專利名稱：通過間接免疫熒光測定的終點(diǎn)效價(jià)確定方法及其評估方法
通過間接免疫熒光測定的終點(diǎn)效價(jià)確定方法及其評估方法描述本發(fā)明涉及通過間接免疫熒光測定確定在人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體的終點(diǎn)效價(jià)確定方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過間接免疫熒光測定確定人血清中抗細(xì)胞核 和細(xì)胞質(zhì)抗原抗體的體外診斷試劑盒，以及在所述方法框架內(nèi)評估和確定終點(diǎn)效價(jià)的計(jì)算 機(jī)程序。
背景技術(shù)：
自身免疫疾病是由免疫系統(tǒng)對于機(jī)體自身組織過度反應(yīng)所致疾病。免疫系統(tǒng)將機(jī) 體自身組織錯(cuò)誤地檢測為待攻擊的外來物質(zhì)。由此產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致受累器官 的損害。T細(xì)胞負(fù)責(zé)檢測外來物質(zhì)。T細(xì)胞在胸腺中被訓(xùn)練以僅停靠在MHC分子上及耐受 機(jī)體自身物質(zhì)。在自身免疫疾病中，這些細(xì)胞表現(xiàn)為與其性質(zhì)相反。代替防御進(jìn)入體內(nèi)的 外來物質(zhì)，它們攻擊機(jī)體自身結(jié)構(gòu)。生物體生命所必需的器官和組織被免疫系統(tǒng)識別為外 來物質(zhì)。免疫系統(tǒng)命令其全部力量對抗這些結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞和體液防御反應(yīng)，導(dǎo)致自身抗體 產(chǎn)生。這些器官和組織因此隨著時(shí)間的推移而喪失其功能。本發(fā)明因此涉及自身免疫疾病 的診斷和及隨后的治療。原則上，可以通過檢測自身抗體譜(Profiler!)對自身免疫疾病進(jìn)行血清學(xué)鑒定。 大多數(shù)這些抗體針對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原?？购丝贵w(ANA)主要與風(fēng)濕性疾病相關(guān)。一些 ANA是疾病特異性的，并且用作診斷標(biāo)記。這種抗體包括例如抗如下物質(zhì)的抗體 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的雙鏈DNA (ds-DNA)和Sm抗原， 硬皮病中的纖維蛋白、彌漫性硬皮病中的拓?fù)洚悩?gòu)酶I (ScI-70)、CREST病中的 著絲粒(ACA)， 多肌炎中的組氨酰-tRNA-合成酶(Jo-1) 多肌炎與硬皮病之間重疊的PM-ScI。在一些疾病中發(fā)現(xiàn)具有不同的流行性(unterschiedlicher PrSvalenz)的ANA。 這些包括SLE、藥物治療引起的狼瘡以及慢性營養(yǎng)毒性肝病中的抗組蛋白抗體；SLE和 Sharp綜合征(MCTD 混合結(jié)締組織病)中的抗RNP抗體；以及SLE和Sj6gren’S綜合征中的 抗-SS-A(Ro)和抗-SS-B(La)抗體?？?M2型抗線粒體抗體(AMA)與線粒體的a酮酸脫 氫酶復(fù)合物的蛋白質(zhì)反應(yīng)，且是慢性膽汁郁積性肝病原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的特征性 標(biāo)記。最早的ANA和AMA的檢測方法是免疫熒光檢測法(IFT)，其中將冷凍的組織切片或 者單細(xì)胞用作基質(zhì)。在這種方法中，待檢測的抗體的不同物種特異性是基本準(zhǔn)則。對于一 些人抗體，可以示出其只是與人或靈長類動物的組織反應(yīng)，而其它自身抗體以物種非特異 性方式與來自大鼠、小鼠、兔或者豚鼠的組織切片反應(yīng)。各個(gè)抗原在其系統(tǒng)發(fā)生方面彼此不 同。更多的物種非特異性抗原在進(jìn)化過程中保持更強(qiáng)的保守性，因此在更不太相關(guān)的物種 中發(fā)現(xiàn)。然而，當(dāng)使用HEp-2細(xì)胞時(shí)，不是所有的動物細(xì)胞均適于檢測特異性自身抗體這個(gè) 缺點(diǎn)可以被忽略。所謂的HEp-2細(xì)胞是指人喉上皮細(xì)胞系，其對于針對核抗原的大多數(shù)人自身抗體(ΑΝΑ/ΕΝΑ)呈現(xiàn)出高特異性(Hollingworth et al. ,Clin. Diagn. Lab. Immunol. Vol. 3，1996 374-377)。系統(tǒng)性風(fēng)濕性炎癥疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)及其變異、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化 癥(PSS)、原發(fā)Sj5gren’s綜合征、皮肌炎、Sharp綜合征(混合結(jié)締組織病-MCTD)或者類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎(RA)均特征在于出現(xiàn)許多針對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成分的自身抗體。盡管這些自 身抗體的Stiopathogenetische作用還未充分闡述，但是其可以用作除了活性參數(shù)之外的 多種臨床譜(clinical profile)的標(biāo)記(Tan Ε. Μ.，Adv Immunol 1982,33 167-240 ；Tan Ε. Μ.