專利名稱：一種菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法，具體地說是涉及一種利用土壤中的芽孢桿菌與結(jié)皮中藻類聯(lián)合作用從而快速形成荒漠地表結(jié)皮進(jìn)行防風(fēng)固沙的方法。
背景技術(shù)：
荒漠地表生物結(jié)皮是干旱區(qū)特殊環(huán)境的產(chǎn)物。通過地物光譜和遙感技術(shù)，可以觀測到沙漠表面約有40～60％的表面被這種特殊“皮膚”覆蓋。荒漠地表生物靠自然露水和降水可四季長青，能夠適應(yīng)零下10℃到60℃之間的低營養(yǎng)環(huán)境，選擇它們作為固沙先鋒植物，在大面積流沙中培植，可以補(bǔ)充完善我國目前采用的“喬、灌、草”結(jié)合的防風(fēng)固沙生態(tài)體系，尤其適合用于荒漠化地區(qū)實(shí)施重大工程對地表破壞后的恢復(fù)。
“生物結(jié)皮”在保持土壤濕度、固定大氣中的氮和增加土壤的有機(jī)質(zhì)含量中扮演著重要的角色。結(jié)皮的高含水量可以使降雨較多地保留在土壤結(jié)皮表面，有利于結(jié)皮中低等生物的生長和繁殖并能通過其生活代謝方式影響并改變環(huán)境，在防風(fēng)固沙、防止土壤侵蝕、改變水分分布狀況等方面起著重要作用。通過對結(jié)皮組成成分的分析，可以得知結(jié)皮中的主要成分之一是藻類物質(zhì)，它們一旦在土壤和沙漠中大量生長，就能向體外分泌以多糖為主的物質(zhì)，從而粘結(jié)土壤顆粒和沙粒形成結(jié)皮。然而單由藻種固定流沙形成的結(jié)皮在自然條件下生長緩慢，需要很長時間才能形成高覆蓋率的結(jié)皮植被。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)僅使用藻種固定流沙，形成結(jié)皮速度緩慢的缺陷，從而提供一種簡單易行、能快速和持久的固沙、且適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法，其為將荒漠藻和土壤芽孢桿菌聯(lián)合使用，具體包括如下步驟
1)從土壤結(jié)皮中分離和培養(yǎng)芽孢桿菌選擇來自干旱、半干旱、或荒漠地表結(jié)皮下2～10cm處的土樣與無菌水混和，經(jīng)100℃高溫處理后制成土壤稀釋液，將此土壤稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，倒置培養(yǎng)；培養(yǎng)好的菌種使用芽孢染色法鑒定，分離出經(jīng)染色后在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌；該土壤芽孢桿菌的分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp，于2005年3月9日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1324；將上述從土壤結(jié)皮中分離的土壤芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基I上按常規(guī)方法經(jīng)過大規(guī)模連續(xù)發(fā)酵液體培養(yǎng)后，離心，傾去上清液，下層的菌體沉淀物冷凍干燥后得到凍干粉，于冰箱保存?zhèn)溆?；所述的液體培養(yǎng)基I為按下述比例配制而成每升水中加入80～100g玉米漿，5g氯化鈉，pH 7.0～7.5；2)從土壤結(jié)皮中分離和培養(yǎng)荒漠藻采集干旱、半干旱、或荒漠土壤表面結(jié)皮，除去其中的植物碎片等雜物后，研磨至能過0.5mm的分樣篩；將此培養(yǎng)樣品于紫外燈下照射后，加無菌蒸餾水振蕩，制得均一懸浮液，將之稀釋后接種于液體培養(yǎng)基II，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將藻種挑出后轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基III上，直至獲得純化、無污染的荒漠藻種；將此純化的荒漠藻種接入含有液體培養(yǎng)基II的三角瓶中，光照培養(yǎng)并間隙搖動燒瓶，得到的荒漠藻通過離心或過濾收集，收集藻片，粉碎，獲得荒漠藻干粉；所述的液體培養(yǎng)基II是按下述方法配制的將硝酸鉀0.8～2.0g、硫酸鎂0.05～1.2g、磷酸二氫鉀0.02～0.05g和檸檬酸0.004～0.008g用少量蒸餾水溶解后，補(bǔ)加蒸餾水到980ml；將硝酸鈣2～4g用20ml蒸餾水溶解后，加入到上述溶液內(nèi)；再加入植物生長調(diào)節(jié)劑0.1～1ppm；所述的固體培養(yǎng)基III是在上述液體培養(yǎng)基II中加入1％的瓊脂，加熱溶化后，15磅壓力下滅菌30min；3)野外接種將步驟1)和2)從結(jié)皮中分離和培養(yǎng)的荒漠藻干粉和土壤芽孢桿菌干粉按2～3∶1的質(zhì)量比混勻，形成固沙劑，并按2.0～4.0g/米2的接種量接種于荒漠流沙中；同時噴灑液體營養(yǎng)調(diào)理劑，并用地膜覆蓋，所述的液體營養(yǎng)調(diào)理劑包括液體培養(yǎng)基II和丙烯酸類保水劑0.1～1g/Kg。
