專利名稱：自尋址、自組裝微電子集成系統(tǒng)、組成裝置、機理和分子生物學(xué)分析和診斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在顯微尺寸可以有效進行和控制多步和多路反應(yīng)的自尋址、自組裝微電子集成系統(tǒng)的設(shè)計、制造和應(yīng)用。具體說來，這些反應(yīng)包括分子生物學(xué)反應(yīng)，例如核酸雜交、核酸擴增、樣品制備、抗體/抗原反應(yīng)、臨床診斷和生物聚合物合成。
相關(guān)申請資料本發(fā)明申請是1995年9月27日遞交的申請序列號為08/534，454、名稱為“用于主動式可編程陣列式裝置的設(shè)備和方法”的部分連續(xù)申請，上述申請是1994年9月9日遞交的申請序列號為08/304，657，名稱為“自動分子生物診斷系統(tǒng)”，現(xiàn)已授權(quán)為美國專利號5，632，957(1997年5月20日遞交的申請序列號為08/859，644，名稱為“用于主動式、可編程電子微生物學(xué)系統(tǒng)的控制系統(tǒng)”的連續(xù)申請)的部分連續(xù)申請，所述申請是1994年7月7日遞交的申請?zhí)枮?8/271，882，名稱為“用于分子生物分析及診斷系統(tǒng)的電子嚴緊控制方法”現(xiàn)已授權(quán)的部分連續(xù)申請，所述申請是1993年11月1日遞交的申請?zhí)枮?8/146，504，名稱為“用于分子生物分析及診斷系統(tǒng)的主動式可編程電子裝置”，現(xiàn)已授權(quán)為美國專利號5，605，662(1996年10月4日遞交的申請序列號為08/725，976，名稱為“用于聚合物電子合成”的連續(xù)申請)的部分連續(xù)申請，也是1996年9月6日遞交的申請序列號為08/708，262，名稱為“用于優(yōu)化電子雜交反應(yīng)的方法和材料”的部分連續(xù)申請。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)包括很多種用于分析核酸和蛋白質(zhì)的技術(shù)，其中有許多種形成臨床診斷試驗的基礎(chǔ)。這些技術(shù)包括核酸雜交分析、限制酶分析、基因序列分析、和核酸和蛋白質(zhì)的分離和純化(見，例如，J.薩姆布魯克，E．F.弗里奇，和T.曼尼阿蒂斯，分子克隆實驗指南，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
許多分子生物學(xué)技術(shù)涉及對大量的樣品進行大量的操作。這些操作通常是復(fù)雜和耗時的，并一般需要高度的準確性。許多技術(shù)由于缺少靈敏性、特異性或再現(xiàn)性而局限了其應(yīng)用。例如，迄今為止由于靈敏性和特異性問題限制了核酸雜交的實際應(yīng)用。
核酸雜交分析一般涉及用探針在大量的非靶核酸中檢測很少量的特異靶核酸(DNA或RNA)。為了保持高的特異性，雜交通常在非常嚴緊的條件下進行，該嚴緊的條件通過溫度、鹽類、去垢劑、溶劑、促溶劑和變性劑各方面的結(jié)合來達到。
已經(jīng)在多種濾膜和固體載體形式上進行了多樣品核酸雜交分析(見G.A.Beltz等，酶學(xué)方法，100卷，B部分，R.Wu，L.Grossmam，K.Moldave編，學(xué)院出版社，紐約，19章，pp266-308，1985)。一種形式，即所謂的“點漬法”雜交，涉及靶DNA與濾膜的非-共價附著，隨后與放射性同位素標(biāo)記的探針雜交。“點漬法”雜交獲得廣泛的應(yīng)用，并發(fā)展了許多變型(見M.L．M.Anderson和B.D.Young，核酸雜交實用方法，B.D.Hames和S.J.Higgins編，IRL出版社，華盛頓特區(qū)，第4章，pp.73-111，1985)?！包c漬法”雜交進一步發(fā)展用于基因突變的多元分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，見EPA 0228075，1987年7月8日)，以及用于檢測重疊克隆和構(gòu)建基因圖譜(G.A.Evans，美國專利#5，219，726，1993年6月15日)。
另一種形式，即所謂的“夾層”雜交，涉及把寡核苷酸探針共價連接到固體載體上，并用它們來俘獲和檢測多元靶核酸。(M.Ranki等，基因，21，pp77-85，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund，英國專利申請GB 2156074A，1985年10月2日；T.M.Ranki和H.E．Soderlund，美國專利#4，563，419，1986年1月7日；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale，PCT WO 86/03782，1986年7月3日；Y.Stabinsky，美國專利#4，751，177，1988年1月14日；T.H.Adams等，PCT WO 90/01564，1990年2月22日；R.B.Wallace等，6，核酸研究，11，p3543，1979；和B.J.Connor等，80，美國科學(xué)院院刊，pp278-282，1983)。這些形式的多元變型被稱為“反點漬”。
利用目前的核酸雜交形式和嚴緊控制方法，即使使用最敏感的受體組(酶、熒光基團、放射性同位素、光度計、光子計數(shù)器、閃爍計數(shù)器等)，仍然很難檢測靶核酸的低拷貝數(shù)(即，1-100，000)。
這一困難是由直接探針雜交有關(guān)的幾個根本問題引起的。一個問題與雜交反應(yīng)的嚴緊控制有關(guān)。雜交反應(yīng)通常在嚴緊條件下進行以實現(xiàn)雜交特異性。嚴緊控制的方法主要涉及在雜交和隨后的洗滌步驟中溫度、離子強度、和變性劑的優(yōu)化。另人遺憾的是，這些嚴緊條件的應(yīng)用引起用于檢測的雜交探針/靶復(fù)合物的數(shù)量顯著降低。
另一個問題與在大多數(shù)樣品中DNA的高度復(fù)雜性有關(guān)，尤其是在人基因DNA樣品中。當(dāng)一個樣品包含與特異靶序列緊密相關(guān)的大量序列時，即使是最專一的探針序列也會與非靶序列部分產(chǎn)生大量的部分雜交。
第三個問題與探針與其特異靶之間的不利雜交動力學(xué)有關(guān)。即使是在最佳的條件下，大多數(shù)雜交反應(yīng)也是在相對低濃度的探針和靶分子下進行的。另外，探針經(jīng)常不得不與靶核酸的互補鏈競爭。
大多數(shù)雜交形式的第四個問題是非特異性背景信號的水平較高。這是由DNA探針與幾乎所有材料的親和性造成的。
這些問題，不管是單獨還是結(jié)合起來，都會導(dǎo)致在上述形式中的核酸雜交的敏感性和/或特異性喪失。這是很令人遺憾的，因為對大多數(shù)基于核酸的臨床診斷試驗來說檢測低拷貝數(shù)的靶核酸是必需的。
因為在檢測低拷貝數(shù)靶核酸中的困難，研究機構(gòu)過分依賴于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來擴增靶核酸序列(見M.A.Innis等，PCR方法和應(yīng)用指南，學(xué)院出版社，1990)。PCR反應(yīng)產(chǎn)生的大量的靶核酸序列改善了隨后的直接核酸探針技術(shù)，當(dāng)然，其代價為步驟冗長和麻煩。
與用直接探針檢測低拷貝數(shù)靶核酸中常見的困難顯著不同的是原位雜交技術(shù)。這一技術(shù)使得能在單個細胞中檢測低拷貝數(shù)單一核酸序列。在原位形式中，靶核酸通常以相對高的局部濃度被限制在一個細胞的面積(～20-50μm2)或核的面積(～10μm2)。另外，探針/靶雜交信號被限制在顯微和形態(tài)學(xué)顯著區(qū)；同在固體載體上相比較這就使得從人工或非-特異性信號區(qū)分出正信號較容易。
在某些方面模仿原位雜交，發(fā)展了在微型多路或陣列式裝置(例如，DNA芯片)上進行多樣品核酸雜交分析的新技術(shù)(見M.Barinaga，253科學(xué)，pp1489，1991；W.Bains，10生物/技術(shù)，pp757-758，1992)。這些方法通常把特異DNA序列附著到固體載體非常小的特異區(qū)域，例如DNA芯片的微孔上。這些雜交形式是傳統(tǒng)“反點漬法”和“夾層法”雜交系統(tǒng)的縮微型式。
縮微型式的雜交可以被用來“通過雜交進行序列分析”(SBH)(見M.Barinaga，253科學(xué)，pp1489，1991；W.Bains，10生物/技術(shù)，pp.757-758，1992)。SBH利用所有可能的n-核酸寡聚體(n-聚體)來識別在未知DNA樣品中的n-聚體，然后通過算法分析定位以產(chǎn)生DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，南斯拉夫?qū)＠暾?570/87，1987；R.Drmanac等，4基因組，114，1989；Strezoska等，88美國國家科學(xué)院院刊10089，1991；和R.Drmanac和R.B.Crvenjakov，美國專利#5，202231，1993年4月13日)。
進行SBH有兩種型式。一種型式包括在載體上產(chǎn)生所有可能n-聚體的矩陣，然后該矩陣與靶序列雜交。這是反點漬法的一種形式。另一種型式涉及把靶序列附著到載體上，順次用所有可能的n-聚體對該載體進行探測。這兩種型式都有直接探針雜交的基本問題，并還具有與多元雜交有關(guān)的困難。這就不能用直接雜交方法實現(xiàn)“通過雜交進行序列分析”，導(dǎo)致一種所謂的“型式3”，該型式包括一個連接酶步驟。雖然它提供了一定程度的改善，但它實際上代表一種不同的與酶反應(yīng)步驟有關(guān)的機制以識別堿基差異。
Southern在英國專利申請GB 8810400，1988；E.M.Southern等在13基因組1008，1992，建議使用“反點漬”型式分析或?qū)NA進行測序。Southern使用PCR擴增的基因組DNA確定一種已知的單點突變。Southern還描述了一種用來在SBN的固體載體上合成寡核苷酸的矩陣。然而Southern并沒有建議怎樣在矩陣上對每一種寡核苷酸實現(xiàn)優(yōu)化的嚴緊條件。
Fodor等，364自然，pp555-556，1993，在固體載體上使用1，024 8聚體寡核苷酸矩陣來對DNA進行序列分析。在這種情況下，靶DNA是一個熒光標(biāo)記的只含A和C堿基的單鏈12-聚體寡核苷酸。對于在矩陣上用8-聚體寡聚物進行雜交，12-聚體靶序列的濃度必需是1pmol(～6×1011分子)。結(jié)果表現(xiàn)出許多的錯配。如同Southern，F(xiàn)odor等沒有致力于解決直接探針雜交的根本問題。這些問題連同需要大量的單一靶12-聚體，表明SBH形式有嚴重的局限性。
同時，Dramanac等，26科學(xué)1649-1652，1993，使用上述第二種型式對幾種短(116bp)DNA進行序列分析。靶DNA被附著在膜載體上(“點漬”型式)。每一種濾膜都隨后與272個標(biāo)記的10-聚體和11-聚體寡核苷酸雜交。廣泛范圍的嚴謹條件被用來為每一種n-聚體探針實現(xiàn)特異雜交；清洗時間從5分鐘到過夜變化。濾膜不得不曝光2到18小時以檢測雜交信號。盡管可以使用單靶序列、寡聚體探針的還原形式以及使用能夠達到的最嚴緊的條件，假陽性雜交總率還是達到5％。
Fodor等，251科學(xué)767-773，1991，使用光刻技術(shù)在一個陣列上合成寡核苷酸。Pirrung等，美國專利#5，143864，1992年9月1日，講述了在硅基板上以矩陣式大規(guī)模光刻固相合成多肽。
在陣列式雜交的另一種方法中，Beattle等，1992年圣地亞哥會議基因識別，1992年11月，使用微機器人系統(tǒng)把含特異DNA序列的微滴沉積到在玻璃基板上單個的細微制造的樣品孔中。通過詢問微電極檢測設(shè)備檢測在每一個樣品孔中的雜交，該設(shè)備用交流電(AC)電場環(huán)繞每一單個的微孔。
不管是什么型式，所有目前的微型DNA雜交和SHB方法都不能克服核酸雜交反應(yīng)伴生的問題。這些方法都需要非常高水平的相對短的單鏈靶序列或PCR擴增DNA，并即使在在最嚴緊的條件下也產(chǎn)生高水平的假陽性雜交信號。對于使用短寡核苷酸序列的陣列的多路型式，不可能用任何傳統(tǒng)的方法對每一單個序列的嚴緊條件進行優(yōu)化，因為這些型式的陣列或設(shè)備不能在單個定位區(qū)相對于其它定位區(qū)改變或調(diào)節(jié)溫度、離子強度或變性劑。必須對設(shè)備上所有的序列使用共同的嚴緊條件。這就導(dǎo)致大量非特異性和部分雜交，嚴重限制了該設(shè)備的應(yīng)用。當(dāng)在矩陣上的不同序列的數(shù)量增加時，以及當(dāng)序列的長度降低為10-聚體之下或增加到20-聚體之上，這一問題就變得更加嚴重。這對于需要大量的短寡核苷酸探針的SBH是尤其令人麻煩的。
通常用電泳技術(shù)來分離不同大小、電荷或構(gòu)型的核酸，電泳技術(shù)可以通過在電場中它們不同的遷移率來區(qū)分雜交種類。脈沖場電泳在一種介質(zhì)(例如，凝膠)周圍使用多電極布置以分離通過傳統(tǒng)的凝膠電泳系統(tǒng)(見核酸凝膠電泳-實用方法，第2版，D.Rickwood和B.D.Hames編，IRL出版社，紐約，pp.101-122，1990)不能解決的非常大的DNA片段。
Pace，美國專利#4，908，112，3月13日，1990，描述使用細微-制造技術(shù)以在硅基板上產(chǎn)生毛細管凝膠電泳。多個電極被加進系統(tǒng)內(nèi)以通過設(shè)備中的分離介質(zhì)移動分子。
Soane和Soane，美國專利5，126，022，1992年6月30日，描述可以使用許多電極通過在試管中含有的凝膠分離介質(zhì)控制帶電分子在混合物中的線性移動。電極必須被安裝在試管中以控制在分離介質(zhì)中分子的移動和位置。
Washizu，M.和Kurosawa，O.，26工業(yè)應(yīng)用IEEE學(xué)報6，pp1165-1172，1990，使用高-頻交流(AC)電場在微制造的電極之間產(chǎn)生的電場線中定向DNA分子。然而，他們的工作中禁止使用直流電(DC)場。Washizu，25靜電學(xué)雜志109-123，1990，描述了使用介電電泳操作細胞和生物分子的方法。細胞可以被融合，生物分子可以沿微電極結(jié)構(gòu)之間AC電壓產(chǎn)生的電場線定向。然而，介電電泳方法需要非常高頻率的AC(1MHz)電壓和低電導(dǎo)率的介質(zhì)。盡管這些技術(shù)可以沿AV場線定向不同大小的DNA分子，但是它們不能區(qū)分出同樣大小的雜交復(fù)合物。
MacConnell，美國專利4，787，936，1988年11月29日，描述以一個加速度退火核酸分子的方法和裝置。核酸探針是電泳上可以富集的，有一個各種序列可以結(jié)合的表面。未退火的探針分子以電取向的反向從表面區(qū)電移出，這樣就電泳移離先前在表面上富集的材料的表面。另外在另一方面，該專利描述了沿被結(jié)合有序列的表面的各個方向相繼移動富集的退火探針分子。
Stanley，C.J.，美國專利5，527，670，于1996年6月18日授權(quán)，要求優(yōu)先權(quán)到1990年9月12日遞交的GB9019946，1991年6月14日遞交的GB9112911。Staley公開了一種用于使在電化學(xué)室內(nèi)的活性雙鏈核酸材料變性成其單股的方法。用一個電極對核酸材料施加電壓對核酸進行電處理。建議使用促進劑化合物，例如甲基紫精加速變性。該方法被建議用于通過雜交與標(biāo)記探針檢測核酸或通過聚合酶鏈反應(yīng)或連接酶鏈反應(yīng)對DNA進行擴增。
最近，已經(jīng)嘗試制造基于微芯片的核酸矩陣以通過雜交使得基因信息被迅速分析。許多這些裝置利用了在最近40年半導(dǎo)體工業(yè)發(fā)展的復(fù)雜的硅制造工藝。在這些裝置中，許多平行的雜交可以在固定化的俘獲探針上同時進行。雜交的嚴緊性和速率通常通過溫度和溶液和洗滌液的鹽濃度來控制。雖然探針密度很高，這種“被動”微雜交方法有幾個局限性，尤其是對于在反點漬型式定向的矩陣、對于堿基錯配分析、以及對于通過雜交應(yīng)用測序和重新測序來說更是如此。
首先，因為所有的核酸探針都同時處于相同的條件下，俘獲探針必須具有類似的熔化溫度，以達到類似的雜交嚴緊性水平。這就對俘獲探針的長度、GC含量和二次結(jié)構(gòu)造成了限制。另外，必須選出單鏈拔片段進行真正的雜交，就需要極長的雜交和嚴緊程度(見，例如，Guo，Z，等，核酸研究，V.22#24，pp5456-5465，1994)。
其二，對于單個堿基錯配分析和重測序應(yīng)用，必須在矩陣上有相對大量的俘獲探針(＞16)以詢問在給定靶序列中的每一位置。例如，一個400堿基對的靶序列就需要有超過12，000個不同的探針序列的矩陣(見，例如，Kozal，M.J.，等，天然藥物，V.2，#7，pp753-759，1996)。
其三，對于許多使用大靶片段的應(yīng)用，包括PCR或其它擴增子，不能被直接雜交到矩陣上。往往，需要擴增作子復(fù)雜的二次處理，包括(1)進一步擴增；(2)轉(zhuǎn)化成單鏈RNA片段；(3)減小尺寸以縮短寡聚體，和(4)復(fù)雜的分子生物/酶反應(yīng)步驟，例如ligation反應(yīng)。
其四，對于被動雜交，其速率與在溶液中的靶片段的起始濃度成正比，因此，就需要非常高濃度的靶片段以實現(xiàn)快速雜交。
其五，因為，控制雜交條件的困難，單個堿基的區(qū)別通常被局限于用中心placed差異俘獲20堿基或更低的寡聚體序列(見，例如，Chee’96；Guo，Z，等，核酸研究，V.22，#24，pp5456-5465，1994；Kozal，M.J.等，天然藥物，V.2，#7，pp753-759，1996)。
從上述討論中可以很明顯看出，已經(jīng)進行了大量的嘗試以提供有效的技術(shù)進行多步、多路雜交和其它分子生物學(xué)反應(yīng)。然而，至少由于上述原因，這些技術(shù)已經(jīng)被證明是有缺陷的。盡管長期以來已經(jīng)認識到需要一種有效的技術(shù)，但這之前一直沒有滿意的解決辦法。
發(fā)明概述為了彌補這些局限性，一種基于微電子的核酸矩陣利用電場作為獨立參數(shù)來控制核酸相互作用的遷移、雜交和嚴緊性。它們是“主動式”的矩陣裝置，其中它們利用微電子以及微制造技術(shù)。這樣，除了鹽、pH、溫度和促溶劑外，電場強度(尤其是電流水平和密度)提供了一種精確控制的和連續(xù)可變參數(shù)，用來調(diào)節(jié)核酸之間的相互作用。
本發(fā)明涉及一種在顯微尺寸可以有效進行和控制多步和多路反應(yīng)的自尋址、自組裝微電子集成系統(tǒng)的設(shè)計、制造和應(yīng)用。這些反應(yīng)包括，但不限于大多數(shù)分子生物學(xué)方法，例如例如核酸雜交、抗體/抗原反應(yīng)、細胞分離、和相關(guān)的臨床診斷。
另外，該裝置能夠進行多步結(jié)合和復(fù)合合成，包括，但不局限于，不同寡核苷酸或多肽在特異微定位區(qū)的合成。
另外，本發(fā)明的微電子裝置和方法在被認為通過任何被動或傳統(tǒng)的雜交技術(shù)是不能雜交或非-嚴緊條件下，允許進行迅速的多路雜交和在全長DNA片段和PCR擴增子中識別出單個堿基的錯配。
使用微光刻和微加工技術(shù)都可以制造出該裝置。該裝置在表面上有一個可尋址的顯微定位矩陣；每一個微定位區(qū)都能夠電控制和定向特異結(jié)合體向自身的遷移和附著(例如，核酸、抗體)。所有的微定位都可用其特異的結(jié)合體尋址。使用這些裝置，系統(tǒng)可以在最小外界干擾下自組裝。
在本發(fā)明起到很重要作用的是覆蓋在電極上的離子可透過的“滲透”層。這一滲透層允許核酸附著從而允許進行固定化。更重要的是，滲透層分離附著的或被捆綁的寡核苷酸并從立即在電極表面產(chǎn)生的高反應(yīng)電化學(xué)環(huán)境中雜交靶DNA序列。這一高反應(yīng)電極表面和其電化學(xué)產(chǎn)物能夠迅速破壞與其接觸或離它很近的DNA探針和靶DNA序列。因此這一滲透層就允許要被“電瞄準”的寡核苷酸和DNA片段在實際的電極表面上并進行雜交以錨定互補寡核苷酸，同時免受反應(yīng)表面和環(huán)境的破壞。
更重要地是，形成微定位區(qū)結(jié)構(gòu)的微電極和滲透層的設(shè)計，允許在被限定的區(qū)域中達到高的電流強度，同時將電極自身產(chǎn)生的副作用降至最小。
自尋址裝置能夠控制和有效進行多種試驗和反應(yīng)。分析物或反應(yīng)物能通過自由場電泳遷移到任何特異的微定位區(qū)，在微定位區(qū)分析物或反應(yīng)物被有效富集并在所述微定位區(qū)與特異結(jié)合體反應(yīng)。因為富集效應(yīng)檢測特異分析物或反應(yīng)物的敏感性就提高了。通過顛倒微定位區(qū)的極性，就可以去除任何未結(jié)合的分析物或反應(yīng)物。更重要的是，在一個微定位區(qū)產(chǎn)生精確控制的高電流水平或強度的能力，允許選擇性地對DNA片段進行“去雜交”，達到單堿基錯配或甚至完全互補序列去雜交的水平。因此，該裝置能夠改善試驗和反應(yīng)的特異性。
該裝置的主動特性為在每一特異微定位區(qū)發(fā)生的雜交反應(yīng)(或其他親和反應(yīng))的所有方面都提供了獨立的電控制。這些裝置為影響雜交反應(yīng)提供了新機制，被稱為電嚴緊控制(ESC)。對于需要不同嚴緊條件的DNA雜交反應(yīng)，ESC克服了傳統(tǒng)矩陣技術(shù)的固有局限性。本發(fā)明的主動式裝置能電在每一個微定位區(qū)生產(chǎn)“不同的嚴緊條件”。因此，所有的雜交都優(yōu)選在相同的原溶液中進行。這些活性裝置與傳統(tǒng)的多路雜交矩陣和DNA芯片不同。盡管傳統(tǒng)的矩陣在每一位點都定位有不同的探針或靶DNA；但是在矩陣上的所有位點都具有相同的共同反應(yīng)或溫度、緩沖液、鹽濃度和pH的嚴緊條件。在反應(yīng)或嚴緊條件中的任何變化，都會影響在矩陣上的位點。盡管復(fù)雜的光刻技術(shù)可以用來制造矩陣，或可以結(jié)合微電子傳感元件進行檢測，但是傳統(tǒng)的裝置是被動式的，不能控制或影響真正的雜交過程。本發(fā)明的主動式裝置允許每一個微定位區(qū)起到完全獨立的檢測或分析位點的作用(即，它們在每一個定位區(qū)形成與“試管”等效的效果)。多元雜交反應(yīng)能用最小的外界物理操作來進行。另外，不必改變溫度，也顯著降低了所需多次洗滌步驟。
另一個重要的考慮是遷移和雜交緩沖液的組成。為了便于自由溶液電泳中核酸的迅速移動，利用的是低電導(dǎo)率的緩沖液。為了達到低電導(dǎo)率和保持良好的緩沖容量，使用在其pI幾乎沒有或沒有凈電荷的兩性離子緩沖液。這些緩沖液，通常具有低于100mS/cm的電導(dǎo)率。通常在分子生物學(xué)使用的緩沖液的電導(dǎo)率為1000倍以上，例如6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)。低電導(dǎo)率和沒有凈電荷的兩性緩沖液并不能最好地屏蔽核酸磷酸二酯骨架電荷，因此，在被動條件下，并不能有助于雜交。盡管我們并不希望局限于任何特異的理論，但是據(jù)認為這有可能有助于避免變性核酸在遷移前的自我退火。然而，經(jīng)驗上發(fā)現(xiàn)，這些緩沖液選擇性有助于電加速雜交。
因此，該公開的裝置能夠用完全和精確的電子控制進行多步和多路反應(yīng)，優(yōu)選在總微處理器控制下進行(即，用計算機運行)。多步和多路反應(yīng)的特異性和敏感性就在該公開的設(shè)備上在特異微定位區(qū)上得到顯著的提高。
