專利名稱：使用合成抗原檢測梅毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是由一個(gè)美國政府機(jī)構(gòu)即“疾病控制和預(yù)防中心”完成的。
梅毒的進(jìn)程分為以下階段；初期、二期、潛伏期、神經(jīng)梅毒期和三期(晚期)。被感染個(gè)體在前兩個(gè)階段中可傳染其他人。當(dāng)細(xì)菌從被感染個(gè)體的潰瘍處蔓延到性伴侶的生殖器區(qū)域、嘴或者肛門的皮膚或粘膜時(shí)，傳播就發(fā)生了。梅毒密螺旋體生物體還可穿過身體其他部位的破損的皮膚。在三期梅毒和神經(jīng)梅毒期，細(xì)菌感染不是傳染性的，但所述生物體向器官、組織和腦中的侵入導(dǎo)致致命的后果，例如嚴(yán)重的心血管異?；蛏窠?jīng)疾病。
在孕婦受到感染且未接受治療的前四年中，可發(fā)生垂直的或經(jīng)胎盤的梅毒感染。盡管對母親進(jìn)行充分治療通常將預(yù)防先天性梅毒，但是據(jù)報(bào)道在子宮中接觸過梅毒密螺旋體的人類胎兒中仍有約25％死產(chǎn)。一些患有先天性梅毒的嬰兒在出生時(shí)表現(xiàn)出癥狀，但大多數(shù)在分娩(partum)后2-3個(gè)月時(shí)發(fā)展出癥狀。這些癥狀包括皮膚瘡、皮疹、發(fā)熱、肝脾腫大、黃疸、貧血和各種畸形。當(dāng)被感染嬰兒成年時(shí)，他們可能發(fā)展出晚期梅毒癥狀，包括對骨、牙、眼、耳和腦的不可逆性損傷。
初期梅毒的最初癥狀是潰瘍或下疳。在接觸后10天至3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)下疳，常常在與被感染性伴侶的潰瘍相接觸的身體部位上發(fā)現(xiàn)下疳，這些部位例如為陰莖、外陰、陰道、子宮頸、直腸、舌或唇。由于下疳持續(xù)僅數(shù)周且可能是無痛的或發(fā)生在體內(nèi)，因此它可能不被注意。在接受或不接受治療的情況下，下疳消失。在未接受治療的個(gè)體中，在初期損害出現(xiàn)后約9周時(shí)將出現(xiàn)二期癥狀。
二期梅毒常常以皮疹為標(biāo)志，其特征在于約美分大小的褐色瘡。由于在這些瘡中存在活性細(xì)菌，因此在這一階段任何與被感染個(gè)體破損皮膚間性或非性的直接接觸可能使感染蔓延。其他癥狀包括輕微的發(fā)熱、疲勞、頭痛、喉痛、片狀脫發(fā)和淋巴腺腫大。這些癥狀可能是輕微的，并且象初期梅毒的下疳一樣將在接受或未接受治療的情況下消失。如果未接受治療，被感染個(gè)體隨后進(jìn)入潛伏期。
潛伏梅毒的特征在于沒有臨床病征或腦脊液(CSF)的異常表現(xiàn)，但血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果為陽性。早期潛伏梅毒在感染1年內(nèi)出現(xiàn)，其可以潛在地傳播并可能復(fù)發(fā)，而晚期潛伏梅毒與對抗復(fù)發(fā)的免疫力和對再次感染的抗性相關(guān)。
在梅毒感染的早期，細(xì)菌可侵入神經(jīng)系統(tǒng)。如果不接受治療，就可能發(fā)展成神經(jīng)梅毒。所述疾病進(jìn)展到神經(jīng)梅毒可能需要20年，并且一些患有神經(jīng)梅毒的個(gè)體沒有發(fā)展出可識別的癥狀，這導(dǎo)致很難進(jìn)行診斷。那些存在癥狀的個(gè)體可能抱怨伴有頭痛、頸強(qiáng)直或發(fā)熱，這些都是由腦內(nèi)層(lining)的炎癥引起的。神經(jīng)梅毒患者還可能受到中風(fēng)的侵襲，伴有中風(fēng)的癥狀如麻木、虛弱或視覺問題。
盡管在未能接受治療的被梅毒密螺旋體感染的個(gè)體中約有三分之二將不會遭受更進(jìn)一步的疾病后果，但約三分之一的未受治潛伏梅毒患者發(fā)展出晚期或者說三期梅毒的并發(fā)癥。在梅毒三期，細(xì)菌損傷心臟、眼、腦、神經(jīng)系統(tǒng)、骨、關(guān)節(jié)或者身體的任何其他部分。梅毒的三期可持續(xù)數(shù)年或甚至數(shù)十年。晚期梅毒一般導(dǎo)致心血管疾病、精神病、失明或甚至死亡。
鑒于梅毒感染有時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的和致命的后果，以及存在傳播和感染HIV的危險(xiǎn)，因此所述感染的特異性的早期診斷是十分必要的。但是，由于其早期癥狀與其他許多疾病相似，梅毒有時(shí)被稱作“大模仿者”。因此，醫(yī)生通常不僅僅依賴于梅毒病征和癥狀的識別，還要依賴包括對梅毒細(xì)菌顯微鏡鑒別的臨床試驗(yàn)的結(jié)果以及針對生物樣品中梅毒感染現(xiàn)象的分析試驗(yàn)的結(jié)果。
通過顯微鏡鑒別細(xì)菌來診斷梅毒通常如下進(jìn)行。從潰瘍或下疳表面剝離樣品，在特殊的“暗視野”顯微鏡下觀察，以檢測生物體。暗視野顯微鏡檢術(shù)需要相當(dāng)多的技巧且容易判斷錯(cuò)誤。
