一種具有fret效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法
【專(zhuān)利摘要】一種具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，屬于材料化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括金納米粒子合成，金納米粒子功能化修飾，金納米粒子上修飾熒光染料，金納米粒子二聚體組裝，F(xiàn)RET效應(yīng)的產(chǎn)生及其表征。本發(fā)明通過(guò)在金納米粒子上修飾功能化的PEG分子SH-PEG-COOH，并再在PEG上修飾熒光染料。利用PEG分子鏈狀結(jié)構(gòu)性質(zhì)使得在貴金屬納米粒子表面周?chē)臒晒馊玖弦材鼙憩F(xiàn)出一定的熒光強(qiáng)度。同時(shí)，利用DNA可控自組裝技術(shù)，將修飾有不同熒光染料的金納米粒子組裝成二聚體，使得兩種熒光染料之間的距離能夠進(jìn)一步拉近，從而產(chǎn)生FRET效應(yīng)。本發(fā)明得到了結(jié)構(gòu)均一，熒光產(chǎn)率高的金納米粒子二聚體。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，屬于材料化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是指距離小于IOnm的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量 轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。供體的能量傳遞給臨近的受體使得其自身熒光強(qiáng)度發(fā)生大幅度的降低，而受體 的熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。金納米粒子作為一種貴金屬納米材料，其本身就會(huì)猝滅周?chē)嬖诘?熒光分子。但是，金納米粒子良好的生物相容性以及可控的尺寸是研究生物體中分子之間 相互作用以及生物醫(yī)學(xué)治療理想基質(zhì)。通過(guò)在金納米粒子上形成FRET，不僅能夠作為組裝 體納米材料顯著的佐證，而且能為納米材料在生物體中的變化規(guī)律、運(yùn)動(dòng)軌跡提供可靠依 據(jù)。
[0003] 本發(fā)明包括金納米粒子合成，金納米粒子功能化修飾，金納米粒子上修飾突光染 料，金納米粒子二聚體組裝，F(xiàn)RET效應(yīng)的產(chǎn)生及其表征。本發(fā)明通過(guò)在金納米粒子上修飾功 能化的PEG分子，并再在PEG上修飾熒光染料。利用PEG分子鏈狀結(jié)構(gòu)性質(zhì)使得在貴金屬納 米粒子表面周?chē)臒晒馊玖弦材鼙憩F(xiàn)出一定的熒光強(qiáng)度。同時(shí)，利用DNA可控自組裝技術(shù)， 將修飾有不同熒光染料的金納米粒子組裝成二聚體，使得兩種熒光染料之間的距離能夠進(jìn) 一步拉近，從而產(chǎn)生FRET效應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開(kāi)了一種具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，得到了結(jié)構(gòu) 均一，熒光產(chǎn)率高的金納米粒子二聚體。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一種具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法， 具體工藝步驟為： (1) 金納米粒子合成 檸檬酸還原法合成金納米粒子； (2) 金納米粒子功能化修飾 步驟（1)中合成的金納米粒子與一端帶有巰基另一端帶有羧基MW 5000的雙功能基團(tuán) 修飾的聚乙二醇分子SH-PEG-C00H偶聯(lián)，形成Au-PEG-COOH復(fù)合體； (3) 金納米粒子上修飾熒光染料 將步驟（2)中的Au-PEG-COOH復(fù)合體分別與熒光染料Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 647偶聯(lián)，形成Au-AF 594和Au-AF 647復(fù)合體； (4) 金納米粒子二聚體組裝 將步驟（3)中的Au-AF 594及Au-AF 647復(fù)合體分別與DNAl，DNA2偶聯(lián)，形成Au-AF 594-DNA1 復(fù)合體及 Au-AF 647- DNA2 復(fù)合體；將 Au-AF 594-DNA1 復(fù)合體和 Au-AF 647- DNA2復(fù)合體雜交，形成金納米粒子二聚體； DNAl :5' -CAATAGCCCT TGGATAAAAA AAAAA-SH-3'， DNA2 :5' -ATCCAAGGGC TATTGAAAAA AAAAA-SH-3' ； (5) FRET效應(yīng)的產(chǎn)生及其表征 將步驟（4)中的金納米粒子二聚體與僅有一端帶有巰基修飾的PEG (MW 5000)溶液混 勻，得到能夠產(chǎn)生FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體，并對(duì)其進(jìn)行透射電鏡和熒光表征。