該裝置也有助于使用附屬的光成像或掃描檢測系統(tǒng)在每一個微定位區(qū)檢測雜交的復(fù)合物。直接檢測DNA的集成的光電子或電子傳感元件也可以被結(jié)合進該裝置自身中。這就是說，光波導(dǎo)管、激光、和檢測器可以微制造成APEX芯片自身，因為它是一個基于硅的結(jié)構(gòu)。
如果需要的話，寫有特異結(jié)合體的原裝置可以被電復(fù)制或拷貝到另一個基本裝置上。因此，這就使得矩陣裝置能夠迅速制造。
本發(fā)明可以使用與本發(fā)明的目的一致的任意大小或形狀的微定位區(qū)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，使用的微定位區(qū)在亞-毫米(10-100微米)的范圍內(nèi)?！疤禺惤Y(jié)合體”通常意味著任何對另一個分子、大分子或細胞有特異親和性通過共價結(jié)合或非-共價結(jié)合的生物或合成分子。優(yōu)選地，特異結(jié)合體包括(或者是根據(jù)特性或者是根據(jù)修飾)一個官能化學(xué)基團(伯胺、巰基、醛等)、一個共同或單一序列(核酸)，一個抗原決定部位(抗體)、一個半抗原、或一個配基，能夠共價反應(yīng)或非-共價結(jié)合到在微定位區(qū)表面上的共同官能團。特異結(jié)合體包括，但不限于脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、合成寡核苷酸、多肽核酸(PNA)、抗體、蛋白質(zhì)、多肽、凝集素、修飾的多糖、細胞、合成復(fù)合大分子、官能化的毫微結(jié)構(gòu)、官能化的微結(jié)構(gòu)、合成聚合物、修飾/阻斷核苷酸/核苷、修飾/阻斷氨基酸、熒光基團、發(fā)色團、配基、螯和物和半抗原。
“嚴緊性控制”意思是通過改變一些物理參數(shù)能夠區(qū)分特異和非特異結(jié)合相互作用。在核酸雜交的情況下，通常用溫度控制嚴緊性。反應(yīng)在特定的雙鏈雜交鏈熔化溫度(Tm)或其附近進行。
因此，本發(fā)明的一個方面是一種有電子編程矩陣和自尋址顯微微定位區(qū)。每一顯微定位區(qū)包含一個在下面作用的直流電(DC)或基片支撐的DC/AC微電極。每一微定位區(qū)的表面有一個小反-離子能自由通過的滲透層，和一層與特定結(jié)合體共價結(jié)合的附著層。這些單一設(shè)計特性為裝置提供了下列重要特性(1)使得可控制的官能DC電極保持在微定位區(qū)之下；(2)允許進行電泳遷移；(3)在電極(金屬)界面把親和或結(jié)合反應(yīng)從電化學(xué)和反電解反應(yīng)分出來。應(yīng)當(dāng)強調(diào)的是，在該裝置中使用的微電極的首要的功能是向特異定位區(qū)提供結(jié)合和反應(yīng)物的電泳推動力。
“矩陣”或“陣列”意思是在裝置上安排尋址定位區(qū)?？梢砸詢删S矩陣、三維矩陣或其它矩陣形式安排定位區(qū)。定位區(qū)的數(shù)目可以從幾個到至少成百上千個。最重要的是，每一個定位區(qū)都代表一個完全獨立的反應(yīng)位點。
在第二方面，本發(fā)明的特征在于一種把結(jié)合體遷移到裝置上的任何特異微定位區(qū)的方法。當(dāng)啟動后，微定位區(qū)可以直接影響任何帶電的官能化的特定結(jié)合體的自由場電泳遷移。在接觸到特定的微定位區(qū)時，官能化的特異結(jié)合體立即共價附著到特異微定位區(qū)的附著層表面。其它微定位區(qū)可以通過對帶電分子保持相反的電勢而同時得到保護。該步驟可以迅速進行直到所有的微定位區(qū)都被其特異結(jié)合體訪問。
“帶電官能化特異結(jié)合體”意思是化學(xué)反應(yīng)性的(即，能夠共價附著到定位區(qū))和帶凈電荷(正或負)的特異結(jié)合體。
本發(fā)明的第三方面的特征在于一種在裝置的任何特異微定位區(qū)富集分析物或反應(yīng)物并與之反應(yīng)的方法。在特定結(jié)合體附著后，在每一個微定位區(qū)下的微電極繼續(xù)以直流電的模式起作用。這一獨特的特性允許在保持與分析物或反應(yīng)物分子相反電荷的任一特異微定位區(qū)上游離在溶液中的相對稀釋的帶電分析物或反應(yīng)物分子迅速以連貫或平行的方式被遷移、富集、和反應(yīng)。特異微定位區(qū)可以通過使它們保持相同的電荷而被保護或屏蔽。這種能在選定的微定位區(qū)富集稀釋的分析物或反應(yīng)物分子的能力大大加速了在這些微定位區(qū)的反應(yīng)速率。
當(dāng)完成所需的反應(yīng)后，可以顛倒微電極的電勢以從微定位區(qū)去除非特異性分析物或未反應(yīng)的分子。
特異分析物或反應(yīng)產(chǎn)物可以從任何微定位區(qū)釋放出來，并被遷移到其它定位區(qū)進一步分析；或儲存在其它可尋址定位區(qū)；或完全從系統(tǒng)中去除。
從這些微定位區(qū)排斥非特異體和對序列去-雜交的能力也能顯著改善在特異微定位區(qū)隨后對分析物分析。
本發(fā)明的第四個方面特征在于一種改善核酸雜交反應(yīng)的效率和嚴緊性的方法，包括步驟迅速在雜交要發(fā)生的特異微定位區(qū)濃縮稀釋的靶DNA和/或探針DNA序列；迅速從雜交已經(jīng)發(fā)生的特異微定位區(qū)去除非特異性結(jié)合靶DNA序列；迅速從雜交已經(jīng)發(fā)生的特異微定位區(qū)去除競爭靶DNA序列；通過電流水平和強度調(diào)節(jié)電嚴緊控制(ESC)以部分去除雜交的DNA序列(大于一個堿基錯配)；使用在8-聚體到21-聚體范圍內(nèi)的探針(例如，識別點突變)通過電流水平和強度調(diào)節(jié)ESC以改善單個錯配雜交的分辨力。
通過電流水平和密度使用ESC利用在常規(guī)步驟使用范圍(例如，大于21-聚體和短于8-聚體)外的寡核苷酸點突變探針(例如，22-聚體到30-聚體和更長)。
通過電流水平和密度應(yīng)用ESC以區(qū)分單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
使用ESC以在俘獲探針寡核苷酸的矩陣上改善擴增的靶DNA和RNA序列的總雜交。
使用ESC以在俘獲探針寡核苷酸的矩陣上以反點漬型式改善任一靶DNA或RNA序列的雜交。
使用ESC以在俘獲探針寡核苷酸的矩陣上以包層型式改善任一靶DNA或RNA序列的雜交。
使用ESC以在核苷酸探針的矩陣上以更標(biāo)準的點漬型式(在陣列上的靶序列，加入的報道探針)改善任一靶DNA或RNA序列的雜交。
使用ESC以在核苷酸探針的矩陣上以同源/異源雜交型式改善靶核酸序列的雜交。
使用ESC以在基因表達應(yīng)用的核苷酸探針的矩陣上改善靶RNA序列的雜交。
對在相同的主體溶液和相同的溫度下發(fā)生的單個雜交應(yīng)用各自的ESC。
使用ESC以改善未雜交靶DNA序列與俘獲探針寡核苷酸的矩陣的雜交。
本發(fā)明的第五方面特征在于一種在微定位區(qū)復(fù)合合成生物聚合物的方法。
本發(fā)明的第六方面特征在于從一個原裝置復(fù)制矩陣的方法。
本發(fā)明的第七方面特征在于一種電進行樣品制備和把靶DNA遷移到裝置的分析元件的裝置。
本發(fā)明的第八方面特征在于一種使用最小的射流電傳遞試劑和反應(yīng)物的裝置。
本發(fā)明的第九方面特征在于一種進行分子生物學(xué)和DNA擴增反應(yīng)(例如，限制切開反應(yīng)、DNA/RNA聚合酶和DNA連接酶靶擴增反應(yīng))的裝置。
本發(fā)明的第十方面特征在于一種能測定大小和識別限制片段(例如，進行電限制片段長度多態(tài)性和DNA指紋分析)的裝置。
本發(fā)明的第十一方面特征在于一種進行抗體/抗原和免役診斷反應(yīng)的裝置。
本發(fā)明的第十二方面特征在于一種能夠進行寡核苷酸和肽的復(fù)合合成的裝置。
本發(fā)明的第十三方面特征在于一種選擇性結(jié)合細胞、處理雜交細胞、溶解和從細胞中去除DNA，或在細胞內(nèi)進行原位雜交。
本發(fā)明的第十四方面特征在于使用輔助有光、光電或電子檢測系統(tǒng)或自尋址微電子裝置或集成光、光電或電子檢測系統(tǒng)的自尋址微電子裝置檢測和分析在訪問的微定位區(qū)發(fā)生的反應(yīng)的方法。
本發(fā)明的第十五方面特征在于在任何被動或常規(guī)雜交技術(shù)基本上被認為不能雜交和非嚴緊性的條件下允許迅速多路雜交和在全長雙鏈或單鏈DNA片段、RNA片段、PCR擴增子和SDA擴增子識別出單堿基錯配的裝置和方法。
本發(fā)明的第十六方面特征在于在任何被動或常規(guī)雜交技術(shù)基本上被認為不能雜交和非嚴緊性的條件下結(jié)合緩沖液和電解化合物(包括但不局限于組氨酸、二組氨酸、組氨酸肽、混合的組氨酸肽和其它低電導(dǎo)/DNA螺旋穩(wěn)定化合物)的電雜交方法，使核酸片段(DNA、RNA等)產(chǎn)生迅速的遷移和雜交。
本發(fā)明的第十七方面特征在于在任何被動或常規(guī)雜交技術(shù)基本上被認為不能雜交和非嚴緊性的條件下允許多路雜交和識別多個重復(fù)序列(二-、三、四等)，包括在核酸片段中的串聯(lián)重復(fù)(STR)的裝置和方法。
本發(fā)明的第十八方面特征在于允許以原位型式進行迅速多路雜交的裝置和方法。
本發(fā)明的第十九方面特征在于可以結(jié)合到允許對所謂的“制造你自己的芯片”產(chǎn)品和應(yīng)用的APEX芯片裝置的尋址的儀表系統(tǒng)的裝置和方法。
本發(fā)明的第二十方面特征在于含有助于保持DNA雜交穩(wěn)定性的化合物的改善的滲透層，這些化合物包括但不限于組氨酸、組氨酸肽、聚組氨酸、賴氨酸、賴氨酸肽和其它陽離子化合物或物質(zhì)。
因為本發(fā)明的裝置是主動式可編程電子陣列，縮寫“APEX”被用來描述或指出這些裝置的獨特特性。APEX是微光刻生產(chǎn)的“芯片”和微-加工的裝置的縮寫。
APEX微電子裝置和芯片的主動式特性使得我們創(chuàng)造了一種能進行更多種分子生物反應(yīng)的新機制。包括實現(xiàn)線性和指數(shù)倍增或靶DNA和RNA分子擴增的新方法。
該裝置為(1)在室溫(例如，大大低于其Tm點)下共同的緩沖液中選擇性變性DNA雜交；(2)在兩個各個或更多微定位區(qū)迅速前后遷移或移動DNA；和(3)在所需的微定位區(qū)選擇性地富集特定的反應(yīng)物、試劑、和酶提供電子機制。這些機制全都涉及進行分子生物和靶擴增型反應(yīng)的新物理參數(shù)。
已經(jīng)發(fā)展了許多電控制分子生物反應(yīng)的例子。包括(1)電導(dǎo)向限制酶切除特定ds-DNA序列；(2)電限制性片段分析；(3)用DNA聚合酶電擴增靶DNA；和(4)用DNA和RNA聚合酶電連接和擴增靶DNA序列；和(5)用RNA聚合酶電增殖靶DNA。這些例子是能在APEX裝置上進行的分子生物反應(yīng)和步驟的種類的典型代表。
本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點從本發(fā)明下面詳細的描述和權(quán)利要求書中可以明顯看出來。
附圖簡述

圖1是用微光刻技術(shù)制造的三個自尋址微定位區(qū)的橫截面圖。
圖2是一個微光刻方法制造的微定位區(qū)的橫截面圖。
圖3是一個自尋址微定位區(qū)64芯片的示意圖。
圖4示出的是允許特定的寡核苷酸共價耦聯(lián)到微定位區(qū)的附著表面的特定附著化學(xué)步驟。
圖5示出的是微加工的96微定位區(qū)裝置的放大示意圖。
圖6示出的是微加工的裝置的橫截面圖。
圖7a和圖7b示出的是在特定微定位區(qū)用來電濃縮分析物或反應(yīng)物的機理和裝置，圖7a示出的是在中性條件下的尋址微定位區(qū)，圖7b示出的是在帶電狀態(tài)下的尋址微定位區(qū)。
圖8a、8b、8c和8d示出的是有三個特定寡核苷酸結(jié)合體(SSO-A，SSO-B，SSO-C)的裝置的自導(dǎo)向組裝，圖8a示出的是被尋址的第一個微定位區(qū)(ML-1)、圖8b示出的是被尋址的第二個微定位區(qū)(ML-2)、圖8c示出的被尋址的第三個微定位區(qū)(ML-3)，以及圖8d示出的是在尋址后組裝后的三個微定位區(qū)。
圖9a、9b和9c示出的是在含有特定DNA俘獲序列的微定位區(qū)濃縮的樣品/靶DNA電控制雜交步驟，圖9a示出的是在尋址微定位區(qū)上的特定俘獲序列，圖9b示出的是鄰近圖9a結(jié)構(gòu)的特異性和非特異性DNA，圖9c示出的是鄰近微定位區(qū)ML-1和ML-3的雜交材料。
圖10a和10b示出的是一個電導(dǎo)向的系列雜交步驟，圖10a示出的是鄰近微定位區(qū)ML-3的材料，圖10b示出的是鄰近微定位區(qū)ML-3和ML-5微定位區(qū)。
圖11a、11b和11c示出的是用來測定單點突變的雜交步驟的電嚴緊控制(ESC)，圖11a示出的是不帶電的尋址微定位區(qū)，圖11b示出的是帶負電的微定位區(qū)，圖11c示出的是有從微定位區(qū)ML-3變性的物質(zhì)的帶負電微定位區(qū)。
圖12a、12b、12c和12d示出的是不使用標(biāo)記DNA探針，即電控制的熒光染料檢測方法檢測雜交DNA的示意圖，圖12a示出的是不帶電的微定位區(qū)，圖12c示出的是有染料的不帶電微定位區(qū)，圖12d示出的是帶正電的微定位區(qū)。
圖13a、13b和13c示出的是裝置的電可控制復(fù)制示意圖，圖13a示出的是帶負電的尋址微定位區(qū)，圖13b示出的是兩個正對的基片，一個基片是圖13a的，另一個是含附著層的配合裝置的，圖13c示出的是兩個基片，每一個基片都有結(jié)合到微定位區(qū)的序列。
圖14a、14b、14c、14d、14e和14f示出的是電導(dǎo)向的寡核苷酸復(fù)合合成示意圖。圖14a示出的是有阻斷基團的尋址微定位區(qū)，圖14b示出的是有一個與去阻斷基團結(jié)合的阻斷基團的尋址微定位區(qū)，圖14c示出的是在單體C存在下阻斷和去阻斷尋址微定位區(qū)，圖14d示出的是與去阻斷基團結(jié)合的尋址微定位區(qū)，圖14e示出的是在單體A存在下在微定位區(qū)ML-2上去阻斷的位點，圖14f示出的是在序列末端上有去阻斷基團的微定位區(qū)。
圖15示出的是使用電嚴緊控制和常規(guī)技術(shù)對15-聚體碎片進行的12點突變雜交的比較結(jié)果圖。
圖16示出的是電控制的限制片段切除DNA示意圖。
圖17示出的是使用聚合酶電控制擴增片段DNA的示意圖。
圖18示出的是設(shè)計來進行樣品制備和DNA分析的APEX裝置示意圖。
圖19是在電雜交方法中雜交的組氨酸穩(wěn)定性圖解表示。
圖20是每秒對1/電導(dǎo)相對熒光增加的圖。
圖21a和圖21b是寡核苷酸對電流圖。
圖22是雜交的寡核苷酸對時間圖。
圖23是殘留的寡核苷酸以緩沖液為函數(shù)的柱形圖。
圖24a和24b是各種電流和緩沖液以時間為函數(shù)的圖。
圖25是在GABA和組氨酸雜交率以各種電流和時間為函數(shù)的柱形圖。
圖26是在不同的pH下6XSSC和組氨酸中的被動雜交的btrRCA5。
發(fā)明詳述前言本發(fā)明的裝置和相關(guān)方法允許分子生物學(xué)和診斷反應(yīng)在“完全電控制”下進行。在本發(fā)明中談及的“電控制”超過該術(shù)語的常規(guī)含義。大多數(shù)常規(guī)的微定位區(qū)裝置，儀器和檢測系統(tǒng)都處在一定的電控制水平。本發(fā)明的微定位區(qū)不僅處在常規(guī)的電控制內(nèi)，而且更重要的是它們還能在進行分子生物和診斷反應(yīng)的物理方面直接進行電控制。本發(fā)明提供了一種有可編程和尋址顯微定位的微電子裝置。在優(yōu)選的實施方案中，每一定位都有一個用來共價附著特定結(jié)合體的衍生上表面(即，附著層)，一個中間滲透層，和一個在下面的直流(DC)微電極(可選擇運行DC/AC)。在基本的微電子結(jié)構(gòu)最初形成后，該裝置能夠自引導(dǎo)每一特定的微定位區(qū)與特定結(jié)合體的尋址。因此，本發(fā)明的裝置和方法能結(jié)合進一個允許有DNA或RNA探針或其它配基的APEX芯片裝置尋址的儀器系統(tǒng)中。這種系統(tǒng)允許將允許“制造你自己的芯片”產(chǎn)品和應(yīng)用。這種產(chǎn)品和應(yīng)用將對許多研究者和臨床診斷、分子生物學(xué)、官能基因組和藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用的終端用戶非常有用。自尋址裝置隨后能在其任何微定位區(qū)進行單個多步和復(fù)合反應(yīng)。該裝置還能進行多步反應(yīng)，但重要的優(yōu)點在于每一反應(yīng)以真正獨立的檢測位點的當(dāng)量進行。裝置能夠電引導(dǎo)和控制分析物和反應(yīng)物迅速移動和濃縮到或離開其微定位區(qū)。裝置能電控制各種反應(yīng)的動力學(xué)方法提供了許多新機制和重要的優(yōu)點和改進。
本發(fā)明的定義和實施方案分五部分描述。第一部分“總述”包括在裝置中使用的物理參數(shù)和機制的各種發(fā)現(xiàn)和定義，包括對緩沖液的討論。第二部分，“基本裝置的設(shè)計和制造”描述基本的基礎(chǔ)微定位區(qū)裝置的設(shè)計和使用微光刻和微加工技術(shù)制造裝置。第三部分，“裝置的自引導(dǎo)尋址”描述裝置的自尋址和自組裝，特別是特異性結(jié)合體迅速遷移和附著到各個微定位區(qū)。第四部分，“裝置的應(yīng)用”描述怎樣對各種多步、復(fù)合和多路反應(yīng)提供電控制。這一部分也描述了裝置的各種用途和應(yīng)用。第五部分描述在本文公開的各個發(fā)明方面的各種實施例。
電泳行為本發(fā)明的裝置(指的是APEX裝置、微芯片、DNA芯片、微加工裝置、樣品制備裝置、電點漬等)涉及使用DC，也使用DC/AC電場以產(chǎn)生遷移、加速反應(yīng)性、并改善帶電試劑和分析物分子和物品(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細胞等)的特異性。因此，有關(guān)電場對帶電分子、電泳遷移的作用的物理參數(shù)的基本理解和定義，以及不同緩沖劑和電解液(陰和陽)的特性對本發(fā)明是很重要的。對本發(fā)明尤其重要的是在鄰近電場發(fā)射和/或電流強度最高的部位繞微定位區(qū)或滲透層發(fā)生的物理效應(yīng)或現(xiàn)象。
許多物理參數(shù)涉及在各種類型的電解液和緩沖液中的DNA和其它帶電分析物的電泳遷移。本發(fā)明的裝置基本上是DC(直流電)電子裝置，在裝置表面上產(chǎn)生電場，并在溶液中產(chǎn)生凈電流。另外，許多低頻(～0.1到500HZ)DC和DC/AC低頻脈沖情況(還是產(chǎn)生凈電流)改善總裝置性能，試劑和分析物濃縮速率、DNA/RNA雜交速率和效率，以及雜交特異性。另外，使用結(jié)合有用來選擇細胞和定位特定的高頻AC電場，和用于電泳遷移的DC電場的本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置都被公開在集成裝置(樣品制備等)上操作。高頻(KHZ到MHZ)AC電場，不產(chǎn)生凈電流、在溶液中不能產(chǎn)生帶電分子的電泳遷移。然而，這些產(chǎn)生電場梯度高頻AC電場能夠?qū)е录毎推渌胁煌殡娞匦缘膶嶓w沿電場梯度線排列。這一方法被稱為介電電泳。
定義-對于DC場(電壓大于1.0到1.2伏特)和脈沖DC和DC/AC場，這些介電場的確會在相反(+／-)偏壓的微定位區(qū)中間或裝置上的檢測定位區(qū)引起帶電分子產(chǎn)生電泳遷移。在這種條件下，當(dāng)使用大于1.0到1.2伏特的電壓時裝置產(chǎn)生顯著的凈直流電流。電流的產(chǎn)生被認為是“電泳方法的特征”。在該方法中，沿電場梯度的方向電力使離子或帶電顆粒遷移，電流和電壓的關(guān)系對該方法非常重要。電泳遷移宏觀上表明在施加電壓下溶液導(dǎo)電，并遵循歐姆定律V=RXI其中V是電勢(電壓)R是電解液的電阻[VxA-1=Ω]I是電流[安培]溶液的電阻(R)是電導(dǎo)(L)的倒數(shù)，電導(dǎo)可以用電導(dǎo)儀測定。電導(dǎo)取決于測定裝置的幾何形狀、緩沖液/電解液離子的種類和它們的濃度。盡管在分子生物學(xué)研究應(yīng)用中這些的形成電泳技術(shù)基礎(chǔ)電流/電壓關(guān)系類似，但是本發(fā)明的裝置產(chǎn)生的電場在許多情況下處于真正的顯微環(huán)境中，受這些電場影響的分子有時靠近電場的起點(～1到20微米)。另外，在微定位區(qū)檢測位點的電解液陰離子和陽離子(Na+，K+、Cl-等)、緩沖劑(磷酸鹽、檸檬酸鹽、三羧甲基氨基甲烷、組氨酸、半胱氨酸等)、和分析物分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細胞等)在施加電場的過程中經(jīng)受非常高的電流強度。
本發(fā)明的另一方面，這一高的電流強度看來是一個重要的特性，可以被用來從附著或連接到微定位區(qū)/滲透層檢測位點的DNA序列“電去雜交”互補的部分互補的DNA序列(包括單堿基差異)。這是被稱為“電嚴緊性”的方法的重要機制。第二個電嚴緊性機制是一個更基本的特性，未結(jié)合或未特異性結(jié)合的物質(zhì)能從微定位區(qū)檢測位點電泳的遷移出來。最后，應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明的裝置和方法利用“電泳遷移”的特性，與“電泳現(xiàn)象”不同，它通常被定義為使用電場使帶電分子通過篩分介質(zhì)分離出來。
某些方面，本發(fā)明的裝置可以被認為是“微電機”，在裝置表面驅(qū)動或遷移帶電分析物和試劑從一個微定位區(qū)到另一個微定位區(qū)。另一方面，本發(fā)明的裝置可以產(chǎn)生高的局部電流密度，可以用來控制、影響、作用和改善在微定位區(qū)檢測位點上的雜交和去雜交步驟。
本發(fā)明的系統(tǒng)、裝置和方法具有涉及純源化電流和電壓的各種方法、怎樣使用各種電流和電壓改善系統(tǒng)的系統(tǒng)的獨特的特性。例如，可以提供一個數(shù)量幾乎不受限制的DC和DC/AC脈沖步驟(線性和對數(shù)梯度)，并且看來對試劑和分析物遷移和濃縮、DNA雜交速率、DNA雜交率、和DNA雜交特異性或嚴緊性。在許多情況下，這些電脈沖步驟DC和DC/AC可以被用來降低或消除在“微電極”表面發(fā)生的電泳反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)產(chǎn)物的不利影響(包括H+、OH-、O2、自由基等)。
1.1.1電泳遷移與離子強度在電泳領(lǐng)域已經(jīng)證明帶電分析物種(蛋白質(zhì)、DNA等)的遷移率對數(shù)降低，與電解液的離子強度的平方根成反比(見“毛細管電泳原理和應(yīng)用”，R.Kuhn和S.Hoffstetter，Springer-Verlag，1993，83頁和圖3.16)。在任何給定的核定電場強度下，當(dāng)電解液濃度相對分析物種(蛋白質(zhì)、DNA等)降低，分析物將以更快的速率遷移。Issaq等，色譜，Vol32，#3/4，1991年8月(詳見157頁圖3)通過danysalted氨基酸已經(jīng)表現(xiàn)了證實了這一效應(yīng)的類似結(jié)果。在P.D.ROSS和R.L.Scruggs，生物聚合物，12卷，231-236頁，1964(詳見232頁圖1)表明在不同電解液中的DNA有證實此效應(yīng)的結(jié)果。