基于這些原因，大多數(shù)梅毒病例首先使用非密螺旋體測定進(jìn)行血清學(xué)診斷。非密螺旋體試驗(yàn)檢測在梅毒密螺旋體感染發(fā)生后產(chǎn)生的物質(zhì)，例如抗體。目前可得的通常用于檢測梅毒感染證據(jù)的非密螺旋體測定是性病研究實(shí)驗(yàn)室(VDRL)試驗(yàn)和快速血漿反應(yīng)素(RPR)試驗(yàn)。VDRL試驗(yàn)使用由天然來源獲得的脂質(zhì)，來檢測抗類脂質(zhì)(lipoidal)的抗體，這些抗體是在梅毒密螺旋體感染后產(chǎn)生的。產(chǎn)生的這些抗體通過被梅毒密螺旋體感染的個(gè)體的免疫系統(tǒng)來對抗梅毒密螺旋體生物體的心磷脂，可在所述個(gè)體的血清或腦脊液中發(fā)現(xiàn)這些抗體。
目前可得的非密螺旋體試驗(yàn)的一個(gè)缺點(diǎn)是特異性差。在目前可得的用于梅毒的試驗(yàn)中，包括支原體感染、肺炎、瘧疾、急性細(xì)菌和病毒感染和自身免疫病在內(nèi)的許多病癥可引起假陽性試驗(yàn)結(jié)果。例如，靜脈使用藥物或自身免疫病引起組織損傷，其導(dǎo)致心磷脂的釋放和抗心磷脂抗體的產(chǎn)生。因此，在非密螺旋體試驗(yàn)中檢測這些抗心磷脂抗體將產(chǎn)生假陽性結(jié)果。對于神經(jīng)梅毒的檢測，成功的診斷是非常成問題的。
由于在使用這些現(xiàn)有試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，因此通常需要使用其他分析方法例如顯微鏡檢術(shù)或密螺旋體基血清學(xué)試驗(yàn)來證實(shí)。標(biāo)準(zhǔn)的密螺旋體基試驗(yàn)包括熒光密螺旋體抗體-吸附(FTA-ABS)試驗(yàn)和FTA-ABS雙染色試驗(yàn)(FTA-ABS DS)。盡管可使用密螺旋體基試驗(yàn)來證實(shí)陽性試驗(yàn)結(jié)果，但是這些試驗(yàn)常常是昂貴、復(fù)雜且費(fèi)時(shí)的，并且可能需要使用非常復(fù)雜的科學(xué)儀器和需要經(jīng)過培訓(xùn)的技術(shù)人員。此外，密螺旋體測定不能作為檢測抗生素治療成功與否的試驗(yàn)，這是因?yàn)樵谥斡罂姑范久苈菪w抗體持續(xù)存在，在約85％的成功治療的個(gè)體中，試驗(yàn)結(jié)果甚至在根除感染后仍保持陽性。
因此，需要一種靈敏且特異的檢測樣品中梅毒密螺旋體感染的單一測定，用于早期梅毒或神經(jīng)梅毒的診斷。同樣需要的是一種簡單且不昂貴的可用于檢測梅毒治療成功與否的測定。
更優(yōu)選的抗原組合物含有經(jīng)純化的合成的心磷脂、合成的卵磷脂、天然或非合成的膽固醇和醇。組合物中合成的心磷脂和卵磷脂的最佳純度是99％或更高。膽固醇的最佳純度是98％或更高，或者是無灰的?？乖M合物更優(yōu)選含有四肉豆寇酰心磷脂、1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿、膽固醇和絕對(100％)乙醇。組合物中合成的心磷脂的優(yōu)選體積濃度是約0.02-0.04％，更優(yōu)選0.03％。組合物中合成的卵磷脂的優(yōu)選體積濃度是約0.11-0.16％，更優(yōu)選0.14％。組合物中膽固醇的優(yōu)選體積濃度是約0.9％，組合物中其余的是醇。
本文提供的抗原組合物通常也可作為體外研究工具用于研究梅毒。更特別地，所述組合物可用于測定或診斷試劑盒中，以檢測梅毒密螺旋體感染的存在，其用于診斷或預(yù)測梅毒疾病的發(fā)病或復(fù)發(fā)。
本文提供的優(yōu)選方法是檢測生物樣品如血清或腦脊液中心磷脂抗體的免疫測定。依據(jù)所述方法，在有助于樣品中的抗類脂質(zhì)抗體與合成的心磷脂-卵磷脂基質(zhì)結(jié)合的條件下，本文所述的抗原組合物與生物樣品混合足夠長的時(shí)間，以形成抗體-抗原復(fù)合體。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法如絮凝或微絮凝試驗(yàn)等來檢測該復(fù)合體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供檢測梅毒密螺旋體感染載體的方法，由此防止梅毒密螺旋體從一個(gè)宿主傳播到另一個(gè)宿主。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供靈敏的診斷早期或潛伏梅毒或者神經(jīng)梅毒的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供快速、簡便且不昂貴的準(zhǔn)確檢測梅毒密螺旋體的測定。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供生產(chǎn)費(fèi)用不高的抗原組合物，用于可再現(xiàn)地測量或檢測梅毒密螺旋體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供檢測梅毒密螺旋體的試驗(yàn)，其具有VDRL抗原標(biāo)準(zhǔn)化和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
