專利名稱：檢測(cè)瘦素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于瘦素活性系統(tǒng)，更具體地，本發(fā)明是關(guān)于體外檢測(cè)瘦素或擬瘦素生物活性的物質(zhì)，本檢測(cè)法適用于分子文庫(kù)的高效篩選。
瘦素(leptin)是肥胖基因的產(chǎn)物(Zhang，Y.，et al.1994，Nature 372，425)，作為一種外周信息可傳遞至調(diào)節(jié)攝食與能量代謝的腦區(qū)，瘦素被認(rèn)為通過(guò)其受體OB-R在下丘腦部位發(fā)揮作用(Tartaglia，L.A.，et al，1995，Cell 83，1263)。嚙齒動(dòng)物的基因突變阻礙了瘦素或全長(zhǎng)瘦素受體OB-R的正常表達(dá)，造成深度肥胖、糖尿病、代謝率降低(ColemanD.L.1978，Diabetologial4，141，)。然而，在人類，并未顯示肥胖與編碼瘦素或OB-R基因的突變相關(guān)(Considine，R.V.，et al.1995，J.Clin.Invest.95，2986；Considine，R.V.，et al，1996，Diabetes19，992)。雖然發(fā)生肥胖基因突變的小鼠在給予重組的瘦素后，可恢復(fù)正常體重(Pelleymounter，M.a.，etal.1995，Science 269，540 Halaas，J.L.，et al，1995，Science 269，543；Campfield，L.A.，etal，Science 269，546)，但這一方法看來(lái)不能在肥胖的人中獲得成功，因?yàn)榉逝秩搜逯械氖菟厮介L(zhǎng)期較高(Maffei，M.，et al，1995，Nature Med.1，1155；Considine，R.V.，et al.，1996，N.Engl.J.Med.334，292；Sinha，M.K.，et al.，1996，J.Clin.Invest.98，1277)，因此肥胖的人表現(xiàn)為“瘦素抗性”(Maffei，M.，et al，1995，NatureMed.1，1155；Flier，J.S.&Elmquist，J.k.1997，Nature Biotech.15，20；Campfield，L.A.，etal，1996，Horm.Metab.Res.28，619)，在肥胖人中并不產(chǎn)生與血清瘦素水平相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。也許是由于瘦素通過(guò)血腦屏障的傳輸缺陷(Caro，J.F.，et al 1996，Lancet348，159)或缺乏適當(dāng)?shù)腛B-R應(yīng)答。對(duì)OB-R信號(hào)通路分析顯示。肥胖人接受選擇性治療，可提高OB-R的應(yīng)答，可克服瘦素抗性并使肥胖逆轉(zhuǎn)。瘦素與OB-R分別是四螺旋束細(xì)胞因子和受體大家族的成員(Tartaglia，L.A.，et al，1995，Cell83，1263；Madej，T.，et al，1995，F(xiàn)EBS Lett.373，13)。OB-R與信號(hào)傳遞受體的糖蛋白gp130密切相關(guān)，gp130被白介素-6與親膽堿能神經(jīng)元因子(CNTF)所激活，該信號(hào)傳遞通路已被重點(diǎn)研究(Kishimoto，T.，et al，1992，Science 256，593；Stahl，N.&Yancopoulos，G.D.1994，J.Neurobiology 25，1454)。
瘦素受體被翻譯為具有不同細(xì)胞區(qū)域的幾種剪接產(chǎn)物(Tartaglia，L.A.，etal，1995，Cell 83，1263；Lee，G-H.，et al 1996，Nature379，632；Chen，H.，et al，1996，Cell 84，491；Cioffi，J.A.，et al，1996，Nature Med.2，585；Wang M.Y.，et al，1996，F(xiàn)EBSLett.392，87)，但是，僅有一種稱為長(zhǎng)形或OB-Rb的異構(gòu)形式顯示能介導(dǎo)瘦素的體重控制效應(yīng)(Lee，G-H.，et al 1996，Nature379，632；Chen，H.，et al，1996，Cell84，491；Ghilardi，N.，et al，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，6231；Baumann，H.，et al，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8374)。糖尿病肥胖(db)小鼠的OB-R發(fā)生突變，阻礙了OB-R長(zhǎng)片段異構(gòu)形式的表達(dá)，而使它們不能適當(dāng)?shù)亟閷?dǎo)瘦素的作用(Lee，G-H.，et al 1996，Cell 84，491)。