離子強度/電導(dǎo)關(guān)系-對涉及在溶液中完全溶解的陰離子和陽離子種類(Na+←---→Cl-，K+←---→Cl-等)非緩沖電解液(氯化鈉、氯化鉀等)，離子強度和電導(dǎo)是相當(dāng)?shù)?，即，電?dǎo)通常與離子強度成正比。對處于解離狀態(tài)(例如2Na+←---→PO4-2)的電解緩沖液(磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽等)，離子強度和電導(dǎo)通常是相當(dāng)?shù)?，即，電?dǎo)與離子強度成正比。(緩沖液已經(jīng)被定義為在添加酸或堿后抗pH變化的化學(xué)溶液。見，例如，生物技術(shù)詞典，第二版，James Coombs，Stockton Press。如書中所述，傳統(tǒng)的、基于無機鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、甘氨酸、馬來酸鹽、巴比妥酸鹽等被用于生物實驗中。)對于有兩性離子種類(在其pI無凈電荷)緩沖電解液[良好緩沖液(MOPS、HEPES、TAPS、麥黃酮、N-二[羥乙基]甘氨酸)、氨基酸緩沖液、兩性電解質(zhì)等]，在等電點(pI)和(pKa)之間的每個pH單位差異電導(dǎo)基本上將降低10倍。例如，在其兩性離子狀態(tài)(-OOC-CH(R)-NH3+)的氨基酸的電導(dǎo)值將比完全是凈正電荷(HCOOC-CH(R)-NH2+←---→X-)、或凈負電荷(Y+←---→-OOC-CH(R)-NH2)的“氨基酸部分”的電導(dǎo)低約1000倍。因此，當(dāng)它偏離pI，在氨基酸部分就形成形式上的負或正電荷，電導(dǎo)和離子強度之間就開始產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。然而，當(dāng)在或鄰近pI，電導(dǎo)將比給定離子強度或濃度所希望的更低。當(dāng)在或鄰近其pI使用，電泳的內(nèi)容就稱良好緩沖液和氨基酸緩沖液為“在高離子強度或濃度有低電導(dǎo)”(見“毛細管電泳原理和應(yīng)用”，R.Kuhn和S.Hoffstetter，Springer-Verlag，1993，88頁)。通常使用的電泳緩沖液“三羧甲基氨基甲烷-硼酸鹽”的確具有比從其離子強度或濃度所預(yù)計的顯著低的電導(dǎo)。這可能是由于“三羧甲基氨基甲烷陽離子”和“硼酸鹽陰離子”在溶液中形成相對穩(wěn)定的兩性復(fù)合物。測定100mM的三羧甲基氨基甲烷-硼酸鹽溶液的電導(dǎo)是694μS/cm，比從其離子強度預(yù)計的電導(dǎo)低約20倍，并大致相當(dāng)于5mM磷酸鹽或氯化鈉溶液。表1表示的是許多遷移緩沖液的電導(dǎo)測定值。
表1溶液/緩沖液測定值1 測定值2測定值3 平均/標(biāo)準偏差10mM MgCl21.95mS/cm 2.02mS/cm 2.13mS/cm2.03+/-0.09mS/cm1mM MgCl2174μS/cm 208μS/cm 177μS/cm186+/-18.8μS/cm0.1mM MgCl216.9μS/cm 16.7μS/cm18.3μS/cm 17.3+/-0.87μS/cm10mM NaCl 1.07mS/cm 1.10mS/cm 1.18mS/cm1.12+/-0.057mS/cm1mM NaCl 112μS/cm 115μS/cm 111μS/cm112.7+/-2.08μS/cm0.1mM NaCl8.80μS/cm 8.98μS/cm10.5μS/cm 9.43+/-0.93μS/cm10mM NaPO41.40mS/cm 1.44mS/cm 1.48mS/cm1.44+/-0.04mS/cm1mM NaPO4122μS/cm 128μS/cm 136μS/cm128.7+/-7.0μS/cm50mM TRIS 3.50mS/cm 3.14mS/cm 3.40mS/cm3.35+/-0.19mS/cm10mM TRIS 572μS/cm 562μS/cm 583μS/cm572+/-10.5μS/cm250mM HEPES 141μS/cm 144μS/cm 158μS/cm147.6+/-9.07μS/cm25mM HEPES9.16μS/cm 9.44μS/cm10.5μS/cm 9.7+/-0.71μS/cm3.3mM檸檬酸鈉 964μS/cm 964μS/cm 1.03μS/cm 986+/-38.1μS/cm5mM琥珀酸鈉 1.05mS/cm 960μS/cm 1.01mS/cm1.01+/-0.045mS/cm5mM草酸鈉 1.02mS/cm 1.03mS/cm 1.12mS/cm1.06+/-0.055mS/cm10mM乙酸鈉901μS/cm 917μS/cm 983μS/cm934+/-43.5μS/cm250mM半胱氨酸 27.4μS/cm 17.3μS/cm23.5μS/cm 22.7+/-5.09μS/cmMilli-Q水 ＜0.5μS/cm 0.1電解槽檢測范圍太低兩性離子緩沖液/電導(dǎo)/傳導(dǎo)速率-使用兩性緩沖液(良好緩沖液，氨基酸緩沖液)；或在或鄰近其pI的三羧甲基氨基甲烷-硼酸鹽緩沖液對電泳遷移DNA的速率或速度有一定的優(yōu)點。如1)這些緩沖液可以被以相對高的濃度使用來增加緩沖容量；2)在同樣的濃度電導(dǎo)顯著比其它種類的緩沖液低，3)能夠利用對靶分析物(DNA)較高的電泳遷移。
在等電點(pI)兩性離子緩沖液的能力-氨基酸緩沖液在其等電點的確具有緩沖的能力。由于給定的氨基酸在等電點可以或不可以具有其“最高緩沖能力”，所有它具有一定程度的緩沖能力。對于在pI和pKa之間的每一個pH單位，緩沖能力降低10倍；在其pI具有三個電離基團的氨基酸(組氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等)比只有兩個電解基團的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等)通常具有更高的緩沖能力。例如，組氨酸pI=7.47，賴氨酸pI=9.74，谷氨酸pI=3.22，在其等電點比在其等電點有相對低的緩沖能力的丙氨酸或甘氨酸有相對高的緩沖能力(見A.L.Lehninger，生物化學(xué)，第二版，Worth出版社，紐約，1975；尤見79頁圖4-8和80頁圖4-9)。見，例如美國專利4，936，963在凝膠電泳中建議組氨酸作為緩沖液，但是在這一系統(tǒng)中不進行雜交。半胱氨酸的緩沖能力處于較中間的位置。半胱氨酸的pI是5.02，α羧基的pKa是1.71，巰基的pKa是8.33，，α氨基的pKa是10.78。250mM的半胱氨酸的酸堿滴定曲線表明半胱氨酸在～pH5比20mM的磷酸鈉具有較好的“緩沖能力”。在pH4到6的范圍，半胱氨酸的緩沖能力比20mM的磷酸鈉的顯著高，尤其在較高的pH下更是如此。然而，在這些pH范圍250mM的半胱氨酸的電導(dǎo)非常低～23μs/cm，同20mM磷酸鈉的電導(dǎo)值為～2.9mS/cm相比大于100倍。
在過去20年發(fā)展的幾種電泳技術(shù)是基于兩性離子緩沖液在“其等電點”分離蛋白質(zhì)的能力，這些技術(shù)被稱為等電電泳，等速電泳，和等電聚焦(見“蛋白質(zhì)凝膠電泳”，B.DV。Hames & D.Rickwood，IRL出版社，1981，見第3和4章)。各種氨基酸緩沖液和良好緩沖液都在其pI用于這些應(yīng)用(見表2，上面所述的參考文獻的168頁)。
I.基本裝置的設(shè)計和制造為了使裝置能進行多步和多路反應(yīng)，其電子元件必須在水溶液中保持主動操作。為了滿足這一要求，每一個微定位區(qū)必須有一個底層可控制和起作用的DC模式微定位區(qū)。然而，在活性DC電極表面發(fā)生的結(jié)合和親和反應(yīng)不能被電解反應(yīng)所抑制對裝置的性能，尤其是敏感性(信噪比)是很重要的。除了直接與電極表面接觸的所有敏感試劑和分析物(DNA、RNA、蛋白質(zhì)等)發(fā)生的破壞作用外，電極產(chǎn)生的電解產(chǎn)物，包括酸(H+)、堿(OH-)、氫、氧和各種自由基類也能夠破壞敏感成分。設(shè)計和制造裝置的其它考慮包括、但不限于材料的兼容性、特異性的結(jié)合體的特性以及隨后的反應(yīng)物和分析物，和微定位區(qū)的數(shù)目。
“可控制和起作用的DC模式微電極”意思是偏置的正或負微電極，以直流電模式操作(或者是連續(xù)的或者是脈沖的或DC/AC的)，能以可控制的方式影響或引起帶電特異性結(jié)合體、反應(yīng)物、或分析物自由場電泳遷移到或離開裝置上的任何定位區(qū)或，或離開樣品溶液。
在本發(fā)明的范圍，分子的自由場電泳遷移并不真正取決于被絕緣材料限制或界定的所產(chǎn)生的電場。傳統(tǒng)的電泳分離技術(shù)需要用絕緣(不傳導(dǎo)的)材料限制或界定電場線。在自由場電遷移的情況下，帶電分子從一個微定位區(qū)遷移到另一個微定位區(qū)，或從主體溶液遷移到特定的微定位區(qū)。因此，對本發(fā)明的這一方面來說不需要用特定安置或限制絕緣材料。然而，微定位區(qū)測試位點的局限區(qū)允許產(chǎn)生高的電流強度，這對實現(xiàn)去雜交合適的電嚴緊性是必需的；也提供了從主體溶液濃縮靶DNA序列的焦點。
可以設(shè)計小到只有兩個尋址微定位區(qū)的裝置，或多達成百上千個微定位區(qū)的裝置。一般地，使用微光刻技術(shù)或結(jié)合微制造和微加工技術(shù)制造有大量微定位區(qū)的復(fù)合裝置。制造在硅或其他合適的基質(zhì)材料例如玻璃、二氧化硅、塑料、絕緣的金屬或陶瓷材料上進行。
這些微定位區(qū)“芯片”設(shè)計被認為是大規(guī)模陣列或多路分析裝置。使用微加工技術(shù)可以制造少量的微定位區(qū)的裝置或微定位區(qū)。
尋址微定位區(qū)可以是任何形狀的，優(yōu)選是圓形、方形或矩形的。尋址微定位區(qū)的大小可以是任何大小的，優(yōu)選從亞微米(～0.5μm)到幾厘米(cm)，對用微光刻技術(shù)制造的裝置5μm到100μm是最優(yōu)選的尺寸范圍，對用微加工技術(shù)制造的裝置100μm到10毫米是最優(yōu)選的。要制造小于微光刻方法分辨力的微定位區(qū)，將需要例如電子束光刻、離子束光刻或分子束外延(生長)方法。對分析和診斷性應(yīng)用需要顯微定位區(qū)，對例如，但不限于制備規(guī)模的生物聚合物合成，樣品制備，試劑的電分配需要較大的尋址定位區(qū)或宏定位區(qū)(例如大于5mm)。
在使用微光刻和/或微加工技術(shù)制造微定位區(qū)后，利用化學(xué)修飾]聚合反應(yīng)、旋涂或甚至其它微光刻制造技術(shù)來制造特定的附著和滲透層。這些重要的層把結(jié)合體從電極的金屬表面分離開。這些重要的結(jié)構(gòu)允許在每一微定位區(qū)表面下的DC模式微電極(1)影響或引起特定的(帶電)結(jié)合體從一個微定位區(qū)表面自由場電泳遷移到另一個微定位區(qū)的表面，或從主體溶液遷移到特定的微定位區(qū)；(2)濃縮或共價附著特定的結(jié)合體到特定的微定位區(qū)的特別修飾的表面上；(3)在特定結(jié)合體附著后以DC模式主動起作用，這樣其他反應(yīng)物和分析物就可以以可控制的方式遷移到微定位區(qū)或從微定位區(qū)遷移出來；(4)不可逆影響與電化學(xué)反應(yīng)和產(chǎn)物的結(jié)合或親和反應(yīng)。
ⅰ(a)設(shè)計參數(shù)(微光刻技術(shù))圖1示出的是使用微光刻技術(shù)制造自尋址微定位區(qū)的基本設(shè)計。在沉積在絕緣層/基底材料金屬位點上形成三個微定位區(qū)(10)(ML-1，ML-2，ML-3)金屬位點(12)起到微電極結(jié)構(gòu)(10)底層的作用。電極材料包括但不限于鋁、銅、碳、鐵、銀、金、鈀、鉑、和氧化銦錫。絕緣材料把金屬位點(12)彼此分割開來。絕緣體材料包括，但不限于，二氧化硅、氮化硅、玻璃、保護層、聚酰亞胺、橡膠或陶瓷材料。
圖2示出的是在微光刻產(chǎn)生的金屬位點上形成的單個微定位區(qū)(10)。在金屬位點(12)上形成尋址微定位區(qū)，并結(jié)合有一層氧化層(在容易產(chǎn)生氧化物的鋁或其它金屬的情況下使用)20，滲透層(22)，和附著層(24)，和結(jié)合體層(26)。
在金屬如鋁的情況下，金屬氧化物層提供滲透層共價耦聯(lián)的基底。金屬氧化物和羥基基團(或者是單獨使用或者是結(jié)合使用)，和本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它表面涂層化學(xué)材料可以提供共價位點，構(gòu)成或固定滲透層。并不絕對要求滲透層的確與金屬電極表面共價附著。滲透材料的物理重疊代表一種在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)可選的方法。在金屬是如鉑和金的情況下，滲透層可以是物理重疊的。
滲透層提供在金屬表面和附著‘結(jié)合體層之間的空隙，并允許溶劑分子、小的反離子和電泳反應(yīng)氣體自由通到金屬表面并從金屬表面通過?？梢栽跐B透層中包括能降低電泳反應(yīng)的不利物理化學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，包括，但不限于氧化還原反應(yīng)捕集物質(zhì)，例如，捕集H2的鉑和捕集O2和過氧化物的鐵復(fù)合物。另外，滲透層可以包括有助于保持DNA雜交穩(wěn)定性的化合物和物質(zhì)；這些包括，但不限于組氨酸、組氨酸肽、聚組氨酸、賴氨酸、賴氨酸肽和其他陰離子化合物或物質(zhì)。用于光刻產(chǎn)生裝置的滲透層的厚度范圍從約1納米(nm)到100微米(μm)，最優(yōu)選是2nm到10μmn。滲透層材料包括，但不限于金屬氧化物、膜、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、水凝膠、溶膠-凝膠、多孔玻璃、多孔硅、交聯(lián)聚合物等。
附著層提供結(jié)合體共價結(jié)合的基底。光刻產(chǎn)生的裝置的附著層的厚度范圍從0.5到5μm，最優(yōu)選為1nm到500nm。在某些情況下，可以用相同的材料形成滲透和附著層。可以進一步活化耦聯(lián)結(jié)合體的某些滲透層材料包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
特異性結(jié)合體共價或親和耦聯(lián)到附著層上，形成特異性結(jié)合體層。例如，可以將抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合到滲透層中，提供生物素衍生的DNA探針的親和結(jié)合位點。理想地，特異性結(jié)合體層通常是單層特異性分子。然而，在某些情況下，結(jié)合體層可以有幾個或甚至許多層的結(jié)合分子。
滲透和附著層的某些設(shè)計和功能方面是由特異性結(jié)合體分子的物理(例如，大小和)化學(xué)特性支配的。一定程度上它們還受反應(yīng)物和分析物分子的化學(xué)特性的支配，這些反應(yīng)物和分析物分子隨后被遷移和結(jié)合到微定位區(qū)。例如，寡核苷酸結(jié)合體可以附著到一種微定位區(qū)的表面，而不引起DC模式功能的損失，即，底層的微定位區(qū)仍可以引起分析物分子的迅速自由場電泳遷移到寡核苷酸結(jié)合體附著的表面或遠離表面。然而，如果大的球蛋白結(jié)合體(例如，抗體)被附著到同樣的表面，它們可以使表面絕緣，并引起DC模式功能的降低或完全喪失。這就必須適當(dāng)?shù)匦揎椄街鴮右曰蛘呓档痛蠼Y(jié)合體(例如，大的球蛋白)的數(shù)量或者在表面上的結(jié)合體之間提供間距。
微定位區(qū)之間的間距是由制造的容易程度、在微定位區(qū)之間的檢測分辨力的需要，以及在裝置上的微定位區(qū)的數(shù)目決定的。然而，對裝置的功能而言特定的微定位區(qū)間隔，或微定位區(qū)的特定排列或幾何形狀是不必的，微定位區(qū)的任何組合(即，底層的微電極)可以在整個裝置表面面積上進行。另外也不需要包封裝置或完全用介電或絕緣屏障限制微定位區(qū)。這是因為復(fù)合電場模式或介電邊界對選擇移動、分離、保留、定向在任何電極之間的空間或介質(zhì)中的特定分子是不需要的。裝置是通過把特異性結(jié)合分子，然后是分析物和反應(yīng)物附著到尋址微定位區(qū)的表面來實現(xiàn)的。自由場電泳推力使得在裝置任何和所有微定位區(qū)的所有帶電分子迅速和直接遷移；或從主體溶液遷移到微定位區(qū)。然而，應(yīng)當(dāng)指出的是，可以將裝置包封以容納液體或防止生物危害。
當(dāng)微定位區(qū)的數(shù)目超過幾百個，微定位區(qū)底層的電路就變得復(fù)雜。在這種情況下就不得不改變微定位區(qū)編組模式并按比例增加間隔距離，或用多層電路制成裝置，即，將晶體管和半導(dǎo)體控制元件直接結(jié)合到硅上。
除了已經(jīng)被特異性結(jié)合體尋址的微定位區(qū)外，裝置還可以含有非分析性微定位區(qū)和起到其他作用的宏定位區(qū)。這些微定位區(qū)或宏定位區(qū)可以用來儲存試劑、暫時容納反應(yīng)物、分析物或細胞；并作為樣品(例如，試劑配制和樣品制備系統(tǒng))中過量反應(yīng)物、分析物或其他干擾成分的處理單位?？梢园褜ぶ肺⒍ㄎ粎^(qū)和其他的非-尋址微定位區(qū)結(jié)合使用影響或作用在這些特異性微定位區(qū)發(fā)生的反應(yīng)。這些微定位區(qū)增加了裝置間或裝置內(nèi)活性和控制。例如，環(huán)繞檢測位點微定位區(qū)矩陣的微定位區(qū)周界(有底層微電極)可以用作反電極以包容更大體積的檢測溶液。另外，對微定位區(qū)來說也可以使兩個單獨的裝置之間的分子相互作用和遷移。這就提供了一種用來加載具有從儲存裝置來的結(jié)合體或反應(yīng)物的工作裝置、用來制備樣品和拷貝或復(fù)制裝置的機制。
圖3示出的是含有64個尋址微定位區(qū)(30)的矩陣型裝置。64微定位區(qū)裝置是常規(guī)的設(shè)計，與標(biāo)準的微電子包裝部件配合。這種裝置在約1.5cm×1.5cm的硅芯片上制造，有一個含64微定位區(qū)的約75μm×75μm的中央?yún)^(qū)。每個微定位區(qū)(32)約50平方μm，鄰近的微定位區(qū)之間的間隔為50μm。每一單個的底層微電極的連接電路接到外圍(10mm×10mm)的金屬連接墊片(300平方μm)(34)上。在微定位區(qū)和連接墊片之間的區(qū)域可以形成凸起的內(nèi)周，產(chǎn)生能容納約2到10微升(μl)的樣品溶液?！靶酒笨梢园惭b在標(biāo)準的方型包裝內(nèi)，芯片連接墊片(34)接線到方型包裝引線上。系統(tǒng)中可以含多個芯片和另外的包裝和鄰近的元件以設(shè)計來解決與臨床診斷，即，樣品材料的添加、流體的傳遞和包含生物危害材料相關(guān)的問題。然后可以把包裝的芯片插到微處理器控制的DC能量供應(yīng)和可以控制和操作該裝置的萬用設(shè)備中。本發(fā)明認為裝置的生產(chǎn)(在尋址前)基本上是涉及結(jié)合三個基本的元件，這三個元件基本上是夾在一起。結(jié)合體要附著的基本芯片在中間位置；樣品或流體包含元件在板上頂部退火，控制元件將退火到基本芯片裝置的底部。這一策略解決了與制造技術(shù)和材料兼容性有關(guān)的許多問題。
Ⅰ(b)微光刻制造步驟Ⅰ(b)(1)制造步驟通用的微光刻或光刻技術(shù)都可以用來制造大量較小的微定位區(qū)的復(fù)合“芯片”型裝置。盡管裝置的制備不需要復(fù)雜的光刻技術(shù)時，但是的確還需要特別地考慮材料的選擇和電子裝置在水溶液中積極起作用的需要。
圖3所示的64微定位區(qū)裝置(30)可以使用相對簡單的掩膜設(shè)計和標(biāo)準的微光刻技術(shù)來制造。一般地，基片材料是1到2平方厘米的硅基片或厚約0.5毫米的芯片。硅芯片首先包涂上1到2微米厚的二氧化硅(SiO2)絕緣層，這是用等離子增強化學(xué)蒸氣沉淀(PECVD)涂布的。
下一步，用真空蒸發(fā)沉積0.2到0.5微米的金屬層(例如鋁)。也可以通過濺射技術(shù)沉積金屬。除了鋁之外，電路的合適金屬和材料包括金、銀、錫、鈦、銅、鉑、鈀、多晶硅、碳和各種金屬的組合。使用了特定的技術(shù)以確保絕緣基片材料(SiO2)與各種金屬適當(dāng)粘合在一起。裝置的不同的導(dǎo)電元件可以使用不同的金屬和其它材料，例如，使用鋁作周邊的連接墊片，多晶硅作中間連接電路，和貴重金屬(金或鉑)作微電極。芯片接著被涂布上正光刻膠(Shipley，Microposit AZ 1350 J)，掩蓋(光場)有電路圖案，曝光和顯影。去除光熔性抗蝕劑，曝光的鋁就被腐蝕掉。去除了抗蝕島，在芯片上留下鋁電路圖案。這就包括金屬連接墊片外周、導(dǎo)電電路(電線)，和起到尋址微定位區(qū)底層作用的微電極的中央陣列。
使用PECVD，芯片被首先包涂上一層0.2到0.4微米的SiO2，然后被包涂上一層0.1到0.2微米的氮化硅(Si3N4)。然后芯片被涂上一層正光刻膠，光刻膠掩蓋連接墊片和微電極定位區(qū)，曝光、顯影。去除光熔性抗蝕劑，腐蝕掉SiO2和Si3N4層，露出鋁連接墊片和微電極。然后去除抗蝕島，在連接墊片和微電極之間的連接電線通過SiO2和Si3N4層保持絕緣。
SiO2和Si3N4層為裝置提供了重要特性。第二SiO2層提供了較好的接觸，并改善了鋁電路之間的密封性。也可以使用抗蝕劑材料絕緣和密封。這就防止在微電極操作時由于電解效應(yīng)對電路的破壞。使用Si3N4作最后的表面層，因為它與用來修飾附特定結(jié)合體的微電極表面隨后試劑的反應(yīng)性很低。
Ⅰ(b)(2)滲透層和附著層形成步驟這時裝置上的微電極就準備好被特定的滲透層和附著層修飾。這是本發(fā)明的一個重要方面。目標(biāo)是在微電極上產(chǎn)生一個具有選擇擴散特性的中間滲透層和最佳的結(jié)合特性的附著表面。
附著層最好每平方微米具有105到107官能化的定位區(qū)以附著特定的結(jié)合體。特定結(jié)合體的附著不應(yīng)包涂或絕緣表面以避免底層電極不起作用。起作用的裝置需要一定比率(～5％到25％)的實際金屬微電極表面以使溶劑(H2O)分子容易接近，并允許產(chǎn)生反離子(例如Na+和Cl-)和電解氣體(例如，O2和H2)擴散。
中間滲透層也被設(shè)計來允許擴散發(fā)生。另外，滲透層應(yīng)當(dāng)有孔徑限制特性，抑制或阻止較大的結(jié)合體、反應(yīng)物和分析物物理接觸到微電極表面。滲透層保持活性微電極表面物理上不同于微定位區(qū)的結(jié)合體層。
這一設(shè)計允許電泳遷移所需的電泳反應(yīng)在微惦記表面上發(fā)生，但是避免了對結(jié)合體、反應(yīng)物和分析物不利的電化學(xué)效應(yīng)。滲透層也可以被設(shè)計來包括清除在電泳反應(yīng)中產(chǎn)生的不利物質(zhì)(O2、H2、自由基等)的物質(zhì)?？梢栽跐B透層設(shè)計一個下層以達到此目的。
多種設(shè)計和技術(shù)可以用來生產(chǎn)滲透層。通常的設(shè)計包括(1)“草坪式”，(2)“網(wǎng)式”和(3)“多孔”結(jié)構(gòu)。
草坪式滲透層涉及以一層厚草的方式排列垂直于金屬表面的線型分子或聚合。這些結(jié)構(gòu)可以通過直接向金屬表面附著線型或聚合親水分子形成，在垂直結(jié)構(gòu)中有最小的交聯(lián)。理想地這些親水線型分子是雙功能的，一個末端適合于共價附著到金屬墊片上，另一個末端適合于共價附著結(jié)合體。
網(wǎng)式滲透層涉及隨機排列聚合物分子，形成平均孔徑由交聯(lián)度決定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可以通過水凝膠型材料例如，但不限于聚丙烯酰胺、瓊脂糖和各種其他生物和非生物可以聚合和交聯(lián)的材料形成。這些材料可以被旋涂到矩陣表面上。