在閱讀了以下對所公開的實(shí)施方案和所附權(quán)利要求書的具體描述后，本發(fā)明的這些和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將是十分明顯的。具體描述本文提供了一種檢測梅毒密螺旋體的抗原組合物和方法。所述抗原組合物含有合成的心磷脂和合成的卵磷脂的組合或混合物。心磷脂是一種具有抗原特性的1，3-雙(磷脂?；?甘油。卵磷脂是一種磷脂?？乖M合物優(yōu)選還含有非合成的(天然)膽固醇。醇也是優(yōu)選的抗原組合物中的一個(gè)組分。醇使脂質(zhì)溶解，由此形成懸浮液。合成的心磷脂和卵磷脂具有99％或更高的最佳純度。膽固醇具有98％或更高的最佳純度，或者是無灰的?？乖M合物可作為測定中的試劑用于檢測生物樣品中與梅毒密螺旋體感染相關(guān)的抗體?？乖M合物優(yōu)選是用于檢測或測量在被梅毒密螺旋體感染的個(gè)體中產(chǎn)生的抗體的免疫測定試劑，其用于診斷或預(yù)測梅毒的發(fā)病或復(fù)發(fā)。
本文所述的方法是檢測或定量生物樣品中與患者的梅毒密螺旋體感染相關(guān)的抗體的測定，所述生物樣品特別是指體液，例如血清或腦脊液。所述方法允許檢測與梅毒密螺旋體感染相關(guān)的循環(huán)抗體，從而檢測或監(jiān)測梅毒密螺旋體感染。本文提供的優(yōu)選方法是免疫測定。依據(jù)所述優(yōu)選的方法，在有助于樣品中的抗類脂質(zhì)抗體與抗原組合物中的心磷脂結(jié)合的條件下，所述抗原組合物與生物樣品混合足夠長的時(shí)間，以形成抗體-抗原復(fù)合體。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來檢測這些抗體-抗原復(fù)合體，如VDRL絮凝或微絮凝試驗(yàn)，其通過顯微鏡來進(jìn)行讀數(shù)。定義本文使用的術(shù)語“一種”和“所述”是指“一個(gè)或更多”并包括復(fù)數(shù)，除非根據(jù)上下文該解釋是不適當(dāng)?shù)摹?br> 本文使用的術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體、多克隆、嵌合、單鏈、雙特異性、猿猴源化(simianized)、人源化抗體以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表達(dá)文庫的產(chǎn)物。
當(dāng)涉及抗體時(shí)，“特異性結(jié)合”或“特異性免疫反應(yīng)”是指在異源肽、蛋白、脂質(zhì)和其他生物物質(zhì)的異相群體中，確定目標(biāo)抗原存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫測定條件下，指定的抗原優(yōu)先與特定抗體結(jié)合，且不以顯著量與樣品中的其他抗體結(jié)合。在這樣的條件下的特異性結(jié)合需要根據(jù)對特定抗體的特異性而篩選出的抗原。多種免疫測定形式可用于篩選與特定抗體有特異性免疫反應(yīng)性的抗原。例如，通常使用固相ELISA免疫測定來篩選與抗體有特異性免疫反應(yīng)性的抗原。參見，Harlow和lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，其中描述了可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測定形式和條件。
術(shù)語“抗原”是指可在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的實(shí)體或其片段。該術(shù)語包括免疫原和賦予抗原性或抗原決定簇的區(qū)域。本文使用的術(shù)語“抗原組合物”是指含有合成的心磷脂和合成的卵磷脂的組合物。本文使用的“抗原決定簇”是指抗體所識別的抗原區(qū)域。
本文使用的術(shù)語“檢測”是指定性或定量確定所研究的生物分子的存在。
“經(jīng)分離的”是指生物分子至少不含有其天然存在時(shí)所伴有的一些成分?？乖M合物本文提供的組合物含有一個(gè)或多個(gè)合成的心磷脂和卵磷脂的組合、懸浮液或物理混合物。優(yōu)選的組合物含有合成的心磷脂、合成的卵磷脂和合成的或非合成的(天然存在的)膽固醇。優(yōu)選的組合物含有合成的心磷脂、合成的卵磷脂、天然膽固醇和醇。