本發(fā)明在于將干旱半干旱地區(qū)土壤結(jié)皮中廣泛存在的芽孢桿菌與荒漠藻聯(lián)合使用，土壤芽孢桿菌具有粘性莢膜，膠質(zhì)鞘或厚的果膠質(zhì)外壁，在生長中能分泌大量的粘液，這些具有粘性附屬物的菌體和粘性質(zhì)液通過與藻類物質(zhì)的交連結(jié)合從而構(gòu)成了結(jié)皮的基礎(chǔ)。使用此種方法固沙20～40天時，每平方米藻類覆蓋率可達(dá)到50～70％，50天時地表可形成微量結(jié)皮。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)益之處在于1、該方法簡單易行、操作方便、設(shè)備簡單。
2、本發(fā)明提供的方法是將微生物和藻類聯(lián)合使用，兩者相互作用促進(jìn)生長，因而，與以往單一由藻類的大規(guī)模培養(yǎng)而固沙的技術(shù)相比，此種方法能更快速、持久的使荒漠土壤形成結(jié)皮。
3、該方法無需對所分離的菌種和藻種進(jìn)行嚴(yán)格的種類純化鑒定，省略了以往繁瑣而不必要的操作步驟。
4、利用本發(fā)明提供的方法固沙后所形成的土壤，為沙漠提供了豐富的碳源和氮源，更利于它種微生物和一些低等的微管束植物生長，由此而更加堅固流沙。
5、本發(fā)明提供的方法能適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、選擇來自我國新疆準(zhǔn)噶爾盆地地區(qū)土壤地表結(jié)皮下2cm的土樣10g與無菌水混和，放入盛有90ml的并帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩20min后將三角瓶放在沸水中加熱10min后制成10-2、10-3、10-4、10-54種稀釋度的土壤懸液，每一稀釋度的土壤懸液中各吸取0.2ml接種于裝有細(xì)菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板中，將培養(yǎng)基平板倒置在37℃的溫箱中培養(yǎng)2天。使用芽孢染色法鑒定培養(yǎng)好的菌種，將培養(yǎng)好的菌體涂片干燥固定，經(jīng)染液染色干燥后置油鏡下觀察，分離出經(jīng)染色后在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌；該土壤芽孢桿菌的分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp，于2005年3月9日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1324。
將上述從土壤結(jié)皮中分離的土壤芽孢桿菌使用優(yōu)化的廉價液體培養(yǎng)基I-1進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，該液體培養(yǎng)基I-1的組成為每升水中含玉米漿80g，氯化鈉5g，pH 7.0，在此條件下，將上述分離的土壤芽孢桿菌大規(guī)模連續(xù)液體發(fā)酵培養(yǎng)3天，離心發(fā)酵液，傾去上清液，下層的菌體沉淀物冷凍干燥，得到芽孢桿菌凍干粉，其收率為90g/每升發(fā)酵液，于冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 用洗凈消毒的采樣器采集我國新疆準(zhǔn)噶爾盆地地區(qū)0.5cm厚的土壤地表結(jié)皮。把采集的樣品放在洗凈滅菌的培養(yǎng)皿和磨口試劑瓶中，取瓶中的樣品，仔細(xì)揀去殘留的植物碎片等雜物，放在研缽中輕輕敲碎，直至全部能通過0.5mm的分樣篩。稱取此培養(yǎng)樣品20g于60W的高效紫外燈下照射2min左右，然后放在250ml三角瓶中加無菌蒸餾水180ml，振蕩20min，制得均一懸浮液，然后按比例稀釋成10-2、10-3、10-4、10-54個等級并將之接種于液體培養(yǎng)基II-1。