發(fā)現(xiàn)新的具生物活性的分子用作治療威脅生命疾病的藥物，這種發(fā)現(xiàn)包括兩個(gè)基本操作(1)多少帶有隨機(jī)性的分子選擇，或經(jīng)化學(xué)合成或從自然源中分離制備；(2)檢測(cè)候選分子的性質(zhì)。發(fā)明過(guò)程的重復(fù)性是無(wú)法預(yù)料的，一直到具理想性質(zhì)的分子被確定。在大多數(shù)情況下，用于檢測(cè)所選擇的分子類型屬于相當(dāng)狹窄的化學(xué)類型。例如新的肽激素的發(fā)現(xiàn)包括了對(duì)肽的研究，新的治療用類固醇的發(fā)現(xiàn)包括類固醇核的研究，新的功能性分子的發(fā)現(xiàn)，特別在自然界，主要靠“運(yùn)氣”，極大地耗費(fèi)時(shí)間、辛勤的工作、昂貴的經(jīng)費(fèi)，并且是不可預(yù)知的。
生物學(xué)活性的現(xiàn)代理論闡述，生物學(xué)活性及生理學(xué)狀態(tài)是分子識(shí)別的結(jié)果。例如核苷酸能夠形成互補(bǔ)的堿基對(duì)，這樣互補(bǔ)的單鏈分子雜交，導(dǎo)致形成雙鏈或三鏈的螺旋結(jié)構(gòu)，它們似乎與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。另一個(gè)例子是稱為配體的生物活性分子與另一分子(通常是稱為配體的受體的大分子(例如受體或酶))相結(jié)合，這種結(jié)合形成的分子反應(yīng)鏈最后導(dǎo)致產(chǎn)生一種生理狀態(tài)，例如導(dǎo)致正常細(xì)胞生長(zhǎng)、分化；導(dǎo)致癌瘤形成的異常細(xì)胞生長(zhǎng)；血壓調(diào)節(jié)；產(chǎn)生神經(jīng)脈沖與傳播。配體與配體受體的結(jié)合具幾何學(xué)的特點(diǎn)，有非常高的特異性，涉及合適的三維結(jié)構(gòu)排列和化學(xué)相互作用。
目前，開(kāi)發(fā)用于治療疾病的藥物的有效策略包括發(fā)現(xiàn)生物受體、酶或與相應(yīng)的大分子相結(jié)合的配體形式，它們模擬配體增強(qiáng)(激動(dòng))、或抑制(拮抗)受體產(chǎn)生的活性。尋找理想配體的工作傳統(tǒng)地一直在進(jìn)行，或是通過(guò)隨機(jī)地篩選相關(guān)分子(通過(guò)化學(xué)合成或從自然來(lái)源中進(jìn)行分離，例如見(jiàn)K.Nakanishi，ActaPharm.，1992，4，319-328.)，或通過(guò)所謂“合理的”途徑進(jìn)行，包括對(duì)主導(dǎo)結(jié)構(gòu)(通常是天然配體)的鑒別，經(jīng)歷多次結(jié)構(gòu)再設(shè)計(jì)和生物學(xué)測(cè)試，使其性質(zhì)最優(yōu)化，(例如，見(jiàn)Testa，B.&Kier，L.B.Med.Res.1991，11，3548Rotstein，S.H.&Mureko，M.A.，J.Med.Chem.1993，36，1700)。由于發(fā)明最有用的藥物不是通過(guò)“合理的”途徑，而是通過(guò)對(duì)化合物隨機(jī)的篩選，近來(lái)出現(xiàn)一種尋找藥物的混合途徑，即以組合化學(xué)法構(gòu)建隨機(jī)形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)物的巨大文庫(kù)，再?gòu)闹泻Y選特異生物活性(Brenner，S&Lerner，R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89，5381)，從如此巨大的隨機(jī)形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)文庫(kù)中進(jìn)行篩選，需要有成本合算的生物學(xué)測(cè)試方法，并使這種測(cè)試法自動(dòng)化。