組合物中合成的心磷脂的優(yōu)選體積濃度是約0.02-0.04％，更優(yōu)選0.03％。組合物中合成的卵磷脂的優(yōu)選體積濃度是約0.11-0.16％，更優(yōu)選14％。組合物中天然膽固醇的優(yōu)選體積濃度是約0.9％，組合物中其余的是醇，優(yōu)選乙醇，最優(yōu)選絕對(100％)乙醇。
合成的心磷脂可從植物源半合成脂質(zhì)前體合成。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述心磷脂是四肉豆寇酰心磷脂，其可商購自例如Avanti PolarLipids(Alabaster，AL)等供應(yīng)商。
合成的卵磷脂可來源于大豆或雞蛋。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述卵磷脂是160，181卵磷脂，即1-棕櫚酰基-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿或3-sn-磷脂酰膽堿(sn意味著按立體專一性編號)，其也可商購自例如Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)等供應(yīng)商。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物是在絕對乙醇中含有約0.03％四肉豆寇酰心磷脂、0.11-0.16％ 1-棕櫚酰基-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿和0.9％天然膽固醇的懸浮液。所述膽固醇也可商購自例如AvantiPolar Lipids(Alabaster，AL)。所述醇可商購自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)例如等化學(xué)供應(yīng)商。
當(dāng)與醇混合在一起時(shí)，心磷脂、卵磷脂和膽固醇形成脂質(zhì)基質(zhì)或膠束。正如下面具體描述的，與人梅毒密螺旋體感染的存在相關(guān)的抗體，在本文中稱為抗心磷脂抗體，與脂質(zhì)膠束結(jié)合并形成抗體-抗原復(fù)合體。因此，這些抗體-抗原復(fù)合體的檢測或測量可用于診斷梅毒密螺旋體感染。盡管不希望為以下假設(shè)所束縛，但仍相信和抗心磷脂基質(zhì)抗體與天然存在的心磷脂和卵磷脂的結(jié)合相比，抗心磷脂基質(zhì)抗體與本文所述的合成抗原組合物的結(jié)合具有更高的特異性和親和力。由此，合成抗原組合物提供了更有效、更靈敏且更特異的工具，以檢測與梅毒感染相關(guān)的抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以用可測的標(biāo)記來標(biāo)記抗原組合物的一個(gè)或多個(gè)組分，從而有助于直接測量或檢測抗體-抗原復(fù)合體的形成。各種類型的標(biāo)記和將標(biāo)記與抗原組合物偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
此外，抗原組合物可作為實(shí)驗(yàn)室研究工具來用于生產(chǎn)、分離或純化抗心磷脂抗體，所述抗體通常可用于研究梅毒。因此，抗原組合物可用于體內(nèi)或體外診斷及實(shí)驗(yàn)室研究等目的。VDRL抗原的制備例如可通過制備體積濃度為0.02-0.04％、更優(yōu)選0.03％的四肉豆寇酰心磷脂的乙醇溶液來制備VDRL抗原。向心磷脂溶液中加入體積濃度為約0.11-0.16％、更優(yōu)選0.14％的合成的卵磷脂的乙醇溶液，和0.9％天然膽固醇的乙醇溶液。按以下順序加入各組分心磷脂、卵磷脂、膽固醇和用于達(dá)到一定體積的乙醇。在測試前，使抗原溶解，在室溫下保存過夜?？剐牧字贵w的檢測本文提供的方法包括診斷和預(yù)測方法，檢測和量化能與上述抗原組合物結(jié)合的抗體。這些方法允許檢測與心磷脂-卵磷脂基質(zhì)結(jié)合的循環(huán)抗體，以指示梅毒密螺旋體感染的存在并由此診斷感染或監(jiān)測對梅毒密螺旋體感染進(jìn)行的抗生素治療的進(jìn)展。
在本領(lǐng)域中已知有許多技術(shù)可用于檢測或測量抗體-抗原復(fù)合體，在本文中指免疫復(fù)合體。經(jīng)典的方法涉及使含有抗體的樣品與已知過量的對抗體有特異性的抗原反應(yīng)，使結(jié)合抗原與游離抗原分開，確定結(jié)合抗原或游離抗原的量。如果測量的是游離抗原，則結(jié)合抗原的量可通過用已知的起始量減去游離抗原的量而計(jì)算得到?？乖３Ｖ苯踊蜷g接地用報(bào)告基團(tuán)或可測標(biāo)記來標(biāo)記，以幫助確定本文所述抗體-抗原復(fù)合體的量。報(bào)告基團(tuán)或“標(biāo)記”一般是熒光或放射性基團(tuán)或酶。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來檢測標(biāo)記，例如分光光度法、閃爍計(jì)數(shù)或流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)。
