一種以黃芪甲苷為配基的免疫親和層析柱及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種W黃巧甲巧為配基的免疫親和層析柱及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃巧為常用中藥，具有補(bǔ)氣固表、斂瘡生肌、利尿托毒等功能?，F(xiàn)代藥理研究表明， 黃巧具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、降血糖、強(qiáng)屯、、利尿、降壓、抗衰老及抗疲勞等多種藥理學(xué)活性。黃 巧中的主要有效成分為黃巧多糖（astragaluspolysaccharides)、黃巧皂巧（astragalus saponins)和黃巧異黃酬（isoflavones)，目前主要采用黃巧皂巧中的黃巧甲巧 (As化agalosidelV)作為評價(jià)黃巧藥材質(zhì)量優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前黃巧甲巧定量分析的方法主 要有：高效液相色譜法化PLC)、薄層掃描法(TLCS)及巧光法等，雖然運(yùn)些方法特異性強(qiáng)、靈 敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也不適用于大批量樣品的篩選檢測。建 立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測黃巧甲巧的免疫學(xué)分析方法可W克服上述方法的不 足，與其形成優(yōu)勢互補(bǔ)，而建立一種重復(fù)性好，靈敏度高，分析結(jié)果準(zhǔn)確的免疫分析方法最 重要的是獲得特異性好效價(jià)高的抗體。免疫化學(xué)分析鑒于在抗原抗體的定性定量方面獨(dú)特 的優(yōu)勢和操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不 足，在黃巧甲巧的檢測中起著越來越重要的作用，而抗血清或腹水的成分非常復(fù)雜，一些雜 蛋白可能會(huì)影響抗體與抗原的反應(yīng)，因此黃巧甲巧抗體的純化就顯得尤為重要。利用親和 層析柱進(jìn)行祀蛋白的篩選具有效率高，成本低、祀向性好的優(yōu)點(diǎn)。目前抗體純化方法主要是 鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、各種原理的層析法W及親和純化法（通常是ProteinA或 ProteinG)等，運(yùn)些都不能得到很純的特異性抗體，即使是親和純化法，也只能得到特異性 抗體和非特異性抗體的混合物，而不能將兩者分離而得到特異性的抗體，從而影響評價(jià)黃 巧藥材質(zhì)量優(yōu)劣的準(zhǔn)確性和效率，因此研究一種能夠有效分離純化特異性抗體的純化方 法，具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。是W此為基礎(chǔ)建立一種能夠快速評價(jià)黃巧藥材質(zhì)量 優(yōu)劣的方法，而建立此種方法的前提就是獲得效價(jià)較高、特異性好的黃巧甲巧單克隆抗體， 我們的方法就是通過純化得到效價(jià)高特異性好的黃巧甲巧單克隆抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提高黃巧甲巧單克隆抗體的純化效率，提供"一種W黃巧甲巧 為配基的免疫親和層析柱及其應(yīng)用"的發(fā)明。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是，1、采用高艦酸鋼將黃巧 甲巧鄰徑基氧化成醒基，可W使黃巧甲巧半抗原與固相載體充分交聯(lián);2、利用抗原與抗體 的特異性親和，有效的去除了非特異性抗體及其他雜蛋白，提高黃巧甲巧單克隆抗體的純 化效率，純度可達(dá)99%W上，且操作簡單、成本低、污染少。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，主要的技術(shù)方案是，一 種W黃巧甲巧為配基的免疫親和層析柱的制備方法，W黃巧甲巧為配基，具體步驟為:制備 黃巧甲巧半抗原，由黃巧甲巧半抗原與固相載體交聯(lián)制備免疫親和吸附劑，將免疫親和吸 附劑為填料裝入層析柱，用醋酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液交替洗涂填料S次得免疫親和層 析柱。
[000引進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述黃巧甲巧半抗原的制備方法，具體步驟為： (1) 將黃巧甲巧溶于80%甲醇中配成濃度為Img/mL的黃巧甲巧溶液，即第一溶液； (2) 將NaI化溶于蒸饋水中，即第二溶液； (3) 用注射器將第一溶液緩緩滴加至第二溶液中，室溫?cái)埌璺磻?yīng)4小時(shí)，即第一反應(yīng)液； (4) 慢慢往第一反應(yīng)液中滴加乙二醇并室溫反應(yīng)2小時(shí)； 巧)終止反應(yīng)，采用透析袋除去過量NaI化，得到黃巧甲巧半抗原。
[0006]進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述免疫親和吸附劑的制備方法，具體步驟為： (1) 將黃巧甲巧半抗原與固相載體置于0.1MP冊.0的碳酸氨鋼溶液中，在20-25°C條 件下反應(yīng)4小時(shí)，即第二反應(yīng)液； 其中：黃巧甲巧半抗原/固相載體/ 0.1MPH8.0的碳酸氨鋼溶液配比為：10mg:2g; 20ni; (2) 將第二反應(yīng)液用IMpH8.0的乙醇胺水溶液在20-25°C條件下封閉2小時(shí)； (3) 封閉交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束，用IOmL0.IMpH8.0的碳酸氨鋼溶液洗涂交聯(lián)物去除未結(jié)合 的黃巧甲巧半抗原，得免疫親和吸附劑(即填料）。