[0006] 所述金納米粒子的合成： 在潔凈的三角燒瓶中加入195mL超純水，再加入5mL 4g/L的三水合四氯金酸溶液，力口 熱，煮沸l(wèi)Omin，然后加入3. 6mL質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從 淡黃色變成酒紅色，持續(xù)沸騰反應(yīng)30 min至顏色不再發(fā)生變化。最后，冷卻至室溫，即制得 20nm左右的金納米粒子。
[0007] 所述金納米粒子功能化修飾： 取ImL所述新制的20nm左右金納米粒子，8500rpm離心15min，去上清，沉淀重懸于 900 ii L含0.05%吐溫20的超純水中；再向其中加入15 ii L 20 ii M的雙功能基團(tuán)修飾的PEG 分子 SH-PEG-COOH，SH-PEG-COOH 是從 Laysan Bio, Inc 公司買(mǎi)的，60°C水浴 2h，冷卻至室 溫，得到Au-PEG-COOH復(fù)合體。
[0008] 所述金納米粒子上修飾熒光染料： 將所述得到的Au-PEG-COOH復(fù)合體8500rpm離心15min，去上清，沉淀重懸于ImL pH4. 7 的2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液（MES)中，將IOii L ImM碳二亞胺（EDC)與IOii L IOmM琥 珀酰亞胺（NHS)加入到Au-PEG-COOH復(fù)合體溶液中，室溫靜置4h ;然后，分別取500 ii L活 化后的Au-PEG-COOH復(fù)合體，8500rpm離心15min，去上清，沉淀分別重懸于500 y L I y M Alexa Fluor 594 (pH9. 6)及 500 ii L IiiM Alexa Fluor 647 (pH9. 6)熒光染料中，室溫避 光靜置12h后得到Au-AF 594復(fù)合體及Au-AF 647復(fù)合體。
[0009] 所述金納米粒子二聚體組裝： 將所述得到的Au-AF 594復(fù)合體與DNAl按摩爾濃度比為1 : 5混勻，Au-AF 647復(fù) 合體與DNA2按摩爾濃度比為1 : 5混勻，分別室溫靜置12h后，8500rpm離心15min，去上 清，沉淀分別重懸于500 ii L含0. 05%吐溫20的超純水中，得到Au-AF 594-DNA1復(fù)合體及 Au-AF 647- DNA2復(fù)合體；然后將得到的兩種復(fù)合體等體積混勻，室溫避光反應(yīng)12h，得到 金納米粒子二聚體。
[0010] 所述FRET效應(yīng)的產(chǎn)生及其表征： 將僅有一端帶有巰基修飾的PEG溶液(分子量5000)按摩爾濃度比Au : PEG為 1 : 1000加入到上述修飾有熒光染料的金納米粒子二聚體溶液中，室溫避光反應(yīng)8h后， 8500rpm離心15min，去上清，沉淀重懸于含0. 05%吐溫20的超純水中，得到能夠產(chǎn)生FRET 效應(yīng)的金納米粒子二聚體；取200 ii L樣品加入到比色皿中，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定在594nm對(duì)其 進(jìn)行熒光發(fā)射光譜表征；另取IOu L的上述金納米粒子二聚體滴加到碳膜支持膜上，進(jìn)行 透射電鏡表征。
[0011] 所述DNA的編號(hào)、序列及長(zhǎng)度如表1所示。
[0012] 表I DNA的編號(hào)、序列及長(zhǎng)度 CN 104308182 A m Ti 3/4 頁(yè)

【權(quán)利要求】
1. 一種具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，其特征在于工藝步驟為： (1) 金納米粒子合成 檸檬酸還原法合成金納米粒子； (2) 金納米粒子功能化修飾 步驟（1)中合成的金納米粒子與一端帶有巰基另一端帶有羧基MW 5000的雙功能基團(tuán) 修飾的聚乙二醇分子SH-PEG-COOH偶聯(lián)，形成Au-PEG-COOH復(fù)合體； (3) 金納米粒子上修飾熒光染料 將步驟（2)中的Au-PEG-COOH復(fù)合體分別與熒光染料Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 647偶聯(lián)，形成Au-AF 594及Au-AF 647復(fù)合體； (4) 金納米粒子二聚體組裝 將步驟（3)中的Au-AF 594及Au-AF 647復(fù)合體分別與DNAl，DNA2偶聯(lián)，形成Au-AF 