)。
樣品由同時摻入300個寄生蟲小隱孢子蟲的卵母細(xì)胞和300個CFU的大腸桿菌的30升自來水組成。
濃縮從水箱中取得水后，加入20mg/l的硫代硫酸鈉(Merck 106516)，即0.6g/301；將小隱孢子蟲的卵母細(xì)胞和大腸桿菌細(xì)胞加到樣品中。
階段1從30升到70ml采用外部通路模式進(jìn)行過濾。
在對室進(jìn)行部分排空和攪拌該組件后，通過將壓縮空氣(0.5b)注射到該室中，收集含有上述微生物的滯留物，大約有35ml。
通過注射入密閉的內(nèi)部腔室而將未加入微生物的中和化自來水(大約35ml)由纖維再導(dǎo)入室中，然后如先前進(jìn)行攪拌和收集。
兩份收集的樣品的組合(即70ml)構(gòu)成滯留物R1。
階段2從70ml到300微升如供應(yīng)商所示，在Vivacel170消耗品中濃縮該滯留物R1，25℃時以1000g的離心力離心10分鐘。為了促進(jìn)收集，在過濾室中的濃縮物中加入1ml的濾液，然后使過濾元件以高速短暫地“渦旋”(vortexed)。在和先前相同的條件下進(jìn)行進(jìn)一步的離心操作，獲得最大體積為300微升的再濃縮物。這就是最終的滯留物R2。
平行產(chǎn)生三份滯留物R2，以獲得三個結(jié)果。
分析對小隱孢子蟲的研究先后采用IMS(免疫磁性分離-Dynal抗隱孢子蟲屬Dynabeads試劑盒，參考號730.01)和IFA(免疫熒光檢測)計算卵母細(xì)胞的原液和滯留物的餾分(參見方法1622)。
根據(jù)下述步驟采用IMS(同上)和PCR先后分析滯留物的餾分—從IMS中獲取珠/卵母細(xì)胞復(fù)合物，放到10μl的超純無菌水+10μl的50％Chelex-100的水溶液中；—進(jìn)行5組熱沖擊95℃2分鐘/-80℃2分鐘；—離心沉淀濃縮物；—加入30μl的擴(kuò)增混合物(PCR緩沖液，MgCl21.5mM，牛血清白蛋白10pg/μl，dNTP200pmol/μl，Taq DNA聚合酶0.5U，引物BB-3和BB-4各為1pmol/μl，加入超純水，使總體積達(dá)到50μl)。
Balatbat A.B.等在《臨床微生物雜志》(J.Clin.Microbiol.)，1996，34，1769-1772中描述了引物BB-3和BB-4。
—采用下述PCR程序94℃5分鐘，共40輪循環(huán)，其中包括94℃30秒、60℃45秒、72℃1分鐘；然后為72℃5分鐘。
—將10μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物移到含有2％瓊脂糖且存在溴乙錠的電泳凝膠上進(jìn)行電泳。
對大腸桿菌的研究根據(jù)IDEXX供應(yīng)商的建議，采用“Colilert 18h’技術(shù)計算大腸桿菌培養(yǎng)液和滯留物的餾分的數(shù)量。此方法是以大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶活性的檢測為基礎(chǔ)。
對編碼β-葡糖醛酸酶的uidA基因進(jìn)行嵌套式PCR，從而分析滯留物的餾分，其步驟如下—在膜(Millipore，直徑為13mm，孔隙度為0.2μm，Durapore GVWP013 00)上過濾濃縮物餾分；—將膜插入0.2ml PCR管中；—熱沖擊式裂解細(xì)胞(85℃1分鐘/冰中1分鐘，共6輪)；—使用引物U270和L1054在裂解試管中進(jìn)行第一次擴(kuò)增U2705′-ggT CAC TCA TTA Cgg CAA Ag-3′L10545′-TTA Aag CCg ACA gCA gCA gT-3′將擴(kuò)增混合物(150μl)放在含有膜的PCR管中PCR緩沖液，MgCl21.5mM，dNTP200pmol/μl，Taq DNA聚合酶1.5U，引物各為1pmol/μl，加入超純水，使總體積達(dá)到150μl。
PCR程序95℃10分鐘，共30輪，其中包括94℃1分鐘、60℃1分鐘；然后維持在4℃。
—在超純水中稀釋所得的擴(kuò)增子100倍，使用1μl此稀釋液作為第二次擴(kuò)增(即嵌套式PCR)的底物，引物為Val754和Val900Val 7545′-AAA ACg gCA AgA AAA AgC Ag-3′Val 9005′-Acg CgT ggT TAC AgT CTT gCg-3′
將擴(kuò)增混合物(50μl)放到新的試管中PCR緩沖液，MgCl21.5mM，dNTP200pmol/μl，Taq DNA聚合酶0.5U，引物各為1pmol/μl，加入超純水，使總體積達(dá)到50μl。