傳統(tǒng)的體內(nèi)檢測(cè)瘦素的方法是給Ob/Ob小鼠進(jìn)行注射，觀察小鼠體重減輕情況。該生物學(xué)測(cè)定方法麻煩、費(fèi)時(shí)，且無(wú)重復(fù)性，也不適于對(duì)含有數(shù)百萬(wàn)化合物的文庫(kù)進(jìn)行高流通量(high throughput)的篩選。但還是有一些較簡(jiǎn)單的檢測(cè)系統(tǒng)。例如含YXXQ序列的長(zhǎng)OB-R的發(fā)現(xiàn)(Tartaglia，L.A.，et al，1995，Cell 83，1263)，該序列是可激活STAT3的基序(Stahl，N.，et al1995，Sciece 267，1349)，提高了STAT3介導(dǎo)瘦素應(yīng)答的可能性，最近的結(jié)果證明STAT3既可在培養(yǎng)的細(xì)胞中(Ghilardi，N.，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，6231；Baumann，H.，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8374；Rosenblum，C.I.，et al.，(1996)Endocrinology137，5178)，也可在活體內(nèi)(Vaisse，C.，et al.，(1996)Nature Gen.14，95)被長(zhǎng)OB-R而非短OB-R或發(fā)生YXXQ基序突變的長(zhǎng)OB-R(Baumann，H.，et al.，(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，8374；White，D.W.，et al.，(1997)，J.Biol.Chem.272，4065)激活。PCT專利申請(qǐng)，NO.WO9857177建議利用STAT3的活化作為體外瘦素簡(jiǎn)易生物檢定法的基礎(chǔ)。但是，STAT3可被很多其他因子如激素和細(xì)胞因子激活，包括IL-6、CNTF、IFN-α、IFN-β、生長(zhǎng)激素及許多細(xì)胞因子和多肽激素。因此，STAT3的活化不能用作為瘦素活性的特異標(biāo)志。
PCT申請(qǐng)WO9740380公開(kāi)了稱為“瘦素應(yīng)答元件”的DNA盒，將這一DNA盒附著于啟動(dòng)子(如胸苷激酶啟動(dòng)子)與報(bào)道基因如熒光素酶上，以提供合適的報(bào)道載體。以報(bào)道載體轉(zhuǎn)染表達(dá)瘦素受體OB-Rb的細(xì)胞。以這種細(xì)胞作為體外檢測(cè)瘦素的工具。但PCT申請(qǐng)WO9740380所建議的“瘦素應(yīng)答元件”是與“γ-激活序列”相一致的，γ-激活序列是眾所周知的，可被許多其他細(xì)胞因子激活，特別是IFN-γ，IFN-α與IFN-β。因此根據(jù)γ激活序列的試驗(yàn)，并不能區(qū)分是擬瘦素活性，還是擬干擾素活性。
另一體外檢測(cè)法以嵌合受體為基礎(chǔ)，該受體由融合于跨膜功能區(qū)的OB-R細(xì)胞外功能區(qū)和報(bào)道受體(如白介素-3受體)的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)組成。已證明表達(dá)所述嵌合受體的白介素-3依賴性細(xì)胞能用來(lái)檢測(cè)促進(jìn)細(xì)胞增殖的瘦素。因此，當(dāng)接觸瘦素后，所述細(xì)胞發(fā)生增殖，其增殖可經(jīng)MTT染色或放射標(biāo)記胸苷的摻入加以測(cè)定(Verploegen SA，et al.1997，F(xiàn)EBS Lett.405，237)。這個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)是可靠的，對(duì)檢測(cè)瘦素有用，并可用于高流通量篩選。但根據(jù)該試驗(yàn)，經(jīng)高流通量篩選出的分子可能完全不是瘦素類物質(zhì)。例如，已顯示，在高流通量篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)的真正的胰島素類物質(zhì)通過(guò)與胰島素受體的胞質(zhì)功能區(qū)交叉反應(yīng)而起作用(Zhang B.，et al.，1999，Science284，974)。因此，通過(guò)例如瘦素—白介素-3嵌合體這樣的嵌合受體來(lái)選擇的分子會(huì)與嵌合體的胞質(zhì)白介素-3來(lái)源的功能區(qū)互相作用，因此被認(rèn)為是白介素-3的類似物而不是瘦素類似物，所以用這種試驗(yàn)篩選瘦素類物質(zhì)是不可靠的。
瘦素是肥胖基因在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。瘦素通過(guò)下丘腦受體OB-Rb調(diào)節(jié)攝食和能量代謝，缺乏瘦素，如在ob/ob小鼠或缺乏OB-Rb的情況下，會(huì)象db/db小鼠那樣導(dǎo)致病態(tài)肥胖。然而，人肥胖最常見(jiàn)的原因與瘦素缺乏并無(wú)聯(lián)系，事實(shí)上血清瘦素與體質(zhì)指數(shù)有關(guān)。因此，肥胖者其血清中有高水平的瘦素。由這種相關(guān)性形成了肥胖與某種形式的瘦素抗性有關(guān)這一概念。一種可能的瘦素抗性機(jī)理是瘦素不能有效地透過(guò)血腦屏障。事實(shí)上，給嚙齒動(dòng)物腦室內(nèi)給予瘦素顯然較外周給予瘦素更有效地減少脂肪組織質(zhì)量。