，Adv Immunol. 1989,44 :93_151)。 目前自身抗體診斷中的一種合適方法是所謂的間接免疫熒光測定法。在ΗΕρ-2細(xì) 胞上進(jìn)行的免疫熒光測定是一種確定抗核抗體(ANA)的靈敏的篩選方法，其除了識別熒光 參數(shù)之外，還提供了特異性潛在抗原和相關(guān)疾病的證據(jù)(Moore et al. ,Cancer Res. 1955， 15 998-602 ；Weller et al.，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954，86 :789_794)。在所述間接 免疫熒光測定中，人上皮細(xì)胞系的ΗΕρ-2細(xì)胞用作基質(zhì)，其對于大多數(shù)針對核抗原的人自 身抗體(ΑΝΑ/ΕΝΑ)均具有高靈敏性。目前許多廠商可以提供ΗΕρ-2細(xì)胞(人上皮細(xì)胞) (例如 INOVA Diagnostics，San Diego, USA ；Kallestadt，Chaska，USA ；Immuno Concepts， Sacramento，USA)0定性和半定量確定ANA的間接ANA HEp-2免疫熒光測定如下所述進(jìn)行在第一個(gè) 反應(yīng)步驟中，稀釋的患者樣品和對照中的抗體與固定在玻片上的ΗΕρ-2細(xì)胞的抗原特異性 反應(yīng)。在室溫保溫30分鐘之后，通過洗滌步驟除去未結(jié)合的成分。在第二個(gè)反應(yīng)步驟中， 結(jié)合的抗體與偶聯(lián)于異硫氰酸熒光素(FITC)的抗人抗體(IgG和輕鏈特異性抗體)特異性 反應(yīng)。在室溫保溫30分鐘后，通過進(jìn)一步的洗滌步驟從所述與固相結(jié)合的免疫復(fù)合物中除 去過量的綴合分子。在覆蓋之后，將該玻片置于熒光顯微鏡下(激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長 520nm)手工讀取。根據(jù)ΗΕρ-2細(xì)胞中所述抗原的組織學(xué)排列檢測特異性熒光模式。間接免疫熒光測定的最顯著的問題之一是在ΗΕρ-2細(xì)胞上自身抗體診斷中熒光 光學(xué)成像的評估。在目前自身抗體診斷中，一種使用ΗΕρ-2細(xì)胞的自動化方法呈現(xiàn)出如下 特征通過熒光顯微鏡和數(shù)碼相機(jī)捕獲圖像的系統(tǒng)，其包含自動圖像分析及確定熒光模式 的描述特征，自動分類熒光模式以及在實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)系統(tǒng)上輸出識別的模式。例如，具有相機(jī) 和標(biāo)準(zhǔn)PC的熒光顯微鏡作為捕獲單元。得自測量的熒光模式使得目前可以識別7種不同 的基本模式(均質(zhì)型、核仁型、細(xì)斑點(diǎn)型、粗斑點(diǎn)型、著絲粒型、周邊型、多核點(diǎn)型)。這種系統(tǒng)例如在DE 198 01 400 Cl中描述。DE 198 01 400 Cl描述了對ΗΕρ-2 細(xì)胞模式進(jìn)行自動識別、性質(zhì)描述和解釋的方法和系統(tǒng)。這種方法和相應(yīng)的系統(tǒng)用以檢測 自身免疫疾病，從而解釋在二維圖像捕獲和數(shù)字化中出現(xiàn)的ΗΕρ-2細(xì)胞，以及圖像背景中 切片的ΗΕρ-2細(xì)胞的分布，眾多不連續(xù)圖像類的分類，各個(gè)物體的像素總和，物體特征的確 定，細(xì)胞模式對比及細(xì)胞模式的展示和/或存檔以及指派的類別關(guān)系。DE 198 01 400 Cl 所述系統(tǒng)由記錄設(shè)備和圖像分割設(shè)備、圖像類分類設(shè)備、特征鑒定設(shè)備以及細(xì)胞模式對比 設(shè)備組成。所述裝置依次包含和連接于數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)中。EP 1 733 333 Bl描述了相似 系統(tǒng)。前述方法基于終點(diǎn)滴定原理，這是確定血清中抗體量的半定量方法。在這種方法 中，使用恒定體積檢測系列稀釋的血清以及因此系列稀釋的抗體。結(jié)果以其中免疫熒光模 式仍可見的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)值表示。這種方法的問題是定性陽性檢測結(jié)果單獨(dú)不提供或者不允許有根據(jù)的診斷報(bào)告。表示終點(diǎn)效價(jià)的血清滴定的半定量確定僅可提供診斷性相 關(guān)報(bào)告。然而，必須說明的是臨床診斷不是沒有問題的。這是因?yàn)榻咏?0%的普通人群可 呈現(xiàn)出ANA。ANA的出現(xiàn)依賴于患者的年齡和性別，隨著年齡的增加頻率增加。上了年紀(jì)的 人具有低效價(jià)而無臨床癥狀的陽性結(jié)果因此可看做是正常結(jié)果。健康的年輕人因此通常是 ANA陰性的。經(jīng)歷皮質(zhì)類固醇治療的SLE患者也可以是ANA陰性的。ANA也可以出現(xiàn)在具 有結(jié)締組織病的患者的親屬中，其隨后也可發(fā)病。目前根據(jù)美國亞特蘭大疾病控制和預(yù)防中心(⑶C)的如下建議(Lyerlaand Forrester :The Immunofluorescence (IF) test. In Immunofluorescencemethods in virology, USDHHS, Georgia, 1979，71-81)，基于各個(gè)熒光物體的不同熒光強(qiáng)度對熒光模式 的評估分類4+ =最大熒光，亮黃-綠色