PCR程序同上。
—取出10μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物，將其加到含有2％瓊脂糖且存在溴乙錠的電泳凝膠上進(jìn)行電泳。
滯留物R2的處理將各滯留物分別分成100μl的3組餾分，分別為R2a、R2b和R2c。
再將餾分R2a分成兩份采用“Colilert 18h’方法處理其中的50μl(用于大腸桿菌計數(shù))，另50μl由IMS-IFA處理(用于小隱孢子蟲計數(shù))。
采用uidA嵌套式PCR分析餾分R2b(用于大腸桿菌的分子檢測)，但在進(jìn)行此分析前，先將其等分成2份，其中50μl直接用于分析，而另50μl則加入大腸桿菌基因組DNA(抑制試驗)。
采用IMS-PCR分析餾分R2c(用于小隱孢子蟲的分子檢測)，但在進(jìn)行此分析前，先將其等分成2份，其中50μl直接用于分析，而另50μl則加入小隱孢子蟲基因組DNA(抑制試驗)。
各PCR有各自的陰性對照(無靶DNA和無滯留物)和陽性對照(具有靶DNA但沒有滯留物)。
在溴乙錠存在的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察所有的擴(kuò)增子。
結(jié)果每個點重復(fù)進(jìn)行3次，重復(fù)進(jìn)行得到的結(jié)果在下表中用“/”分開。
結(jié)果的解釋采用Colilert檢測到濃縮物中大腸桿菌細(xì)胞數(shù)量少乃至死亡率可解釋為在濃縮過程中細(xì)菌所經(jīng)受的應(yīng)力所致，因為這個試驗是以酶活性的檢測為基礎(chǔ)。
uidA PCR對于三次重復(fù)都是陽性的，這表明該方法對于總的50個細(xì)菌/5升(即每升5個細(xì)菌)具有可重復(fù)的敏感性。
從邏輯上說，將細(xì)菌DNA加到餾分中作為抑制對照也獲得陽性反應(yīng)。在隱孢子蟲屬的例子中，表型方法(IMS-IFA)獲得比期望的理論值低得多的計數(shù)。同樣，這也可能是一些卵母細(xì)胞在濃縮過程中受到不利的影響的緣故，而非這些卵母細(xì)胞保留在過濾裝置中的緣故，因為基于分子生物學(xué)的其它試驗表明，在10升中可重復(fù)收集1個卵母細(xì)胞(在本專利中未公開數(shù)據(jù))。
順便說一下，IMS-PCR對于三次重復(fù)都是陽性的，它獲得50個卵母細(xì)胞/5升的最小敏感性，即5個卵母細(xì)胞/升。
結(jié)論本實施例闡明了采用分子生物學(xué)方法檢測一份且相同的摻入水樣品中的細(xì)菌和寄生蟲的兩步濃縮裝置的有效性。
權(quán)利要求
1.一種過濾裝置的用途，該過濾裝置包括室(2)，在室(2)中有許多相互平行排列著的空心纖維(3)，這些纖維的多孔壁(3a)限定了孔(4)，這樣，所述裝置包括由所述各個空心纖維的許多平行的孔(4)組成的內(nèi)部通路(A)和對應(yīng)于這些纖維和該室之間的有效體積的外部通路(B)；該裝置用于處理呈稀釋狀態(tài)的、含有多種不同大小的微生物的大體積起始液體樣品，以獲得呈濃縮狀態(tài)的、含有相同的相應(yīng)組分的微生物的小體積最終液體樣品；在使用這種裝置時，要進(jìn)行至少一個濃縮步驟，其中a)采用單過濾裝置；b)以正向模式使用所述過濾裝置；c)確定纖維的多孔壁(3a)的截留閾值，以留住起始樣品中尺寸最小的微生物；并間斷地進(jìn)行以下步驟d)在過濾階段，通過過濾裝置的通路(A，B)導(dǎo)入所有的起始液體樣品，從該過濾裝置的其它通路(B，A)移出濾液，濃縮物在導(dǎo)入液體樣品的所述通路中積聚；e)在收集階段，在使所有的樣品通過后，起始液體樣品在所述過濾裝置(1)中從所述通路到所述其它通路的流通停止，獲得出口液體樣品，即濃縮物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，進(jìn)行所述過濾階段(d)時沒有預(yù)過濾所述起始液體樣品。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述過濾裝置是超濾裝置。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的用途，其特征在于，所述過濾裝置的纖維由有機(jī)膜(如由乙酸纖維素、乙基纖維素、聚醚砜或聚丙烯腈制成)組成，或者由無機(jī)膜如陶瓷組成。