此外，抗原也可與固相珠或顆粒偶聯(lián)，所述固相珠或顆粒是經(jīng)過濾、離心或從混合物中取出的，例如通過磁性移出金屬或磁化顆粒。將抗原與固相珠如乳膠珠連接，提供了一種更靈敏且快速的新玻片凝集試驗(yàn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原經(jīng)心磷脂分子與上述珠相連。抗原與珠相連的一個(gè)方法是修飾心磷脂分子從而使之能與珠共價(jià)連接。例如，將胺基團(tuán)連接到心磷脂脂肪酸鏈的末端甲基上。以此方式修飾的心磷脂可與羧基化或胺翼化(aminealated)的乳膠珠相連。
如下進(jìn)行檢測樣品中抗心磷脂抗體的優(yōu)選免疫測定。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來收集或獲得樣品。自生物來源獲得含待測抗心磷脂抗體的樣品。樣品優(yōu)選獲自生物流體，例如，但不限于，全血、血清、血漿、唾液、腦脊液等。當(dāng)樣品是血清或脊髓液時(shí)，得到最佳診斷結(jié)果。樣品在免疫測定之前可經(jīng)過濾或經(jīng)其他處理，以便獲得最佳的免疫測定結(jié)果。
然后，將樣品與本文所述抗原組合物一起溫育，以形成抗體-抗原免疫復(fù)合體。然后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來檢測抗體-抗原復(fù)合體。本文使用的術(shù)語“檢測”意指使用已知技術(shù)來檢測生物分子，例如采用免疫化學(xué)或組織學(xué)方法。這些方法包括使用脂質(zhì)的單克隆或多克隆抗體的免疫學(xué)技術(shù)，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、夾心測定、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測定、放射免疫分析或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他類型涉及抗體的測定。
在所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在絮凝試驗(yàn)中使用本文描述的合成抗原組合物來檢測樣品中的抗心磷脂抗體。已知絮凝試驗(yàn)的例子包括未加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)、快速血漿反應(yīng)素10毫米圓形卡片試驗(yàn)(RPR)、甲苯胺紅未加熱血清試驗(yàn)(TRUST)和VDRL玻片測定。這些測定均是絮凝試驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，也可在凝集試驗(yàn)中使用本文所述的抗原組合物來檢測抗心磷脂抗體，這些試驗(yàn)還使用載體顆粒。在更優(yōu)選的方法實(shí)施方案中，在VDRL玻片測定中使用合成抗原組合物，正如下文所簡要描述的，具體可參見性病研究實(shí)驗(yàn)室(VDRL)玻片試驗(yàn)(Venereal Disease Research Laboratory(VDRL)Slide Test)，Kennedy，E.J.Jr.和Creighton，E.T.，157-78(1998)，AManual of Tests for Syphilis，第9版，Larsen，S.A.，Pope，V.，Johnson，R.E.和Kennedy，E.J.Jr.(編輯)，美國公共衛(wèi)生協(xié)會，哥倫比亞特區(qū)華盛頓，所述文獻(xiàn)引入本文作參考。
如下進(jìn)行VDRL玻片測定。在容器中加入VDRL緩沖鹽溶液，其中含有甲醛、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和蒸餾水。以恒速將抗原組合物慢慢加入鹽溶液中，同時(shí)搖動容器，然后攪拌混合物以充分混合各組分并形成懸浮液。將樣品如血清加入石蠟或帶瓷環(huán)玻片的環(huán)中，加入一滴抗原組合物懸浮液。旋轉(zhuǎn)玻片以混合樣品和抗原組合物，然后經(jīng)顯微鏡讀數(shù)。存在凝塊、聚集現(xiàn)象或不平滑，表示抗體-抗原形成?？乖瓚腋∫旱倪B續(xù)稀釋液可用于定性測量樣品中的抗體。通過使用標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗體進(jìn)行測定并比較樣品結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果，可進(jìn)行定量測定。