594-DNA1 復(fù)合體及 Au-AF 647- DNA2 復(fù)合體；將 Au-AF 594-DNA1 復(fù)合體和 Au-AF 647-DNA2復(fù)合體雜交，形成金納米粒子二聚體； DNAl :5' -CAATAGCCCT TGGATAAAAA AAAAA-SH-3'， DNA2 :5' -ATCCAAGGGC TATTGAAAAA AAAAA-SH-3' ； (5) FRET效應(yīng)的產(chǎn)生及其表征 將步驟（4)中的金納米粒子二聚體與僅有一端帶有巰基修飾的PEG-5000溶液混勻，得 到能夠產(chǎn)生FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體，并對(duì)其進(jìn)行透射電鏡和熒光表征。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，其特征在于所 述金納米粒子的合成： 在潔凈的三角燒瓶中加入195mL超純水，再加入5mL 4g/L的三水合四氯金酸溶液，力口 熱，煮沸l(wèi)Omin，然后加入3. 6mL質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從 淡黃色變成酒紅色，持續(xù)沸騰反應(yīng)30 min至顏色不再發(fā)生變化；最后，冷卻至室溫，即制得 20nm級(jí)的金納米粒子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，其特征在于所 述金納米粒子功能化修飾： 取ImL所述新制的20nm級(jí)金納米粒子，8500rpm離心15min，去上清，沉淀重懸于 900 ii L含0.05%吐溫20的超純水中；再向其中加入15 ii L 20 ii M的雙功能基團(tuán)修飾的PEG 分子SH-PEG-C00H，60°C水浴2h，冷卻至室溫，得到Au-PEG-COOH復(fù)合體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，其特征在于所 述金納米粒子上修飾熒光染料： 將所述得到的Au-PEG-COOH復(fù)合體8500rpm離心15min，去上清，沉淀重懸于ImL pH4. 7 的2- (N-嗎啡啉）乙磺酸MES緩沖液中，將10 ii L ImM碳二亞胺EDC與10 ii L IOmM琥珀酰 亞胺NHS加入到Au-PEG-COOH復(fù)合體溶液中，室溫靜置4h ;然后，分別取500 ii L活化后的 Au-PEG-COOH復(fù)合體，8500rpm離心15min，去上清，沉淀分別重懸于500iiL IiiM pH 9. 6 Alexa Fluor 594及 500 ii L IiiM pH 9.6 Alexa Fluor 647 熒光染料中，室溫避光靜置 12h 后得到Au-AF 594復(fù)合體及Au-AF 647復(fù)合體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，其特征在于所 述金納米粒子二聚體組裝： 將所述得到的Au-AF 594復(fù)合體與DNAl按摩爾濃度比為I:5混勻，Au-AF 647復(fù) 合體與DNA2按摩爾濃度比為1:5混勻，分別室溫靜置12h后，8500rpm離心15min，去上 清，沉淀分別重懸于500 ii L含0. 05%吐溫20的超純水中，得到Au-AF 594-DNA1復(fù)合體及 Au-AF 647- DNA2復(fù)合體；然后將得到的兩種復(fù)合體等體積混勻，室溫避光反應(yīng)12h，得到 金納米粒子二聚體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有FRET效應(yīng)的金納米粒子二聚體的組裝方法，其特征在于所 述FRET效應(yīng)的產(chǎn)生及其表征： 將僅有一端帶有巰基修飾的PEG-5000溶液按摩爾濃度比Au : PEG為1:1000加 入到上述修飾有熒光染料的金納米粒子二聚體溶液中，室溫避光反應(yīng)8h后，8500rpm離心 15min，去上清，沉淀重懸于含0. 05%吐溫20的超純水中，得到能夠產(chǎn)生FRET效應(yīng)的金納米 粒子二聚體；取200y L樣品加入到比色皿中，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定在594 nm對(duì)其進(jìn)行熒光發(fā)射 光譜表征；另取IOu L的上述金納米粒子二聚體滴加到碳膜支持膜上，進(jìn)行透射電鏡表征。
【文檔編號(hào)】B82Y40/00GK104308182SQ201410565114
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】徐麗廣, 胥傳來(lái), 孫茂忠, 匡華, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)