進(jìn)一步體現(xiàn)該三價病毒抗體在活體應(yīng)用方面的安全性，本實施例其他部分與上述實施例相同，這里不再贅述。
[0039]實施例6:
本實施例在上述實施例的基礎(chǔ)上，為驗證所述的三價病毒抗體的在活體生物不同部位的停留時間長，對獲取的抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體進(jìn)行了藥物停留時間小動物成像實驗。
[0040]具體試驗過程如下:
調(diào)制pH至8.5-10.0，將少量熒光染料加入到抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體原液中，溫度為4°C，垂直混合過夜。然后超濾離心來去除未反應(yīng)的熒光分子，獲得含有熒光分子的抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體原液。
[0041]試驗方法:將含有熒光分子抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體原液制成口腔噴霧。分成三組實驗組:a組:噴霧后禁水8小時，不禁食；b組:噴霧后禁食8小時，不禁水；c組:噴霧后禁水禁食8小時；皮膚噴涂:背部剔除部分皮毛后進(jìn)行噴霧。
[0042]通過小動物成像采集噴霧部位熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度減弱情況，判斷抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體原液在噴霧部位的停留時間，口腔噴霧后，不同組別的抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體原液的熒光隨時間減弱，口腔噴霧后，不同試驗組別在口腔的停留時間均能達(dá)到8.5小時，其中禁食禁水實驗組效果比較好。含有熒光分子的抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體原液在皮膚處停留時間可長達(dá)70多小時。
[0043]本實施例的實驗是為了驗證該三價病毒抗體噴涂在活體動物表面或者口腔內(nèi)，停留的時間均能達(dá)到8小時以上，具有較長的保護(hù)周期，在實際使用過程中，可以準(zhǔn)確的預(yù)測該三價病毒抗體的噴涂時間。本實施例其他部分與上述實施例相同，這里不再贅述。
[0044]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項】
1.一種三價病毒抗體，其特征在于:所述三價病毒抗體為三價抗手足口病病毒的雞卵黃抗體，所述手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)分別制備病毒EV7l、CoxA10、CoxA16的免疫抗原； (2)將步驟(I)中獲得的三種免疫抗原分別注入到不同的母雞體內(nèi)； (3)收集免疫母雞下的免疫雞蛋，并對免疫雞蛋的蛋黃進(jìn)行提取、純化，從而分別獲得三種單型抗體原液； (4)將獲得三種單型抗體原液按照抗體效價檢測配加穩(wěn)定劑，從而獲得抗三價手足口病病毒的雞卵黃抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中，制備相應(yīng)病毒的免疫抗原具體過程為:分別將EV71、CoxAlO及CoxA16手足口病毒株接種于Vero細(xì)胞中，并將接種有病毒株的Vero細(xì)胞置于33~36°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5~7天，待細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲病毒液，根根據(jù)收貨的病毒液確定CCID5tl具體數(shù)值，使用0.2-0.4%甲醛進(jìn)行滅活，經(jīng)離心、純化后置于2~8°C的溫度環(huán)境中備用；根據(jù)CCID5tl結(jié)果，將EV71、CoxAlO及CoxA16分別用緩沖液稀釋，分別與等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑配制成乳化免疫抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中將三種免疫抗原分別注入到不同的母雞體內(nèi)的具體過程為:取健康適齡的產(chǎn)蛋母雞，在產(chǎn)蛋母雞的翅基部三角肌或胸肌等位置用乳化好的免疫抗原進(jìn)行肌肉、皮下多點注射，以使產(chǎn)蛋母雞產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)；其中首次免疫采用弗氏完全佐劑，其余采用弗氏不完全佐劑；首次免疫28天后免疫第2次，以后每間隔28天免疫一次，每次免疫劑量為0.5~lml/只。