3+ =略低的亮黃-綠色熒光2+ =清楚但暗黃色_綠色熒光1+ =非常微弱的受抑制的熒光然而熒光的強(qiáng)度不反映抗體濃度。各種顯微鏡中的光鏡(Optik)、濾光器和光源的 不同可導(dǎo)致一個(gè)步驟以上的熒光強(qiáng)度不同。在這方面，產(chǎn)生所謂的“陰性”和“陽性”結(jié)果。 當(dāng)HEp-2細(xì)胞呈現(xiàn)熒光小于1+及不存在可確定模式時(shí)，該樣品稀釋液被評定為“ANA陰性”。 當(dāng)HEp-2細(xì)胞除了清晰可確定模式之外還呈現(xiàn)熒光為1+或之上時(shí)，該樣品稀釋液被評定為 "ANA陽性”。因此滴定終點(diǎn)的確定也依賴于熒光顯微鏡的類型和條件，除了觀測者的主觀判斷 之外還依賴于物鏡的放大倍數(shù)。污染細(xì)菌的樣品或者洗滌緩沖液可導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)的非特異 性著色。在半定量滴定中，其中存在1+熒光信號的最后稀釋倍數(shù)作為結(jié)果。然后將這個(gè)滴 定倍數(shù)作為血清終點(diǎn)效價(jià)。所述效價(jià)是是稀釋倍數(shù)的倒數(shù)值。在由疾病控制和預(yù)防中心 (CDC)推薦的四倍系列稀釋中，滴定終點(diǎn)可以如下推斷1 40 = 3+1 160 = 2+1 640 = +/"1 2560 =-因此推斷的效價(jià)是1 320。作為這個(gè)評估的結(jié)果，認(rèn)為40和80的效價(jià)是低陽性但臨床不相關(guān)，認(rèn)為160和 320的效價(jià)是中等效價(jià)，其可以是臨床相關(guān)的，而640或更高的效價(jià)被認(rèn)為是高陽性且是臨 床相關(guān)的。然而，產(chǎn)生這種類型的系列稀釋液以及進(jìn)行各個(gè)檢驗(yàn)耗時(shí)且成本較高，因此在實(shí) 施中通常放棄四倍系列稀釋，分析限于一或二倍稀釋(例如1 80和1 320)。
例如，現(xiàn)有技術(shù)使用如下系統(tǒng)進(jìn)行效價(jià)確定所述應(yīng)用系統(tǒng)除了使用電動X-Y樣 品工作臺之外還含有待分析的制備物，電動熒光顯微鏡(Z-控制)具有可控相機(jī)以及具有 相應(yīng)軟件和存取數(shù)據(jù)庫的個(gè)人計(jì)算機(jī)。第1天用1 80 (+1 320)稀釋液進(jìn)入篩選；由醫(yī)學(xué)技術(shù)助理(MTA)目測終點(diǎn)效價(jià)；第2天1 640,1 1280稀釋，及任選進(jìn)一步稀釋步驟直至在估計(jì)的終點(diǎn)效價(jià) 基礎(chǔ)上高或者低1。如果終點(diǎn)效價(jià)不可確定，則需要進(jìn)一步稀釋直至熒光模式不再可見。這種方法最主要的問題是制備物的熒光強(qiáng)度依賴于許多因素，例如應(yīng)用的具體相 機(jī)的靈敏性、染色方案、防脫色介質(zhì)、激發(fā)光，激發(fā)光又依賴于光源齡以及應(yīng)用的光學(xué)元件 如物鏡和濾光器組。目前使用的方法的缺點(diǎn)可以概括如下 仍是由觀測者純主觀方式進(jìn)行熒光模式評估。 熒光模式的強(qiáng)度有很大波動，因?yàn)槟Ｊ揭蕾囉谠S多技術(shù)參數(shù)，例如應(yīng)用的具體相 機(jī)的靈敏性，染色方案，防脫色介質(zhì)，激發(fā)光，激發(fā)光又依賴于光源齡及光學(xué)分析中使用的 光學(xué)元件。最后，每個(gè)觀察者對熒光模式的強(qiáng)度和“亮度”的感知不同。因此不應(yīng)忽略對“亮 度評估”的主觀影響。 評估本身被限制于在實(shí)驗(yàn)室中可行的并且被認(rèn)為是大多情況下必須的最小值。 這意味著僅進(jìn)行了不完整測量或稀釋系列，然后滴定終點(diǎn)被外推，其根據(jù)各個(gè)用戶的經(jīng)驗(yàn) 或多或少精確。因此這個(gè)終點(diǎn)可以位于實(shí)際終點(diǎn)效價(jià)之上或之下?！罢_”結(jié)果經(jīng)常是依賴 于機(jī)會。 通過表型特征主觀評估熒光模式導(dǎo)致錯(cuò)誤率增加，由此甚至導(dǎo)致待被評估圖像 的錯(cuò)誤解釋。在診斷實(shí)踐中，這可以導(dǎo)致自身免疫疾病未被識別，或者假陽性結(jié)果被確定和 評估。在診斷及臨床實(shí)踐中這可以導(dǎo)致治療可能被省略或者不成熟治療，這兩種情況均代 表對患者的不利情形。發(fā)明詳述要解決的現(xiàn)有技術(shù)問題是通過間接熒光免疫測定在自身抗體診斷中提供客觀及 可再現(xiàn)的熒光模式評估。除了各個(gè)從屬權(quán)利要求之外，通過獨(dú)立權(quán)利要求的特征解決這個(gè)問題。根據(jù)本發(fā)明，提供了通過間接免疫熒光測定在人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原抗 體確定中的終點(diǎn)效價(jià)確定方法，所述方法包括多個(gè)步驟，其中患者血清內(nèi)含有的自身抗體 與固定于玻片上的HEp-2細(xì)胞、白細(xì)胞、綠蠅短膜蟲(Crithidia luciliae)和/或組織切 片的抗原反應(yīng)及結(jié)合。發(fā)生結(jié)合的自身抗原的特異性熒光標(biāo)記，除了使用評估系統(tǒng)中熒光 強(qiáng)度經(jīng)光學(xué)記錄和評估熒光光學(xué)圖像之外，隨后對結(jié)合所述玻片的熒光標(biāo)記的自身抗體進(jìn) 行熒光顯微鏡分析。