開(kāi)發(fā)能透過(guò)血腦屏障的瘦素類物質(zhì)可解決瘦素抗性問(wèn)題，為此，篩選低分子量物質(zhì)組成的文庫(kù)有益于鑒別顯示擬瘦素活性的物質(zhì)，這種篩選需要一種簡(jiǎn)單、特異的瘦素活性測(cè)定的生物檢定法。到目前為止，如上所述，瘦素的生物學(xué)活性僅能用動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，這樣的測(cè)定是繁鎖的，因此也不適合于篩選含有數(shù)百萬(wàn)不同物質(zhì)的文庫(kù)。雖已有幾種體外測(cè)定方法的敘述，但并非是瘦素特異性的。因此有必要建立一種簡(jiǎn)單而特異性的瘦素活性測(cè)定法，使這種測(cè)定法易于自動(dòng)化。
本發(fā)明方法以采用真核細(xì)胞或細(xì)胞線為宜，更好的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞線。
合適的細(xì)胞線為，例如，分化的鼠脂肪細(xì)胞，如Swiss 3T3 F442A鼠前脂肪細(xì)胞，或人細(xì)胞線，如人骨髓基質(zhì)細(xì)胞線hMS2-12。
按照本發(fā)明，用使用抗Ang-2的單克隆抗體或多克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)以常規(guī)方法檢測(cè)培養(yǎng)基中的Ang-2含量，這種ELISA方法可用于現(xiàn)代篩選方法，如大量樣品的篩選。采取常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞線中的Ang-2 RNA。
按照本發(fā)明，檢測(cè)Ang-2啟動(dòng)子的活化為先構(gòu)建一個(gè)構(gòu)建物，包括含一個(gè)啟動(dòng)子和至少一個(gè)瘦素應(yīng)答元件的Ang-2啟動(dòng)子區(qū)域以及與啟動(dòng)子區(qū)域操作性連接的報(bào)道基因，它們最好處于一合適載體中，然后轉(zhuǎn)染對(duì)瘦素應(yīng)答時(shí)能表達(dá)Ang-2的宿主細(xì)胞，然后與樣品一起培養(yǎng)，并用常規(guī)方法檢測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)。
發(fā)明還提供了一種載體，該載體包含編碼含一個(gè)啟動(dòng)子與至少一個(gè)瘦素應(yīng)答元件的Ang-2啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列，及與該啟動(dòng)子區(qū)域有效連接的報(bào)道基因。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明揭示了一種瘦素的測(cè)定方法。該方法適用于瘦素樣物質(zhì)的高流通量篩選。本發(fā)明揭示瘦素特異性地誘導(dǎo)培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中血管生成素-2(angiopoietin-2)基因的表達(dá)。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定瘦素誘導(dǎo)分泌的血管生成素-2(Ang-2)，從而達(dá)到瘦素樣物質(zhì)的高流通量篩選?；蛘?，通過(guò)測(cè)定連接于報(bào)道基因并插入培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞的Ang-2啟動(dòng)子的活性也可評(píng)估瘦素的活性。
