本公開整體上涉及制備用于灌流細(xì)胞培養(yǎng)過程的哺乳動物細(xì)胞的方法，所述方法改善細(xì)胞的生長和生產(chǎn)力。更具體地，本公開涉及改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中使哺乳動物細(xì)胞經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)灌流程序，其涉及用連續(xù)流動離心機(jī)產(chǎn)生固相和液相，以及利用該至少固相的一部分以維持、保持和/或啟動新的細(xì)胞培養(yǎng)物。本公開還涉及灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)及其部件。

背景技術(shù)：

1、盡管該領(lǐng)域在過去幾十年取得了重大進(jìn)展，但涉及哺乳動物細(xì)胞的工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)和其中產(chǎn)物生產(chǎn)的生物制造過程仍然充滿重大挑戰(zhàn)。例如，用于此類過程的典型生物反應(yīng)器系統(tǒng)必須保持無菌、封閉的環(huán)境，這使得新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基的添加和用過的細(xì)胞培養(yǎng)基的去除成為問題。因此，在分批或分批補(bǔ)料過程條件下生長的細(xì)胞，當(dāng)其細(xì)胞培養(yǎng)基耗盡重要組分時(shí)，通常會面臨養(yǎng)分限制。此外，細(xì)胞培養(yǎng)物中不需要的代謝副產(chǎn)物的積聚可能進(jìn)一步限制生長，并可能對所需的產(chǎn)物造成損害。因此，仍然強(qiáng)烈需要改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)及方法，其可通過解決這些及其他限制來增加生長和提高生產(chǎn)力。

2、與細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物相比，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物通常具有較低的生產(chǎn)速率并產(chǎn)生較低的生產(chǎn)產(chǎn)量。因此，大量研究集中于可以優(yōu)化多肽輸出的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)條件和方法，即支持高細(xì)胞密度和高蛋白滴度的條件和方法。例如，已經(jīng)確定，在不需要恒定速率補(bǔ)料葡萄糖的情況下，在分批補(bǔ)料過程中限制向哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)料葡萄糖可控制乳酸根產(chǎn)生(參見例如美國專利申請公開號us20050070013)。

3、兩種細(xì)胞培養(yǎng)過程主要用于大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)：分批補(bǔ)料過程和灌流過程。這些方法的主要目標(biāo)是在養(yǎng)分(例如葡萄糖)由細(xì)胞消耗時(shí)添加這些養(yǎng)分，并在產(chǎn)生代謝廢物(例如乳酸和氨)時(shí)除去這些代謝廢物。在分批補(bǔ)料過程中，細(xì)胞通常在培養(yǎng)開始時(shí)以及在培養(yǎng)開始后但在培養(yǎng)終止前的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)接受含有葡萄糖的接種培養(yǎng)基。雖然這種方法可以幫助將經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞的乳酸產(chǎn)量控制在相對較低的水平，但由于葡萄糖限制條件而無法達(dá)到最大細(xì)胞密度、生長速率和細(xì)胞活力水平。因此，細(xì)胞的數(shù)目和/或細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)物的數(shù)量沒有最大化。

4、在灌流過程中，細(xì)胞也接受接種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并且當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的細(xì)胞密度時(shí)，開始細(xì)胞灌流，使得用過的培養(yǎng)基被新鮮培養(yǎng)基替換。灌流過程允許培養(yǎng)物達(dá)到更高的細(xì)胞密度，并因此能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞和/或產(chǎn)物。然而，在更大、工業(yè)相關(guān)的生產(chǎn)規(guī)模下，灌流過程需要極大量的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。此外，當(dāng)除去用過的培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞所分泌到培養(yǎng)基中的任何產(chǎn)物都會丟失。這就需要單獨(dú)的收獲步驟來捕獲用過的培養(yǎng)基中的產(chǎn)物，否則若丟棄用過的培養(yǎng)基，則會導(dǎo)致整體效率損失。