多孔型滲透層涉及對金屬墊片使用可以在涂層上表面直接形成通道或孔的材料，這些材料包括，但不限于聚碳酸酯、聚砜或玻璃材料。在所有的情況下滲透層都必須確保物理或化學(xué)結(jié)合在金屬表面上，并必須含官能基團或能被官能化以把結(jié)合體附著到其表面上。
生產(chǎn)草坪式結(jié)構(gòu)的一個優(yōu)選的方法涉及使用氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)的金屬微電極表面的衍生。APS很容易與金屬和硅片表面上的氧化物和或羥基反應(yīng)。APS提供結(jié)合的具有用于隨后共價耦聯(lián)結(jié)合體的伯胺基團的滲透層和附著層。至于表面結(jié)合位點，APS在稍微氧化的鋁表面產(chǎn)生相對高水平的官能化(即，大量伯胺基團)，在SiO2上產(chǎn)生中間水平的官能化，在Si3N4表面上產(chǎn)生非常有限的官能化。
用10％的APS甲苯溶液在50℃處理整個裝置(例如芯片)30分鐘進行APS反應(yīng)。然后在甲苯、乙醇中洗滌，然后在50℃下干燥一小時，微電極表面被大量的伯胺基團(每平方微米105到106)官能化。這時結(jié)合體就可以共價結(jié)合到衍生的微電極表面?？梢允褂镁垩趸蚁╇p(胺)，雙(聚氧化乙烯雙(胺))和其它的聚乙二醇類或類似化合物增加這一“草坪式”滲透層的厚度。
APS方法對寡核苷酸結(jié)合體的附著很有效。圖4示出的是3’-末端醛衍生的寡核苷酸(40)附著到APS官能化的表面(42)的機制。而這只是多種方法中的一種，各種形成滲透層和附著層的其他方法都是可能的。這就包括基極自身使用自-導(dǎo)向的尋址以(1)通過電鍍到基片微電極上形成第二金屬層；(2)通過電聚合在微電極定位區(qū)形成聚合物層；或(3)通過自由場電泳方法遷移聚合物和試劑到微電極表面以形成隨后的滲透和附著層，或(4)通過旋涂材料(水凝膠、瓊脂糖、丙烯酰胺等)到陣列表面產(chǎn)生聚合物層。
Ⅰ(c)微加工的裝置的設(shè)計和制造這一部分描述怎樣使用微加工技術(shù)(例如，鉆孔、磨制)或非-光刻技術(shù)制造裝置。一般地，這些裝置比微光刻產(chǎn)生的裝置有較多的微定位區(qū)(＞100微米)。這些裝置可以用于分析，以及用于制備型應(yīng)用，例如生物聚合物合成，樣品制備，試劑配制、儲存部位及廢物處理。可以以三維模式(例如，管或圓柱體)制造大量的尋址定位以攜帶大量的結(jié)合體。這種裝置可以使用各種材料包括，但不限于塑料、橡膠、硅、玻璃(例如，微開槽的，毛細管等)或陶瓷制造。低熒光材料對于分析應(yīng)用是更理想的。在微-加工裝置的情況下，可以使用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)人員已知的標(biāo)準電路板印刷技術(shù)把連接電路和較大的電極結(jié)構(gòu)印刷到材料上。
尋址微定位區(qū)裝置可以使用微加工技術(shù)相對容易地制造出來。圖5是代表96孔微定位區(qū)裝置的示意圖。這一微定位區(qū)裝置由合適的原材料(2cm×4×1cm)制造，在材料上鉆96個相稱的排列的孔(直徑1mm)。在薄片塑料原材料上形成電極電路板(52)，在微定位區(qū)元件(54)頂部精確配合。電路板的下面包括連接到每一個微定位區(qū)(55)的單根電線(印刷電路)。設(shè)計了短鉑電極結(jié)構(gòu)(～3-4mm)(62)延伸到各個微定位區(qū)室(57)中。印刷電路線被包涂有一層合適的防水絕緣物質(zhì)。印刷電路線會聚到插口，插口允許連接到多路開關(guān)控制器(56)和直流電源(58)上。裝置在共同的緩沖液容器中部分浸漬和操作。
盡管由微加工和微光刻技術(shù)制造的裝置的主要功能相同，但他們的設(shè)計可以不同。在微光刻技術(shù)制造的裝置中，滲透層和附著層直接在底層的金屬微電極上形成。在微加工技術(shù)制造的裝置中，滲透層和附著層可以被在單個室或儲存器(57)中的緩沖液從其單個金屬電極結(jié)構(gòu)(62)上物理分離開(見圖6)。在微加工裝置中，可以使用相同的官能化親水凝膠、膜、或其他合適的多孔材料形成滲透層忽然附著層。
一般地，滲透層和附著層的總厚度范圍從10μm到30μm。例如，可以用20％到30％的聚丙烯酰胺(0.1％聚賴氨酸)修飾親水凝膠部分填充(～0.5mm)裝置的各個微定位區(qū)室。這些濃度的凝膠形成孔徑范圍從2nm到10nm的理想的滲透層。加進凝膠的聚賴氨酸提供隨后附著特異性結(jié)合體的伯胺官能基團。這種凝膠滲透層允許電極以DC模式積極起作用。當(dāng)電極被啟動，凝膠滲透層就允許小的反離子通過，但較大的特異性結(jié)合體分子就濃縮在外表面上。因此它們就共價結(jié)合到伯胺外層，有效地成為附著層。
形成滲透層和附著層的另外技術(shù)是把多孔膜材料加進各個微定位區(qū)室的底層。然后用化學(xué)官能基團衍生膜的外表面以形成附著層。進行這一方法的合適的技術(shù)和材料對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的。
上面關(guān)于設(shè)計和制造光刻和微加工裝置的描述不應(yīng)被認為是限制了基本裝置的其他變型或形式。許多具有用較大或較小尋址微定位區(qū)元件或其結(jié)合的裝置變型可以用于不同的分析和制備應(yīng)用。具有較大的尋址定位區(qū)的裝置變型可以被設(shè)計來制備生物聚合物合成應(yīng)用，樣品制備、細胞分級系統(tǒng)、原位雜交、試劑的配制、強儲存系統(tǒng)和廢物處理系統(tǒng)。
Ⅱ.裝置的自導(dǎo)向?qū)ぶ繁景l(fā)明的裝置能夠用特異性結(jié)合體電自尋址每一微定位區(qū)。裝置自身直接影響或引起帶電特異性結(jié)合體遷移到特異性的微定位區(qū)上。結(jié)合體通常被官能化以使他們易于反應(yīng)或共價結(jié)合到附著層上。裝置能夠自尋址其意義在于在特異性微定位區(qū)不需外部步驟、機制或裝置物理導(dǎo)向、定位或安置特定結(jié)合體。自尋址方法既迅速和特異性，又能夠以連續(xù)或平行方式進行。
通過維持所選微定位區(qū)處于DC模式和特異性結(jié)合體相反的電荷(電勢)可以使裝置連續(xù)被特異性結(jié)合體尋址。如果結(jié)合體具有凈負電荷，那么結(jié)合體要遷移的微定位區(qū)就偏壓到正電荷。反之，充有負電的微定位區(qū)將被用來遷移帶正電的結(jié)合體。在連續(xù)的尋址方法中偏壓其他的微定位區(qū)的選項包括使所有的其他微定位區(qū)偏壓處于相反的電荷(與要尋址的微定位區(qū)的電荷相反)；使有限組的微定位區(qū)偏壓到相反電荷；或只使一個微定位區(qū)(或其他電極)處于在相反的電荷。在某些情況下，需要使一個或多個微定位區(qū)強烈偏壓為相反電荷，而其他組的微定位區(qū)只是微弱偏壓。這一方法使得先前尋址的微定位區(qū)在在尋址剩下的微定位區(qū)時受到保護。在結(jié)合體不過量于微定位區(qū)附著點的的情況下，有必要只啟動一個其他的微電極以影響自由場電泳遷移到微定位區(qū)。特異性結(jié)合體可以迅速通過主體溶液，并直接在特異性微定位區(qū)濃縮，其中他們與附著層的特異性表面共價結(jié)合。遷移速率取決于結(jié)合體的大小和電荷，以及在微定位區(qū)之間所使用的電壓或電流。一般地，遷移速率可以從幾秒到幾分鐘，在一個特異性微定位區(qū)上電濃縮結(jié)合體、反應(yīng)物或分析物(70)的能力見圖7a和7b。所有其他的微定位區(qū)都可以被保護并在特異性結(jié)合體尋址的過程中保持不受影響。所有未反應(yīng)的結(jié)合體都通過顛倒特異性微定位區(qū)的極性，并電泳到處理定位區(qū)而去除。重復(fù)這一循環(huán)知道所有所需的微定位區(qū)都被其特異性結(jié)合體尋址。圖8a到圖8b示出的是用特異性的寡核苷酸結(jié)合體(82，84，86)尋址特異性微定位區(qū)的連續(xù)步驟。能夠自尋址裝置的顯著優(yōu)點，引起儀器系統(tǒng)的發(fā)展，允許APEX芯片裝置被DNA或RNA探針，或其他配基尋址。這種“制造你自己的芯片”的儀器包括一個平臺以固定或安裝芯片或包裝芯片元件；提供電連接和控制以控制在芯片的每一定位的電壓以控制電流；提供流體或電傳送系統(tǒng)以向芯片提供探針序列；以及微處理器單元控制整個系統(tǒng)。這一系統(tǒng)將允許“制造你自己的芯片”產(chǎn)品和應(yīng)用。這中產(chǎn)品和應(yīng)用將對許多臨床診斷、分子生物學(xué)、官能幾何和藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用的研究者和終端擁護是有用的。
尋址微定位區(qū)的平行步驟涉及同時啟動多個微定位區(qū)(特定的一組)這樣遷移、濃縮相同的特異性結(jié)合體，并與多個微定位區(qū)反應(yīng)。隨后的平行步驟類似于連續(xù)方法。
Ⅲ.裝置的應(yīng)用一旦裝置被特異性結(jié)合體自尋址，可以在裝置上進行各種分子生物學(xué)類型的多步和多路反應(yīng)。本發(fā)明的裝置能夠為許多重要的反應(yīng)參數(shù)電提供主動和動力學(xué)控制。這一電控制導(dǎo)致控制反應(yīng)的新物理機制，并顯著提高反應(yīng)速率、特異性和敏感性。這些參數(shù)的改善來自裝置裝置能電控制和直接影響裝置的能力(1)迅速把反應(yīng)物或分析物遷移到含附著特異性結(jié)合體的特異性微定位區(qū)；(2)由于反應(yīng)物或分析物與特異性結(jié)合體在特異性微定位區(qū)表面濃縮增高了反應(yīng)速率；(3)從微定位區(qū)迅速或選擇去除未反應(yīng)的和未特異性結(jié)合的成分；和(4)優(yōu)化結(jié)合條件的嚴緊性。
本發(fā)明的自尋址裝置能夠迅速進行各種微形成多步和/或多路反應(yīng)和步驟，包括，但不限于傳統(tǒng)型式的DNA和RNA雜交步驟和分析；例如，附著靶DNA/探針DNA，附著探針DNA/靶DNA，附著俘獲的DNA/靶DNA/探針DNA；以連續(xù)和平行的方式進行多步或多路雜交反應(yīng)；限制性片段和通常的DNA/RNA片段大小分析；STR分析，SNP分析；分子生物學(xué)反應(yīng)，例如，限制性酶反應(yīng)和分析，連接酶反應(yīng)激酶反應(yīng)，和DNA/RNA擴增；涉及大或小抗原和半抗原的抗體/抗原反應(yīng)；診斷分析，例如，雜交分析(包括原位雜交)、基因分析、DNA指紋識別，法醫(yī)應(yīng)用和免疫分析；生物分子共軛方法(即，核酸、酶、蛋白質(zhì)、或有報告基團的抗體的共價和非共價標(biāo)記，包括熒光、化學(xué)發(fā)光、比色和放射形同位素標(biāo)記)；生物聚合反應(yīng)，例如，寡核苷酸或多肽的復(fù)合合成；水溶性合成聚合物合成，例如，碳水化合物或線性聚丙烯酸酯；以及大分子和毫微結(jié)構(gòu)(毫微大小的微粒和結(jié)構(gòu))合成和制造。
Ⅲ(a)核酸雜交由于其在診斷中的重要性，而且因為他們的特征在于是較困難類型的結(jié)合(親和)反應(yīng)之一，核酸雜交被用作本發(fā)明的主要實施例。當(dāng)他們在多路型式中進行時尤其是這樣，每一個的雜交反應(yīng)都需要不同的嚴緊條件。
本裝置和方法允許核酸雜交以多種常規(guī)的和新型式進行。本裝置能電控制參數(shù)的能力顯著改善了核酸雜交分析，尤其是裝置能對陣列上每一單個的微定位區(qū)提供電嚴緊控制(ESC)。這就基本上允許每一單個雜交反映在共同的陣列上進行，就如單個試管分析一樣。
術(shù)語“核酸雜交”意思包括所有天然和合成形式和衍生的核酸的雜交反應(yīng)，包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、聚核苷酸和寡核苷酸、肽核酸等。
常規(guī)的雜交型式，例如“點漬法”雜交和“夾層”雜交，都可以本公開的裝置和大規(guī)模陣列或矩陣型式進行。
例如，以下面的方式設(shè)計、制造和使用一個用于DNA雜交的APEX裝置。首先使用微光刻(或微加工)技術(shù)制造微定位區(qū)陣列。在矩陣上的可尋址微定位區(qū)的數(shù)目取決于最終用途。裝置以連續(xù)方式與一組特異性的寡核苷酸迅速自尋址。在這種情況下，特異性的寡核苷酸是6-聚體到100-聚體的3’-端醛官能化的寡核苷酸，如果需要的話可以附著較大的聚核苷酸。醛功能基團允許共價附著到特異性微定位區(qū)附著表面(見圖4)。這組特異性的寡核苷酸易于使用傳統(tǒng)的技術(shù)在常規(guī)的DNA合成儀上合成。每一特異性的寡核苷酸的合成是從核苷酸控孔玻璃載體觸發(fā)的。因此，3’-端位置包括核苷酸，其在合成和純化后通過高碘酸氧化反應(yīng)容易轉(zhuǎn)化成末端雙醛衍生物。含醛寡核苷酸(40)通過席夫氏堿反應(yīng)過程將容易與微定位區(qū)表面上的伯胺官能基團反應(yīng)。
裝置與特異性寡核苷酸的電尋址如圖8a到8d所示。通過維持特異性微電極(ML-1)處于正DC電勢，同時所有其他微電極保持在負電勢(圖8(A))，完成第一特異性微定位區(qū)(ML-1)(81)與其特異性寡核苷酸系列(SSO-1)(82)的尋址。在含水緩沖液中的醛官能化的特異性序列(SSO-1)自由場電泳到ML-地址，在那里它濃縮(＞106倍)并立即共價連接到ML-1(81)的表面。所有的其他微電極都保持負電，保護或屏蔽它們不與SSO-1序列反應(yīng)。然后ML-1電勢顛倒為負電(-)以使所有未反應(yīng)的SSO-1電泳到處理系統(tǒng)。重復(fù)這一循環(huán)，SSO-2(84)--→ML-2(83)，SSO-3(86)--→ML-3(85)，SSO-n--→ML-n，直到所有所需的微定位區(qū)都被其特異性DNA序列尋址(圖8(D))。
另外一種尋址該裝置的方法是遷移特異性結(jié)合體例如從電試劑供應(yīng)裝置來的特異性寡核苷酸。這一供應(yīng)裝置將保留大量的結(jié)合體或試劑，并將用來裝載分析裝置。結(jié)合體將電遷移到兩裝置之間。這一系統(tǒng)消除了物理操作例如微-吸取的需要，以及在裝置內(nèi)或之間復(fù)雜的流體傳送系統(tǒng)的需要。
另外尋址裝置的另一方法是在特異性的微定位區(qū)進行特異性寡核苷酸的復(fù)合合成。復(fù)合合成將在下一部分描述。在裝置被特異性的DNA序列尋址后，在陣列裝置上微定位區(qū)下的微電極保持為獨立的工作直流(DC)電極很重要。這是可能的，因為到電極表面附著的進行是在底層的微電極沒有化學(xué)或物理絕緣的方式下進行的。每一微電極始終能夠產(chǎn)生其他帶電DNA分子自由場電泳遷移到微定位區(qū)表面所需的較強電流。因此，DNA陣列裝置為所有的DNA雜交和任何隨后的反應(yīng)提供了電控制。
電控制雜交方法的一個例子如圖9a到9c所示。在這種情況下，每一個尋址的微定位區(qū)都有一個特異性的俘獲序列(90)。將含靶DNA(92)的樣品應(yīng)用到裝置中。所有的微定位區(qū)都被啟動，樣品DNA在微定位區(qū)濃縮(圖9(B))。稀釋溶液的拔DNA分子就高度高度濃縮在微定位區(qū)，使得迅速雜交到表面上的特異性的互補DNA序列。顛倒微電極電勢從微定位區(qū)排斥所有未雜交的DNA，而靶DNA保持雜交(圖9(C))。以類似的方式，在隨后的步驟雜交報告探針以檢測雜交的復(fù)合體。
雜交過程的電控制通過增強總雜交效率和從微定位區(qū)面積去除非雜交DNA改善了靶DNA分子隨后的檢測。預(yù)計在未擴增的基因組DNA中10，000到100，000拷貝的靶序列將是可檢測的。這種類型的雜交反應(yīng)可以在低于探針的Tm等溫條件下在幾分鐘或之內(nèi)并且以最小的外部操作(即，降低常規(guī)洗滌步驟，在某些情況下是完全消除)進行。
DNA雜交檢測的另一常見形式涉及使靶DNA固定化在表面上，然后雜交特異性探針到這些靶DNA上。這一型式還涉及在多定位點相同的靶DNA，或在特異性定位區(qū)的靶DNA。從圖10a和10b可以看出，這一連續(xù)雜交型式的改善形式。在這一情況下，微定位區(qū)(101-107)被不同的俘獲DNA尋址。它們與不同序列的特定寡核苷酸(108，109)雜交。微定位區(qū)隨后偏壓為正以遷移分子到其自身，然后偏壓為負以把靶分子遷移到另一個微定位區(qū)。在合適的電極電勢下，特異性雜交的DNA探針被遷移到另一個微定位區(qū)。序列特異性寡核苷酸探針可以用合適的報告基團例如熒光標(biāo)記。公開的裝置能提供電嚴緊控制。嚴緊控制地雜交特異性是必須的，并對解決點突變中單堿基錯配是尤其重要的。圖11a到11c示出的是電嚴緊控制是怎樣用于單堿基錯配分析。電嚴緊控制也能夠應(yīng)用于多堿基錯配分析。在圖11(A)中正確匹配的DNA雜交(110)比錯配DNA(112)雜合體稍微穩(wěn)定。通過在給定時間偏壓微定位區(qū)為負(圖11(B))，并供應(yīng)限制量的電泳動力，有可能是錯配的DNA雜合體變性或去除，同時保留正確匹配的DNA雜合體(圖11(C))。圖(15)比較了利用電嚴緊控制和常規(guī)雜交技術(shù)進行電雜交的結(jié)果。雜交涉及Ras12癌基因15-聚體G和A點突變探針。電雜交結(jié)果表明與常規(guī)方法相比雜交率顯著提高，對單堿基錯配的識別率也非常大。
更具體地說，所要求保護的裝置對在裝置發(fā)生的每一特異性雜交反應(yīng)提供了獨立的嚴緊性控制。實際上每一雜交都是獨立的反應(yīng)。以常規(guī)或被動的矩陣形式，有可能對在相同雜雜交溶液中發(fā)生的所有雜交反應(yīng)實現(xiàn)優(yōu)化的嚴緊性控制。然而，本發(fā)明的主動式陣列裝置能夠提供對在不同微定位區(qū)的雜交不同的電嚴緊性，甚至即使是在它們在相同的主體雜交溶液中發(fā)生時也是這樣。這一特征通過雜交(SBH)型式測序，以及其他多路分析克服了常規(guī)矩陣或陣列雜交型式的固有局限性。
除了改善雜交的特異性(即，識別率)和敏感性(例如單電突變檢測)，電嚴謹控制允許在這些應(yīng)用中使用正常大小范圍之外的寡核苷酸。范圍從8-聚體到21-聚體的寡核苷酸序列對用常規(guī)雜交方法點突變檢測是可接受的。在使用常規(guī)方法的目前實踐中，這些常規(guī)方法中以20-聚體到19-聚體的寡核苷酸最頻繁使用，這些方法利用溫度和鹽濃度來嚴謹控制。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)短于10-聚體的寡核苷酸對多路雜交是不能接受的；短于8-聚體的序列因為其差的雜交率甚至被認為不能使用。長于21-聚體的序列因為在匹配和錯配探針之間有很差的識別率而不能使用。當(dāng)序列長度超過21-聚體，識別匹配和錯配探針之間的雜交信號的差異的能力就顯著下降。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用電嚴緊控制在APEX裝置下進行雜交允許使用較短(7-聚體和更短)和較長(22-聚體和更長)的寡核苷酸而具有非常高的識別率。較短的寡核苷酸序列(7-聚體或更小)的使用的優(yōu)點在于能通過雜交(SBH)測序。較短長度的序列允許使用較小數(shù)目的寡核苷酸(8-聚體=65，536，7-聚體=16，384，6-聚體=4，096)的陣列用于SBH應(yīng)用。較長探針的使用對有高復(fù)雜性的DNA樣品提供了更高的敏感性，并具有較高的總雜交率。
電雜交技術(shù)也可以被用來進行原位雜交。原位雜交代表一種根本不同的雜交形式，在于靶DNA(或RNA)不從細胞中去除，而是直接在細胞中進行檢測。原位雜交技術(shù)通常是很復(fù)雜和耗時的，而且檢測短靶序列(即，單點突變)幾乎是不可能的。電控制的原位雜交可以在APEX裝置上進行，裝置直接在裝置的表面處理細胞(見實施例14中關(guān)于樣品制備技術(shù))。而APEX裝置不是把DNA從細胞中提取出，而是電雜交報告探針到細胞中的DNA。通過消除許多非特異性結(jié)合或者改善總雜交效率使用電嚴緊控制增強選擇性和敏感性。
對雜交提供電嚴緊控制的能力也提供了檢測DNA雜交的新機制，而不需使用報告基團標(biāo)記的DNA探針。它自身提供了進行更直接檢測的雜交方法。熒光染料檢測步驟如圖12a到12d所示，如實施例4到6所述。通過使用DNA結(jié)合染料例如溴化乙錠可以實現(xiàn)DNA雜交的直接檢測。該染料既能結(jié)合到雙鏈DNA也能結(jié)合到單鏈DNA上，但對前者的親和力更大。在圖12(B)中帶正電的染料(122)被遷移到負偏壓的微定位區(qū)。染料既結(jié)合到雜交的(120)DNA序列，也結(jié)合到未雜交(121)的DNA序列上(圖12C)。通過使微定位區(qū)偏壓為正，并在各頂時間內(nèi)提供一定量的功率，結(jié)合到未雜交微定位區(qū)的染料分子就被選擇去除?？梢詰?yīng)用不對DNA雜交有不利影響的合適量的電勢。然后使用相關(guān)的或集成的光系統(tǒng)熒光檢測結(jié)合上染料分子的雜交DNA。下面重申本發(fā)明的用于核酸雜交反應(yīng)和分析的裝置的重要優(yōu)點(1)迅速遷移稀釋的靶DNA和/或探針DNA序列到雜交發(fā)生的特異性微定位區(qū)。這一步驟可以在5到120秒中內(nèi)發(fā)生。
(2)在雜交要發(fā)生的特異性的微定位區(qū)濃縮稀釋的靶DNA和/或探針DNA序列濃縮效果可以很好地達到一百萬倍(＞106)。
(3)迅速從雜交已經(jīng)發(fā)生的微定位區(qū)去除非特異性結(jié)合的靶DNA序列。這一步驟可以在5到120秒內(nèi)發(fā)生。
(4)迅速從雜交已經(jīng)發(fā)生的微定位區(qū)去除完全互補的靶DNA序列。這一步驟可以在5到120秒內(nèi)發(fā)生。
(6)在數(shù)分鐘內(nèi)就可以進行大量的獨立雜交反應(yīng)的能力。
(7)在遠低于探針Tm的等溫條件下，使用最少的操作或洗滌步驟進行雜交步驟的能力。
(8)使用電嚴緊控制(ESC)去除部分雜交的DNA序列。
(9)在1000到100，000拷貝范圍進行雜交分析未擴增的基因組靶DNA序列的能力。
(10)使用ESC改善單堿基錯配雜交(點突變)的識別率(即，分辨率)和敏感性。
(11)使用比在常規(guī)雜交步驟中短(7-聚體或更少)或長(22-聚體或更大)的點突變探針的能力。
(12)使用ESC在矩陣雜交中提供各個嚴緊性控制。
(13)通過去除非特異性背景成分改善雜交過程中的檢測。
(14)在固定的細胞上進行電原位雜交的能力。
(15)消除使用共價標(biāo)記的報告探針或靶DNA檢測雜交的檢測方法的發(fā)展。
Ⅲ(b)裝置的再生產(chǎn)除了用特異性的結(jié)合體分別尋址各個裝置，也可能生產(chǎn)主裝置，該裝置可以把特異性的結(jié)合體拷貝到其他裝置上。這就代表了生產(chǎn)和制造裝置的另一方法。復(fù)制該裝置的步驟如圖13a到13c所示。用各個互補DNA序列(130)雜交含已經(jīng)被特異性序列尋址的微定位區(qū)的主裝置。這些互補的序列被激化，并因此能夠共價結(jié)合到微定位區(qū)附著層上。
用雜交的主裝置對準含附著層的未尋址的姊妹裝置(132)(圖13(B))。該主裝置微定位區(qū)被偏壓為負，姊妹裝置微定位區(qū)被偏壓為正。DNA雜合體被電變性，并遷移到姊妹裝置上，其中啟動的DNA序列共價結(jié)合到微定位區(qū)(圖13(C))。這一步驟可以平行或連續(xù)進行，這取決于裝置的幾何形狀，這樣在微定位區(qū)之間的串?dāng)_就可以降至最低。通過應(yīng)用充分的負電勢或使用帶正點的促溶劑或變性劑將雜合體變性。
或者是，在溶液、凝膠基質(zhì)、主裝置單獨的孔道或室中所含的DNA探針可以被連續(xù)或平行方式電遷移到選擇的在姊妹裝置上的微定位區(qū)。對于生產(chǎn)診斷和其他應(yīng)用的尋址DNA芯片上述方法被認為是合適的。