所述評估系統(tǒng)在患者血清中含有的自身抗體與固定在玻片上的HEp-2 細(xì)胞、白細(xì)胞、綠蠅短膜蟲和/或組織切片的抗原結(jié)合之前通過具有限定效價(jià)的至少兩個(gè) 對照血清校準(zhǔn)以產(chǎn)生稀釋系列，其中還測量激發(fā)光的強(qiáng)度。相對于對照血清的效價(jià)設(shè)置記 錄的熒光光學(xué)圖像的熒光強(qiáng)度，從而提供待檢測的患者血清的終點(diǎn)效價(jià)。待檢測的患者血 清的終點(diǎn)效價(jià)從校準(zhǔn)的系統(tǒng)的確定的參考函數(shù)中產(chǎn)生，其根據(jù)所述模式或模式組合可以是 線性或者非線性的。除了測量激發(fā)光的強(qiáng)度之外，本發(fā)明的終點(diǎn)效價(jià)確定方法特征在于校準(zhǔn)階段。此 外，除了患者血清的最初效價(jià)之外，最大的有意義的曝光時(shí)間(最終曝光時(shí)間)以及相機(jī)的 曝光時(shí)間是相關(guān)的。
本發(fā)明的基本特征是光學(xué)校準(zhǔn)程序，其用于評估熒光模式。這通過測量熒光的激 發(fā)光實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明的玻片在其表面上呈現(xiàn)具有限定效價(jià)的多個(gè)對照血清，由此校準(zhǔn)所述光 學(xué)系統(tǒng)。為了進(jìn)行校準(zhǔn)，對每個(gè)限定的對照血清經(jīng)過多個(gè)圖像測量平均曝光時(shí)間，隨后確定 相機(jī)的終點(diǎn)(飽和點(diǎn))，其得自最大有意義的曝光時(shí)間，其相應(yīng)于對照血清的終點(diǎn)效價(jià)的曝 光時(shí)間。因此待研究的患者血清的終點(diǎn)效價(jià)得自最終曝光時(shí)間、患者血清的最初效價(jià)和相 機(jī)的曝光時(shí)間，優(yōu)選根據(jù)確定的校準(zhǔn)函數(shù)，其在最簡單的線性情況中可以根據(jù)如下等式計(jì) 算 此外，通過間接免疫熒光測定法確定人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原抗體的體外 診斷試劑盒也是本發(fā)明的主題，所述試劑盒包括至少a.用HEp-2細(xì)胞包被的具有施加對照血清和患者血清的多個(gè)施加部位的玻片，b.具有不同的預(yù)定效價(jià)的對照血清，用以校準(zhǔn)免疫熒光顯微鏡測量和評估系統(tǒng)的 光學(xué)系統(tǒng)，c.熒光標(biāo)記的抗人抗體，用以特異性偶聯(lián)與HEp-2細(xì)胞結(jié)合的抗體。所述試劑盒中要應(yīng)用的抗人抗體是抗人免疫球蛋白，且可以任選與異硫氰酸熒光 素偶聯(lián)。本文所述的試劑盒適于進(jìn)行本發(fā)明的方法，以在人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原 抗體確定中確定終點(diǎn)效價(jià)。所述試劑盒有利地還包括適于其應(yīng)用的試劑、洗滌溶液及其它 溶液。所述試劑盒除了任選提供參考數(shù)值表和校準(zhǔn)信息之外，優(yōu)選還提供在體外診斷中每 個(gè)必需步驟的方案。所述試劑盒進(jìn)一步含有組合該試劑盒內(nèi)容物的信息。本發(fā)明還提供了在HEp-2細(xì)胞上的免疫熒光測定作為確定抗核抗體(ANA)的靈敏 篩選測定法，其通過熒光模式的識別可以報(bào)告潛在的抗原及相關(guān)的病癥。所述試劑盒包含 一系列試劑，用以通過自動化評估方式定性和半定量確定人血清中抗HEp-2細(xì)胞的細(xì)胞核 和細(xì)胞質(zhì)中抗原的抗體。此外，本發(fā)明提供了計(jì)算機(jī)程序，其存儲于含有計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)(程序代碼)的計(jì) 算機(jī)可讀介質(zhì)中，在計(jì)算機(jī)運(yùn)行期間通過其命令計(jì)算機(jī)進(jìn)行本發(fā)明的方法。通過計(jì)算機(jī)程 序，可以電子控制和評估在自身抗體診斷中通過間接免疫熒光測定評估熒光光學(xué)圖像確定 人血清中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原抗體中終點(diǎn)效價(jià)確定方法。本發(fā)明還包含這樣的設(shè)備，其用于通過間接免疫熒光測定在確定人血清中抗細(xì)胞 核和細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體中在自身抗體診斷中的終點(diǎn)效價(jià)確定，所述設(shè)備包括a.利用具有相機(jī)的熒光顯微鏡的圖像捕獲系統(tǒng)，b.自動圖像分析和確定患者血清的結(jié)合的自身抗體的捕獲的熒光模式和熒光強(qiáng) 度的系統(tǒng)，所述自身抗體與固定于玻片上的HEp-2細(xì)胞、白細(xì)胞、綠蠅短膜蟲和組織切片的 抗原反應(yīng)及結(jié)合。這個(gè)設(shè)備具有提供圖像捕獲及同時(shí)進(jìn)行自動圖像分析的優(yōu)勢。這樣特別減少了現(xiàn) 有技術(shù)關(guān)于數(shù)據(jù)分析不足的已知缺點(diǎn)。本發(fā)明的方法和基于所述方法的試劑盒適于基于細(xì)胞的測定，其中熒光模式和潛在地效價(jià)被自動化讀取。所述方法適于通過自動化評估定性和半定量確定人血清中抗HEp-2細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的抗原的抗體。