本發(fā)明揭示了一種瘦素的體外測(cè)定法。該方法也適用于瘦素樣物質(zhì)的高流通量篩選。申請(qǐng)日為1999年9月5日的以色列待批專利申請(qǐng)No.131739揭示瘦素特異性地誘導(dǎo)培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)。在缺乏瘦素的培養(yǎng)脂肪細(xì)胞中無(wú)Ang-2的表達(dá)，瘦素誘導(dǎo)Ang-2的作用強(qiáng)、特異性高。因此，用不同劑量瘦素或瘦素樣物質(zhì)處理合適的真核細(xì)胞，并測(cè)量培養(yǎng)基中的Ang-2，編碼Ang-2的細(xì)胞mRNA，或測(cè)定Ang-2啟動(dòng)子的活化，可測(cè)得瘦素或瘦素樣物質(zhì)的活性。所述合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答而表達(dá)Ang-2的細(xì)胞或細(xì)胞線。一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是合適地培養(yǎng)的真核細(xì)胞，更佳為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別優(yōu)選的細(xì)胞線是Swiss 3T3 F442A鼠前脂肪細(xì)胞(Green，H.，Kehinde，O.，1975，Cell5，19)，將融合細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中維持6天，這些細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。另一更加優(yōu)選的細(xì)胞線是人骨髓基質(zhì)細(xì)胞線hMS2-12，該細(xì)胞線表達(dá)瘦素受體，并可被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞(Thomas T.，et al.，1999，Endocrinology 140，1630)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用很多合適的方法測(cè)定培養(yǎng)基中的Ang-2，編碼Ang-2的細(xì)胞mRNA，或測(cè)定Ang-2啟動(dòng)子的活化。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，開(kāi)發(fā)了用于鼠Ang-2定量測(cè)定的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。該ELISA需要產(chǎn)生小鼠單克隆抗體，以將Ang-2捕獲于ELISA板上。將純化單克隆抗體用作ELISA板的第一包被層，以便從培養(yǎng)上清液中捕獲Ang-2。在宿主動(dòng)物(例如家兔)中產(chǎn)生抗Ang-2的多克隆抗體。應(yīng)當(dāng)注意，用于產(chǎn)生抗體的Ang-2與其被瘦素誘導(dǎo)所用的細(xì)胞線應(yīng)該來(lái)自相同的種。為進(jìn)行該測(cè)定，將對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答而表達(dá)Ang-2的細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板上。將瘦素(陽(yáng)性對(duì)照)或推測(cè)為瘦素樣物質(zhì)的樣品加在培養(yǎng)物中，連續(xù)培養(yǎng)24～96小時(shí)。然后取出一份份培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到ELISA板上，用對(duì)Ang-2特異性的捕獲單克隆抗體將ELISA板預(yù)包被。將ELISA板培養(yǎng)1～16小時(shí)，洗滌，加上所述Ang-2多克隆抗體。將ELISA板培養(yǎng)1～16小時(shí)，洗滌，加上酶一抗體偶聯(lián)物。典型的偶聯(lián)物是與過(guò)氧化物酶或與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗家兔免疫球蛋白。將ELISA板培養(yǎng)1～16小時(shí)，洗滌，加適當(dāng)?shù)牡孜镲@色。所述ELISA適合于自動(dòng)高流通量篩選。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在用瘦素或瘦素樣物質(zhì)處理的所述培養(yǎng)細(xì)胞中測(cè)定Ang-2 mRNA。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)可測(cè)定特異性鼠Ang-2mRNA。例如，用特異性“分子信號(hào)”，可設(shè)計(jì)高流通量RT-PCR(Research Genetics，Huntsville Alabama，USA)。這些分子信號(hào)是分別在其5’和3’端含熒光染料和淬滅劑染料的單股寡核苷酸。該寡核苷酸設(shè)計(jì)成具有與Ang-2 cDNA序列互補(bǔ)的發(fā)夾環(huán)序列。