5、因此，需要改進(jìn)的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法，其可使得細(xì)胞活力、細(xì)胞濃度和所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的數(shù)量最大化，以及使得用過的培養(yǎng)基中的產(chǎn)物損失最小化。本公開可解決這些及其他需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文提供了細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括使用連續(xù)流動離心機(jī)對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行灌流程序以產(chǎn)生固相和液相，以及將該至少固相的一部分和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基返回至培養(yǎng)器皿以維持、保持和/或啟動新的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施例中，這些方法可用于達(dá)到范圍為約0.5多至約6個(gè)或更多個(gè)器皿體積/天(vvd)的灌流速率。連續(xù)流動離心機(jī)用作細(xì)胞培養(yǎng)的一部分，即用作生產(chǎn)例如治療性多肽或蛋白質(zhì)(諸如抗體或融合蛋白)的“上游”過程的一部分，這與使用連續(xù)流動離心機(jī)作為澄清的一部分(作為細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的此類治療性多肽或蛋白質(zhì)的“下游”純化的一部分)相反。

2、在第一方面中，本文提出了一種在為蛋白質(zhì)純化做準(zhǔn)備而進(jìn)行澄清之前，例如，培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞已經(jīng)被工程化以產(chǎn)生蛋白質(zhì)，例如，治療性蛋白質(zhì)(諸如抗體)的哺乳動物細(xì)胞的方法；即，在預(yù)生產(chǎn)器皿，例如生物反應(yīng)器中。在具體實(shí)施例中，該方法包括將多個(gè)哺乳動物細(xì)胞和一定體積的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)器皿中以產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。在其他具體實(shí)施例中，該方法包括將細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)至大于1％紅血球壓積(pcv)的細(xì)胞密度。在具體實(shí)施例中，該方法包括對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行灌流程序。在更具體的實(shí)施例中，灌流程序包括將細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一部分轉(zhuǎn)移至連續(xù)流動離心機(jī)。在更具體的實(shí)施例中，灌流程序包括操作連續(xù)流動離心機(jī)以產(chǎn)生具有大于或等于1％?pcv的細(xì)胞密度的固相。在更具體的實(shí)施例中，灌流程序包括將固相和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基返回至培養(yǎng)器皿以達(dá)到范圍為0.5至6個(gè)器皿體積/天(vvd)的灌流速率。在具體實(shí)施例中，使用約0.7vvd的低灌流速率，和/或使用約4至約5vvd的高灌流速率。

3、在具體實(shí)施例中，在灌流程序完成后，細(xì)胞培養(yǎng)物可具有0.2％?pcv或更大，例如0.2％至約30％?pcv的細(xì)胞密度。

4、在某些實(shí)施例中，灌流程序包括以恒定方式增加或減少灌流速率。在某些實(shí)施例中，灌流程序包括以可變方式增加或減少灌流速率。

5、在某些實(shí)施例中，進(jìn)行灌流程序或包括此類灌流程序的細(xì)胞培養(yǎng)方法的時(shí)間周期介于0.5小時(shí)多至約5小時(shí)的范圍內(nèi)，諸如約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或4.5小時(shí)或更長時(shí)間。在某些實(shí)施例中，進(jìn)行灌流程序或包括此類灌流程序的細(xì)胞培養(yǎng)方法的時(shí)間周期介于約5小時(shí)多至約24小時(shí)的范圍內(nèi)，諸如約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時(shí)。在某些實(shí)施例中，進(jìn)行灌流程序或包括此類灌流程序的細(xì)胞培養(yǎng)方法的時(shí)間周期介于約1天多至約20天的范圍內(nèi)，諸如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19天。在其他實(shí)施例中，進(jìn)行灌流程序或包括灌流程序的細(xì)胞培養(yǎng)方法多至20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90天。此外，根據(jù)以上實(shí)施例的灌流程序可以以半連續(xù)、不連續(xù)或“間斷”方式進(jìn)行，其中灌流程序例如在數(shù)天的時(shí)間段內(nèi)每天一次進(jìn)行。