除了 HEp-2細(xì)胞之外，也優(yōu)選白細(xì)胞、綠蠅 短膜蟲和組織切片。熒光信號取決于變量，這是為什么加入防脫色試劑如2，3，5，6-四甲基-1，4-苯二 胺(C10H16N2)是有利的。本發(fā)明尤其是試劑盒和方法的基本要素是待檢測的“細(xì)胞+綴合物”保持恒定。所 述綴合物(=著色劑+抗體)通過防止著色劑褪色(防脫色)的物質(zhì)保持穩(wěn)定。優(yōu)選使用 2，3，5，6_四甲基-1，4_苯二胺(C1QH16N2)。所述基本技術(shù)參數(shù)(熒光濾光器、相機(jī)、物鏡) 也是常量。因此僅曝光強(qiáng)度可波動，因此其在預(yù)測效價(jià)時(shí)進(jìn)行測量(=測量激發(fā)光)。所述 技術(shù)的單一變量因此是光源，這也解釋了為什么要測量熒光的激發(fā)光，因?yàn)闊晒饧ぐl(fā)和熒 光發(fā)射彼此相關(guān)?？贵w濃度(效價(jià))因此得自血清圖像的曝光時(shí)間。除了快速且有效成本地獲得血清的終點(diǎn)效價(jià)之外，本發(fā)明的優(yōu)勢因此是客觀確定 終點(diǎn)效價(jià)?？梢詫⒈景l(fā)明的系統(tǒng)普遍應(yīng)用于各個(gè)測量系統(tǒng)。此外，可以使用不同種類的制 備物(該系統(tǒng)可普遍應(yīng)用于不同制備物如細(xì)胞、單細(xì)胞或者組織切片)。此外，通過本發(fā)明 可以節(jié)約技術(shù)和財(cái)政資源。進(jìn)一步的有利方面在所附權(quán)利要求書中描述。本發(fā)明通過實(shí)施例和附圖得以更清 晰地描述，但是本發(fā)明非限于本文揭示的實(shí)施例。

圖1-4證實(shí)不同的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例通過附圖和實(shí)施例試圖更清晰地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明非試圖限于本文揭示的 實(shí)施例。I.準(zhǔn)備及實(shí)施測量。應(yīng)用如下方法1.使用一些對照血清校準(zhǔn)熒光光學(xué)元件。2.在室溫將患者血清用吸量管滴在包被玻片的指定施加部位，在濕潤保溫室中在 室溫保溫30分鐘。3.將該玻片用PBS溶液漂洗，以及在染色槽中在新鮮制備的PBS中洗滌2次，每次 5分鐘。4.將該玻片用綴合溶液覆蓋，在具有紫外光防護(hù)的濕潤保溫室中在室溫保溫30 分鐘。5.重復(fù)步驟3。6.將該玻片用蓋玻片覆蓋，不留氣泡，在熒光顯微鏡下測量。II.校準(zhǔn)圖2示出用第一種校準(zhǔn)血清1校準(zhǔn)，由此獲知終點(diǎn)(640)。在最簡單情況中，測量 的滴定出的血清的曝光時(shí)間的回歸是直線(Y = mx+b)，其中m是斜率，b是與Y軸的交點(diǎn)。 更復(fù)雜的曲線可以根據(jù)下式計(jì)算 由于已知校準(zhǔn)血清的終點(diǎn)，因此應(yīng)僅包括向上直至回歸終點(diǎn)的測量點(diǎn)，因?yàn)槌^ 此點(diǎn)僅組織的自身熒光被測量。
圖3示出具有已知終點(diǎn)(640)的校準(zhǔn)血清1 (均質(zhì)型)與也已知其終點(diǎn)(1280)的 校準(zhǔn)血清2 (斑點(diǎn)型模式)的相關(guān)性。根據(jù)所述模式和特異性(線性斜率或者指數(shù)或者S 形)可以產(chǎn)生不同校準(zhǔn)血清的不同曲線形狀。每個(gè)校準(zhǔn)血清均具有不同的抗體特異性(均 質(zhì)模式，著絲粒模式，斑點(diǎn)模式等(見下文))。在測量期間確定所述模式，選擇校準(zhǔn)曲線以 及將稀釋效價(jià)引入校準(zhǔn)曲線中計(jì)算血清終點(diǎn)效價(jià)點(diǎn)。III.血清效價(jià)評估使用1 80最初效價(jià)進(jìn)行HEp-2終點(diǎn)效價(jià)評估。如下校準(zhǔn)所述“校準(zhǔn)玻片”(見實(shí)施例1，點(diǎn)1)將1 640已知效價(jià)的第一種血清 以8倍稀釋度施加于玻片上的8個(gè)孔中，曝光并通過熒光顯微鏡測量。在不同曝光時(shí)間測 量熒光強(qiáng)度。這樣產(chǎn)生如下系列測量結(jié)果表1:玻片的校準(zhǔn)

通過從孔1至5的值的回歸確定所述函數(shù)的原形(見圖1 ;Y-軸光強(qiáng)度；X-軸 稀釋倍數(shù))。在這個(gè)實(shí)施例中，最大有意義曝光時(shí)間是5000ms，因?yàn)殡S后所述制備物開始出 現(xiàn)自身熒光，從而導(dǎo)致誤報(bào)結(jié)果。由于對玻片(校準(zhǔn)玻片)描述的校準(zhǔn)，因此這個(gè)實(shí)施例中 校準(zhǔn)系統(tǒng)的終點(diǎn)已知為5000ms。然而，具有患者血清的玻片(患者玻片)可呈現(xiàn)不同的稀釋倍數(shù)。在這種情況中， 孔中血清的稀釋倍數(shù)已知為1 80。圖像自動化曝光，由此免疫熒光信號被相機(jī)的傳感器 完全捕獲(見 Hiemann et al. Cytometry Part A 69A(2005))。測量 500ms 相機(jī)的平均曝 光時(shí)間，這個(gè)時(shí)間通過平均所述孔的單一圖像的曝光時(shí)間而獲得。在實(shí)施中，需要回答的問 題是所述血清的預(yù)期終點(diǎn)效價(jià)是多高？基于本發(fā)明的解決方案提供了這樣的結(jié)果，即使用線性關(guān)系，感興趣的終點(diǎn)效價(jià) 可以根據(jù)校準(zhǔn)系統(tǒng)的確定的參考函數(shù)計(jì)算。