Ⅲ(c)部件裝置和集成尖端系統(tǒng)可以結(jié)合許多單獨的APEX裝置或芯片形成集成APEX系統(tǒng)。因為APEX型裝置可以執(zhí)行許多不同的功能，在裝置之間的反應(yīng)物可以通過自由場電泳去除，就可以發(fā)展集成系統(tǒng)。例如，各個APEX裝置或芯片可以結(jié)合(1)選擇性結(jié)合和溶解細胞，(2)電分配試劑，(3)進行預(yù)雜交，(4)起到廢物處理單元的作用，(5)提供DNA片段的儲存，(6)進行雜交分析以形成樣品制備和雜交分析系統(tǒng)(見實施例14和圖19)。這些集成APEX微電子系統(tǒng)等價于完全臨床分析者或可編程分子生物實驗室(即，芯片實驗室)。然而，它們遠勝于自動化(機器人)或其他微分析裝置之處在于他們需要非常少的流體或物理操作樣品、試劑、和反應(yīng)物。另外類型的集成APEX系統(tǒng)將包括，但不限于那些能夠進行原位雜交、細胞選擇和處理系統(tǒng)以及免疫診斷分析的系統(tǒng)。
Ⅲ(d)檢測系統(tǒng)和報告基團在結(jié)合反應(yīng)涉及熒光標(biāo)記的報告基團的情況下，有可能使用落射光型顯微鏡檢測系統(tǒng)分析在APEX裝置上的結(jié)合反應(yīng)。系統(tǒng)的總敏感性取決于相關(guān)的檢測元件(冷卻的電荷耦合裝置(CCD)，增強的電荷耦合裝置、微孔道盤檢測器、或光子計數(shù)光電倍增管(PMT)系統(tǒng))。或者是，敏感的CCD芯片檢測器或雪崩式光電二極管(APD)檢測器可以更直接地與APEX裝置結(jié)合。這些系統(tǒng)將或多或少降低復(fù)雜光學(xué)器件的需要。更先進的系統(tǒng)將涉及把集成光電或電檢測元件結(jié)合進芯片。使用這些系統(tǒng)光和直接電檢測DNA都是可能的。本發(fā)明預(yù)計最先進的類型將最終涉及與一個微電檢測器和在板控制器元件一起包層到基本的APEX芯片元件上。電和光(波導(dǎo)管)連接將直接通過APEX元件的底層進行。這一策略解決了許多與制造技術(shù)、材料相容性、制造一次性APEX元件成本效率相關(guān)的問題。
除了各種熒光染料和報告基團可以用來標(biāo)記DNA探針、靶DNA或抗體外，也可以使用其他類型的標(biāo)記或報告基團。這些標(biāo)記包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、非線性光(頻率倍增)材料、生物素/抗生物素蛋白復(fù)合體和各種酶。
Ⅲ(e)復(fù)合生物聚合物合成本方面的裝置還能夠進行生物聚合物例如寡核苷酸和肽的復(fù)合合成。這一步驟允許自導(dǎo)向合成的發(fā)生，不需任何外界導(dǎo)向、影響或機械運動。其它復(fù)合合成的方法需要物理掩膜和復(fù)雜的光刻方法、用來傳送試劑的微機器人移液系統(tǒng)、或在顯微定位區(qū)進行真正合成的復(fù)雜的物理運動。復(fù)合合成的基本概念涉及使用自由場電泳遷移以傳遞、濃縮和與單體反應(yīng)，在裝置上的特異性的可尋址微定位區(qū)耦聯(lián)試劑或阻斷試劑。這一概念利用裝置的固有能力以電保護一定的定位區(qū)部首臨近的實際和反應(yīng)物的影響。另外，對該概念重要的是在一個或多個反應(yīng)物或者是正電或是負電，或產(chǎn)生這些過程適合的試劑的化學(xué)合成過程中選擇步驟性的識別。
復(fù)合寡核苷酸合成的一個方法如圖14a到14f所示。這一方法從一套選擇性的其表面用分塊的伯胺(X-NH-)基團(142)衍生的可尋址微定位區(qū)(140)開始。在該方法中的起始步驟涉及使用帶電分塊劑(144)選擇性分塊微定位區(qū)。在這種情況下，試劑將帶正(+)電荷。通過對分塊的微定位區(qū)施加負電勢，對要保護的微定位區(qū)施加正電荷進行這一過程(圖14(B))。對選擇性電極使用正或負電勢引起帶電試劑從試劑傳送點移出，并在所需要分塊的微定位區(qū)濃縮，同時排除從其他的微定位區(qū)來的試劑。
第二步，將第一個堿基在這里是胞嘧啶，化學(xué)耦聯(lián)到分塊的微定位區(qū)是通過簡單暴露系統(tǒng)到氨基亞磷酸酯試劑(x-C)(146)。(C)核苷酸耦聯(lián)到分塊的微定位區(qū)表面。但不到任何封閉的電極表面(圖14(C)和(D))。這時進行的是正常的磷酰胺化學(xué)直到下一分塊步驟。
在第二分塊步驟(圖14(D))，使那些與下一堿基耦聯(lián)的電極位置為負，使那些保護的為正。在這種情況下(x-A)(148)，將系統(tǒng)暴露到要耦聯(lián)的下一堿基，并選擇性耦聯(lián)到分塊的微定位區(qū)(圖14(E)和(F))。重復(fù)耦聯(lián)和分塊步驟，直到在每一可尋址微定位區(qū)表面上都合成有全部的不同的DNA序列。
上述例子代表合成寡核苷酸的一條可能的途徑。另一方法涉及一種完全水溶性的DNA合成。在這種情況下，使用帶電水溶性耦聯(lián)劑，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDCA)與水溶性核苷酸衍生物進行合成。這一方法將對目前的基于有機溶劑需要大量封閉堿基部分的方法有顯著的優(yōu)勢。水溶性合成將較為廉價并不必使用在目前基于有機溶劑的方法所使用的毒性物質(zhì)。第三種方法，也是用于水溶性合成，涉及使用帶電單體和酶。
Ⅲ(e)用末端轉(zhuǎn)移酶合成寡核苷酸用于復(fù)合合成寡核苷酸的這一方法涉及使用核苷酸聚合酶。這一方法利用末端轉(zhuǎn)移酶，三磷酸5’-脫氧核苷的3’-單磷酸酯和磷酸酶。末端轉(zhuǎn)移酶用來耦聯(lián)核苷酸。3’-磷酸酯起到在每一耦聯(lián)步驟添加多于一個核苷酸的封閉基團的作用。3’-磷酸酯被用來去除下一步耦聯(lián)步驟的3’-磷酸酯。
因為所有的試劑都是水溶性的并帶有電荷，在這一復(fù)合合成步驟中可以對所有步驟使用通常的APEX技術(shù)。在該方法中，使用有A、T、G和C核苷酸的APEX矩陣，通過其5’-羥基位置連接到裝置上的適當(dāng)數(shù)目的尋址的微定位區(qū)。第一核苷酸被連接成為標(biāo)準的APEX尋址技術(shù)。
通過使所有的在其第二位置將與A核苷酸耦聯(lián)的微定位區(qū)偏壓為正，含末端轉(zhuǎn)移酶和三磷酸脫氧腺苷3’-磷酸酯的兩個電試劑分配器偏壓為負啟動第一輪耦聯(lián)反應(yīng)。試劑自由場電泳到合適的微定位區(qū)，并通過末端轉(zhuǎn)移酶把A核苷酸耦聯(lián)到矩陣上的第一核苷酸上。因為三磷酸核苷在其3’位置被酯化，末端轉(zhuǎn)移酶一次只能加一個核苷酸。
在完成核苷酸耦聯(lián)之后，將微定位區(qū)偏壓為負廢物處理系統(tǒng)偏壓為正，并去除酶和剩下的試劑。重復(fù)C、C和T核苷酸第一輪耦聯(lián)，知道所有的微定位區(qū)已經(jīng)被耦聯(lián)。
當(dāng)完成第一輪耦聯(lián)(A、T、G和C)后，所有的微定位區(qū)都偏壓為正，并將3’-磷酸酶的試劑分配器偏壓為負。3’磷酸酶自由場電泳到微定位區(qū)，其中它水解3’-磷酸酯。磷酸酯的去除使得3’-羥基基團準備進行下一步耦聯(lián)反應(yīng)。進行耦聯(lián)反應(yīng)，直到在APEX裝置上完成所需的寡核苷酸序列。
除了DNA合成，可以發(fā)展用于RNA合成、肽合成和其他復(fù)合多聚體的類似方法。
Ⅲ(f)電控制的分子生物學(xué)和擴增反應(yīng)各種分子生物反應(yīng)包括靶DNA和RNA分子的線性和指數(shù)增殖和擴增都可以用APEX微電子裝置和芯片。
可以在完全的電控制下進行限制酶切除和DNA片段分析。使用APEX裝置的核酸增殖或擴增反應(yīng)與其他的“DNA芯片”裝置的明顯不同，“DNA芯片”裝置對傳統(tǒng)的擴增方法(PCR、LCR等)基本上是被動式微-矩陣載體。擴增的新機制直接來自APEX的主動特性。主動式裝置提供獨特的電機制到(1)在等溫反應(yīng)條件并遠低于其Tm點(熱熔化溫度)下選擇變性DNA雜合體；(2)在兩個或多個微定位區(qū)之間迅速來回遷移或移動DNA；和(3)在裝置上的任何所需的微定位區(qū)選擇性濃縮DNA修飾酶，例如，但不限于，限制性內(nèi)切酶、DNA或RNA聚合酶和連接酶?？梢栽贏PEX裝置上進行電控制的分子生物學(xué)和擴增反應(yīng)的例子包括(1)ds-DNA序列的電導(dǎo)向的限制性酶切；(2)用DNA聚合酶電擴增靶DNA；(3)用DNA和RNA連接酶電連接和增殖靶DNA序列；和(4)用RNA聚合酶電增殖靶DNA。
Ⅲ(g)電限制片段分析除了進行ds-DNA的限制酶切，APEX裝置和電技術(shù)可以用來分析和確定DNA片段的相對大小。當(dāng)有不同長度的DNA片段能雜交到在微定位區(qū)的共同的俘獲序列上時這是可能的?；蛘呤钱?dāng)不同長度的DNA片段能夠雜交到不同的俘獲序列上，它們都具有相同的雜交或結(jié)合能。在這種情況下，可以根據(jù)它們的未雜交或伸出的序列使用電嚴緊控制選擇性去-雜交不同的DNA片段。在有較長的伸出序列的片段上的電泳力引起它們在有較短的伸出序列的片段之前去雜交。因此，如果為了檢測對片段進行標(biāo)記，并尋址到特定的微定位區(qū)，其大小可以通過從微定位區(qū)去雜交所需的電泳電勢或功率水平進行測定。也可以進行類似于電限制片段長度聚合分析的步驟。
Ⅲ(h)在低離子強度和低電導(dǎo)緩沖液中進行電遷移和雜交在一系列熒光DNA檢測板尋址實驗中使用2.5％瓊脂糖包被的有25(80微米)微定位區(qū)和Bodipy德克薩斯紅-RCA5(btr-RCA5)熒光寡核苷酸檢測探針的5580芯片在低離子強度/低電導(dǎo)溶液演示DNA遷移。檢測板尋址涉及輪流使微定位區(qū)偏壓為正和負，然后每6秒鐘顛轉(zhuǎn)偏壓。這就在陣列上產(chǎn)生一個檢測板模式，當(dāng)熒光DNA探針在正偏壓的微定位區(qū)濃縮，并移離負偏壓的微定位區(qū)。對下面的低電導(dǎo)溶液演示迅速(6秒)檢測板尋址和濃縮btr-RCA5熒光DNA探針(1)250mM HEPES(低電導(dǎo))，(2)10μM琥珀酸鈉，(3)10μM檸檬酸鈉，和(4)蒸餾水。同時，某些低電導(dǎo)或低離子強度的溶液可能具有某些較好的特性，用最低電導(dǎo)系統(tǒng)實現(xiàn)擋板尋址和迅速DNA遷移(DNA在6秒內(nèi)聚集在80μM的墊板上，橫向總距離是～200μM)。另外，在蒸餾水中DNA尋址到APEX芯片也是可能的，因為DNA(其實是聚陰離子)在提供電導(dǎo)的主體溶液中電解存在的。
電泳遷移率與陽/陰離子種類的關(guān)系除了帶電分析物種類(DNA、蛋白質(zhì)等)的遷移率與電解液的離子強度有關(guān)這一事實外，淌度還受電解液中的陽和陰離子種類的特性影響(見參考文獻“毛細管電泳原理和應(yīng)用”pp89)。這一點在上述參考文獻生物聚合物，第2卷，pp231-236，1964中詳細描述。在這一參考文獻的232頁的圖1表明當(dāng)在相同的離子強度下使用不同的一價陽離子(Li+＞Na+＞K+＞TMA+)DNA的淌度改變?；旧?，不同的陽離子DNA磷酸基團可以有不同的離解常數(shù)，和/或改變環(huán)繞DNA分子的雜交球，這就導(dǎo)致其遷移率的改變。除了對淌度有影響，不同的陽離子也可能影響雙鏈DNA的相對穩(wěn)定性。
電遷移和雜交增強緩沖液本發(fā)明的許多方面涉及發(fā)現(xiàn)各種參數(shù)、DC和DC/AC脈沖、特定的電解質(zhì)和緩沖液(組氨酸、半胱氨酸等)、和其他改善或優(yōu)化試劑或反應(yīng)物(DNA、RNA等)遷移速率、DNA或RNA雜交反應(yīng)效率、在電系統(tǒng)和裝置中的總雜交特異性，尤其是APEX微電子芯片的條件。其中有一些在先前的專利申請和CIP中包括了。特別是發(fā)現(xiàn)各種低電導(dǎo)和兩性離子緩沖液，包括但不限于D-和L-組氨酸、二-組氨酸、1和3甲基-組氨酸、肌肽、咪唑、吡啶和可力丁，既能提供迅速DNA遷移和也能提供有效的雜交反應(yīng)。相反，其他兩性離子緩沖液例如半胱氨酸、甘氨酸、b-丙氨酸和g-氨基丁酸(GABA)能提供迅速遷移、但在這些條件下不能有助于有效雜交。當(dāng)使用這些遷移和濃縮DNA的緩沖液時，在微定位區(qū)發(fā)生合適的DNA濃縮后通過迅速用更傳統(tǒng)的雜交緩沖液(100mM NaCl和Na2PO4等)立即替換該緩沖液可以實現(xiàn)雜交。對雜交率的影響是無法預(yù)料的。低電導(dǎo)緩沖液和系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是當(dāng)應(yīng)用APEX芯片和裝置時靶序列的相對變性條件。
組氨酸、二-組氨酸和其他雜交增強緩沖液的優(yōu)點在于對操作10到100微米直徑的微定位區(qū)的APEX微芯片型裝置特別重要。一般地，這些裝置(與較大規(guī)模的裝置對應(yīng))被包被較薄的滲透層(～1到10微米)，并在較低的電流(～10nA到～5uA)和電壓(～1.2到5.0伏特)范圍內(nèi)操作。這些較低的電流和電壓(始終產(chǎn)生電泳遷移)用來降低在正和負偏壓的微電極/滲透層界面上的主動氣泡。在正電極上產(chǎn)生氧氣，在負電極上產(chǎn)生氫氣，但是氣體通過擴散而散開這與主動氣泡相對。在這些較低的電流(～10nA到～5uA)和電壓(～1.2到5.0伏特)下當(dāng)使用較高電導(dǎo)率的緩沖液和電解液(＞10mM NaCl、KCl、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉、三羧甲基氨基甲烷等)時，發(fā)現(xiàn)DNA遷移率降低。另外，通過積聚在負偏壓的微定位區(qū)滲透層表面上的較小和更多電解陰離子(磷酸鹽、檸檬酸鹽、Cl-等)的競爭濃度，聚陰離子核酸的濃縮緩慢降低。最后，由于高度濃縮的陰離子環(huán)境和對應(yīng)缺少穩(wěn)定陽離子，就降低了靶DNA序列雜交到附著到檢測位點的DNA序列的能力。應(yīng)當(dāng)記住的是，較小的電解液陽離子(Na+、K+、Tris等)的濃縮也可逆地在負偏壓的微定位區(qū)滲透層表面發(fā)生。另外，在低緩沖條件(＜10mM)或當(dāng)主要緩沖液成分不是陰離子類(磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽等)的條件下，在正偏壓的微定位區(qū)低pH(＜4)酸環(huán)境的產(chǎn)生降低了核酸雜交率，也促進在滲透層上或內(nèi)的DNA或RNA沉淀。反之，在負偏壓的微定位區(qū)的未緩沖的高pH(＞10)堿性環(huán)境的產(chǎn)生有不利的影響。
記住這些條件，進行“電泳DNA雜交”的方法之一是使用低電導(dǎo)緩沖液，例如半胱氨酸或丙氨酸，以相對高的濃度(～50nM到100nM)遷移DNA，其中相對低的電流和電壓始終產(chǎn)生非?？斓腄NA遷移。在這些條件下靶DNA保持在相對變性的狀態(tài)，降低了互補靶鏈的競爭雜交。靶DNA可以迅速濃縮在微定位區(qū)檢測位點。在這些低電導(dǎo)緩沖液中的一個中遷移后，將溶液換成高鹽緩沖液(＞100mM氯化鈉或磷酸鈉)，然后促進濃縮的靶DNA與微定位區(qū)位點上的DNA探針非常有效地雜交。
作用的組氨酸機制在緩沖液依賴方式中，在對DNA濃縮和雜交的遷移和尋址步驟后，發(fā)現(xiàn)在正偏壓的電極上的pH立即降低了。在單獨的實驗中，觀察到當(dāng)具有凈正電賀在酸性pH下被動雜交可以有助于雜交，但在中性下不是這樣(見實驗部分)。這些組氨酸和有助于電雜交的相關(guān)的緩沖液與四個重要的特性有關(guān)(1)保持靶DNA在相對變性的狀態(tài)下的能力，(2)有助于DNA電場濃縮的能力，(3)緩沖在正偏壓的微定位區(qū)酸性條件的能力，(4)獲得能夠屏蔽或消除DNA磷酸酯骨架穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)之間的排斥的能力。圖19示出的是組氨酸穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的可能機制。
基本上，因為組氨酸分子在a-氨基基團和咪唑環(huán)上帶正電就變得質(zhì)子化和重陽離子化，分子開始穩(wěn)定雙鏈DNA結(jié)構(gòu)、促進雜交。實際上，在檢測填充組氨酸和雙鏈DNA的分子結(jié)構(gòu)的CPK空間時，重組氨酸類看來與沿DNA骨架的磷酸氧陰離子空間非常“吻合”。而且，CPK空間填充結(jié)構(gòu)的檢測說明二-組氨酸和其他的二-、三-、和多肽結(jié)構(gòu)將顯著穩(wěn)定ds-DNA結(jié)構(gòu)。據(jù)認為除了這些多肽結(jié)構(gòu)，大量的肽衍生物和合成結(jié)構(gòu)可以設(shè)計來穩(wěn)定ds-DNA。
組氨酸和相關(guān)緩沖液的優(yōu)點對APEX微芯片型裝置尤其重要。當(dāng)這些特定的結(jié)構(gòu)被覆蓋有較薄滲透層(～1到10微米)，與深孔裝置(～10到100微米滲透層)和微加工或顯微型裝置(樣品制備、復(fù)雜性降低、擴增、電點漬等)相對，通常在較低的電流(～10nA到～5uA)和電壓(～1.2到5.0伏特)下使用。這一較低的電流和電壓在較高電導(dǎo)緩沖液和電解液中降低遷移率和雜交率。一般地，在這些情況下，DNA遷移將在低的電導(dǎo)緩沖液(例如半胱氨酸或丙氨酸)中進行，其中相對低的電流和電壓將始終產(chǎn)生迅速的DNA遷移。在這些條件下，DNA迅速在檢測位點聚集，但不能有效雜交。在這些低電導(dǎo)緩沖液中遷移后，通常將溶液假加入到高鹽緩沖液中(＞100mM氯化鈉或磷酸鈉)，這些緩沖液然后促進濃縮的DNA有效雜交到在微定位區(qū)檢測位點上的DNA探針上。
表2示出的是使用APEX芯片裝置聚集DNA和雜交敏感性(效率)與緩沖液能力、pH和電導(dǎo)相關(guān)的一系列實驗的結(jié)果。
表2溶液緩沖能力在PI的 電導(dǎo)(μs) 相對DNA SA-生物素 DNA雜交pH遷移率 T12敏感性 敏感性β-丙氨酸 pK1-3.6 +7.310.0 +++++ 3×104pK2-10.2 (最快)?；撬? pK1-1.5+/-4.64.5 +++++ ＞7.5×1010pK2-8.7半胱氨 pK1-1.7+/-5.225.00 ++++3×1077.5×1011酸 pK2-8.3pK3-10.8組氨酸 pk1-1.8+++7.6212.0 +++ 3×1063×106pK2-6.0 (172.0高純度)pK3-9.0賴氨酸 pK1-2.2 ++9.6477.0 ++ ＞7.5×1010pK2-8.9pK3-10.3NaPO4綜合 +7.41，400.0 +(最慢)用20mM NaPO4調(diào)整pH為7.4尤其是，表2示出的是各種兩性離子氨基酸緩沖液[β-丙氨酸、牛磺酸、半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸和磷酸鈉(不是兩性離子緩沖液)]對遷移的靶DNA雜交到檢測位點上的特異性俘獲DNA能力的影響。從表2可以清楚看到用組氨酸(3×106靶點)比半胱氨酸(7.5×1010靶點)可以達到非常低的雜交敏感性。當(dāng)要遷移時，在相同場條件下電導(dǎo)通常與遷移相關(guān)。β-丙氨酸、牛磺酸和半胱氨酸表現(xiàn)出優(yōu)異的遷移，組氨酸表現(xiàn)出良好的遷移，賴氨酸和磷酸鈉較好的遷移。報道的是具有負帶電聚陰離子磷酸骨架的“正常DNA”的雜交敏感性。除了雜交敏感性外，表2還報道了抗生物素蛋白鏈菌素/生物素DNA探針俘獲親和性的敏感性。表2清楚地表明DNA遷移(聚集)與低電導(dǎo)(β-丙氨酸、牛磺酸、半胱氨酸、組氨酸)之間的關(guān)系。從表中可以看到使用β-丙氨酸、半胱氨酸和組氨酸對抗生物素蛋白鏈菌素/生物素探針具有良好的親和性。如表2中的敏感性數(shù)據(jù)所反映的那樣，組氨酸比半胱氨酸或其他緩沖液例如20mM的NaPO4的雜交效率高四個數(shù)量級。對半胱氨酸的相對提高為至少10倍，更特別地為102倍，最特別地至少為104。更重要地，用組氨酸緩沖液DNA雜交敏感性(效率)特別好。因此所有的兩性離子氨基酸緩沖液都檢測了，組氨酸、二-組氨酸和組氨酸衍生物提供出良好的遷移和良好的DNA/DNA雜交效率。
據(jù)認為低電導(dǎo)的組氨酸緩沖液系統(tǒng)是迅速的DNA遷移(積聚)的原因。對為什么組氨酸緩沖液產(chǎn)生相對高效的DNA/DNA雜交的原因有幾種解釋。一個優(yōu)勢是組氨酸良好的緩沖能力。由于其pI為7.47，組氨酸將在酸性和堿性條件下很好地緩沖(見A.L.Lehninger，生物化學(xué)，第2版，Worth出版社，紐約，1975，第80頁的圖4-9)。APEX芯片在DNA積聚雜交的正電極上產(chǎn)生酸，組氨酸有效緩沖這些條件。在其兩性離子狀態(tài)，組氨酸的濃度在正和負偏壓的微定位區(qū)局部附近保持較高。更重要的是，在酸性條件(pH＜5)下，在正偏壓的電極上組氨酸上的咪唑基團質(zhì)子化開始把分子轉(zhuǎn)變成二-陽離子類。這些有帶正點的α-氨基基團和代正點的咪唑基團的陽離子類促進雜交，并穩(wěn)定在APEX芯片上正偏壓的微定位區(qū)上形成的DNA/DNA雜合體。已知陽離子、二陽離子和聚陽離子有助于通過減少在雙鏈DNA結(jié)構(gòu)上的帶負電的磷酸酯骨架的排斥反應(yīng)穩(wěn)定DNA/DNA雜合體。因此，建議使用組氨酸設(shè)計具有兩性離子、低電導(dǎo)和二-陽離子或多-陽離子特性用來改善在APEX芯片裝置上的電雜交化合物(組氨酸多肽、混合肽、合成衍生物等)。
Ⅲ(ⅰ)在雙鏈PCR擴增子電雜交和點突變檢測本發(fā)明的顯著優(yōu)點是能夠?qū)ο鄬Υ蟮腄NA片段進行迅速的直接雜交和堿基錯配分析。有可能處理雙鏈PCR擴增子產(chǎn)品、其他擴增子產(chǎn)品(SDA等)、DNA片段、或RNA片段并(1)把她們直接稀釋到低電導(dǎo)組氨酸緩沖液(1到5，或更高的稀釋度)，(2)迅速進行加熱變性，(3)向APEX芯片(用俘獲探針序列預(yù)尋址進行識別)加樣品(～5uL)，(4)進行2分鐘電泳雜交，(5)洗滌芯片幾次，(雜交熒光報告探針序列(可選))，(7)進行30秒電嚴緊控制(對特定的堿基錯配序列使用合適的電流水平)，(8)進行熒光檢測和分析(～1分鐘)。
進行整個過程的必須時間少于30分鐘。快的雜交率是因為在低電導(dǎo)緩沖液如組氨酸類電雜交的獨特優(yōu)點。迅速的堿基錯配識別是由于電嚴緊控制的獨特優(yōu)點。雙鏈PCR產(chǎn)品可以應(yīng)用到有最小變性的芯片上，不必分離單鏈靶序列。步驟(6)不是必須的，如果擴增子或片段已經(jīng)被熒光標(biāo)記，在大多數(shù)情況下可以在PCR擴增步驟中使用熒光標(biāo)記引物進行標(biāo)記。對完全擴增的PCR擴增子，不必對樣品脫鹽，因為它可以直接稀釋到低電導(dǎo)(組氨酸緩沖液)。對于低拷貝數(shù)的擴增子，脫鹽到較低電導(dǎo)的步驟四可選的。
在一個例子中，通過標(biāo)準的PCR反應(yīng)方法從鐮刀形細胞陽性組織生產(chǎn)PCR擴增子。在25檢測位點APEX陣列每5行的三個80微米微定位區(qū)用三個生物素標(biāo)記俘獲探針、一個24-聚體生物素標(biāo)記的鐮刀形細胞匹配序列(GCAP-3)；一個24-聚體生物素標(biāo)記的鐮刀細胞錯配T-→A(GCAP-4)和一個完全非-互補序列(ATA4)預(yù)尋址。將擴增子以1比50稀釋到組氨酸緩沖液中，并應(yīng)用到APEX芯片上。然后進行上述基本步驟。使用四個不同的電嚴緊電流水平以確定優(yōu)化的電嚴緊控制。獲得下面的“錯配比匹配”識別率對533nA/位點是1.3比1；對566nA/位點是1.4比1；對600nA/位點是2.0比1；對633nA/位點是1.8比1；對600nA/位點是1.7比1，重復(fù)。因此有可能歲雙鏈PCR擴增子靶材料的錯配迅速檢測和獲得2比1識別率。所以本發(fā)明就允許一種迅速進行直接雜交堿基錯配分析的迅速工藝。