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中，分離、提純的具體步驟如下: (3.1)將免疫后收集的雞蛋清洗干凈、破殼，分離蛋清蛋黃，去除蛋清，收集蛋黃稱取重量; (3.2)將蛋黃按1:6~9比例加入純化水稀釋勻漿，用lmol/L鹽酸溶液調(diào)pH4.8-5.5，并在2~8°C的溫度條件下靜置1~24小時； (3.3)靜置后的液體進(jìn)行離心，從而去除沉淀物、取上層清液； (3.4)將獲取的上層清液中加入10%~35%硫酸銨鹽析，使其充分混勻，之后過夜沉淀； (3.5)沉淀完成后，進(jìn)行離心脫鹽，取得沉淀制得卵黃抗體粗提物，去除硫酸銨上層清液； (3.6)獲取的卵黃抗體粗提物用1/150~1/300體積弱酸性緩沖液復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH為4.8-5.5，令其充分溶解，并在2~8°C的溫度環(huán)境過夜，之后獲取上層清液； (3.7)將獲取的上層清液用超濾膜進(jìn)行超濾； (3.8)將超濾后的溶液進(jìn)行病毒滅活； (3.9)進(jìn)行滅活后的溶液，取其上層清液，剩余的懸濁液進(jìn)行離心分離，除去沉淀，獲得的上層清液進(jìn)行合并，獲得單型抗體原液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述病毒抗體的分離、提純步驟中，進(jìn)行離心的離心參數(shù)為4000~20000r/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(3.7)中超濾使用的超濾膜的截留相對分子量為50~100kD。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(3.8)中超濾后溶液的病毒滅活方法為:將需要病毒滅活的溶液放置在溫度為54~60°C的環(huán)境中，保持8~20小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中，對獲得三種單型抗體進(jìn)行效價檢測的方法為細(xì)胞法或ELISA法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的三價病毒抗體的制備方法，其特征在于:所述細(xì)胞法檢測三種單型抗體的效價方法為:消化并分散RD細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度2 X 105/ml左右，待檢樣品從1:8開始進(jìn)行倍比稀釋至1:64 4fEV71、CoxA16、CoxA10型病毒分別稀釋為10TCID5q備用，取稀釋的病毒液，按照體積比1:1，分別與稀釋的待檢樣品混勻，接種于96孔板中，置36°C中和2小時；加入濃度為2 X 15個/ ml的RD細(xì)胞懸液0.1ml，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中36 °C孵育5-7天，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變；待檢樣品出現(xiàn)100%CPE判為陰性，50%以上細(xì)胞出現(xiàn)保護(hù)者為陽性；能抑制50%細(xì)胞病變或能保護(hù)50%細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度即為該待檢樣品的中和抗體效價。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三價病毒抗體及其制備方法，所述三價病毒抗體為三價抗手足口病病毒的雞卵黃抗體，所述三價手足口病病毒包括EV71、CoxA10、CoxA16。其制備方法包括以下步驟：（1）分別制備病毒免疫抗原；（2）將三種免疫抗原分別注入到不同的母雞體內(nèi)；（3）收集免疫母雞下的免疫雞蛋，并對免疫雞蛋的蛋黃進(jìn)行提取、純化，分別獲得三種單型抗體原液；（4）將獲得三種單型抗體原液按照抗體效價檢測配加穩(wěn)定劑，獲得雞卵黃抗體。本發(fā)明中的三價病毒抗體可中和三型病毒抗原，保護(hù)范圍覆蓋更廣；配置的三型抗體原液中的單型抗體可獨立發(fā)揮抑殺抗原的作用；生物活性穩(wěn)定，可長時間保存，效價高；該三價病毒抗體安全性好。
【IPC分類】C07K16-02, C07K16-10
【公開號】CN104817640
【申請?zhí)枴緾N201510269185
【發(fā)明人】林小軍, 葉琳, 朱玲, 李燕, 何麗珊, 萬強(qiáng), 何珊, 葉向陽, 蔡仲 , 林燁暄
【申請人】成都安蒂康生物科技有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月25日