培養(yǎng)條件是在4只40瓦的日光燈管的光照培養(yǎng)箱中，光周期光/暗＝16h/8h，溫度25℃左右下培養(yǎng)，培養(yǎng)天數(shù)為10天左右。將平板培養(yǎng)基中生長的藻種用無菌玻璃棒或小鑷子挑出，在無菌載玻片上用液體培養(yǎng)基II-1清洗，再將之接種到新的裝有固體培養(yǎng)基III-1的平板上，獲得無污染藻種后轉(zhuǎn)接到斜面保存。將斜面中生長的無污染藻種進(jìn)行大批量液體培養(yǎng)，接種量是把藻液光密度控制在0.1A左右，光照周期同上，培養(yǎng)周期為6天，計測培養(yǎng)后的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果70,000細(xì)胞/ml。培養(yǎng)后得到的荒漠藻通過離心或過濾收集，涂抹于絲絹上，收集到藻片后，用粉碎機(jī)粉碎，獲得荒漠藻干粉。培養(yǎng)全部在無菌條件下進(jìn)行。
所述的液體培養(yǎng)基II-1是按下述方法配制的將硝酸鉀1g、硫酸鎂0.8g、磷酸二氫鉀0.03g和檸檬酸0.005g用少量蒸餾水溶解后，補(bǔ)加蒸餾水到980ml；將硝酸鈣2.5g用20ml蒸餾水溶解后，加入到上述溶液內(nèi)；再加入植物生長調(diào)節(jié)劑三十烷醇0.1ppm。
所述的固體培養(yǎng)基III-1是在上述液體培養(yǎng)基II-1中加入1％的瓊脂，加熱溶化后，15磅壓力下滅菌30min。
將上述從結(jié)皮中分離和培養(yǎng)的荒漠藻干粉和土壤芽孢桿菌干粉以2∶1的質(zhì)量比混合后，按2.0g/米2的量接種于荒漠流沙中；同時按0.5-1千克/米2使用移動式噴溉裝置噴溉液體營養(yǎng)調(diào)理劑，并用地膜覆蓋，地膜上扎有空洞便于空氣流通，該液體營養(yǎng)調(diào)理劑中含有上述液體培養(yǎng)基II-1，同時還含有聚丙烯酸鈉-聚丙烯酰胺保水劑0.1g/Kg。
在此種培養(yǎng)條件下地膜內(nèi)5～7天后出現(xiàn)藻類生長跡象，40天左右時藻類覆蓋率達(dá)到50％，50天左右時形成微量結(jié)皮后揭去地膜，任其自由生長。
實(shí)施例2、選擇來自我國新疆準(zhǔn)噶爾盆地地區(qū)土壤地表結(jié)皮下6cm的土樣10g與無菌水混和，放入盛有90ml的并帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩20min后將三角瓶放在沸水中加熱10min后制成10-2、10-3、10-4、10-54種稀釋度的土壤懸液，每一稀釋度的土壤懸液中各吸取0.2ml接種于裝有細(xì)菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板中，將培養(yǎng)基平板倒置在37℃的溫箱中培養(yǎng)3天。使用芽孢染色法鑒定培養(yǎng)好的菌種，將培養(yǎng)好的菌體涂片干燥固定，經(jīng)染液染色干燥后置油鏡下觀察，分離出經(jīng)染色后在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌。
將上述從土壤結(jié)皮中分離的土壤芽孢桿菌使用優(yōu)化的廉價液體培養(yǎng)基I-2進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，該液體培養(yǎng)基I-2的組成為每升水中含玉米漿90g，氯化鈉5g，pH 7.5，在此條件下，將上述分離的土壤芽孢桿菌大規(guī)模連續(xù)液體發(fā)酵培養(yǎng)3天，離心發(fā)酵液，傾去上清液，下層的菌體沉淀物冷凍干燥，得到芽孢桿菌凍干粉，其收率為120g/每升發(fā)酵液，于冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 在基本操作同實(shí)施例1的情況下，荒漠藻液體培養(yǎng)基II-2的組成為硝酸鉀1.5g、硫酸鎂1.0g、磷酸二氫鉀0.04g、檸檬酸0.006g、硝酸鈣3g、植物生長調(diào)節(jié)劑三十烷醇0.5ppm。所述的固體培養(yǎng)基III-2是在上述液體培養(yǎng)基II-2中加入1％的瓊脂，加熱溶化后，15磅壓力下滅菌30min。在此條件下發(fā)酵后計測培養(yǎng)后的藻細(xì)胞數(shù)，結(jié)果是300,000細(xì)胞/ml。