可以理解，測定方法包括使用上述合成抗原組合物和本文所述抗原的合成衍生物組合物，條件是所述衍生物保留了抗原活性或表現(xiàn)出等量的抗原活性，并對抗心磷脂抗體有特異性。檢測梅毒密螺旋體存在的試劑盒還提供了通過檢測抗心磷脂抗體存在或?qū)ζ涠縼碓\斷或評價(jià)梅毒感染的試劑盒。所述試劑盒可具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的任何構(gòu)造，并可用于實(shí)施一個(gè)或更多本文所述檢測生物樣品中抗心磷脂-卵磷脂基質(zhì)抗體或者檢測或監(jiān)測患者或載體中梅毒密螺旋體感染的方法。試劑盒是十分方便的，因?yàn)樗嗽S多(如果不是全部的話)必要試劑，所述試劑用于進(jìn)行檢測生物樣品中梅毒抗體的測定。試劑可以經(jīng)預(yù)先測量或以穩(wěn)定形式含在容器中或在固相上，在其中或其上可進(jìn)行所述測定，由此可使由實(shí)施測定的個(gè)體所進(jìn)行的操作次數(shù)減至最少。此外，可與試劑盒中所包括的標(biāo)準(zhǔn)品如預(yù)定量的抗體同時(shí)進(jìn)行測定，從而可確證或測量試驗(yàn)的結(jié)果。
試劑盒優(yōu)選含有本文所述的抗原組合物，其可用于檢測與梅毒密螺旋體感染相關(guān)的心磷脂抗體。試劑盒還優(yōu)選含有膽固醇，并還可含有有助于檢測抗體-抗原復(fù)合體的適宜的試劑。試劑盒另外還可含有用于安全獲得樣品的裝置，裝有試劑的容器，用于稀釋樣品或試劑的緩沖液，以及VDRL、RPR和TRUST測定中使用的圓形卡片例如10毫米玻片或18毫米圓形卡片。
測定試劑盒包括但不限于準(zhǔn)備用于以下技術(shù)中的試劑絮凝試驗(yàn)，例如USR、RPR和TRUST；凝集測定；和夾心或ELISA測定。與這些技術(shù)一同使用的材料包括但不限于微量滴定板、用于快速監(jiān)測生物流體的由抗體包被的條或浸棒(dipstick)。對于每一試劑盒，確定測定的范圍、靈敏度、精確度、可靠性、特異性和再現(xiàn)性。使用參照對照血清并將血清滴定至終點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，或者也可使用一組血清。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，測定試劑盒使用VDRL玻片技術(shù)，并提供說明書和上述抗原組合物。該試劑盒可用于測量梅毒密螺旋體感染，更具體而言，可用于測量針對生物流體中的心磷脂的抗體，所述生物流體來自表現(xiàn)出梅毒癥狀或有梅毒感染危險(xiǎn)的人。
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，這些實(shí)施例并不對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成限制。相反，應(yīng)當(dāng)清楚地認(rèn)識到，該技術(shù)手段可具有多種其他的實(shí)施方案、修改或等價(jià)形式，在閱讀了本說明書之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解這些變化，它們并沒有超出本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。
還從Avanti Polar Lipids得到經(jīng)硅膠層析純化至約99％純度的卵磷脂(1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-磷酸膽堿)。所述卵磷脂最初是從大豆中分離的。
制備1.2％的膽固醇(Avanti Polar Lipids)絕對乙醇溶液并用經(jīng)醇沖洗的濾紙#560過濾。所述膽固醇最初是從羊毛脂中得到的，并經(jīng)重結(jié)晶純化，晶體保存在-20℃。
使合成的心磷脂依次與合成的卵磷脂、膽固醇溶液和乙醇混合，從而制備抗原組合物。合成的心磷脂的終體積濃度是0.02-0.03％。合成的卵磷脂的終體積濃度是0.11-0.16％。膽固醇的終體積濃度是0.9％，抗原組合物中其余的是乙醇。
將使用實(shí)施例1所述的合成心磷脂和卵磷脂組合物的VDRL玻片測定的靈敏度與A Manual of Tests for Syphilis(第9版，159-77，Larsen，S.A.，Pope，V.，Johnson，R.E.和Kennedy，E.J.Jr.(編輯)，美國公共衛(wèi)生協(xié)會，哥倫比亞特區(qū)華盛頓)所述的常規(guī)VDRL玻片測定的靈敏度相比較。簡言之，將0.4ml VDRL緩沖鹽溶液(甲醛、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和蒸餾水)加到具有平內(nèi)底表面的帶玻璃塞的30ml圓底燒瓶或者25ml錐形瓶的底部。然后，將0.5ml抗原組合物懸浮液直接加入鹽溶液，速度為6秒/0.5ml抗原懸浮液，同時(shí)持續(xù)地轉(zhuǎn)動燒瓶。持續(xù)轉(zhuǎn)動10秒直至4.1ml緩沖的鹽溶液加完。給瓶塞緊蓋，在10秒內(nèi)上下振搖約30次。抗原懸浮液在8小時(shí)內(nèi)使用。