6、在某些實(shí)施例中，連續(xù)流動離心機(jī)包括碟式堆疊轉(zhuǎn)筒(disc?stack?bowl)。在某些實(shí)施例中，連續(xù)流動離心機(jī)包括管狀轉(zhuǎn)筒(tubular?bowl)。在某些實(shí)施例中，連續(xù)流動離心機(jī)可具有范圍為3,000至10,000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的操作速度。在某些實(shí)施例中，連續(xù)流動離心機(jī)包括可滅菌部件。在某些實(shí)施例中，連續(xù)流動離心機(jī)包括可棄式部件。在某些實(shí)施例中，連續(xù)流動離心機(jī)可具有范圍為1,000m2至200,000m2的σ值。在某些實(shí)施例中，在完成離心程序之后，細(xì)胞培養(yǎng)物可具有大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％)的活力百分比。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物在1至90天的時(shí)間段內(nèi)(例如持續(xù)、或多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90天)保持可大于或等于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％，例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的活力百分比。在某些實(shí)施例中，哺乳動物細(xì)胞包括重組哺乳動物細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，重組哺乳動物細(xì)胞包括重組中華倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物可具有小于或等于4g/l的乳酸根濃度。在某些實(shí)施例中，重組哺乳動物細(xì)胞可生產(chǎn)分泌產(chǎn)物。在某些實(shí)施例中，分泌產(chǎn)物包括重組蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，重組蛋白質(zhì)可為抗體。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)器皿可具有大于或等于80l的工作體積。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)器皿可具有范圍為100l至3,000l的總體積。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)器皿可具有100l的總體積。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)器皿可具有3,000l的總體積。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)器皿具有范圍為100l至30,000l的總體積。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)器皿具有范圍為5,000l至30,000l的總體積。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)器皿具有范圍為100l至6,000l的總體積。在一些實(shí)施例中，該方法可以包括將細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一部分轉(zhuǎn)移至不同的培養(yǎng)器皿以啟動第二細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些實(shí)施例中，第二細(xì)胞培養(yǎng)物具有范圍為大于或等于0.1％至10％?pcv的初始細(xì)胞密度。在一些實(shí)施例中，該方法可包括將細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一部分轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)培養(yǎng)器皿，以啟動具有范圍為大于或等于0.1％至10％?pcv的起始細(xì)胞密度的生產(chǎn)培養(yǎng)物。在一些實(shí)施例中，該方法可包括在分批或分批補(bǔ)料過程條件下培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)物。在一些實(shí)施例中，該方法可包括自連續(xù)流動離心機(jī)中分離液相并對其中的分泌產(chǎn)物進(jìn)行純化程序。在一些實(shí)施例中，該方法可以包括將新鮮培養(yǎng)液(例如，細(xì)胞培養(yǎng)基(cell?culture?medium)和/或細(xì)胞培養(yǎng)基(cell?culture?media))添加至培養(yǎng)器皿中。

7、在某些實(shí)施例中，本文提供的細(xì)胞培養(yǎng)方法包括產(chǎn)生具有大于或等于0.1％?pcv的細(xì)胞密度的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些實(shí)施例中，該方法包括將多個(gè)哺乳動物細(xì)胞和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基置于培養(yǎng)器皿中以產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些實(shí)施例中，該方法包括將細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)至大于或等于10％?pcv(例如約12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或約30％)的細(xì)胞密度。在某些實(shí)施例中，該方法包括對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行灌流程序。在某些實(shí)施例中，灌流程序包括將細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一部分轉(zhuǎn)移至連續(xù)流動離心機(jī)。在某些實(shí)施例中，灌流程序包括操作連續(xù)流動離心機(jī)以產(chǎn)生范圍為約1％至約10％、約20％、約30％、約40％或約50％pcv的細(xì)胞密度的固相。在具體實(shí)施例中，細(xì)胞密度的范圍為約20％至約40％。在更具體的實(shí)施例中，細(xì)胞密度的范圍為約30％至約35％。在某些實(shí)施例中，灌流程序包括將固相的一部分和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基返回至培養(yǎng)器皿以達(dá)到范圍為0.5至6vvd的灌流速率。在某些實(shí)施例中，在完成灌流程序之后，細(xì)胞培養(yǎng)物密度增加或已經(jīng)增加了大于0.1％pcv，例如大于或等于1％?pcv或大于或等于10％?pcv。在具體實(shí)施例中，固相細(xì)胞密度的范圍為約20％?pcv至約40％?pcv。