該寡核苷酸還設(shè)計(jì)成具有發(fā)夾主干結(jié)構(gòu)，從而當(dāng)分子信號(hào)不連接于有待PCR擴(kuò)增的Ang-2 cDNA時(shí)，經(jīng)能量轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)被3’端淬滅劑染料淬滅而不發(fā)生熒光。但是，如果加入經(jīng)PCR擴(kuò)增的Ang-2 cDNA，則分子信號(hào)的互補(bǔ)環(huán)形成帶有靶PCR產(chǎn)物的比主干強(qiáng)的區(qū)帶。這種雜交導(dǎo)致使主干分離和產(chǎn)生熒光的構(gòu)象變化(Tyagi S.，和Kumar F.R.，1996，Nature Biotech.，16 49)。
為了進(jìn)行測(cè)定，將對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答而表達(dá)Ang-2的細(xì)胞培養(yǎng)在例如96孔板上。在培養(yǎng)物中加入瘦素(陽(yáng)性對(duì)照)或推定的瘦素樣物質(zhì)的樣品，繼續(xù)培養(yǎng)24～96小時(shí)。將板洗滌，從細(xì)胞單層提取總RNA。用隨機(jī)引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA用特異性Ang-2引物作定量PCR。Ang-2 mRNA的量反映在靶PCR產(chǎn)物的量中，借助所述分子信號(hào)測(cè)量該量。此測(cè)定法的所有步驟均適合于自動(dòng)高流通量篩選。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域的已知技術(shù)從基因組DNA鑒定和克隆人或鼠Ang-2啟動(dòng)子。將所述啟動(dòng)子和報(bào)道基因串聯(lián)連接到可復(fù)制的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。但是，可以存在訪問(wèn)(interviewing)序列，如果它們不干擾Ang-2啟動(dòng)子的功能化的話。報(bào)道基因可以是編碼易于檢測(cè)的肽、或者使轉(zhuǎn)錄或翻譯易于檢測(cè)的任何基因。它通常編碼非天然存在于宿主細(xì)胞或只被宿主細(xì)胞少量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。公知的報(bào)道基因包括例如氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(細(xì)菌的或螢火蟲(chóng)的)及其他基于酶的檢測(cè)系統(tǒng)，如β-半乳糖苷酶、堿性酸磷酶，等等。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，報(bào)道基因是熒光素酶基因。
報(bào)道基因構(gòu)建物包括a)包含一個(gè)啟動(dòng)子和至少一個(gè)瘦素應(yīng)答元件的Ang-2啟動(dòng)子區(qū)域，和b)與啟動(dòng)子區(qū)域操作性連接的報(bào)道基因。它最好處于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞用的合適載體中。載體可以是任何已知的載體，包括可在選定的宿主細(xì)胞中起作用的質(zhì)粒、粘粒和病毒載體。這樣的載體也形成本發(fā)明的另一方面。宿主細(xì)胞可以是對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答而表達(dá)Ang-2的任何細(xì)胞或細(xì)胞線。這種的細(xì)胞被所述報(bào)道載體穩(wěn)定或臨時(shí)轉(zhuǎn)染。一般來(lái)說(shuō)，較佳的宿主細(xì)胞是易于培養(yǎng)的真核細(xì)胞，更佳為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別好的實(shí)施例是分化的鼠脂肪細(xì)胞。最佳的細(xì)胞線是Swiss 3T3 F442A鼠前脂肪細(xì)胞(Green，H，和Kehinde，O，1975，Cell 5，19)，將融合細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中維持6天，于是分化為成熟的脂肪細(xì)胞。