通過用安全移液裝置將50μl血清加入石蠟或帶瓷環(huán)的玻片的一個(gè)環(huán)中來進(jìn)行定性測定?？乖瓚腋∫簻睾偷卦俅螒腋。尤胍坏巫杂陕湎碌囊后w(17μl)。將玻片裝到機(jī)械振搖器上，以180±2rpm振搖4分鐘。立即取出玻片并使用10X目鏡和10X物鏡經(jīng)顯微鏡讀數(shù)。結(jié)果報(bào)告如下反應(yīng)性—中等或大凝塊，弱或極小反應(yīng)性—小凝塊，非反應(yīng)性—不聚集或有非常輕微的粗糙度。定量試驗(yàn)使用連續(xù)二倍稀釋的血清類似地進(jìn)行。
結(jié)果列于下表1中，表明使用合成抗原組合物的試驗(yàn)比使用標(biāo)準(zhǔn)VDRL抗原的試驗(yàn)更加靈敏，所述標(biāo)準(zhǔn)品是用天然心磷脂和卵磷脂制備的。
表1比較天然VDRL和合成VDRL測定的靈敏度
使用實(shí)施例1所述的合成心磷脂和卵磷脂抗原組合物的VDRL玻片測定以及常規(guī)VDRL玻片測定的靈敏度還與常規(guī)RPR玻片測定進(jìn)行了比較。如下表2和表3所示，與使用非合成VDRL抗原的測定相比，使用合成VDRL抗原組合物的測定與用RPR試驗(yàn)測試為陽性的樣品具有更高的反應(yīng)性。
表2RPR與合成VDRL的比較
表3RPR與天然VDRL的比較
實(shí)施例3合成的VDRL抗原和天然VDRL抗原的比較分析(定性試驗(yàn))采用經(jīng)非密螺旋體(RPR)試驗(yàn)測試為反應(yīng)性的來自100份冷凍血清的樣品，將CDC合成VDRL抗原和對照VDRL抗原(天然VDRL抗原)進(jìn)行比較。血清樣品在56℃加熱30分鐘滅活。將50μl的各血清樣品加入相應(yīng)的石蠟或帶瓷環(huán)的玻片中。將每種抗原各一滴(17μL)加入玻片的相應(yīng)環(huán)中。將玻片裝到機(jī)械振搖器上，以180rpm振搖4分鐘，然后經(jīng)顯微鏡讀數(shù)。觀察并記錄兩種抗原的絮凝程度。
如表4(未被檢驗(yàn)的)所示，所有血清(100％)經(jīng)RPR測試為反應(yīng)性的，具有與CDC合成VDRL抗原的反應(yīng)性，而只有88％具有與天然VDRL抗原的反應(yīng)性。
此外，合成VDRL抗原和天然VDRL抗原在同一試驗(yàn)中使用100份樣品來進(jìn)行比較，所述樣品來自己被檢驗(yàn)過并有記載的梅毒病例。該試驗(yàn)的結(jié)果也列于表4中(已被檢驗(yàn)過的)。這些試驗(yàn)的所有結(jié)果均通過SERODIA梅毒密螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TP-PA)(FujirebioAmerica，Inc.，F(xiàn)airfield，NJ)證實(shí)。
表4
實(shí)施例4合成的VDRL抗原和天然VDRL抗原的比較分析(定量試驗(yàn))采用經(jīng)非密螺旋體(RPR)試驗(yàn)測試為反應(yīng)性的來自100份冷凍血清的樣品，將CDC合成VDRL抗原和對照VDRL抗原(天然VDRL抗原)進(jìn)行比較。血清樣品在測試管中用0.9％鹽水稀釋二倍。將50μl的各血清稀釋液加入石蠟或帶瓷環(huán)的玻片的相應(yīng)環(huán)中。將每種抗原各一滴(17μL)加入玻片的相應(yīng)環(huán)中。將玻片裝到機(jī)械振搖器上，以180rpm振搖4分鐘。經(jīng)顯微鏡讀取各血清稀釋液的終點(diǎn)滴度。將一個(gè)雙倍稀釋的區(qū)別定義為終點(diǎn)，對于一個(gè)抗原為(R)，針對另一抗原為(N)。
如表5(未被檢驗(yàn)過的)所示，該試驗(yàn)顯示，在RPR試驗(yàn)中有反應(yīng)性的冷凍血清中，其中85％與CDC合成VDRL抗原的終點(diǎn)滴度比與天然VDRL抗原的終點(diǎn)滴度大0.5或1個(gè)稀釋度。在15％的情況中，用CDC合成VDRL抗原得到的終點(diǎn)滴度和用天然VDRL抗原得到的終點(diǎn)滴度相等。在所測試的樣品中，沒有一個(gè)與天然抗原的終點(diǎn)滴度比與CDC合成抗原的終點(diǎn)滴度高。
使用來自己被檢驗(yàn)過并被記載的梅毒病例的100份樣品重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。如表5(已被檢驗(yàn)過的)所示，來自己被檢驗(yàn)過并被記載的梅毒病例的血清中，84％與CDC合成VDRL抗原的終點(diǎn)滴度比與天然VDRL抗原的終點(diǎn)滴度大0.5或1個(gè)稀釋度。在7％的情況中，用CDC合成VDRL抗原得到的終點(diǎn)滴度和用天然VDRL抗原得到的終點(diǎn)滴度相等，而在3％的情況中，用天然VDRL抗原得到的終點(diǎn)滴度比用CDC合成VDRL抗原得到的終點(diǎn)滴度大0.5或1個(gè)稀釋度。這些試驗(yàn)的結(jié)果通過TP-PA試驗(yàn)得以證實(shí)。