根據(jù)上述實(shí)施例，通過下式計(jì)算 圖4示出使用斑點(diǎn)模式進(jìn)一步測量患者血清，其中未知終點(diǎn)。使用已知稀釋效價(jià) 80。測量的曝光時(shí)間為200ms。由此通過在校準(zhǔn)函數(shù)中插入數(shù)值計(jì)算終點(diǎn)效價(jià)為 400。下表2提供了根據(jù)本發(fā)明從第二個(gè)檢測系列(線性校準(zhǔn)函數(shù))獲得的測量結(jié)果。表2 “血清”描述了以內(nèi)部參考號碼提供的血清。“效價(jià)軟件”描述了通過本發(fā)明的軟件確定的效價(jià)，使用如上述從已知最初效價(jià)、 使用的曝光時(shí)間和最終曝光時(shí)間中獲得的比例量?！靶r(jià)人”描述了根據(jù)目前常用方法通過主觀感知熒光強(qiáng)度確定的效價(jià)。“偏差”描述了主觀確定的效價(jià)步驟中的偏差。因此，+/-1效價(jià)步驟的偏差(見上 述)不認(rèn)為是有意義的而且實(shí)際上在所應(yīng)用的技術(shù)中不起作用。因此獲得令人吃驚的結(jié)果，使用本發(fā)明的技術(shù)可以更精確地及無失誤地確定終點(diǎn) 效價(jià)。除了檢測原理之外，本發(fā)明的方法、基于所述方法的本發(fā)明的試劑盒在下文詳細(xì) 描述。a.本發(fā)明的試劑盒含有至少如下內(nèi)容物-用HEp-2細(xì)胞包被的具有施加部位的玻片，其任選用保護(hù)氣體密封，-洗滌緩沖液/樣品稀釋PBS緩沖液，pH7.4士0. 1，固體物質(zhì)，-與FITC偶聯(lián)的包含抗人免疫球蛋白(IgG和輕鏈特異性抗體)的綴合物，-磷酸鹽緩沖的具有防脫色試劑的永久甘油溶液覆蓋介質(zhì)，-蓋玻片，-陽性對照；具有抗體特異性的陽性人血清，-陰性對照；陰性人血清，-讀取和評估熒光模式的測量系統(tǒng)。
此外，所述試劑盒中也可包含其它常用輔助設(shè)備，如用戶自定義的微量加液器 (10，100，1000 μ 1)，微量加液吸頭，樣品稀釋管，測量圓筒或者量瓶，濕潤保溫室，洗滌瓶和 /或染色槽。b.稀釋的患者樣品或者對照血清中的抗體在第一個(gè)反應(yīng)步驟中與固定于玻片的 HEp2-細(xì)胞的抗原特異性反應(yīng)。在室溫保溫30分鐘后，通過洗滌步驟除去未結(jié)合的成分。結(jié) 合的抗體在第二個(gè)反應(yīng)步驟中與偶聯(lián)于異硫氰酸熒光素(FITC)的抗人抗體(IgG和輕鏈特 異性抗體)特異性反應(yīng)。在室溫保溫30分鐘后，通過進(jìn)一步洗滌步驟從與固相結(jié)合的免疫 復(fù)合物中分離出剩余的綴合物分子。根據(jù)HEp-2細(xì)胞中抗原的組織學(xué)排列可觀測特異性熒 光模式。在覆蓋之后，在具有自動測量系統(tǒng)的熒光顯微鏡下讀取該玻片(激發(fā)波長490nm， 發(fā)射波長520nm)。c.為了提取樣品，使通過靜脈穿刺取自患者的血液凝固，隨后通過離心分離血清。 在應(yīng)用于所述測定中之前，將血清置于室溫下，任選簡單搖動以保證適當(dāng)均質(zhì)性。將進(jìn)行本 發(fā)明測定的患者樣品以1 80(v/v)比率用PBS緩沖液稀釋。除了這個(gè)篩選稀釋之外，在 潛在混合型模式(EASI推薦)情況中可以應(yīng)用1 320稀釋液以保證效價(jià)預(yù)測或者更好的 評估。從1 80 (ν/ν)稀釋倍數(shù)開始，將所述樣品在PBS緩沖溶液中進(jìn)一步4倍稀釋，例如 100 μ 1樣品稀釋液+300 μ 1 PBS緩沖液。d.如下所述進(jìn)行本發(fā)明測定d. 1.將測定試劑置于室溫下(RT，20_25°C )。將玻片從其包裝中取出，在馬上使用 之前標(biāo)記以避免污染。d. 2.用吸液管吸取25 μ 1對照物(25 μ 1稀釋的患者血清)。d. 3.將玻片在室溫在濕潤保溫室中保溫30分鐘。d. 4.用PBS溶液漂洗將該玻片。d. 5.將該玻片在染色槽中用新鮮制備的PBS溶液洗滌2次，每次5分鐘。d. 6.單獨(dú)取出玻片，使PBS滴下，將1滴綴合物加入每個(gè)施加部位，由此所述施加
部位被完全覆蓋。d. 7.將該玻片在室溫在濕潤保溫室中保溫30分鐘。使該玻片避免光直射。d. 8.重復(fù)步驟 d. 4 和 d. 5。d. 9.單獨(dú)取出玻片，使PBS滴下，將一小滴覆蓋介質(zhì)加于每個(gè)施加部位的邊緣。然 后將蓋玻片小心置于該玻片上，由此所述覆蓋介質(zhì)形成無泡沫密閉層。d. 10.通過自動系統(tǒng)讀取該玻片。應(yīng)擦干凈該玻片的下表面！e.結(jié)果評估本發(fā)明的自動化評估系統(tǒng)除了關(guān)于主要熒光模式和推薦終點(diǎn)效價(jià)(抗體濃度)之 夕卜，還報(bào)告了每個(gè)施加部位的結(jié)果(陽性或者陰性)?？梢允褂肞C上存儲的圖像對照通過 該系統(tǒng)評估為陽性的樣品。當(dāng)1 80稀釋液中熒光強(qiáng)度小于軟件預(yù)定閾值時(shí) ，將樣品評估為ANA陰性。當(dāng) 1 80稀釋液中熒光強(qiáng)度大于軟件預(yù)定閾值時(shí)，將樣品評估為ANA陽性。本發(fā)明另一方面是對于ANA陽性結(jié)果，所述軟件將熒光模式分為如下幾類均質(zhì) 型、斑點(diǎn)狀型、核仁型、著絲粒型、核斑點(diǎn)型、有絲分裂型、胞質(zhì)型。根據(jù)HEp-2細(xì)胞的細(xì)胞核染色可以區(qū)分各種模式