為了進(jìn)行測(cè)定，將對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答而表達(dá)Ang-2的細(xì)胞或細(xì)胞線用所述報(bào)道載體穩(wěn)定或臨時(shí)轉(zhuǎn)染。所述細(xì)胞在96孔板上生長(zhǎng)和分化。在培養(yǎng)物中加入瘦素(陽(yáng)性對(duì)照)或推定的瘦素樣物質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)。24-96小時(shí)后測(cè)定孔中報(bào)道基因產(chǎn)物的水平。在本測(cè)定法中，通過(guò)測(cè)定所述報(bào)道基因構(gòu)建物的基因產(chǎn)物來(lái)測(cè)定Ang-2啟動(dòng)后的活化。因此，基因產(chǎn)物的水平對(duì)應(yīng)于瘦素或瘦素樣物質(zhì)的活性水平。
下面的實(shí)施例作進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例決不意味著對(duì)其范圍的限制。相反，可以清楚地理解，在閱讀本說(shuō)明書后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可要借助于其他各種實(shí)施方案、修改及其等同物實(shí)施本發(fā)明，而不背離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1 用Ang-2的ELISA測(cè)定瘦素和瘦素樣物質(zhì)鼠Swiss3T3 F442A細(xì)胞在96孔板上生長(zhǎng)、分化。在培養(yǎng)物中加入瘦素(陽(yáng)性對(duì)照)或推定的瘦素樣物質(zhì)至終濃度1μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后，取出一份份瘦素誘導(dǎo)或瘦素樣物質(zhì)誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至以鼠Ang-2特異性捕獲單克隆抗體預(yù)包被的ELISA板上。將微量滴定板(Dynatech或Maxisorb，by Nunc)用抗小鼠Ang-2單克隆抗體(無(wú)血清雜交瘤上清液或腹水免疫球蛋白)于4℃包被過(guò)夜。用含BSA(0.5％)和吐溫20(0.05％)的PBS洗板，并用同一溶液于37℃阻斷至少2小時(shí)。然后取出瘦素誘導(dǎo)或瘦素樣物質(zhì)誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)至ELISA板(100μl/孔)上，37℃4小時(shí)。將板用含吐溫20(0.05％)的PBS洗滌三次，再加入家兔抗小鼠Ang-2血清(1∶1000，100μl/孔)，4℃培養(yǎng)過(guò)夜。將板洗滌三次，加入山羊抗家兔辣根過(guò)氧化物酶共軛物(HRP，Jackson Labs，1∶10000，100μl/孔)，室溫下2小時(shí)。將板洗滌4次，用ABTS(2，2′-連氮一雙(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸，Sigma)顯色，以H2O2為底物。用ELISA自動(dòng)讀數(shù)儀對(duì)板讀數(shù)。實(shí)施例2 用Ang-2 RT-PCR測(cè)定瘦素和瘦素樣物質(zhì)鼠Swiss 3T3F442A細(xì)胞在96孔板上生長(zhǎng)、分化。在用瘦素刺激前將細(xì)胞于低血清(0.5％)中維持16小時(shí)。在培養(yǎng)物中加入瘦素(1μg/ml，陽(yáng)性對(duì)照)或推定的瘦素樣物質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。倒去板上的水，用TRI試劑盒(Molecular ResearchCenter Inc.)分離總RNA。用RNAaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(Super Script II，GIBCO-BRL)和1μg(N)6隨機(jī)引物(New England Biolabs，USA)，在20μl體積中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的等分物(2μl)用于PCR，采用VENT DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，USA)，有義和反義引物分別為muAng-2mRNA，AF4326.gb-ro，核苷酸637-657和1147-1167。在飽和前終止PCR反應(yīng)，分離PCR產(chǎn)物，在IM NaCl中37℃變性，于52℃與如下結(jié)構(gòu)的分子信號(hào)雜交5’若丹明-GCTGAG-CTGGAGAAGAAGCTGGTGACA-CTCAGC-3’-dabcyl.
