昂貴的。這種方法還受到5304638中討論的 結(jié)構(gòu)性缺點(diǎn)的損害。
[0017] 所有這三項(xiàng)專利，6090288、5304638和5547576都沒有認(rèn)識(shí)到控制聚胺涂層的厚度 或聚合物在那種涂層中的交聯(lián)度的重要性。所有它們都依賴于含胺的化合物與共價(jià)固定在 表面上的反應(yīng)性基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)，通過接枝或直接反應(yīng)。在任何這些過程的最后，實(shí)質(zhì)上受 到單層型含胺涂層的限制。這些膜的高吸附性容量?jī)H僅可以通過增加表面積獲得，正如用 瓊脂糖層析小球的情況。本發(fā)明教導(dǎo)了通過在膜表面建立相對(duì)厚的松散交聯(lián)的聚合性層而 獲得高吸附性容量，一種從根本上與所有那些現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的不同的方法。
[0018] 因此，期望提供介質(zhì)和包括這種介質(zhì)的流通陰離子交換器，它提供與病毒的強(qiáng)力 結(jié)合并且不會(huì)受到現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的損害。當(dāng)將其放置在親合層析柱的下游，任選在一個(gè)或 多個(gè)用陽離子交換柱進(jìn)行的跑過步驟之后時(shí)，這種交換器特別用于使用層析系統(tǒng)純化來自 細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的單克隆抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供了介質(zhì)和裝置，例如包括該介質(zhì)的 陰離子交換器，其中介質(zhì)為具有表面涂布有聚合物，例如聚烯丙胺(polyallylamine)，的 膜。得到的膜出人意料的提供了比常規(guī)的基于季銨鹽、包括三甲基銨配體更強(qiáng)的結(jié)合蛋白 質(zhì)雜質(zhì)的能力以及更突出的從生物樣品中去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的能力。
[0020] 本發(fā)明描述了一種顯著提高微孔膜的吸附容量的方法。代替在類似單層方式中改 性膜的表面，用松散交聯(lián)的水凝膠涂布整個(gè)外部和內(nèi)部孔隙表面，這種水凝膠的濕(溶脹） 厚度為大約50-100nm，這足以容納好幾層蛋白質(zhì)分子。因此，微孔膜的吸附容量從大約 20mg/ml增加到80-100mg/ml。推動(dòng)吸附的相互作用的類型通過使用給定的膜吸附器產(chǎn)品的 特定應(yīng)用來定義的?，F(xiàn)在存在從單克隆抗體(MABs)的溶液中除去病毒、核酸、內(nèi)毒素和宿主 細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCPs)的高容量、高親合力吸附器的需要。許多化學(xué)成分在水溶液中帶有正電 荷，包括伯、仲和叔胺，以及季銨鹽。胺在pH值低于11時(shí)是正電性的，而銨鹽在所有pH值下都 帶有正電荷，因此這些基團(tuán)分別稱為弱或強(qiáng)陰離子交換器。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)聚合性伯胺，優(yōu)選具 有共價(jià)連接在聚合物主鏈上的伯胺的脂肪族聚合物，更優(yōu)選其具有通過至少一個(gè)脂肪族基 團(tuán)、優(yōu)選為亞甲基基團(tuán)共價(jià)連接在聚合物的主鏈上，與電負(fù)性雜質(zhì)強(qiáng)力地結(jié)合，并且因此是 優(yōu)選地用于在膜吸附器的表面形成吸附性水凝膠的材料種類。
[0021] 本發(fā)明還描述了一種層析系統(tǒng)和用于純化單克隆抗體的方法，其中陰離子交換吸 附器放置在親合柱(例如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親合柱)和任選一種或幾種拋光裝置例如陽離 子交換柱或恰好是陽離子交換柱的下游?？紤]到所述陰離子交換吸附器中介質(zhì)的特性，極 少稀釋或不稀釋陽離子交換池(或不使用陽離子交換器的親合柱交換池)對(duì)于降低樣品的 傳導(dǎo)率是必要的，這是因?yàn)楸景l(fā)明的吸附器介質(zhì)可以在較高的離子強(qiáng)度下運(yùn)行。吸附器與 生物樣品中的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和其它電負(fù)性的雜質(zhì)甚至在傳導(dǎo)率接近15mS/cm以及相對(duì)高 pH值下也具有良好的強(qiáng)結(jié)合功能。