本發(fā)明將參照下面的非限制性的實施例對制造和應(yīng)用APEX裝置更詳細地進行描述。
緩沖液、溶液和在下面實施例中的介質(zhì)配方在J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，和T.曼尼阿蒂斯，分子克隆實驗指南，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989有描述。
Ⅳ實施例實施例1寡核苷酸的合成和修飾使用傳統(tǒng)的氨基亞磷酸化學(xué)在應(yīng)用生物系統(tǒng)自動化DNA合成儀上制備合成DNA探針。設(shè)計寡核苷酸使之含有5’-氨基或3’-核糖核苷酸末端。通過使用ABI Aminolink2試劑結(jié)合5’官能性，和通過從RNA CPG載體啟動合成導(dǎo)入3’官能性。3’-核糖核苷酸末端可以通過高碘酸氧化方法轉(zhuǎn)化成末端雙醛與伯胺反應(yīng)形成席夫氏堿。
反應(yīng)條件如下在水中溶解20-30O.D.寡聚體使終濃度為lOD/μl。加入1體積的0.1M乙酸鈉，pH5.2和1體積的0.45M高碘酸鈉(在水中新鮮制備)。在暗處室溫下攪拌和孵育反應(yīng)至少2小時。將反應(yīng)混合物裝到在0.1M磷酸鈉，pH7.4平衡的SephadexG-10柱(巴斯德滴管，0.6×5.5cm)中。收集200μl組分，在薄層色譜(TLC)點樣并收集紫外(UV)吸收部分。
下面的寡聚體含3’-核糖核苷酸末端(U)ET-12R 5’-GCT AGC CCC TGC TCA TGA GTC TCUCP-15’-AAA AAA AAA AAA AAiA AAA AAUAT-A1 5’-CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGA GACTGC CTG UAT-A2 5’-GAG TTC AGC AAA TTT GGA GUAT-A3 5’-CGT AGA ACT CCT CAT CTC CUAT-A4 5’-GTC TCC TTC CTC TCC AGUAT-A5 5’-GAT GAG CAG TTC TAC GTG GUAT-A6 5’-CTG GAG AAG AAG GAG ACUAT-A7 5’-TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC UAT-A8 5’-TTC CGC AGA TTT AGA AGA TUAT-A9 5’-TGT TTG CCT GTT CTC AGA CUAT-A10 5’-CAT CGC TGT GAC AAA ACA TU含5’胺基的寡聚體通常與熒光基團反應(yīng)，例如德克薩斯紅(TR，激發(fā)590nm，發(fā)射610nm)磺酰氯對伯胺的反應(yīng)性很強形成穩(wěn)定的磺胺連接。
如下制備德克薩斯紅-DNA耦聯(lián)將德克薩斯紅磺酰氯(分子探針)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中使終濃度為50mg/ml(80mM)。將寡聚體溶解在pH9.0-9.1的0.4M碳酸鈉中，使終濃度為1O.D./μl(對21-聚體是5.4mM)。在一個微試管中，合并10μl寡聚體和20μl德克薩斯紅。在暗處使反應(yīng)進行1小時。用氨或羥胺淬滅反應(yīng)，水解樣品，并用PAGE(Sambrook等，1989，如上)純化。
下面的寡聚體含5’-核糖核苷酸末端(U)ET-21A 5’-氨基-TGC GAG CTG GAG TCA GAC ATET-10AL5’-氨基-GAG AGA CTC ATG AGC AGGET-11AL5’-氨基-CCT GCT CAT GAG TCT CTCT-2 5’-氨基-TIT TTT TTT TTT TTT TTT TRC-A15’-氨基-CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCC AGGTCC ACG TAGRC-A25’-氨基-CTC CAA ATT TGC TGA ACT CRC-A35’-氨基-GGA GAT GAG GAG TTC TAC GRC-A45’-氨基-CTG GAG AGG AAG GAG ACRC-A55’-氨基-CCA CGT AGA ACT GCT CAT CRC-A65’-氨基-GTC TCC TTC TTC TCC AGRC-A75’-氨基-GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAA.RC-A85’-氨基-ATC TTC TAA ATC TGC GGA ARC-A95’-氨基-GTC TGA GAA CAG GCA AAC ARC-A10 5’-氨基-ATG TTT TGT CAC AGC GAT G實施例2在微制造的裝置上的電尋址微定位區(qū)-聚賴氨酸方法用微毛細管(0.2mm×5mm)制造微定位區(qū)。將微毛細管填充以含0.1-1.0聚賴氨酸的18-26％聚丙烯酰胺并進行聚合。將多出的毛細管刻痕去除以避免氣泡截留在管中，并使管長度標(biāo)準化。這樣安裝毛細管，使它們共用共同的上緩沖液儲存器，并各有自己的下緩沖液儲存器。每一個低緩沖液儲存器含有鉑電極線。
在上儲存器的微毛細管的上表面被認為是可尋址的微定位區(qū)。將上和下儲存器填充以pH7.4的0.1M磷酸鈉，并在0.05mA常數(shù)下使用伯樂(BioRad)500/1000電源預(yù)運轉(zhuǎn)10分鐘。在開啟電源下將約2μl(0.1O.D.)高碘酸鹽氧化的ET-12R復(fù)活序列滴到上儲存器并在恒定參數(shù)下電泳2-5分鐘。ET-12R俘獲序列就開始濃縮并立即共價結(jié)合到微定位區(qū)的伯胺上。然后顛轉(zhuǎn)極性使得檢測的毛細管偏壓為負，并電泳另外2-5分鐘。所有剩下的未結(jié)合DNA都被排斥，而共價附著的DNA保留在微定位區(qū)。
吸干上儲存器并用緩沖液浸洗。將裝置拆開并安裝新的參比檢測裝置。將儲存器重新注滿，并熒光標(biāo)記加入的互補DNA序列，即，ET-10AL-TR。在0.05mA的恒定電流下將寡聚體電泳濃縮到正偏壓的檢測微定位區(qū)2-5分鐘。顛轉(zhuǎn)極性使未互補的去除。去除檢測裝置并用落射光式熒光顯微鏡檢驗。用非-互補DNA序列ET-21-A-TR替換ET-10AL-TR對非特異性結(jié)合如上所述進行陰性控制。
在安裝有濱松ICCD照相成像系統(tǒng)的耶拿(Jena)落射光式熒光顯微鏡下檢測毛細管微定位區(qū)表面的橫截面。熒光分析結(jié)果表明互補ET-10AL-TR雜交到結(jié)合體/俘獲序列并即使在電勢偏壓為負的時候保持雜交。當(dāng)電勢顛轉(zhuǎn)時非-互補ET-21A-TR不能保留在檢測裝置表面。
實施例3在微制造的檢測裝置上電尋址微定位區(qū)-丙烯酸琥珀酰亞胺方法這一實施例描述的是另一個共價結(jié)合到寡核苷酸5’-末端的附著化學(xué)。除了用1％的丙烯酸琥珀酰亞胺(分子探針)代替聚賴氨酸，如上所述制造毛細管。新鮮制備毛細管，因為與伯胺反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯相對不穩(wěn)定，特別是在pH8.0下。如上所述安裝毛細管，并用pH7.4的0.1M的磷酸鈉注入儲存器。在0.05mA下預(yù)運行毛細管10分鐘。在開啟電源下將含5’-氨基末端的約2μl的ET10AL(0.1O.D.)滴到上儲存器并電泳2-5分鐘。當(dāng)共價附著的DNA保留在微定位區(qū)，排斥未結(jié)合的DNA。
吸干上儲存器并用緩沖液浸洗。將參比檢測裝置拆開并安裝新的參比檢測裝置。將儲存器重新注滿，并熒光標(biāo)記加入的互補寡聚體，ET-10AL-TR并如上進行電泳。用非-互補DNA序列ET-21-A-TR替換ET-10AL-TR對非特異性結(jié)合如上所述進行陰性控制。
每一檢測裝置的熒光分析結(jié)果表明互補ET-10AL-TR雜交到俘獲序列(RT-10AL)，并即使在電勢偏壓為負的時候保持雜交。當(dāng)電勢顛轉(zhuǎn)時非-互補序列ET-21A-TR不能保留在檢測裝置表面。
實施例4電控制的熒光DNA/染料檢測方法某些染料，例如溴化乙錠(EB)在結(jié)合(插入)雙鏈DNA時就變得有很高的熒光性。盡管在結(jié)合到雙鏈DNA時熒光和結(jié)合親和性變大；染料對單鏈DNA也有一定的親和性，并產(chǎn)生低水平的熒光。下面的實施例表明的是電控制的DNA/染料檢測方法是怎樣開展的。
如實施例2和3所述制備和雜交毛細管檢測裝置。將溴化乙錠(EB)加到緩沖液(～0.05mM EB終濃度)，將檢測裝置偏壓為負以在雜交和非雜交微定位區(qū)濃縮EB(帶正電)。用落射光式熒光顯微鏡在550nm激發(fā)和600nm發(fā)射下觀察檢測裝置。雜交和未雜交的微定位區(qū)都表現(xiàn)出從濃縮的EB來強烈的紅色熒光。
將檢測裝置重安裝偏壓為正，電流為0.05mA 0.03伏特-小，以選擇性去除EB。在未雜交微定位區(qū)的熒光消失，而雜交的微定位區(qū)保持非常高水平的EB熒光。結(jié)果如下俘獲 靶 正?；男盘朎T-10AL ET-11AL(正) ＞200ET-10AL ET-21A(負)1使用ICCD成像照相系統(tǒng)測定熒光信號，顯示出峰值熒光強度。如果積分整個熒光信號面積信噪比將大于1000倍。這就表明使用插入染料增加信噪比和DNA檢測動力學(xué)范圍的方法。
實施例5主動式可編程電子矩陣(APEX)-微加工制造6個可尋址的250μm毛細管定位區(qū)徑向排列由塑料基質(zhì)材料微加工。裝置具有共同的上儲存器和單獨的低儲存器，這樣每一微定位區(qū)被單獨尋址。將獨特的寡聚體序列結(jié)合體定位并附著到用高度交聯(lián)的聚丙烯酰胺按如上所述的方法制備的特異性微定位區(qū)上。檢測微定位區(qū)具有正電勢，而其他微定位區(qū)具有負電勢以避免非特異性相互作用。
清洗陣列，然后用互補的熒光標(biāo)記的DNA探針雜交。洗滌陣列以去除剩余的探針，然后在落射光式顯微鏡下進行觀察。只有特異性尋址的微定位區(qū)是熒光性的。用其他結(jié)合體在其他定位區(qū)重復(fù)該方法，并與其他熒光部分標(biāo)記的探針雜交檢驗。
DNA序列特異性定位在預(yù)定位置并與其他的定位區(qū)有可以忽略的串?dāng)_。這就在預(yù)定的定位區(qū)制造出幾個到成百上千個獨特的序列的微矩陣。
為了選擇合適的低熒光背景的塑料基質(zhì)，對不同的塑料基質(zhì)在600nm下的熒光特性進行檢測。用落射光式成像系統(tǒng)和熒光計對塑料進行檢測。下表列出了從LS50B熒光計獲得的基質(zhì)和熒光讀數(shù)。
塑料基質(zhì)在610nm，5秒間隔的強度ABS黑色 0.140白色 6.811聚苯乙烯7.955丙烯酸 透明 0.169白色 51.77淺色 0.151黑色 0.03551.22透明白UHMW 黑色 0.743白色Delrin 黑色 1.834白色 61.39TFE 96.05聚丙烯 白色 0.743天然 25.82聚碳酸酯 透明 11.32淡色 3.103白色 45.31黑色 0.156PVC灰色 2.667實驗表明黑色丙烯酸、ABS和聚碳酸酯具有最低熒光背景水平。
實施例6主動式可編程電矩陣(APEX)-微光刻制造在硅基片上設(shè)計、制造一個8×8矩陣(64個位點)的50平方微米的微定位區(qū)(見圖3)，與一個轉(zhuǎn)換開關(guān)箱(詳見裝置制造部分)組裝。將用如下所述的幾種改進材料和方法來提高APEX芯片裝置的選擇性和有效性。
6a)頂層部分APS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)方法涉及芯片整個表面的反應(yīng)。這一起始官能化方法的選擇性取決于在芯片表面的各種材料的相對反應(yīng)性。為了降低官能化和DNA隨后附著到環(huán)繞微定位區(qū)需要一種比SiO2或金屬氧化物更不易與APS反應(yīng)的材料。檢測光刻膠和氮化硅。將不同的頂層涂到二氧化硅芯片上。用落射光顯微鏡檢測芯片，然后用APS處理，然后共價附著高碘酸氧化的聚-A RNA序列(Sigma，M100，000)。在37℃雜交緩沖液中用200nM德克薩斯紅標(biāo)記的20-聚體(T2-TR)對芯片進行雜交5分鐘。將芯片在洗滌緩沖液清洗三次，在1xSSC中清洗一次。用熒光在590nm激發(fā)和610nm發(fā)射下進行檢測。
選擇氮化硅是因為它相對于二氧化硅對APS的反應(yīng)性小的多，并不象檢測的光刻膠材料那樣本身是發(fā)熒光的。其他方法，例如背景面積的UV熔蝕也是可能的。
6b)APEX物理特性使用裝有一個B&L顯微鏡和CCD照相機的探針檢測站(微控制器模型6000)視覺檢測完成的矩陣芯片。檢測芯片在檢測墊板和外接觸墊板之間的連續(xù)性。這通過把墊板與控制器探針尖端接觸而完成。連續(xù)性保證墊板已經(jīng)被蝕刻到金屬表面。然后檢測墊板在電泳環(huán)境中的穩(wěn)定性。金屬線的等級為在干燥狀態(tài)下處理達1mA。
把一滴(1-5微升)緩沖溶液(1xSSC)滴到8×8矩陣上。表面張力固定液體，使外接觸層面積干燥。將探針尖端連接到接觸墊板，另一探針尖端與液體接觸。使用HP6625電源和HP3458A數(shù)字萬用表在最大電壓50V電流被遞增至50uA。
最初的制造由硅基片、二氧化硅絕緣層、鋁沉積和形成圖案和氮化硅頂層組成。
第二制造方法包括在鋁金屬和氮化硅層之間的二氧化硅絕緣層。二氧化硅和Al具有更相容的物理特性，并形成較好的化學(xué)界面以提供比初始制造方法更穩(wěn)定和堅固的芯片。
6c)DNA附著用APS試劑如實施例5所示對一個8×8矩陣芯片官能化。用高碘酸氧化作用氧化的聚-A RNA序列(Sigma，平均分子量100，000)處理芯片。將芯片在洗滌緩沖液(WB)清洗去除多余的和微結(jié)合的RNA。這一方法用俘獲序列包涂整個芯片，然而在暴露的金屬表面的密度比在氮化物覆蓋的面積更高。在37℃用200nM在雜交緩沖液(HB)中的TA-TR雜交芯片5分鐘，然后在WB中清洗三次，在1xSSC中清洗一次，每次在室溫下清洗一分鐘。用熒光在590nm激發(fā)和610nm發(fā)射下進行檢測。
開放的金屬面積具有高的熒光，并具有50平方μ墊片(微定位區(qū))形狀。低的熒光強度和/或不規(guī)則的邊界表明一些墊片還沒有完全開放。在這種情況下將建議額外進行等離子體蝕刻幾次。
6d)電控制的雜交通過使用實施例8c的芯片進行主動式雜交，并偏壓一個特異性微定位區(qū)為正。這通過使用轉(zhuǎn)換開關(guān)箱或通過使用一個在外溶液中的電極完成，該轉(zhuǎn)換開關(guān)箱也能自動偏壓剩下的微定位區(qū)為負。只有三微升的緩沖液沉積在矩陣墊片上(微定位區(qū))。施加～1-5nA的電流幾秒鐘，并把0.1pmol的T2-TR加到溶液中。去除液體并使芯片干燥，在德克薩斯紅的590nm激發(fā)和610nm發(fā)射下檢測德克薩斯紅熒光。只有偏壓為正的特異性微定位區(qū)有熒光性。這一實驗可以重復(fù)許多次，使用在APEX芯片上的其他特異性微定位區(qū)。另外，通過偏壓起初的定位區(qū)為負和目標(biāo)微定位區(qū)為正在一個微定位區(qū)上的熒光DNA被電去-雜交并移位到另一個微定位區(qū)。
6e)電控制尋址和裝置制造如上使用APS對8×8APEX矩陣進行官能化。通過高碘酸氧化方法激發(fā)寡核苷酸結(jié)合體CP-1。將在矩陣中的四個微定位區(qū)偏壓為正，并使剩下的偏壓為負。在矩陣上沉積兩微升緩沖液并施加電流。加入結(jié)合體CP-1并電濃縮到預(yù)定的定位區(qū)。去除液體，用緩沖液簡單浸洗芯片，并將兩微升緩沖液沉積在芯片上。再次施加電流數(shù)秒鐘，加入0.1pmolT2-TR。馬上去除液體，并在WB中清洗整個芯片3次。干燥芯片，并檢測熒光。
結(jié)果表明四個正偏壓的微定位區(qū)都被熒光化。這一例子表明有特異性結(jié)合體的微定位區(qū)選擇尋址、定位和共價偶聯(lián)到微定位區(qū)的附著序列，并且，互補靶序列特異性雜交到衍生的微定位區(qū)。
6f)基因分類APEX芯片合成對HLA基因dQa多態(tài)性有特異性的有3’-核糖核苷酸末端的DNA結(jié)合體。用上述高碘酸氧化反應(yīng)激發(fā)結(jié)合體。用5’-氨基末端合成反互補體，并與如上所述的熒光團例如德克薩斯紅、若丹明或Bodipy染料偶聯(lián)。如上所述通過用APS處理將微定位區(qū)官能化以伯胺。
在8×8矩陣上放置幾微升溶液。通過偏壓微定位區(qū)為正，使特異性的微定位區(qū)被尋址，加入高碘酸鹽氧化的DNA寡聚體～0.1pmol，并轉(zhuǎn)定位和共價偶聯(lián)到定位區(qū)上。顛轉(zhuǎn)極性，并去除未結(jié)合的結(jié)合體分子。對在另一尋址微定位區(qū)的另一結(jié)合體重復(fù)該步驟，直到所有的唯一結(jié)合到芯片上。
將芯片雜交到單個熒光標(biāo)記的互補序列以確定偶聯(lián)反應(yīng)的特異性同時立即用肉眼觀察所有的微定位區(qū)。
在點變性以去除互補寡聚體(90℃在0.05％SDS中10分鐘)的同一芯片上，用未標(biāo)記的靶DNA或基因組DNA雜交尋址的微定位區(qū)。如上所述通過熒光染料檢測方法進行檢測。
結(jié)果表明微定位區(qū)被唯一的結(jié)合體特異性尋址。非特異性結(jié)合到負偏壓的微定位區(qū)將是可以忽略的。在變性條件下裝置和相關(guān)的結(jié)合體化學(xué)是穩(wěn)定的。變性雜合體的電方法有增加電流和/或增加施用時間。
實施例7用15聚體PAS-12探針電嚴緊控制(7A)單點突變使用15聚體探針用RAS-12致癌基因模型系統(tǒng)驗證裝置影響高水平電嚴緊控制的能力。相對于匹配的雙鏈體在DNA雙鏈體中的單堿基對錯配只引起雜交對輕微的不穩(wěn)。這種輕微的不穩(wěn)引起錯配雙鏈體在比匹配的雙鏈體稍低的Tm下變性。當(dāng)對(匹配和錯配)都在優(yōu)化的嚴緊條件下對匹配進行雜交，錯配的對的雜交效率將較低。錯配雜交信號將或多或少比匹配的對的信號低。用常規(guī)的雜交方法。單點突變分析在8聚體到21聚體的范圍內(nèi)進行。在10聚體到20聚體范圍內(nèi)的探針最常使用。當(dāng)突變體特異性探針比8聚體短，比20聚體長，以任何可靠的方法要從錯配中區(qū)分出匹配就變得極為困難。這是因為在匹配和錯配對之間的雜交信號幾乎沒有分別。在點突變分析中使用的常規(guī)的雜交嚴緊性控制傳統(tǒng)方法取決于溫度和鹽濃度。我們發(fā)現(xiàn)還可以用電泳電勢影響嚴緊性控制。
以RAS-12為例，15-聚體點突變特異性探針電雜交到附著到檢測裝置上的微定位區(qū)的30-聚體靶序列。在微定位區(qū)的極性就偏壓為負，雜合體經(jīng)受恒定的電流給定的時間，提供變性錯配的確定功率水平而不影響準確的匹配。
下面的序列在一套有三個檢測結(jié)構(gòu)的裝置上合成和檢測，每一檢測結(jié)構(gòu)有250μm的表面定位區(qū)。下劃的/粗體堿基表示錯配位置。
附著序列是Ras-G5’-GGT GGT GGG CBC CGB CGG TGT GGG CAA GAU- 3’-微定位區(qū)Ras-T5’-GGT GGT GGG CGC CGT CGG TGT GGG CAA GAU-3’-微定位區(qū)報告探針序列(用德克薩斯紅標(biāo)記)是Ras-13’-CC-GCG-GCC-GCC-ACA-C-5’-(TR)Ras-23’-CC-GCG-GCA-GCC-ACA-C-5’-(TR)Ras-33’-CC-GTG-GCA-GCC-ACA-C-5’-(TR)如說明書上述檢測裝置由微毛細管制備。附著序列Ras-G和Ras-T被高碘酸氧化并共價偶聯(lián)到尋址的微定位區(qū)。
然后將Ras-G微定位區(qū)用Ras-1、Ras-2或Ras-3雜交。Ras-1是Ras-G的準確匹配。Ras-2是一個堿基對錯配(G-A)。Ras-3是一個兩堿基對錯配(G-A和G-T)。G-A錯配對DNA雙鏈體產(chǎn)生最小的去穩(wěn)定作用，因此也是最難從正確的匹配中區(qū)分的。
首先進行常規(guī)的雜交，熒光檢測微定位區(qū)以測定多大程度的互補序列被雜交。重新安裝檢測裝置(微毛細管)，并然后進行電雜交。通過偏壓它們在負電勢(以恒定電流)使檢測裝置全都經(jīng)受相同的電嚴緊性控制，直到完全去除錯配雜合體而不顯著改變正確匹配的雜合體。步驟和結(jié)構(gòu)如下所示常規(guī)雜交步驟
在40℃5xSSC雜交15分鐘。
在20℃1xSSC洗滌三次，每次5分鐘。
進行熒光分析。
所觀察到的正確匹配(Ras-G/Ras-1)對1堿基對錯配(Ras-/-2)的信號比約10到1電嚴緊控制(ESC)步驟在20℃5xSSC雜交5分鐘。
“沒有洗滌步驟”。
在150伏特(V)0.15毫安(MA)下應(yīng)用電嚴緊性4分鐘(20℃)。
進行熒光分析。
所觀察到的正確匹配(Ras-G/Ras-1)對1堿基對錯配(Ras-/-2)的信號比＞100到1對所有實驗的完全結(jié)果見圖(15)所示。這些結(jié)果表明在DNA雜交反應(yīng)中不僅可能使用電泳電勢進行嚴緊控制；而且表明比傳統(tǒng)的雜交方法ESC既提供了較高的雜交效率，也提高了較高的識別率。另外，ESC可以應(yīng)用到各個微定位區(qū)，在相同的主體溶液中提供各自的嚴緊性控制。
(7B)使用7-聚體和22-聚體探針進行單點突變分析7聚體和22聚體，都在電突變分析通常使用的通常大小范圍之外，被制備來進一步驗證電雜交和ESC的優(yōu)點。下面列出的點突變特異性寡聚體探針可以被配對，這樣產(chǎn)生的雜合體有0、1或2個堿基錯配。如上互補的寡聚體序列偶聯(lián)到微定位區(qū)并雜交。顛轉(zhuǎn)微定位區(qū)的極性(偏轉(zhuǎn)為負)雜合體經(jīng)受電流一定的時間，提供限定的功率水平以使錯配變性而不去除正確的匹配。
將Ras-G或Ras-GA寡聚體(見下)附著到微定位區(qū)并用作靶序列。將下面所示的22-聚體和7聚體Ras特異性核苷酸系列用德克薩斯紅熒光團如本說明書其他部分所述進行標(biāo)記?！跋聞澗€和粗體”的堿基表示錯配和/或可能的錯配位置。Ras-G5’-GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAAGAURas-GA 5’-氨基-GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGGCAA GARas-22C-TR (TR)-5’-TGC CCA CAC CGC CGG CGC CCA CRas-22A-TR (TR)-5’-TGC CCA CAC CGA CGG CGC CCA CRas-TA (TR)-5’-TGC CCA CAC CGA CGG TGC CCA CRas-7C (TR)-5’-ACA CCG CRas-7A (TR)-5’-ACA ACG C如說明書上述從微毛細管制造檢測裝置。將寡聚體靶序列共價附著到微定位區(qū)然后用德克薩斯紅標(biāo)記的正確的22-聚體互補Ras-22C-TR雜交一個微定位區(qū)。用Ras-22A-TR，一個22聚體單堿基對錯配(G-A)；或Ras-22-TA，一個22聚體雙堿基對錯配(G-A或G-T)雜交另一個微定位區(qū)。
如說明書上面所述立即以雙道模式運行檢測裝置，其中兩個微定位區(qū)同時經(jīng)受相同的電流或功率水平。通過常規(guī)的方法首先雜交檢測裝置，熒光檢測微定位區(qū)以測定要雜交的互補序列的量。然后使用檢測裝置進行電雜交以控制在恒定電流的時間，直到去除錯配雜合體，而沒有顯著影響正確匹配的雜合體。通常將Bio-Rad1000/500電源設(shè)定到0.02到0.1mA，并在恒定電流下進行實驗0.02到0.04伏特-小時。拆卸裝置，在安裝有硅增強的CAD照相機(濱松)Jena顯微鏡上通過落射式熒光觀察檢測裝置。使用濱松Argus10圖象處理器處理圖象，并用索尼圖象打印機記錄。當(dāng)需要其他的電嚴緊條件時重運行毛細管。