此環(huán)相應(yīng)于鼠Ang-2 mRNA的核苷酸898-918，基因庫(kù)保藏號(hào)No.AF004326，主干一環(huán)結(jié)構(gòu)的Tm為61.6℃。熒光樣品代表通過(guò)表達(dá)Ang-2 mRNA對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答的那些結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3 用報(bào)道載體測(cè)定瘦素和瘦素樣物質(zhì)用鼠Ang-2全部啟動(dòng)子區(qū)域后接綠色熒光蛋白(GFP)基因而組成的報(bào)道載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼠Swiss3T3 F442A前脂肪細(xì)胞。細(xì)胞在96孔板上生長(zhǎng)、分化。在培養(yǎng)物中加入瘦素(陽(yáng)性對(duì)照)或推定的瘦素樣物質(zhì)的樣品，繼續(xù)培養(yǎng)。綠色熒光的出現(xiàn)表明細(xì)胞培養(yǎng)物接觸到了瘦素或瘦素樣物質(zhì)。實(shí)施例4 用報(bào)道載體測(cè)定瘦素和瘦素樣物質(zhì)用鼠Ang-2全部啟動(dòng)子區(qū)域后接綠色熒光蛋白(GFP)基因而組成的報(bào)道載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人hMS2-12基質(zhì)前脂肪細(xì)胞。細(xì)胞在96孔板上生長(zhǎng)、分化。在培養(yǎng)物中加入瘦素(陽(yáng)性對(duì)照)或推定的瘦素樣物質(zhì)的樣品，繼續(xù)培養(yǎng)。綠色熒光的出現(xiàn)表明細(xì)胞培養(yǎng)物接觸到了瘦素或瘦素樣物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)瘦素或瘦素樣物質(zhì)存在的方法，其特征在于包括將樣品與對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答而表達(dá)Ang-2的細(xì)胞或細(xì)胞線接觸，并測(cè)定培養(yǎng)基中的Ang-2、編碼Ang-2的細(xì)胞RNA或Ang-2啟動(dòng)子的活化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中采用真核細(xì)胞或細(xì)胞線。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述真核細(xì)胞或細(xì)胞線為哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞線。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述細(xì)胞線選自分化的鼠脂肪細(xì)胞線。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述細(xì)胞線是Swiss 3T3 F442A鼠前脂肪細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述細(xì)胞線選自人細(xì)胞線。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中細(xì)胞線是人骨髓基質(zhì)細(xì)胞線hMS2-12。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，用免疫試驗(yàn)在培養(yǎng)基中按常規(guī)方式測(cè)定Ang-2。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，用使用抗Ang-2單克隆和多克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在培養(yǎng)基中按常規(guī)方式測(cè)定Ang-2。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，所述方法適用于高流通量篩選。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以常規(guī)方式測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞線中Ang-2 RNA的存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，如下測(cè)定Ang-2啟動(dòng)子的活化構(gòu)建一個(gè)載體，該載體包括含一個(gè)啟動(dòng)子和至少一個(gè)瘦素應(yīng)答元件的Ang-2啟動(dòng)子區(qū)域和與啟動(dòng)子區(qū)域操作性連接的報(bào)道基因；轉(zhuǎn)染能對(duì)瘦素產(chǎn)生應(yīng)答而表達(dá)Ang-2的宿主細(xì)胞；與樣品一起培養(yǎng)；以常規(guī)方式測(cè)定報(bào)道基因的表達(dá)。
13.一種載體，包括編碼含一個(gè)啟動(dòng)子和至少一個(gè)瘦素應(yīng)答元件的Ang-2啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列，以及有效地連接于啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)道基因。
14.一種測(cè)定試劑盒，所述試劑盒用于實(shí)施前述任一權(quán)利要求所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中瘦素的方法,所依據(jù)的是對(duì)某些細(xì)胞或細(xì)胞線,例如Swiss 3T3 F442A鼠前脂肪細(xì)胞或人骨髓基質(zhì)細(xì)胞線hMS2－12內(nèi)瘦素誘導(dǎo)的血管生成素－2表達(dá)的檢測(cè)。瘦素的檢測(cè)為:用含有血管生成素－2啟動(dòng)子調(diào)控下的報(bào)道基因(例如綠色熒光蛋白(GFP))的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1378648SQ00814035
公開(kāi)日2002年11月6日 申請(qǐng)日期2000年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月11日
發(fā)明者M·魯賓斯坦, B·科恩 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究發(fā)展有限公司