表5
實(shí)施例5在患有除梅毒外的疾病的患者中合成的VDRL抗原和天然VDRL抗原的比較分析(定性試驗(yàn))使用實(shí)施例3的步驟定性測試來自100名患有除梅毒外的疾病的患者的樣品。這些試驗(yàn)通過TP-PA試驗(yàn)和FTA-ABS試驗(yàn)證實(shí)。這些試驗(yàn)的結(jié)果列于表3中，其表示所有樣品與CDC合成VDRL抗原和天然VDRL抗原均是非反應(yīng)性的。4個(gè)樣品在TP-PA試驗(yàn)中是反應(yīng)性的，但在FTA-ABS試驗(yàn)中是非反應(yīng)性的。
表6
R＝反應(yīng)性；N＝非反應(yīng)性表7
R＝反應(yīng)性；N＝非反應(yīng)性表8
R＝反應(yīng)性；N＝非反應(yīng)性
權(quán)利要求
1.一種抗原組合物，含有合成的心磷脂和合成的卵磷脂。
2.權(quán)利要求1的抗原組合物，進(jìn)一步含有膽固醇。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述膽固醇的濃度為約0.9％。
4.權(quán)利要求2的組合物，進(jìn)一步含有醇。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述心磷脂的濃度為約0.02-0.04％。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述心磷脂的濃度為約0.03％。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述卵磷脂的濃度為約0.11-0.16％。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述卵磷脂的濃度為約0.14％。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述心磷脂是四肉豆寇酰心磷脂。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述卵磷脂是1-棕櫚酰基-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿。
11.權(quán)利要求4的組合物，其中所述醇是乙醇。
12.一種檢測人體內(nèi)梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)存在的方法，包括使來自所述人的生物樣品與含有合成的心磷脂和合成的卵磷脂的組合物混合，和檢測生物樣品中的抗體與所述組合物形成的免疫復(fù)合體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物進(jìn)一步含有膽固醇和醇。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物中的膽固醇的濃度為約0.9％。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述醇是乙醇。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物中的心磷脂的濃度為約0.01-0.05％。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物中的卵磷脂的濃度為約0.11-0.16％。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物中的心磷脂是四肉豆寇酰心磷脂。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物中的卵磷脂是1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述免疫復(fù)合體的檢出是梅毒的陽性診斷。
21.權(quán)利要求12的方法，其中使用絮凝或凝集試驗(yàn)來檢測免疫復(fù)合體。
全文摘要
描述了用于檢測梅毒密螺旋體抗體和診斷梅毒的抗原組合物和方法。所述抗原組合物含有合成的心磷脂和合成的卵磷脂。所述抗原組合物還可含有膽固醇和醇。所述抗原組合物可在免疫測定中作為免疫試劑用于檢測與梅毒密螺旋體感染相關(guān)的抗體。所述方法對于梅毒密螺旋體感染具有靈敏性和特異性。
文檔編號G01N33/92GK1353815SQ00808540
公開日2002年6月12日 申請日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月9日
發(fā)明者維多利亞·波普, 阿諾德·R·卡斯特羅, 威廉·E·莫里爾 申請人:美國政府健康及人類服務(wù)部