如上所述在7聚體上進行單堿基對錯配。然而，由于較低的Tm，裝置需要在4-6°的冷箱運行，而不能在室溫下運行。
結(jié)果表明電雜交和嚴謹控制能夠識別在7聚體和22聚體的單堿基錯配。匹配錯配率是100∶1或更大。信噪比任何一種報道使用溫度和離子強度控制嚴緊條件的雜交方法都顯著大。
電嚴緊控制能夠從正確的錯配中識別堿基G-A錯配，即便G-A錯配是最穩(wěn)定的錯配，因為G亞氨基部分能夠參與與A形成的氫鍵，可以穩(wěn)定雙鏈體。
功率消耗計算和測定表明溫度的變化可以忽略，這表明在微定位區(qū)的嚴緊條件不是由溫度改變引起的。如上被動雜交的微定位區(qū)(不經(jīng)受電雜交)在匹配和錯配之間表現(xiàn)不出區(qū)別，這表明擴散作用不會造成識別。
這些實施例還表明每一微定位區(qū)都有各自的嚴緊控制，從而克服了受制于單共用雜交水平的大規(guī)模多路雜交的主要障礙。還有可能將電嚴緊功率水平與熱熔化(Tm)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)以產(chǎn)生預(yù)言的電熔化(Em)曲線和方程。
(7c)在高基因組背景中電雜交真正的靶DNA序列通常只組成在基因組DNA樣品中的總DNA的一小部分。通過在APEX裝置上的非常小的定位區(qū)濃縮總DNA，本發(fā)明增加了在異源DNA過剩的情況下靶雜交的效率。
在該實施例中，含有5’-氨基的附著序列被附著到含有22％PAGE、1％丙烯酸琥珀酰亞胺的檢測裝置。用ET-2AL或ET-11AL俘獲序列衍生毛細管。用德克薩斯紅標(biāo)記靶探針ET-12R。ET-12R-TR將雜交到ET-23AL上，但不雜交到ET-11AL俘獲序列，分別進行檢測和控制。
將異源基因組DNA，小牛胸腺DNA(CT DNA，Sigma)，溶解到水中使終濃度為1mg/ml，超聲處理以使DNA變性。在0.5x TBE中制備含有1010拷貝數(shù)的ET-12R-TR靶序列和0、0.1微克、1.0微克變性CTDNA的樣品終體積100微升。這就代表相當(dāng)于靶DNA多出0、1，000、10，000倍的CT DNA。
檢測裝置每次使用Bio-Rad 1000/500電源在0.3mA 0.5XTBE中預(yù)運行5分鐘。設(shè)定裝置以雙道模式運行，這樣檢測和控制毛細管就可以在完全相同的條件下在相同的時刻運行。施加樣品(100μl)，在0.03mA下5分鐘使毛細管偏壓為正電勢以吸引DNA。顛轉(zhuǎn)極性并施加相同的功率以從檢測裝置表面去除所有的未雜交的ET-12R-TR靶。吸出緩沖液，并在安裝有硅增強CAD照相機(濱松)的Jena顯微鏡上通過落射式熒光觀察檢測裝置，并用索尼圖象打印機記錄。
在每100微升中有或沒有0.1μg CT DNA的絕對雜交信號和信噪比之間沒有差異。信號強度相當(dāng)，并且信號沿主動面積均勻分布。
以每100微升1微克CT DNA的水平，信號主要分布在環(huán)繞毛細管的周界，表明俘獲序列被中斷或飽和。通過在雜交步驟過程中擺動極性這一人工效應(yīng)可以很容易地被克服。這將脈沖總DNA朝向或遠離主動面積，允許靶更有效和均勻地雜交。
(7D)被動雜交和電控制的雜交因為在電控制的雜交中的濃縮效應(yīng)，電控制的雜交比被動雜交更有效和更快。
用ET-23AL和ET-11AL附著序列制造微毛細管檢測裝置分別作為檢測和控制裝置。就形成總體積100微升含1×1010拷貝數(shù)的ET-12R-TR與1微克CT DNA的雜交溶液。
被動雜交在50℃用100微升在小試管中安置一套檢測和控制裝置，并雜交15分鐘。然后在45℃1xSSC、0.1％SDS洗滌樣品3次，每次5分鐘。
電控制的雜交在0.06mA下安裝檢測裝置并預(yù)運行5分鐘。吸出緩沖液并加入100微升雜交溶液。在0.06mA下偏壓檢測裝置為正3分鐘，然后顛轉(zhuǎn)極性30秒鐘，并再次顛轉(zhuǎn)極性使檢測裝置再次為正3分鐘。將檢測裝置偏壓為負3分鐘以電洗滌。
使用主動型式比被動型式雜交的效率和程度顯著高。在主動(電)形式中的絕對信號比在被動型式中的信號高100倍多。在主動型式中的信噪比在被動型式信號增加10倍多。使用最小操作在10分鐘內(nèi)完成主動雜交試驗。被動型式需要～30分鐘，并需要幾步試管和緩沖液的操作。
常規(guī)的雜交方法使用2.5nm探針和3次C.t15分鐘，完成反應(yīng)90％。以我們的實驗中的探針濃度0.17nm，被動雜交反應(yīng)動力學(xué)將通常需要～4小時。
主動雜交能使用較低濃度的探針，這會造成較低的背景。傳統(tǒng)方法取決于擴散，從而必須使用更高濃度的探針以驅(qū)動反應(yīng)動力學(xué)。主動方法能濃縮樣品到一個非常小的體積，造成非常高的局部探針濃度和非?？斓碾s交反應(yīng)動力學(xué)。
結(jié)構(gòu)通常，非擴增型雜交檢測的總敏感性受制于非特異性結(jié)合的背景。當(dāng)使用多報告組或與有多報告組的次級復(fù)合物時，這通常是一個主要的問題。因此，在達到報告標(biāo)記的實際或固有檢測極限之前，通常已經(jīng)很好地達到了試驗檢測極限，使用電控制的雜交方法，我們發(fā)現(xiàn)高熒光亞微米或毫微米級珠可以和附著的DNA探針一起使用進行超敏感試驗。我們已經(jīng)能夠使用自由場DNA電泳控制DNA探針熒光毫微結(jié)構(gòu)。因為電嚴緊控制從未雜交結(jié)構(gòu)能高水平識別出雜交結(jié)構(gòu)，DNA熒光毫微結(jié)構(gòu)就能顯著增強雜交敏感性。電嚴緊控制允許我們利用這些高熒光毫微結(jié)構(gòu)或其他多標(biāo)記的方案進行低拷貝數(shù)(50到1000靶)檢測，而不必進行任何擴增。迄今為止，這對常規(guī)雜交方法和步驟都還是不可能的。
熒光毫微顆粒、熒光球得自分子探針公司。這些顆粒含有裝有熒光染料例如德克薩斯紅或熒光素的羧甲基乳膠球?？梢垣@得有不同官能基團，例如胺或醛的乳膠球。粒徑從0.01到5微米。
1)熒光毫微顆粒的表征微修飾的、胺修飾的或醛修飾的毫微顆粒具有凈正電荷。在電場中這些顆粒向負偏壓的微定位區(qū)遷移。
2)DNA附著到熒光球的化學(xué)可以將胺修飾的顆粒偶聯(lián)到含末端醛基團的核酸上。后者可以通過與3’-末端核糖核苷合成，隨后用在說明書上述高碘酸方法氧化的DNA探針產(chǎn)生。
將顆粒以在蒸餾水中的2％懸濁液形式儲存。將25到50微升0.02-1.0微米的胺修飾的紅色熒光熒光球沉淀，并重懸于pH7.40.1M磷酸鈉中。向懸濁液中加入過量的高碘酸氧化的聚ribo-A。使反應(yīng)在室溫下孵育90分鐘。在1xSSC，0.1％SDS(0.15mM氯化鈉，0.015mM檸檬酸鈉，0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉，pH7.0)洗滌和沉淀顆粒三次以去除未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的聚ribo-A。
將在緩沖液中的DNA-熒光球放置于直流電場中。觀察到DNA-熒光球向正電極遷移，表明凈電荷現(xiàn)在為負。這是一種確定偶聯(lián)反應(yīng)是否成功的簡單和方便的方法。傳統(tǒng)的雜交方法需要使用放射性標(biāo)記的報告探針，因為從顆粒發(fā)出的熒光強度將使所有的雜交信號模糊。
3)DNA附著到檢測裝置上用高交聯(lián)琥珀酰亞胺聚合檢測裝置，其中高交聯(lián)琥珀酰亞胺含1％丙烯酸琥珀酰亞胺，丙烯酸琥珀酰亞胺隨后與5’-胺末端的DNA探針反應(yīng)。通過與熒光標(biāo)記的互補探針雜交驗證俘獲序列，寡-T的附著。檢測裝置表面被具有很高的熒光，這表明表面被俘獲序列衍生。
4)電雜交和DNA-熒光球檢測在容納兩個微毛細管，共有一個共同的上儲存室和各自的低儲存室的檢測裝置中進行雜交反應(yīng)。放映表面暴露到共同的儲存室中。
將檢測裝置安裝在該結(jié)構(gòu)中，并在0.5xTBE0.05mA下運行15分鐘。一個檢測裝置具有T2互補附著序列，其他毛細管具有ET-10AL非互補附著序列。向上儲存室加入一微升DNA熒光球。將檢測裝置偏壓為正在0.02mA下5分鐘以吸引DNA-熒光球(熒光毫微顆粒)檢查檢測裝置以確定顆粒是否存在于表面上。顛轉(zhuǎn)極性，這樣檢測裝置就偏壓為負，未雜交的DNA-熒光球就會排斥開來。
在試驗毛細管和對照裝置之間沒有差異。無論施加多大的功率在反復(fù)幾次嘗試后顆粒也不能被去除。
5)被動雜交和DNA熒光球檢測不受任何理論或假說的限制，我們認為顆粒的電雜交物理嵌入或俘獲在檢測裝置表面凝膠基質(zhì)上中的顆粒。因此，被動雜交到凝膠表面上的附著序列的DNA-熒光球應(yīng)當(dāng)更容易被電去雜交去除。
如上所述安裝新檢測裝置。將0.05％的DNA-熒光球滴到上儲存室并被動雜交5分鐘。吸出緩沖液，加入新鮮的1x TBE緩沖液。這時將檢測裝置偏壓為負以排除顆粒。在0.02mA下操作檢測裝置5分鐘，然后用熒光檢查。
在室溫下進行ECS總共10分鐘后試驗和對照毛細管之間有顯著的區(qū)別。信號沿試驗表面均勻分布，但濃縮在信號區(qū)域(pocket)。這就可能說明表面附著序列的可利用性被限制?？梢允褂幂^長的疏水、親水或混合特性的間臂進行改善。這種間臂例如可以使用二氨基己烷和琥珀酸酐制造，其他各種間臂基團在本領(lǐng)域公知。
實施例9特異性ds-DNA序列的電導(dǎo)向限制性酶切用兩個例子驗證APEX芯片裝置選擇性進行ds-DNA序列的限制性內(nèi)切的能力。在這些例子中使用M13mp18(具有XbaⅠ限制位點)和M13mp8(沒有XbaⅠ限制位點)載體。這些載體在許多克隆和DNA測序步驟中被普遍使用。
第一個例子驗證(1)在檢測裝置上電雜交M13mp序列到特異性微定位區(qū)，(2)自由場電泳遷移XbaⅠ限制性酶到微定位區(qū)，和(3)在其他微定位區(qū)隨后俘獲切除的片段。例子還驗證該設(shè)備用特異性結(jié)合體(寡核苷酸俘獲序列)自尋址的能力。
在該方法的基本步驟見圖(16)。在該方法中使用四個共價結(jié)合寡核苷酸俘獲序列特異性微定位區(qū)(ML-1、ML-2、ML-3和ML-4)。使用電遷移系統(tǒng)遷移試劑(寡核苷酸、限制性酶等)和處理反應(yīng)物。
第一步涉及M13-1寡核苷酸俘獲序列向ML-1和ML-2微定位區(qū)的遷移和共價附著，M13-2寡核苷酸俘獲序列向ML-3和ML-4微定位區(qū)的遷移和共價附著。因為在pH＞4下核酸帶負電，當(dāng)在pH范圍5-9內(nèi)電泳時它們總是向帶正電的電極遷移。
第二步涉及自由場電泳遷移和M13mp18序列與在ML-1微定位區(qū)的ML13-1俘獲序列的雜交，和M13mp8序列與在ML-2微定位區(qū)的ML13-1俘獲序列的雜交。
第三步涉及XbaI限制性酶向ML-I(M13mp18)微定位區(qū)和ML-2(M13mp8)微定位區(qū)的遷移。XbaI切除在ML-1的M13mp18，但不切除在ML-2的M13mp8。從ML-1的切除切除片段被遷移并雜交到在ML-3的M13-2序列。作為一個對照實驗，在ML-2和ML-4之間進行自由場電泳。因為在ML-2的M13mp8序列沒有被切除，在ML-4就檢測不到片段。
如說明書上述制備在這一實施例中使用的各種M13附著和探針序列。這些序列如下所示M13-C1 5’-CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGCCAG UM13-C2 5’-GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT TCC TGT GTGUMP18-40C 5’GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGATCC CCG-GGT ATT CM8-40C 5’-TGC CAA GCT TGG CTG CAG GTC GAC GGATCC CCG-GGT ATT CM18-R1 (TR)-5’-AAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TGCMP8-R2 (F)-5’-ACA CAA CAT ACG AGC CGG AAG ACT步驟1M13俘獲序列的附著在這一步中使用有200微米微定位區(qū)的胺激活高交聯(lián)將一個有200微米微定位區(qū)的胺激活高交聯(lián)(26％)聚丙烯酰胺表面或聚碳酸酯(5-10nm)多孔膜表面的APEX試驗裝置用于這一步驟。
M13-C1俘獲序列是一個含3’-核糖核苷的31聚體DNA寡核苷酸。M13-C1序列與M13mp18 3’端和M13mp8單鏈(+)載體互補。M13-C1俘獲序列被設(shè)計來雜交和強烈結(jié)合所有的未切除的M13載體。
M13-C2序列是一個含3’-核糖核苷的31聚體寡核苷酸。M13-C2序列與從含XbaⅠ限制性位點的克隆位點起M13序列上游部分互補。M13-C2俘獲序列被設(shè)計來雜交和強烈結(jié)合所有的XbaⅠ切除的M13載體。
通過paraded氧化M13-C1和M13-C2俘獲序列被激活用來偶聯(lián)到胺衍生的在APEX微定位區(qū)。通過paraded氧化方法3’核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)化成醛末端，醛末端就能與伯胺反應(yīng)形成席夫氏堿。
反應(yīng)條件如下在水中溶解10-20O.D.的M13-C1或M13-C2寡聚體達終濃度1OD/μl。加入1體積的pH0.45的0.1乙酸鈉，和1體積鈉paraded(在水中新鮮制備)。在暗處室溫下攪拌和孵育反應(yīng)至少2小時。將反應(yīng)混合物裝到用pH7.4 0.1M的磷酸鈉平衡的Sephadex G-10柱(巴斯德滴管，0.6×5.5cm)。收集200微升組分，在薄層色譜(TLC)上點樣2微升并收集在紫外(UV)吸收組分。
設(shè)計APEX試驗裝置的四個頂面為ML-1、ML-2、ML-3和ML-4可尋址的微定位區(qū)。
通過下面的步驟將M13-C1共價偶聯(lián)到ML-1和ML-2微定位區(qū)上將上和下儲存室充滿pH7.4的0.1M磷酸鈉，并使用BioRad500/1000電源在0.05mA恒定電流下預(yù)運行5分鐘。將含有～0.1O.D.單位的paraded氧化的M13-C1寡聚體的電傳送系統(tǒng)頭放到下儲存室。電傳送系統(tǒng)是一個在里面有鉑電極的特異性修飾的塑料滴管頭。在0.1mA下使電傳送系統(tǒng)偏壓為負(-)，微定位區(qū)ML-1和ML-2偏壓為正(+)。在恒定電流下是M13C-1電泳到ML-1和ML-22分鐘，其中它共價結(jié)合到表面上。顛轉(zhuǎn)極性～4分鐘，使未反應(yīng)的M13C-1從ML-1和ML-2去除。
用上述同樣的方法將M13C-2序列附著到ML-3和ML-4微定位區(qū)。
步驟2-M13載體、互補序列和熒光報告探針的雜交因為限制性內(nèi)切酶切除需要雙鏈DNA，單鏈M13mp18(從6240到6280)和M13mp8(從6230到6270)的克隆/限制位點片段必須用互補DNA序列雜交。電雜交被用來分別雜交40聚體互補片段(MP18-40C序列)到在ML-2/M13C-1微定位區(qū)的M13mp18載體；并雜交40聚體互補片段(MP8-40C序列)到在ML-2/M13C-1微定位區(qū)的M13mp8載體。
通過在0.1mA使含0.05 O.D.單位的M13mp18點傳送系統(tǒng)偏壓為負(-)，使ML-1/MP13C-1微定位區(qū)偏壓為正(+)2分鐘進行點雜交。對電雜交M13mp8到ML-1/M13C-1微定位區(qū)使用相同的步驟。
然后用兩種不同的熒光報告探針電雜交M13mp18和M13mp8。在ML-1/M13C-1微定位區(qū)上的M13mp18電雜交以24聚體德克薩斯紅標(biāo)記的報告探針(MP18R-1序列)，探針雜交到5’端克隆/限制位點。M13mp8載體電雜交以24聚體熒光素標(biāo)記的報告探針(MP8-R2序列)，探針雜交到5’端克隆限制位點。
步驟3使用XbaI限制酶限制切除M13取決于它們的等電點(pI)，許多蛋白質(zhì)和酶在pH5-9的范圍可帶負電(pH＞pI)，不帶電(pH=pI)或帶正點(pH＜pI)。大量限制內(nèi)切酶的等電點在6-7范圍。在pH大于pI時，這些酶將帶負電荷。因此，當(dāng)在pH＞7的緩沖液中進行自由場電泳，這些酶將向帶正點的微定位區(qū)遷移。
對于許多DNA修飾酶例如限制性內(nèi)切酶，總是需要選擇一種緩沖液，該緩沖液能在優(yōu)化的酶活性和相對快的電泳淌度之間取得平衡。在某些情況下，有可能在大于或小于pI的pH下都具有較好的酶活性。取決于所選擇的pH，這些酶可以向正或負偏壓的微定位區(qū)遷移。
如下進行在ML-1的M13mp18的XbaI切除。使用一個電傳送系統(tǒng)XbaI首先自由場電泳到ML-1/M13mp18微定位區(qū)。在0.1mA下將在pH7.7的緩沖液中含100單位的Xba1電傳送系統(tǒng)偏壓為負，ML-1/M13mp18微定位區(qū)偏壓為正2分鐘。然后降低電流到0.02mA3分鐘。關(guān)閉電傳送系統(tǒng)，同時在0.1mA下使ML-1/M13mp18微定位區(qū)偏壓為負，ML-3/M13C-2微定位區(qū)偏壓為正5分鐘。這時ML-3/M13C-2微定位區(qū)偏壓為負，啟動電傳送系統(tǒng)并在0.1mA下偏壓為正2分鐘以去除從ML-3/M13C-2微定位區(qū)Xba1和未雜交的片段。
通過落射式熒光顯微鏡觀察可以看到在ML-1/M13mp18的紅色熒光信號喪失，在ML-3/M13C-2微定位區(qū)出現(xiàn)紅色熒光信號，驗證了M13mp18載體的Xba1切除。這時對ML-2/M13mp8微定位區(qū)重復(fù)進行相同的基本Xba切除步驟，以作為負對照。因為M13mp8載體沒有Xba1位點，片段的切除和產(chǎn)生是不可能的。ML-2/M13mp18微定位區(qū)因此就保持其綠色熒光信號，在ML-4/M13C-2微定位區(qū)觀察不到熒光信號。
第二個例子用共價附著到裝置上的可尋址的微定位區(qū)的限制酶進行限制切除反應(yīng)。在這種情況下，限制性內(nèi)切酶將被衍生并自由場電泳到它們能夠共價結(jié)合的APEX裝置的可尋址微定位區(qū)。將限制性酶衍生或共價結(jié)合到固體載體上的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。許多不同的限制酶可以尋址到APEX裝置上。通過自由場電泳進行特異性的酶切反應(yīng)以在含所需限制性內(nèi)切酶的微定位區(qū)濃縮ds-DNA載體或DNA樣品。ds-DNA將被切除，然后片段移動到裝置上的其他微定位區(qū)。這時所需的或有用的其它DNA修飾酶將偶聯(lián)到APEX裝置上的可尋址微定位區(qū)。另外，這一例子被認為不受DNA修飾酶的限制，因為大多數(shù)其它酶都能附著到在APEX裝置上的可尋址微定位區(qū)。
實施例10電擴增方法在用非常低靶序列拷貝數(shù)的(例如，HIV，膿血感染)雜交分析的情況下，靶DNA序列的增殖和擴增將通過純化的靶DNA和/或RNA在APEX裝置上的擴增使得敏感性提高。擴增也降低了在雜交分析之前非常高產(chǎn)率制備步驟的需要。
APEX擴增方法為DNA遷移、變性、和反應(yīng)合成提供了完全的電控制。最重要的是不用高溫或不需耐熱聚合酶或其他熱穩(wěn)定酶就可以電變性雜合體。
作為第一個例子，可以使用DNA聚合酶(Klenow大片段)高保真地完成DNA合成。而不需進行熱循環(huán)。在該實施例中，以異種使其共價結(jié)合到微定位區(qū)的方法擴增DNA鏈。該方法以下面的方式進行1)將已知靶序列電雜交到在尋址微定位區(qū)上的已知序列的俘獲探針上，2)通過已用俘獲探針處理的DNA聚合酶合成新生互補鏈DNA(-)，3)將新合成的DNA雜合體電變性，4)進行靶鏈DNA向非-延伸俘獲探針退火，和-鏈互補探針向新生-鏈DNA退火。5)用DNA聚合酶進行新生靶鏈DNA(+)的合成和如2所示的-鏈DNA的伴生合成，重復(fù)這些步驟從而加倍每次的+和-鏈的數(shù)目，和6)通過雜交到特意設(shè)計的互補探針上進行擴增靶的大小選擇。完整的方法見圖17所示，更詳細地描述如下步驟1)靶序列向俘獲序列的附著將靶序列電泳遷移到含共價結(jié)合俘獲探針的微定位區(qū)(1)。靶序列可以在非靶(基因組)序列背景下存在，但必須在退火到俘獲探針之前被變性。最初被俘獲的靶序列將有各種長度。
步驟2)與靶互補的DNA的合成將DNA聚合酶和dNTP’s電遷移到微定位區(qū)1。俘獲探針為DNA聚合酶提供3’末端，俘獲的靶序列提供模板。施加足夠的電流維持試劑濃度進行反應(yīng)。電流可以是恒定或脈沖的，這些參數(shù)可以操作以獲得不同長度范圍的新生互補(-)鏈。
步驟3)新合成鏈的電變性顛轉(zhuǎn)在微定位區(qū)1的極性，施加電壓分開兩條鏈。電壓量和施加時間將取決于雜交DNA復(fù)合體的長度和堿基組成。這些參數(shù)可以經(jīng)驗確定或從電變性曲線計算出來。
步驟4)引物退火(俘獲和互補探針)到DNA鏈寡聚體需要退火到+和-鏈以提供DNA聚合酶的引物位點。對于靶或+鏈這是通過電泳遷移+鏈到未伸展的俘獲探針完成的。只要未伸展的俘獲探針對伸展的共價結(jié)合-鏈DNA是過剩的這就會發(fā)生?；パa探針電泳到微定位區(qū)并結(jié)合到共價結(jié)合的-鏈DNA。這時+和-鏈都有電泳到結(jié)合到它們的引物，并是DNA聚合酶催化合成的模板(見圖)?；パa探針與非共價結(jié)合-鏈DNA的結(jié)合也可以產(chǎn)生，但是，這些雜合體不能電變性，因此應(yīng)對總擴增幾乎沒有影響。
步驟5)兩種新DNA鏈的合成重復(fù)步驟2，因為+和-鏈是引物模板，序列特異性DNA的量加倍。重復(fù)這些步驟每次DNA的量將幾何增加。
步驟6)擴增靶序列的大小選擇互補探針的核酸序列將決定擴增靶DNA的大小和序列。因此，擴增的DNA通常被設(shè)計來增強在隨后分析和/或操作中的效率。
在本發(fā)明中的擴增方法中可以使用其它酶，包括但不限于其他DNA聚合酶、T7或SP6RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA連接酶和聚核苷酸phosphoreaylase，和其他核酸修飾酶(核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶)的結(jié)合。
實施例11電控制器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)所有的裝置，不管是APEX芯片還是微加工的裝置，都具有可尋址微定位區(qū)(或宏定位區(qū))陣列的特性。計算機控制/數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)被設(shè)計來對陣列中的所有墊片各自施加電勢并測量在微定位區(qū)電解液系統(tǒng)中產(chǎn)生的電流。計算機控制/數(shù)據(jù)收集界面提供a)顯示微定位區(qū)的陣列。高電平和低電平顯示在最高電平圖下為所有微定位區(qū)的視圖提供微定位區(qū)區(qū)段的分辨率，在較低電平下為它們提供完全分辨的微定位區(qū)區(qū)段。
b)在微定位區(qū)上的點擊將彈出微定位區(qū)的窗口視圖，該視圖詳述了微定位區(qū)的的特性，允許以各種類型、電勢大小和標(biāo)記等的信號時序設(shè)定微定位區(qū)的控制，顯示覆蓋在其他微定位區(qū)的控制時序。菜單為控制設(shè)計、觀察的實際控制信號和收集的數(shù)據(jù)提供分析、記錄和歸檔功能。