e. 1.均質(zhì)型整個(gè)細(xì)胞核彌漫件染餼,有或無核隱藏。該模式在一些樣品中可以出現(xiàn)斑點(diǎn)狀型，尤其在接近終點(diǎn)處。有絲分裂中細(xì)胞染色體區(qū)域呈現(xiàn)強(qiáng)陽性熒光?？乖?DNA，組蛋白。臨床相關(guān)性特異于SLE的高效價(jià)，對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎較低的效價(jià)；組蛋白 抗體與藥物誘導(dǎo)的狼瘡極其相關(guān)。e. 2.周邊型細(xì)胞核外部區(qū)域均勻染色，內(nèi)部區(qū)域出現(xiàn)微弱熒光；不是施加部位 的所有細(xì)胞均需要示出這種外周染色，一些細(xì)胞可以呈現(xiàn)均質(zhì)型模式。有絲分裂中細(xì)胞染 色體區(qū)域示出強(qiáng)陽性熒光(然而在有絲分裂中陰性細(xì)胞染色體區(qū)域薄環(huán)形染色提示抗體 是針對核膜的)?？乖璂NA，組蛋白。臨床相關(guān)性在SLE活動期高效價(jià)，對于其它結(jié)締組 織病呈現(xiàn)較低效價(jià)。e. 3. A^iM:在整個(gè)細(xì)胞核出現(xiàn)熒光斑點(diǎn)，根據(jù)抗體類型可以是非常細(xì)至非常 粗的斑點(diǎn)。有絲分裂中細(xì)胞染色體區(qū)域通常陰性反應(yīng)。a)Sm和nRNP 粗斑點(diǎn)，細(xì)胞核除外，有絲分裂中細(xì)胞的染色體區(qū)域是陰性的。臨床 相關(guān)性Sm抗體是SLE的高特異性標(biāo)記；高抗-nRNP效價(jià)是MCTD的特征，在SLE、RA、PSS中 與其它ANA—起。b) SS-A和SS-B 適當(dāng)分布的小的均一斑點(diǎn)，有絲分裂中細(xì)胞染色體區(qū)域是陰性 的。臨床相關(guān)性在原發(fā)Sj6gren’s綜合征中非常常見，在SLE中不太常見；抗-SS-S在新生 兒狼瘡和先天性心臟傳導(dǎo)阻滯中非常常見。c)Scl-70 具有核熒光的細(xì)小密度斑點(diǎn)，有絲分裂中細(xì)胞染色體區(qū)域是陽性的。臨 床相關(guān)性抗-Scl-70是PSS的有效標(biāo)記。d)PCNA 在30-60%細(xì)胞中可變的細(xì)小和粗大斑點(diǎn)，有絲分裂中的細(xì)胞可以是陽 性或陰性的。臨床相關(guān)性在小部分SLE患者中出現(xiàn)抗-PCNA。e. 4.著絲粒型在整個(gè)細(xì)胞核中不連續(xù)的斑點(diǎn)，數(shù)目相應(yīng)于單一或多個(gè)染餼體 組。有絲分裂中細(xì)胞的熒光模式依據(jù)染色體分布在中期赤道面配對點(diǎn)，在后期運(yùn)動離開至 中心體。由NSP-I (SP100)抗體導(dǎo)致相似模式(多核斑點(diǎn))，但是在這種情況中有絲分裂中 的細(xì)胞染色體區(qū)域保持陰性?？乖旧w的著絲粒蛋白。臨床相關(guān)性CREST綜合征、罕 見的彌漫性硬皮病和Raynaud’ s現(xiàn)象的標(biāo)記。e. 5.核仁型與未染餼的核漿清晰界定的細(xì)胞核內(nèi)的核熒光。細(xì)胞核的熒光可以 是均質(zhì)或者斑點(diǎn)狀(成塊狀)。通常伴隨斑點(diǎn)狀模式?？乖璓MScl、RNA聚合酶I、原纖蛋 白。臨床相關(guān)性特異于PSS、多肌炎-皮肌炎重疊的高效價(jià)，對于SLE、Sj5gren’s綜合征、 Raynaud’ s現(xiàn)象的低效價(jià)。e. 6.紡錘體在經(jīng)歷有絲分裂時(shí)細(xì)胞中連接彼此中心體的細(xì)小線狀網(wǎng)?？乖?絲分裂中細(xì)胞的紡錘體。臨床相關(guān)性在許多資自身免疫疾病和其它疾病(RA、SLE、PBC、腕 管綜合征)中的罕見模式。e. 7.胞質(zhì)型細(xì)胞質(zhì)中斑點(diǎn)狀的或者線狀熒光a)核糖體RNP 在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)小斑點(diǎn)熒光，通常伴隨核仁型模式(建議在其 它組織切片上證實(shí))。臨床相關(guān)性一些SLE特有。b)Jo-l(PL-7，PL_12)—般具有微弱熒光的細(xì)小斑點(diǎn)，主要在核周區(qū)域中。臨床相 關(guān)性多肌炎、皮肌炎。c)線粒體線狀排列的小的均一斑點(diǎn)，在接近細(xì)胞核的區(qū)域更密集(建議在其它組織切片上證實(shí))。臨床相關(guān)性原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的標(biāo)記。d)細(xì)胞骨架由于抗肌動蛋白及細(xì)胞骨架其它成分(波形蛋白，微管蛋白)抗體 導(dǎo)致的細(xì)胞質(zhì)的線狀、蛛網(wǎng)狀熒光，建議在其它組織切片上證實(shí)。臨床相關(guān)性在自身免疫 性肝炎和傳染性疾病中常見一些抗肌動蛋白。
除了關(guān)于主要熒光模式和推薦終點(diǎn)效價(jià)(抗體濃度)之外，所述自動評估系統(tǒng)報(bào) 告每個(gè)施加部位的結(jié)果(陽性或陰性)。使用PC上保存的圖像可以對照通過該系統(tǒng)評估為 陽性的樣品。
權(quán)利要求