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其特征在于，所述過濾裝置的空心纖維的兩端埋植于樹脂中，以防止污染物在內(nèi)部通路(A)和外部通路(B)之間以及該過濾裝置和外部之間的任何通過。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的用途，其特征在于，所述過濾裝置的大小確定，過濾階段的時間長短確定，這樣起始樣品與最終樣品之間的體積比值至少等于50，較佳在150-500之間。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的用途，其特征在于，導(dǎo)入起始樣品的通路是內(nèi)部通路(A)，提取出口樣品的通路是外部通路(B)。
8.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的用途，其特征在于，導(dǎo)入起始樣品的通路是外部通路(B)，提取出口樣品的通路是內(nèi)部通路(A)。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，在過濾階段d)和收集階段e)之間，外部通路是空的，并且有可能用空氣增壓。
10.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，在濃縮物的自流作用下進(jìn)行收集階段(e)，和/或通過使增壓空氣進(jìn)入內(nèi)部通路而進(jìn)行收集階段(e)。
11.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，在進(jìn)行過濾階段(d)期間，通過將起始液體樣品傳送到內(nèi)部通路的入口和/或在所述外部通路的出口處抽吸，使該樣品環(huán)流通過該內(nèi)部通路。
12.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，在過濾階段(d)和收集階段(e)之間，外部通路被部分或完全排空。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，通過洗脫外部通路中的濃縮物而獲得最終液體樣品。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的用途，其特征在于，在反洗階段，將可能沒有微生物的液體從所述通路環(huán)流通過所述其它通路。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的用途，其特征在于，進(jìn)行至少兩步連續(xù)的濃縮步驟，這兩個步驟使用權(quán)利要求1所述的濃縮裝置進(jìn)行，在第一次濃縮步驟結(jié)束時獲得的濃縮物構(gòu)成第二次濃縮步驟的起始液體樣品。
16.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的用途，其特征在于，對一份液體樣品進(jìn)行至少兩次連續(xù)的處理，至少一個這樣的處理是權(quán)利要求1中所述的濃縮步驟，第一次處理結(jié)束時獲得的濃縮物構(gòu)成第二次處理的起始液體樣品。
17.如權(quán)利要求15或16所述的用途，其特征在于，所述過濾裝置被加工成所需尺寸，所述處理進(jìn)行的時間長度是確定的，這樣，起始樣品的體積與最終樣品的體積比值至少等于5000，較佳在15000-100000之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及過濾裝置的使用，該過濾裝置包括室(2)，在室(2)中有許多相互平行排列著的空心纖維(3)，這些纖維的多孔壁(3a)限定了孔(4)，這樣所述裝置包括內(nèi)部通路(A)和對應(yīng)于這些纖維和圓盤分離器之間的有效體積的外部通路(B)；該裝置用于處理呈稀釋狀態(tài)的含有多種不同大小的微生物的大體積起始液體樣品。本發(fā)明的特征是，在進(jìn)行至少一個濃縮步驟期間，僅需要一個過濾裝置，纖維的多孔壁(3a)的原子質(zhì)量單位閾值是確定的，以留住起始樣品中最小的微生物，所述裝置以正向模式和間斷地使用，從而提供出口液體樣品，即濃縮物。
文檔編號G01N33/48GK1440453SQ01812039
公開日2003年9月3日 申請日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月9日
發(fā)明者E·吉約, L·杜蘭德－布魯里勒, S·布爾特奧 申請人:比奧·麥利尤股份有限公司