[0022] 正如前面所討論的，因?yàn)榕c小球基吸附器的擴(kuò)散流動(dòng)相比的膜吸附器的對(duì)流，本 發(fā)明獲得了相對(duì)高的裝置滲透性而沒有損失結(jié)合容量。
【附圖說明】
[0023]圖1A為1mm的用PAH與0.5%的PEG-DGE交聯(lián)制備的膜吸附器柱的水通量和BSA容量 的曲線圖；
[0024]圖1B為1mm的用9wt%的PAH與PEG-DGE交聯(lián)制備的膜吸附器柱的水通量和BSA容量 的曲線圖；
[0025] 圖2為加速板壽命測(cè)試中不含堿形式和氨基磺酸離子形式的膜吸附器的BSA容量 的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明涉及一種具有多孔性、在多孔上形成的聚合性涂層以及自我支撐基質(zhì)的多 孔性層析或吸附介質(zhì)，一種包括這種介質(zhì)的陰離子交換器，包括這種吸附器的純化系統(tǒng)以 及純化方法。這種介質(zhì)特別適合用于以整體良好的存在于下游純化過程中的方式從人造生 物治療劑例如單克隆抗體中強(qiáng)有力地除去低水平的雜質(zhì)。典型的雜質(zhì)包括DNA、內(nèi)毒素、HCP 和病毒。這種介質(zhì)在高鹽濃度和高傳導(dǎo)率(高親合性)下有良好的作用，甚至在這種條件下 也能有效地除去病毒。其獲得了高結(jié)合容量而不損害裝置的滲透性。實(shí)際上，取決于通過這 里描述的方法制備的涂層的性質(zhì)，獲得了大于5mg/ml，或者大于25mg/ml，或者大于大約35-40mg/ml的核酸的結(jié)合容量。由于承載于吸附器介質(zhì)上的高稀釋樣品不再是必要的，陰離子 交換吸附器的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于相對(duì)比的小球基方法的量。
[0027] 多孔性基質(zhì)具有與基質(zhì)的幾何或物理結(jié)構(gòu)相關(guān)的兩個(gè)表面。片層具有頂部和底部 表面，或者是第一和第二表面。這些通常稱為"側(cè)"。在使用中，流體將會(huì)從一側(cè)(表面)流動(dòng) 通過另一側(cè)(表面）。對(duì)于中空纖維和管狀膜，其具有內(nèi)側(cè)和外側(cè)表面。流動(dòng)從內(nèi)側(cè)到外側(cè)進(jìn) 行，或者反之亦然，這取決于設(shè)計(jì)和用途。
[0028] 兩個(gè)表面之間的厚度層(thickness)的維度是多孔的。這種多孔性區(qū)域具有與孔 隙相關(guān)的表面積。為了防止與"表面""表面"或"表面積"或類似的用語混淆，在本發(fā)明中幾 何表面指的是如外部或正表面或側(cè)面。與孔隙相關(guān)的表面積指的是內(nèi)部或多孔表面積。
[0029] 多孔性材料含有孔，其為空洞的空間，以及制成材料的物理裝置的固體基體或骨 架。例如，在無紡網(wǎng)中，任意取向的纖維制成基體并且賦予網(wǎng)以其自身的形式。在聚合物微 孔膜中，相分離聚合物提供了基體。在這里，發(fā)明人討論了涂刷或覆蓋介質(zhì)的表面。通過這 一方法，發(fā)明人意在涂刷內(nèi)表面和外表面，以致于不會(huì)完全堵塞孔隙，即保留了大部分用于 對(duì)流的結(jié)構(gòu)，特別的，對(duì)于內(nèi)表面積，涂刷或覆蓋意味著涂刷或覆蓋基體，而留下大部分的 孔隙敞開著。
[0030] 吸附作用指的是通過滲透到吸附材料的體內(nèi)吸收物質(zhì)。吸附作用指的是分子從體 相運(yùn)動(dòng)到吸附介質(zhì)的表面上。吸附作用是包括吸附和吸收的總稱。同樣的，這里的吸附材料 或吸附裝置表示吸附器，指的是吸附或吸收、或者吸附和吸收的材料或裝置。