通過間接免疫熒光測定確定人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體的終點(diǎn)效價(jià)確定方法，所述方法包括如下步驟a.患者血清內(nèi)含有的自身抗體與固定于玻片上的HEp-2細(xì)胞、白細(xì)胞、綠蠅短膜蟲和組織切片的抗原反應(yīng)并結(jié)合，b.特異性熒光標(biāo)記結(jié)合的自身抗原，c.除了在評估系統(tǒng)中使用熒光強(qiáng)度光記錄和評估熒光光學(xué)成像之外，還對結(jié)合在所述玻片上的熒光標(biāo)記的自身抗體進(jìn)行熒光顯微鏡分析，其特征在于d.在進(jìn)行所述方法步驟之前，所述評估系統(tǒng)a)用具有限定效價(jià)的至少兩個(gè)對照血清校準(zhǔn)以產(chǎn)生系列稀釋液，b)測量所述系統(tǒng)的熒光激發(fā)光，e.相對于對照血清的效價(jià)設(shè)定記錄的熒光光學(xué)圖像的熒光強(qiáng)度，從而提供所研究的患者血清的終點(diǎn)效價(jià)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述特異性熒光標(biāo)記使用熒光標(biāo)記的抗人抗體進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中加入防脫色試劑以穩(wěn)定熒光信號。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述防脫色試劑是2，3，5，6-四甲基-1，4-苯二胺。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所研究的患者血清的終點(diǎn)效價(jià)得自最終曝光時(shí) 間、患者血清的初始效價(jià)以及相機(jī)的曝光時(shí)間，優(yōu)選根據(jù)確定的校準(zhǔn)函數(shù)確定，在最簡單的 線性情況中，其可以根據(jù)如下等式計(jì)算血清效價(jià)佼＝輸入效價(jià)/曝光時(shí)間*最終爆光時(shí)間
6.在通過間接免疫熒光測定優(yōu)選根據(jù)權(quán)利要求1-5的方法確定人血清中抗細(xì)胞核和 細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體中在自身抗體診斷中用于終點(diǎn)效價(jià)確定的設(shè)備，其包括a.用于通過具有相機(jī)的熒光顯微鏡捕獲圖像的系統(tǒng)，b.用于自動化圖像分析及確定患者血清的結(jié)合的自身抗體的捕獲的熒光模式以及熒 光強(qiáng)度的系統(tǒng)，所述自身抗體與固定于玻片上的HEp-2細(xì)胞、白細(xì)胞、綠蠅短膜蟲和組織切 片的抗原反應(yīng)并與其結(jié)合。
7.通過間接免疫熒光測定確定人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體的體外診斷試 劑盒，所述試劑盒包括至少a.具有用HEp-2細(xì)胞包被的用于施加對照血清和患者血清的多個(gè)施加部位的玻片，b.具有不同的預(yù)定效價(jià)以校準(zhǔn)免疫熒光顯微鏡測量和評估系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)的對照血清，c.特異性偶聯(lián)與HEp-2細(xì)胞結(jié)合的抗體的熒光標(biāo)記的抗人抗體。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述校準(zhǔn)玻片是所述試劑盒的組分，其在表面展示具有 限定效價(jià)的多個(gè)對照血清。
9.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述抗人抗體是抗人免疫球蛋白。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述抗人抗體與異硫氰酸熒光素偶聯(lián)。
11.可執(zhí)行的計(jì)算機(jī)程序，其存儲于含有作為計(jì)算機(jī)可讀數(shù)據(jù)的程序代碼的計(jì)算機(jī)可 讀介質(zhì)中，在計(jì)算機(jī)運(yùn)行期間指導(dǎo)該計(jì)算機(jī)以基于權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的通過間接免疫熒光測定確定人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體的終點(diǎn)效價(jià)確定方法確定終點(diǎn)效價(jià)。
12.計(jì)算機(jī)程序，優(yōu)選權(quán)利要求11的計(jì)算機(jī)程序，其中所述計(jì)算機(jī)程序適于自動化圖 像分析及確定患者血清的結(jié)合的自身抗體的捕獲的熒光模式和熒光強(qiáng)度，所述自身抗體與 固定于玻片上的HEp-2細(xì)胞、白細(xì)胞、綠蠅短膜蟲和組織切片的抗原反應(yīng)并與其結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過間接免疫熒光測定確定在人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原抗體的終點(diǎn)效價(jià)確定方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過間接免疫熒光測定確定人血清中抗細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原抗體的體外診斷試劑盒，以及在所述方法框架內(nèi)評估和確定終點(diǎn)效價(jià)的計(jì)算機(jī)程序。
文檔編號G01N33/564GK101874206SQ200880115751
公開日2010年10月27日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日
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