[0007]進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述固相載體為瓊脂糖凝膠、纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙締 酷胺凝膠、多孔玻璃或聚丙締酷胺-瓊脂糖凝膠中的一種，具體為經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的瓊 脂糖凝膠6B。
[0008]進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述免疫親和層析柱的制備方法，具體步驟為： (1)將填料裝入層析柱，用0.IMPH4.0醋酸緩沖液和0.IMP冊.OhiS-HCl緩沖液交替 洗涂填料=次，得到免疫親和層析柱； 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用免疫親和層析柱純化黃巧甲巧單克隆抗體的方法，具體步驟 為： (1) 將待純化樣品加入到所述免疫親和層析柱； (2) 用洗涂液洗涂至紫外分光光度計(jì)測定0D28G值至0.01W下； (3) 洗脫液洗脫； (4) 中和液中和； 所述洗脫液與中和液的體積比為300:36。
[0009] 其中，所述洗涂液為0.IMPH4.0的含0.5M化Cl的醋酸緩沖液，該醋酸緩沖液制備 方法為:取醋酸鋼8.2g，醋酸1.04mL,NaCl29.22g，加水配成1000 mL溶液。
[0010] 所述洗脫液為0.1MP冊.0的含0.5M化Cl的化is-HCl緩沖液，該化is-HCl緩沖 液制備方法為:取化iS12.114g，NaCl29.22g，加水配成1OOOmL溶液。
[0011] 所述中和液為IMpHS.STriS-HCl緩沖液，該緩沖液由如下制備步驟得到：稱取 121.HgTris,加蒸饋水SOOmL,用0.IM肥1調(diào)抑至8.8,加蒸饋水至lOOOmL。
[0012] 采用本發(fā)明所設(shè)計(jì)制備的W黃巧甲巧為配基的免疫親和層析柱純化黃巧甲巧單 克隆抗體的方法，與現(xiàn)有鹽析、傳統(tǒng)層析等抗體的純化技術(shù)相比較，具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、因免疫親和吸附劑是由黃巧甲巧半抗原與固相載體交聯(lián)制備而成，又因黃巧甲巧半 抗原的制備步驟中，將黃巧甲巧溶于80%甲醇中配成濃度為Img/mL的黃巧甲巧溶液，即第一 溶液;將NaI〇4溶于蒸饋水中，即第二溶液;用注射器將第一溶液緩緩滴加至第二溶液中，室 溫?cái)埌璺磻?yīng)4小時(shí)，采用化I〇4將黃巧甲巧鄰徑基氧化成醒基，可W使黃巧甲巧半抗原與固 相載體充分交聯(lián)。
[0013] 2、應(yīng)用免疫親和層析柱純化黃巧甲巧單克隆抗體的方法中，利用抗原與抗體的特 異性親和，有效的去除了非特異性抗體及其他雜蛋白，提高黃巧甲巧單克隆抗體的純化效 率，純度可達(dá)99%W上，且操作簡單、成本低、污染少。
[0014] 3、本發(fā)明免疫親和層析柱純化黃巧甲巧單克隆抗體，純化效率高，純度可達(dá)99%W 上。
【附圖說明】
[001引圖1為黃巧甲巧單克隆抗體洗脫曲線。
[0016]通過本發(fā)明所制備的免疫親和吸附劑對黃巧甲巧單克隆抗體進(jìn)行了純化，由圖1 所示:洗脫曲線對稱性良好，洗脫時(shí)間分布合理，證明所建立的洗脫條件較為合適。
[0017] 圖2為黃巧甲巧單克隆抗體純化前后抗體效價(jià)測定結(jié)果。
[001 引 由圖2所示:純化后抗體的效價(jià)明顯高于純化前抗體的效價(jià)。
[0019]圖3為黃巧甲巧單克隆抗體純化前后抗體特異性測定結(jié)果。
[0020] 采用間接競爭化ISA法測定了純化前和純化后所得黃巧甲巧單克隆抗體的特異 性。由圖3所示:純化后的黃巧甲巧單克隆抗體的特異性明顯高于純化前的黃巧甲巧單克隆 抗體的特異性。
[0021] 圖4為黃巧甲巧單克隆抗體純化前后SDS-PAGE檢測結(jié)果。
[0022] Lanel是未純化的單克隆抗體進(jìn)行的凝膠電泳分析，lane2是純化后的單克隆抗體 的凝膠電泳分析。由圖4所示:純化后的單克隆抗體純度較高，達(dá)99%W上。
[0023] 圖5為偶聯(lián)前環(huán)氧氯丙烷活化S邱harose她的紅外掃描圖 圖6為偶聯(lián)后環(huán)氧氯丙烷活化S邱haroseSB的紅外掃描圖。
[0024]由圖5、圖6通過紅外掃描圖譜可知在偶聯(lián)前位于1295cnfi處的吸收峰在偶聯(lián)之后 消失了，而峰對應(yīng)的官能團(tuán)為酸基團(tuán)，說明在偶聯(lián)之后酸鍵斷裂與黃巧甲巧分子進(jìn)行了偶 聯(lián)。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面通過非限制性實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，理解本發(fā)明。
[0026]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027]黃巧甲巧:成都曼思特生物科技有限公司，貨號(hào)84687-43-4。
[0028]氯化鋼：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)10019318。
[0029]甲醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)32060。
[0030] 碳酸氨鋼：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)10019261。
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