[0031] 多孔性基質(zhì)充當(dāng)著用于吸附性水凝膠的支撐骨架。這種基質(zhì)應(yīng)當(dāng)服從于處理和制 造成強(qiáng)有力的和完整的裝置。孔隙結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)提供均勻的流動(dòng)分布、高通量和高表面積?；|(zhì) 可以是纖維、片層例如紡織織物、無紡織物、紙、氈或膜。優(yōu)選地，基質(zhì)為由織物或無紡織物 或膜形成的片層。
[0032] 纖維可以是任何長(zhǎng)度、直徑并且可以是中空的或固態(tài)的。作為基質(zhì)它們并不結(jié)合 在一起(雖然在應(yīng)用涂刷后它們可以形成單一的結(jié)構(gòu)），而是單獨(dú)離散的實(shí)體。它們可以是 連續(xù)長(zhǎng)度的形式例如不確定長(zhǎng)度的線或單絲，或者通過切細(xì)纖維狀材料例如無紡織物或紡 織織物而制備形成較短的單獨(dú)纖維，將連續(xù)長(zhǎng)度的纖維切斷成單獨(dú)的段，通過結(jié)晶生長(zhǎng)方 法或類似的方法形成。
[0033] 無紡織物是直接由分離的纖維通過使纖維或細(xì)絲采用熱或化學(xué)纏繞結(jié)合在一起 制成的平整的、多孔性片層。典型的，無紡織物制造者提供具有1到500微米平均流動(dòng)孔隙 (MFP)等級(jí)的介質(zhì)。對(duì)于無紡織物，多孔性結(jié)構(gòu)是纏繞的纖維，且多孔性指的是纖維之間或 之中曲折的空間。優(yōu)選的無紡織物為L(zhǎng)owell，Mass ·的Freudenberg Nonwovens NA，其型號(hào) 為F02463。
[0034] 紡織織物通過經(jīng)線纖維和煒線纖維以規(guī)則的方式或編織樣式在一些相互之間預(yù) 先確定的角度編織制成。典型的煒線與經(jīng)線之間的角度為大約90度。其它通常使用的角度 包括但不限于30、45、60和75度?？椢锏耐暾酝ㄟ^由紡織過程導(dǎo)致的纖維機(jī)械互鎖來保 持?？椢?織物符合復(fù)雜表面的能力）、織物的表面光潔度和穩(wěn)定性主要通過編織樣式控制， 例如平紋、斜紋、鍛紋、籃形織物、紗羅織物等。在這種情況中，基質(zhì)的孔隙度為織物之間的 空間且其很少有曲折的性質(zhì)。
[0035] 基質(zhì)還可以有多種材料形成，包括玻璃、塑料、陶瓷和金屬。
[0036] 硼硅酸鹽玻璃是合適的玻璃的一個(gè)實(shí)例。它可以形成纖維或玻璃紙。
[0037] 也可以使用基于更常規(guī)的硅酸鹽化學(xué)或特別的化學(xué)例如釔、鋯、鈦以及類似物和 它們的共混物的多種陶瓷。它們可以形成纖維、紙、氈、單塊或膜。
[0038] 金屬例如不銹鋼、鎳、銅、鐵或其它磁性金屬和合金，鈀、鎢、鉬以及類似物可能制 備成多種形式，包括纖維、燒結(jié)片和結(jié)構(gòu)，例如燒結(jié)的不銹鋼或鎳過濾器、織物篩和無紡紙、 織物和氈，例如不銹鋼棉。
[0039]優(yōu)選的基質(zhì)由合成的或天然的聚合材料制成。熱塑性塑料是用于這個(gè)用途的聚合 物種類。熱塑性塑料包括但不限于聚烯烴，例如聚乙烯、包括超高分子量聚乙烯，聚丙烯，包 層聚乙烯/聚丙烯纖維，PVDF，聚砜，聚醚砜，聚芳基砜，聚苯基砜，聚氯乙烯，聚酯例如聚對(duì) 苯二甲酸乙二醇酯、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯以及類似物，聚酰胺，丙烯酸酯例如聚甲基丙烯 酸酯，苯乙烯類聚合物和上述物質(zhì)的混合物。其它合成材料包括纖維素、環(huán)氧化物、氨基甲 酸酯和類似物。
[0040] 合適的基質(zhì)包括微孔濾膜，即那些具有大約0.1到大約ΙΟμπι孔隙尺寸的濾膜?；|(zhì) 材料可以是親水性的或疏水性的。親水基質(zhì)材料的實(shí)例包括但不限于多糖和聚酰胺，以及 表面處理的親水多孔性膜，例如Durapore? (Millipore Corporation,Billerica ΜΑ)。疏 水材料的實(shí)例包括但不限于聚烯烴，聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，聚砜，聚碳酸酯，聚酯，聚 丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯。通過那些任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法由基質(zhì)材料形成多 孔性結(jié)構(gòu)，例如溶液相轉(zhuǎn)變，溫度誘導(dǎo)相分離，空氣流延，