8、在某些實(shí)施例中，本文提供的細(xì)胞培養(yǎng)方法包括產(chǎn)生包括至少4.8x1012個(gè)細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。在具體實(shí)施例中，該方法包括將多個(gè)哺乳動物細(xì)胞和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基置于具有至少、不大于或約80l的工作體積的培養(yǎng)器皿中，以產(chǎn)生具有大于或等于1百萬個(gè)細(xì)胞/ml的起始細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)物。在具體實(shí)施例中，該方法包括將細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)至大于或等于1％?pcv，或大于或等于10％?pcv的細(xì)胞密度。在具體實(shí)施例中，該方法包括對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行灌流程序。在具體實(shí)施例中，灌流程序包括將細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一部分轉(zhuǎn)移至連續(xù)流動離心機(jī)，該連續(xù)流動離心機(jī)包括可棄式碟式堆疊轉(zhuǎn)筒且包括范圍為1,000至200,000m2的σ因子。在具體實(shí)施例中，該方法包括操作連續(xù)流動離心機(jī)以產(chǎn)生具有大于或等于1％pcv(例如約10％、約20％、約30％、約40％或約50％pcv)的細(xì)胞密度的固相。在具體實(shí)施例中，該方法包括將至少固相的一部分和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基返回至培養(yǎng)器皿以達(dá)到范圍為0.5至6vvd的灌流速率。在具體實(shí)施例中，在完成灌流程序之后，細(xì)胞培養(yǎng)物具有大于或等于6千萬個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。

9、在某些實(shí)施例中，本文提供了產(chǎn)生包括總計(jì)至少2.16x1014個(gè)細(xì)胞或約1.5-2.5x106個(gè)細(xì)胞/ml的哺乳動物細(xì)胞接種培養(yǎng)物的方法。在具體實(shí)施例中，該方法包括將多個(gè)哺乳動物細(xì)胞和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基置于具有多至、至少或約3,000l或3,600l的工作體積的培養(yǎng)器皿中，以產(chǎn)生具有大于或等于1百萬個(gè)細(xì)胞/ml(1x106個(gè)細(xì)胞/ml)的起始細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)物。在具體實(shí)施例中，該方法包括將細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)至大于或等于10％pcv的細(xì)胞密度。在具體實(shí)施例中，該方法包括對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行灌流程序。在具體實(shí)施例中，灌流程序包括將細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一部分轉(zhuǎn)移至連續(xù)流動離心機(jī)，該連續(xù)流動離心機(jī)包括可棄式碟式堆疊轉(zhuǎn)筒且進(jìn)一步包括范圍為1,000至200,000m2的σ因子。在本文提供的方法的具體實(shí)施例中，灌流程序包括操作連續(xù)流動離心機(jī)以產(chǎn)生具有大于或等于1％pcv(例如多至約10％、約20％、約30％、約40％或約50％pcv)的細(xì)胞密度的固相。在某些實(shí)施例中，灌流程序包括將至少固相的一部分和一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)基返回至培養(yǎng)器皿以達(dá)到范圍為0.5至6vvd的灌流速率。在某些實(shí)施例中，在完成灌流程序之后，細(xì)胞培養(yǎng)物具有大于或等于60x106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。

10、在某些實(shí)施例中，通過本文所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物為預(yù)生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)中的種子培養(yǎng)的一部分。例如，通過本文所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物可用于接種另一個(gè)更大的生物反應(yīng)器，其構(gòu)成預(yù)生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物的進(jìn)一步步驟。在具體實(shí)施例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞使用離心機(jī)，例如，連續(xù)流動離心機(jī)濃縮，并且所得濃縮細(xì)胞(即，固相或重相)用于啟動另一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)器皿，例如，生物反應(yīng)器。在某些實(shí)施例中，生物反應(yīng)器為預(yù)生產(chǎn)生物反應(yīng)器。在某些其他實(shí)施例中，生物反應(yīng)器為生產(chǎn)生物反應(yīng)器。在具體實(shí)施例中，固相或重相用于在2、3或更多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)器皿(例如，生物反應(yīng)器)中啟動多于一種，例如2、3或更多種其他細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些具體實(shí)施例中，重相或固相用于啟動2或3種生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物。

11、這些和進(jìn)一步的方面將在本公開的其余部分(包括實(shí)例)中進(jìn)一步解釋。