將上述從結(jié)皮中分離和培養(yǎng)的荒漠藻干粉和土壤芽孢桿菌干粉以3∶1的質(zhì)量比混合后，按3.0g/米2的量接種于荒漠流沙中；同時按0.5-1千克/米2使用移動式噴溉裝置噴溉液體營養(yǎng)調(diào)理劑，并用地膜覆蓋，地膜上扎有空洞便于空氣流通，該液體營養(yǎng)調(diào)理劑中含有上述液體培養(yǎng)基II-2，同時還含有聚丙烯酸鈉—聚丙烯酰胺保水劑0.5g/Kg。
在此種培養(yǎng)條件下地膜內(nèi)3～5天后出現(xiàn)藻類生長跡象，30天左右時藻類覆蓋率達(dá)到70％，50天左右時形成微量結(jié)皮后揭去地膜，任其自由生長。
實(shí)施例3、選擇來自我國新疆準(zhǔn)噶爾盆地地區(qū)土壤地表結(jié)皮下10cm的土樣10g與無菌水混和，放入盛有90ml的并帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩20min后將三角瓶放在沸水中加熱10min后制成10-2、10-3、10-4、10-54種稀釋度的土壤懸液，每一稀釋度的土壤懸液中各吸取0.2ml接種于裝有細(xì)菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板中，將培養(yǎng)基平板倒置在37℃的溫箱中培養(yǎng)3天。使用芽孢染色法鑒定培養(yǎng)好的菌種，將培養(yǎng)好的菌體涂片干燥固定，經(jīng)染液染色干燥后置油鏡下觀察，分離出經(jīng)染色后在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌。
將上述從土壤結(jié)皮中分離的土壤芽孢桿菌使用優(yōu)化的廉價液體培養(yǎng)基I-3進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，該液體培養(yǎng)基I-3的組成為每升水中含玉米漿100g，氯化鈉5g，pH 7.5，在此條件下，將上述分離的土壤芽孢桿菌大規(guī)模連續(xù)液體發(fā)酵培養(yǎng)3天，離心發(fā)酵液，傾去上清液，下層的菌體沉淀物冷凍干燥，得到芽孢桿菌凍干粉，其收率為80g/每升發(fā)酵液，于冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 在基本操作同實(shí)施例1的情況下，荒漠藻液體培養(yǎng)基II-3的組成為硝酸鉀2.0g、硫酸鎂1.2g、磷酸二氫鉀0.05g、檸檬酸0.008g、硝酸鈣4g、植物生長調(diào)節(jié)劑三十烷醇1ppm。所述的固體培養(yǎng)基III-3是在上述液體培養(yǎng)基II-3中加入1％的瓊脂，加熱溶化后，15磅壓力下滅菌30min。在此條件下發(fā)酵后計測培養(yǎng)后的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果10,000細(xì)胞/ml，這是因?yàn)楦邼舛鹊闹参锷L調(diào)節(jié)劑抑制藻類物質(zhì)的生長。
將上述從結(jié)皮中分離和培養(yǎng)的荒漠藻干粉和土壤芽孢桿菌干粉以3∶1的質(zhì)量比混合后，按4.0g/米2的量接種于荒漠流沙中；同時按0.5-1千克/米2使用移動式噴溉裝置噴溉液體營養(yǎng)調(diào)理劑，并用地膜覆蓋，地膜上扎有空洞便于空氣流通，該液體營養(yǎng)調(diào)理劑中含有上述液體培養(yǎng)基II-3，同時還含有聚丙烯酸鈉-聚丙烯酰胺保水劑1fg/Kg。
在此種培養(yǎng)條件下地膜內(nèi)3～5天后出現(xiàn)藻類生長跡象，35天左右時藻類覆蓋率達(dá)到60％，50天左右時形成微量結(jié)皮后揭去地膜，任其自由生長。
由上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明將干旱半干旱地區(qū)土壤結(jié)皮中廣泛存在的芽孢桿菌與荒漠藻聯(lián)合使用，兩者相互作用促進(jìn)生長，因而，與以往單一由藻類的大規(guī)模培養(yǎng)而固沙的技術(shù)相比，此種方法能更快速、持久的使荒漠土壤形成結(jié)皮，使用此種方法固沙20～40天時，每平方米藻類覆蓋率即可達(dá)到70～90％，50天時地表可形成微量結(jié)皮。而且，利用本發(fā)明提供的方法固沙后所形成的土壤，為沙漠提供了豐富的碳源和氮源，更利于它種微生物和一些低等的微管束植物生長，由此而更加堅固流沙。
權(quán)利要求
1.一種菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法，其為將荒漠藻和土壤芽孢桿菌聯(lián)合使用。
2.如權(quán)利要求1所述的菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法，其特征在于所述的土壤芽孢桿菌的分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp，于2005年3月9日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》，其保藏號為CGMCC No.1324。
3.如權(quán)利要求1所述的菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法，其特征在于所述的土壤芽孢桿菌是通過如下的步驟從土壤結(jié)皮中分離和培養(yǎng)的選擇來自干旱、半干旱、或荒漠地表結(jié)皮下2～10cm處的土樣與無菌水混和，經(jīng)100℃高溫處理后制成土壤稀釋液，將此土壤稀釋液接種于細(xì)菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，倒置培養(yǎng)；培養(yǎng)好的菌種使用芽孢染色法鑒定，分離出經(jīng)染色后在油鏡下觀察芽孢呈綠色，菌體呈紅色的耐熱性的土壤芽孢桿菌；將上述從土壤結(jié)皮中分離的土壤芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基I上按常規(guī)方法經(jīng)過大規(guī)模連續(xù)發(fā)酵液體培養(yǎng)后，離心，傾去上清液，下層的菌體沉淀物冷凍干燥后得到凍干粉，于冰箱保存?zhèn)溆茫凰龅囊后w培養(yǎng)基I為按下述比例配制而成每升水中加入80～100g玉米漿，5g氯化鈉，pH7.0～7.5。
4.如權(quán)利要求1所述的菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法，其特征在于所述的荒漠藻是通過如下的步驟從土壤結(jié)皮中分離和培養(yǎng)的采集干旱、半干旱、或荒漠土壤表面結(jié)皮，除去其中的植物碎片等雜物后，研磨至能過0.5mm的分樣篩；將此培養(yǎng)樣品于紫外燈下照射后，加無菌蒸餾水振蕩，制得均一懸浮液，將之稀釋后接種于液體培養(yǎng)基II，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將藻種挑出后轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基III上，直至獲得純化、無污染的荒漠藻種；將此純化的荒漠藻種接入含有液體培養(yǎng)基II的三角瓶中，光照培養(yǎng)并間隙搖動燒瓶，得到的荒漠藻通過離心或過濾收集，收集藻片，粉碎，獲得荒漠藻干粉；所述的液體培養(yǎng)基II是按下述方法配制的將硝酸鉀0.8～2.0g、硫酸鎂0.05～1.2g、磷酸二氫鉀0.02～0.05g和檸檬酸0.004～0.008g用少量蒸餾水溶解后，補(bǔ)加蒸餾水到980ml；將硝酸鈣2～4g用20ml蒸餾水溶解后，加入到上述溶液內(nèi)；再加入植物生長調(diào)節(jié)劑0.1～1ppm；所述的固體培養(yǎng)基III是在上述液體培養(yǎng)基II中加入1％的瓊脂，加熱溶化后，15磅壓力下滅菌30min。
5.如權(quán)利要求1所述的菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法，其特征在于所述的將荒漠藻和土壤芽孢桿菌聯(lián)合使用為在野外接種時，將從結(jié)皮中分離和培養(yǎng)的荒漠藻干粉和土壤芽孢桿菌干粉按2～3∶1的質(zhì)量比混勻，形成固沙劑，并按2.0～4.0g/米2的接種量接種于荒漠流沙中；同時噴灑液體營養(yǎng)調(diào)理劑，并用地膜覆蓋，所述的液體營養(yǎng)調(diào)理劑包括液體培養(yǎng)基II和丙烯酸類保水劑0.1～1g/Kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菌藻聯(lián)合固定荒漠流沙的方法。將從干旱、半干旱、或荒漠地表結(jié)皮中分離和大規(guī)模培養(yǎng)的荒漠藻干粉和土壤芽孢桿菌干粉按2～3∶1的質(zhì)量比混勻，形成固沙劑，并按2.0～4.0g/m
文檔編號E02D3/00GK1833484SQ20051005538
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者任天瑞, 次素琴, 劉京玲, 陳亞寧, 李衛(wèi)紅 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所