c)軟件提供通過從b)描述的陣列控制軟件所發(fā)出的輸入所控制的硬件接口提供所有的切換和數(shù)據(jù)收集。
d)一個單獨的硬件和軟件系統(tǒng)提供圖象收集和處理能力。這一系統(tǒng)成像微定位區(qū)陣列和記錄在主動微定位區(qū)DNA結(jié)合相互作用發(fā)出熒光信號，以提供DNA結(jié)合實驗結(jié)果的讀出。圖象處理軟件提供定量處理這些圖象和取出定量分析結(jié)果的能力。這一軟件與陣列控制器/數(shù)據(jù)收集軟件充分接口，以提供一個記錄APEX裝置控制/電解液現(xiàn)時數(shù)據(jù)和圖象數(shù)據(jù)分析結(jié)果的集成系統(tǒng)，分析數(shù)據(jù)以提供關(guān)于這些結(jié)果的一致性和可靠性的輔助信息，和歸檔所有的數(shù)據(jù)和分析結(jié)果。
e)APEX控制器將結(jié)合所有的這些軟件以及只提供“DO分析”的頂層，如果必要的話可再加一個存取a)到c)功能的按紐，但在所有的情況下a)到c)都將收集和存檔。
f)用來開發(fā)本項目的控制器的初始版本使用麥金托什蘋果機Quadra950作為主計算機，并使用與Quadra950接口的國家標(biāo)準儀表板(NationalInstruments)以提供如上所述的硬件接口。這些板對APEX微定位區(qū)使用可變電勢，并測定在電解液系統(tǒng)中產(chǎn)生的電流。在這一控制器中使用的國家標(biāo)準儀表板是高分辨力多功能I/O板，NB-MIO-16XL-18，模擬輸出板，NB-AO-6，定時輸入/輸出板，NB-TIO-10，塊模式DMA和GPIB接口板，NB-DMA2800，和模擬信號調(diào)節(jié)模塊板和熱電偶模塊，以及其他的環(huán)境傳感器，5B系列。在Quadra中的NuBus板和APEX裝置之間的連接將通過安裝在SCXI-1001機殼上的SCXI16-道SPDT繼電器模塊板連接。
實施例12電控制的樣品制備和雜交分析-集成APEX系統(tǒng)樣品制備通常涉及細胞的選擇；細胞材料的破壞(例如，溶胞)，一系列分離步驟和親和反應(yīng)。樣品制備對分子生物反應(yīng)是很重要的。例如，由于在樣品制備過程中的低效造成實際靶DNA序列大量喪失通常限制雜交實驗。
用于電控制的基本APEX概念可以用于在DNA雜交試驗中的樣品制備。電方法將允許樣品制備，細胞選擇和分析在APEX元件的主動電系統(tǒng)進行。樣品制備將從細胞選擇和溶胞、在樣品中從細胞和胞外材料粗分離DNA開始。電裝置將電處理樣品DNA并把它有效遷移到裝置的分析元件上，同時去除其它的材料。系統(tǒng)提供有效處理靶DNA的合適的放大系數(shù)。對于人類基因組分析，電樣品制備將包括一步高效的預(yù)雜交步驟，通過這一步驟大多數(shù)非特異性DNA的復(fù)合體將從靶DNA中分離出來。
有樣品制備的集成裝置或完整的APEX系統(tǒng)將抽取相對粗的樣品(血液、唾液、尿等)，并用最小的機械操作和射流技術(shù)進行處理，然后電傳送靶DNA到裝置的分析元件上。這一“主動電處理”不同于通常是機械型手工處理和技術(shù)的自動化或機器人處理。
可以使用許多全基于通常APEX概念的元件制造集成DNA樣品制備和分析的APEX系統(tǒng)。該系統(tǒng)的元件包括(1)電細胞分類單元；(2)電試劑分配單元；(3)電廢物處理單元；(4)粗DNA選擇器單元；(5)附屬的DNA或限制片段選擇器單元；(6)DNA片段儲存單元；和(7)APEX分析單元(芯片)。集成APEX系統(tǒng)如圖6所示。
這種系統(tǒng)可以在大的硅基片上制造?；蛘呤?，通過微光刻或微加工技術(shù)并在特意設(shè)定的平臺單元上安置(即插入)制造各個元件。設(shè)計整個系統(tǒng)的元件使得其主動面積與其樣品大小和樣品(例如細胞)中的物質(zhì)的量成比例。例如，細胞選擇器主動面積通常比粗DNA選擇器主動面積大，而粗DNA選擇器反過來又比限制片段選擇器活性面積大，限制片段選擇器比APEX分析芯片有效面積大。
例如，細胞選擇器的“主動面積”可以是幾平方厘米的數(shù)量級，而64微定位區(qū)APEX分析元件的總“有效面積”將少于1平方毫米。平臺單位被設(shè)計來在密封的共用緩沖儲存室中容納所有的元件單位。達幾百微升的合適的樣品通過臨近細胞選擇器元件的樣品添加口加到系統(tǒng)中。細胞選擇器元件是一個較大的APEX裝置，對不同的細胞類型有幾個或多個選擇親和性。這些親和選擇可以基于細胞表面電荷、半抗原和抗原進行。
例如，可以對全血樣品親和選擇以從紅細胞選擇白血細胞(淋巴細胞等)。可以使用高選擇性的方法從血樣品材料中選擇胚細胞。也可能為感染微生物(酵母、真菌、細菌和病毒)提供親和選擇。當(dāng)選擇的細胞保持與細胞選擇器元件附著；所有的其他細胞和蛋白質(zhì)材料被遷移到廢物處理單元。在這時細胞可以通過帶電去垢劑和/或促溶劑，和/或合適的水解酶和蛋白酶(溶菌酶、蛋白酶K、胃蛋白酶等)的從電試劑分配單元自由場電泳遷移到在細胞選擇單元的細胞上而溶解。適當(dāng)?shù)碾姀U物處理系統(tǒng)可以用來溶解廢物材料。這時可以使用正偏壓的粗DNA選擇單元以遷移粗核酸(DNA/RNA)材料到這一元件。
粗DNA選擇器是對DNA有普遍親和性的APEX裝置。這一親和性可以是帶正電的，或帶常見或重復(fù)DNA序列。例如，一個Alu重復(fù)俘獲序列將有效俘獲大多數(shù)的從體細胞提出的粗DNA。當(dāng)以感染疾病分析為目的時可以使用常見或基因細菌或病毒序列。除了從DNA去除多余的材料；APEX系統(tǒng)還能設(shè)計來降低樣品DNA的復(fù)雜性。這可以通過使用限制性酶以在粗DNA選擇器單元選擇性切除DNA。限制性鎂從試劑分配單元遷移出。這時通過使它偏壓為正切除的限制性片段可以從次生的DNA或限制性片段選擇單元。這一單元被設(shè)計來使用在其表面的合適的復(fù)活序列選擇結(jié)合大的DNA片段。
這時，選擇的DNA片段可以被遷移到APEX分析芯片進行雜交分析。也可能把DNA片段遷移到儲存單元或甚至遷移出系統(tǒng)。上述這些例子只是代表樣品制備和多雜交分析的某些可能的方案。元件的結(jié)合親和編程能力和結(jié)合不同元件和功能的靈活性允許實現(xiàn)很多種類的方法。
實施例13用組氨酸和其他兩性離子緩沖液的電雜交在這些實驗中使用的緩沖液和化學(xué)物質(zhì)購自Sigma(圣路易斯，蒙大拿州)，Aldrich(密爾沃基，威斯康星州)，ICN Biochemicals(奧羅拉，俄亥俄州)，寶靈曼(印第安納波利斯，印第安納州)或Calbiochem(圣地亞哥，加利福尼亞州)。寡核苷酸合成’97)，或購自O(shè)ligoTherapeutics(威爾遜威爾，俄勒岡)。肽核酸(PNA)寡核苷酸類似物由博大生物系統(tǒng)(PerSeptive Biosystem)合成。
微電子芯片，滲透層和儀器除了下述之外與上述相同。這里所用的滲透層在頂層含抗生物素蛋白鏈菌素瓊脂糖層(總厚約1微米)。為了制備下層，在涂布抗生物素蛋白鏈菌素-瓊脂糖層之前將50ml乙二醛瓊脂糖(2％)以2000rpm旋轉(zhuǎn)20秒鐘。簡而言之，用于這些實驗的5580系列APEX芯片由在陣列的每一個角有200nm微電極5×5陣列的80cm圓形微電極組成。芯片被安裝在微操作臺上并用電源和適當(dāng)?shù)目煽乩^電器開關(guān)激發(fā)微電極。使用594nm HeNe激光傾斜照明肉眼觀察在芯片上的熒光標(biāo)記的寡核苷酸，使用NIH成像或IPLab光譜軟件包對圖象進行量化。
積聚和雜交將兩種生物素標(biāo)記的俘獲寡核苷酸、ATA5和ATA4進行電遷移并定位在臨近的微定位區(qū)。去除溶液并在試驗緩沖液中洗滌3-4x。在這些研究中使用的緩沖液列于表3，并以所列出的pH和濃度使用。
表3溶液 濃度 pKa1pI pH2電導(dǎo)甘氨酸50mM 2.34，9.605.976.012.5+／-0.2甘氨酸250mM 2.34，9.605.976.117.8+／-0.5β-丙氨酸 50mM 3.60，10.19 6.906.713.6+／-0.6GABA 50mM 4.03，10.56 7.306.765.6+／-0.6半胱氨酸 50mM 1.71，5.025.089.0+／-0.98.3310.78半胱氨酸 250mM 1.71，5.02 nd421.8+/-4.48.3310.783(τ)-甲基組 50mM 1.70，7.527.4439.4+／-0.4氨酸5.879.163D-組氨酸 50mM 1.78，7.477.7057.1+／-0．35.978.97L-組氨酸 50mM 1.78，7.477.6560.1+／-0.15.978.97肌肽 50mM 2.64，8.178.0774.5+／-5.56.83，9.511(τ)-甲基組 50mM 1.64，7.547.59117+/-2.8氨酸6.468.613吡啶 50mM 5.19 - 8.175.0+／-0.8咪唑6.99 - 9.0817.6+／-1.6可力丁 6.99 - 9.8533.0+/-0.91.數(shù)值得自Budavari，S.(1980)，MerckIndex，11版，Merck&Co.Inc.Rahway，NJ，除非另有標(biāo)注。
2．在室溫水中測定緩沖液的pH。
3．Remelli，M.Munerato，C.和Pulidori，F(xiàn).(1994)，J.Chem.Soc.DaltonTrans。2049-2056。
4.nd=沒有測定。
使用氨基酸的L-異構(gòu)體，除非領(lǐng)有標(biāo)注。芯片在試驗緩沖液中平衡5-10分鐘。然后使用含10nM BODIPY-德克薩斯紅標(biāo)記的RCA5(btrRCA5)與ATA5互補的寡核苷酸但不含ATA4(RS paper)的新鮮緩沖液。
ATA5 5’-GATGAGCAGTTCTACGTGG-3’-生物素ATA4 5’-GTCTCCTTCCTCTCCAG-3’-生物素btrRCA5btr-5’-CTACTCGTCAAGATGCACC-3’將200nm的微定位區(qū)用作陰極，在陣列中的一個微電極用作相應(yīng)的陽極。通過對各個微定位區(qū)提供500nA的恒定電流30秒鐘，并監(jiān)測在微電極陣列中正偏壓的(陽極)位點上熒光的積聚評定積聚狀況。減去從非熒光源產(chǎn)生的信號(即，熱噪聲等)。以類似的方式對不同電流對信號積聚的影響進行檢測實驗，除了施加電流從100nA到1mA變化。在起初5秒的信號積聚中計算起始速率，其中，在所有的緩沖液中都觀察到線性熒光積聚。為了比較各種緩沖液的電導(dǎo)性，使起初熒光的數(shù)據(jù)增加數(shù)倍，以解釋在信號水平的芯片對芯片變化以及激光照明變化。對于其他實驗，在把觀察的熒光強度轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的寡核苷酸摩爾數(shù)后，以微微微摩爾產(chǎn)物對時間表示數(shù)據(jù)。
在一個微電極定位區(qū)聚集后，去除緩沖液并加入含btrRCA5的新鮮緩沖液。臨近的微定位區(qū)以同樣的方式提供電源。完成后，去除緩沖液，用不含btrRCA5的試驗緩沖液洗滌芯片5-7x。然后照明預(yù)先靶定的微電極對定量在每一位點存在的熒光。對照實驗利用bodipy-德克薩斯紅標(biāo)記的與ATA4互補的寡核苷酸以檢驗ATA4俘獲寡聚體的完整性和濃度。雜交百分率如下計算(互補寡核苷酸信號-非互補信號)/(在施加電流那一刻存在的信號)×100。
緩沖液電導(dǎo)和pH測定在RT使用一個與Accumet型50pH/離子/電導(dǎo)儀(Fisher Scientific)連接的Acument1.0cm-1玻璃電導(dǎo)池測定用于遷移和雜交的試驗緩沖液的電導(dǎo)。使用一個Accu-pHast可變溫度復(fù)合電極和相同型號的電導(dǎo)儀測定緩沖液pH值。
微pH測定使用在其他地方(Horrock‘93)已經(jīng)描述的方法制造銻電極，除了下面微小的改動。θ玻璃，世界精密儀器，薩拉索塔，佛羅里達州)雙柱型電極，另外，所有的毛細管被手工拉到最終尖端直徑估計為75微米。使用上述pH測定相對于Ag/AgCl參比電擊銻電極的電勢。銻電極的標(biāo)定產(chǎn)生57mV/pH的斜率，這與其他文獻值一致(Horrock’93，Bicher’72，Matsumara’80，Glab‘89)。當(dāng)通過顯微鏡進行觀察，使用一個機動的X-Y-Z微操作器把銻電極降低到瓊脂糖涂布的芯片的表面，直到觀察到電極彎曲。然后把電極升高到一定高度，恰好高于所觀察的拐點。從銻電極到芯片表面的距離測定為7微米。然后把銻電極的尖端以一傾斜角定位在各個微電極孔之上，以使擴散效應(yīng)最小化(Horrock‘93)。在50mM KCl、50mM組氨酸、50mM咪唑或50mM GABA中使用200nA或500nA獲得pH讀數(shù)。
被動雜交與電場雜交將ATA5電靶送到上述制備的抗生物素蛋白鏈菌素/瓊脂糖包被的芯片上的微陣列的起初4列上，將ATA4靶送到剩下的列上。對于被動雜交，在5x SSC(1x=0.15M NaCl，15mM檸檬酸鹽，pH7.0)施加5.0nM或0.5nM btrRCA5 1分鐘，然后在緩沖液中洗滌6x并成像。對于3分鐘的時點，施加含btrRCA的新鮮緩沖液并孵育另外2分鐘以達到3分鐘的累積孵育時間。對剩下的時點重復(fù)這一方法。使用在50mM組氨酸中的5nMbtrRCA5進行類似實驗。對于電場雜交，施加在50mM中的5.0nM或0.5nMbtrRCA5?？偣彩褂?.1V(約500nA/位點)，電靶送五個位點，4個預(yù)先附著以ATA5，一個預(yù)先附著以ATA4。在對所需的時間段施加電流后，在組氨酸中洗滌6x并成像。對于表明的次數(shù)以類似的方式通過靶送新鮮的在組氨酸中的btrRCA5到預(yù)先未靶定的位點獲得數(shù)據(jù)點。在被動和電場介導(dǎo)的雜交，在ATA4位點存在的背景信號減去在ATA5位點存在的信號。
磷酸二酯連接的寡核苷酸與PNA類似物的雜交的比較在pH7.410％甘油，25mM NaCl，25mM磷酸鈉中使用Eppendorf微操作器5171和Transjector 5246將30μM生物素標(biāo)記的寡核苷酸或這些寡核苷酸的PNA型微沉積在抗生物素蛋白鏈菌素/瓊脂包被的微陣列的各個位點。孵育30分鐘后，將芯片用水洗滌。寡核苷酸序列和PNA類似物序列如下DNA1生物素-CACCTGCTTTGATAGCTGPNA1生物素-O-O-CACCTGCTTTGATAGCTG，O=接頭DNA2生物素-GATGAGCAGTTCTACGTGGPNA2生物素-O-O-TGTACGTCACAACTA報告DNAbtr-CAGCTATCAAAGCAGGTG，btr=與報告DNA互補的BODIPY-德克薩斯紅DNA1和PNA1，其中DNA2和PNA2起到對照作用以評定非特異性雜交。用在50mMGABA或50mM組氨酸中的5微升DNA報告探針進行電雜交。芯片在200nA或30秒或在500nA30秒電激活。在每一電雜交后，將芯片用相同的緩沖液洗滌幾次。在最后電雜交后，用0.2 xSTE(20Mm NaCl，2mM Tris-HCl，pH8.0，0.2mMEDTA，pH8.0)和0.1％十二烷基硫酸鈉浸洗芯片幾次，并最后進行成像。如上計算雜交率。
在不同的pH進行被動雜交將生物素標(biāo)記的ATA5和ATA4靶送到用抗生物素蛋白鏈菌素/瓊脂糖包被的微陣列的臨近位點。將在其等電點(pH》7.5)，或用HCl調(diào)節(jié)到或者pH6.0，5.0，4.0，或3.0的50mM組氨酸中含100nM btrRCA5的緩沖液加到每一芯片并使之反應(yīng)10分鐘。在6xSSC中進行平行雜交實驗。在雜交后，如上在0.2x STE，0.1％十二烷基硫酸鈉中洗滌芯片幾次，定量在每一位點剩下的熒光。熒光值就是在ATA4位點的熒光值減去臨近的ATA5位點的熒光值并把剩下的熒光轉(zhuǎn)化成btrRCA5特異性雜交的微微微摩爾數(shù)。在這一方法中重復(fù)另外實驗，并還檢查用濃縮的乙酸(在等電點或pH6和5)。觀察到類似的結(jié)果。
結(jié)果緩沖液組分對寡核苷酸遷移的影響為了促進互補核酸在稀釋溶液中的雜交，樣品必須在俘獲序列之上濃縮。這就引起環(huán)繞俘獲的區(qū)域內(nèi)檢測時間(Cot)的局部增加，通過質(zhì)量作用增加雜交速率。在恒定的電流條件下，電荷將被在溶液中的所有的離子種類遷移，從而溶液的電導(dǎo)將決定寡核苷酸攜帶的電流部分。因此，希望低電導(dǎo)溶液以使寡核苷酸更迅速遷移和聚集在陽極上。為了測量它，熒光標(biāo)記的報告基因寡核苷酸被電靶送到定位區(qū)，其中互補或非互補寡核苷酸預(yù)先已經(jīng)被附著。然后對幾種不同的緩沖液(表3)在對應(yīng)于施加電流的時間聚集熒光信號。我們注意到最終聚集達到一個平臺。因此，為了準確測定電導(dǎo)的效果，我們測定了聚集的起始速率。圖20示出了對選擇的代表性的緩沖液的分析。熒光信號的最初增加與緩沖液電導(dǎo)的倒數(shù)(即，溶液的電阻)比較。這一曲線表明溶液電阻與信號的聚集之間基本上是線性關(guān)系。溶液越導(dǎo)電，寡核苷酸聚集的速率越緩慢。
有趣的是，在半胱氨酸中的聚集速率(在圖20中兩組數(shù)據(jù)都在橫坐標(biāo)之上并遠離截距)比基于起始電導(dǎo)所預(yù)計的速率低。一個可能的解釋是半胱氨酸的巰基在電壓低于水解所需的電壓時是電化學(xué)反應(yīng)的(Davis’66)，并產(chǎn)生多余的反應(yīng)離子或分子。因此，除了溶液的起始電導(dǎo)之外的因素也可能支配緩沖液例如半胱氨酸的電泳特性。
如上所述，我們還注意到熒光聚集的逐漸放慢，不同緩沖液之間的速率不同。在恒定的電流，在一定時間離子強度梯度從電極進入到主體溶液中(Oldham’88，Newman’91)。這就導(dǎo)致在溶液中的電導(dǎo)增加恰好電極之上。這種電導(dǎo)的增加引起較低的淌度，或DNA聚集速率的降低。另外，當(dāng)DNA在電極上聚集，擴散增加對抗電場介導(dǎo)的DNA遷移，也表現(xiàn)為總聚集速率。最后，達到一種穩(wěn)態(tài)，其中擴散速率等于電場遷移，造成沒有寡核苷酸的凈聚集(Newman’91)。另外，當(dāng)它們遭遇電化學(xué)介導(dǎo)降低的pH與寡核苷酸匹配的區(qū)域時(見下)寡核苷酸的淌度下降。最后，在反應(yīng)后期熒光信號被電化學(xué)淬滅，信號喪失。
如果核苷酸自己攜帶電流，帶電寡核苷酸的遷移將根據(jù)與施加電流成比例進行預(yù)計。然而，在圖21的分析表明隨著電流的增長沒有線性行為。當(dāng)施加的電流增加信號聚集的速率看來達到一個平臺。這一效應(yīng)對組氨酸這種比GABA電導(dǎo)更高的緩沖液更具有戲劇性。非線性聚集速率與在較高電流下離子組成的構(gòu)建更快或緩沖液的產(chǎn)品分解不一致。
應(yīng)用到雜交的電場的影響圖22示出了寡核苷酸的電濃度對雜交速率的影響。在這一實驗中，寡核苷酸首先被導(dǎo)向到然后錨定在微陣列的選擇的位點上。相應(yīng)的熒光標(biāo)記互補寡核苷酸，或者被以高鹽緩沖液(5xSSC)導(dǎo)入，并允許被動雜交，或者以50mM組氨酸導(dǎo)入，并電靶送到俘獲寡核苷酸上。如圖所示，被雜交寡核苷酸的電靶送速率是被動雜交的30到40倍多。在缺少施加電場的情況下使用組氨酸沒有觀察到雜交，不管進行多少時間。因此，濃縮自身并不能充分解釋在電場中寡核苷酸雜交效率顯著的增加。
除了迅速的遷移和信號在碘片上的高水平的聚集，D]GABA、b-丙氨酸，以及甘氨酸都不能支持序列的特異性雜交。半胱氨酸則很難評定，因為其信號聚集很差。相反，當(dāng)使用非互補俘獲序列作為對照時組氨酸表現(xiàn)出特異性雜交。互補俘獲信號序列水平對非互補俘獲信號水平的比率可以作為特異性的指示。圖23示出了被發(fā)現(xiàn)在促進電雜交中有效(互補＞非互補，P＜0.05)的緩沖液的比較。這些緩沖液包括組氨酸、取代的組氨酸、和雜環(huán)類例如咪唑、吡啶和可力丁(異種三甲基化的吡啶)(圖5)。在表4中列出的緩沖液中的共同特性是弱堿的存在，例如咪唑環(huán)，其pKa值接近中性。
表4緩沖液 被遷移1，2 特異性雜交1雜交率3(微微微摩爾)吡啶 764+/-66 12.8+/-4.2 1.7咪唑 528+/-63 21.2+/-6.6 4.0可力丁 382+/-63 14.1+/-4.6 3.73-甲基組氨酸 259+/-48 54.0+/-14.8 20.8D-組氨酸 490+／-50 119+/-11.8 24.3L-組氨酸 533+/-65 78.0+/-9.1 14.6肌肽 129+／-45 33.7+/-12.1 26.11-甲基組氨酸 141+/-20 30.0+/-5.0 21．31．?dāng)?shù)據(jù)以值+/-SEM的形式列出。2．在完成電靶送后出現(xiàn)熒光信號。3．雜交率={(特異性雜交)/(遷移的)}
相反，不支持雜交的緩沖液不含這種緩沖基團。兩性離子緩沖液例如GABA盡管有高的聚集，但不支持電雜交，再次說明除了寡聚體濃縮之外的因素很重要。這些結(jié)果表明在中性pH的緩沖能力對這些條件下支持雜交可能是一個重要的特性。
進一步分析表4揭示在雜交相對效率之間有顯著的差異。這就是說，在數(shù)據(jù)中出現(xiàn)了兩組明顯不同的組。一組由咪唑、吡啶和可力丁組成。同其他緩沖液，D-和L-組氨酸、肌肽和甲基化的組氨酸衍生物相比，這些化合物產(chǎn)生的雜交率低5倍多。(這些實驗被設(shè)計來揭示雜交率的差異，并因此在不飽和現(xiàn)有的俘獲位點的條件下進行)。更有效的緩沖液都含有咪唑或取代的咪唑環(huán)，在支持雜交方面比咪唑自身更有效。這就表明在這些分子上的其他官能基團也有助于雜交過程。
在表4中列出的最后方面是同其他組氨酸類的化合物相比，L-組氨酸相對低的雜交率。因為特異性雜交是基于從特異性信號中減去非特異性信號，因此這些參數(shù)的任何一個都會影響最終的雜交率。同遷移的材料相比，評定非特異性信號的水平表明L-組氨酸具有較高的非特異性信號，同其他組氨酸類緩沖液為1％或更抵相比為2.2％。在L-組氨酸中高殘留的原因不清楚，然而其他實驗表明這一背景信號可以不必更多的清洗就可以去除?？赡艿脑蚴桥c其他組氨酸類衍生物比較L-組氨酸中的遷移稍高，造成某些域濃度，這樣更多的熒光寡核苷酸進一步濃縮在滲透層，并因此更難于去除。從吡啶得出的結(jié)果某種程度上支持了這一可能性。當(dāng)與咪唑或可力丁比較，吡啶具有較高的遷移和非特異性信號，但是，在它那一組中，它也具有最低的雜交效率。然而，與L-組氨酸中的非特異性相互作用不同，寡核苷酸和有可能滲透層都不能被清除。
pH對雜交的影響如上所述，這些成功地支持雜交的緩沖液具有可滴定的取代基，其pK值等于或接近中性pH。這將是非常重要的，因為在遷移中在陽極(俘獲位點)上電解產(chǎn)生酸。為了評定pH對雜交的影響，一個約75mm外徑的微pH電極被構(gòu)建和位于各個電極位點上恒定的距離。因為水的水解在電極(或在電化學(xué)雙層上)上產(chǎn)生質(zhì)子，從電極表面到滲透層向外，并向外到溶液有一個質(zhì)子梯度。在圖24a和b所示的pH測定值可能比滲透層頂部錨定的寡核苷酸的受到的pH要多少高一些。在缺少緩沖液的情況下，即使在低的電流水平200nA，(圖24a和b)也能觀察到pH顯著的降低。在500nA，微緩沖的系統(tǒng)顯示出pH極迅速的下降，并產(chǎn)生氣泡(圖6B)。相反，GABA在低電流下在緩沖pH某種程度上更加有效。對于200nA或500nA的電流組氨酸和咪唑被證明在維持滲透層上的pH為5以上更加有效。
這些發(fā)現(xiàn)表明咪唑環(huán)起到緩沖組氨酸和咪唑在這些pH范圍的主要根源的作用。相反，GABA不具有這一基團，因此必須依賴羧酸酯基團在低pH下進行緩沖。這些低的pH不支持寡核苷酸孔的雜交(Bloomfield’74)?；蛘呤?，在中性附近不能變得質(zhì)子化可能阻止這些緩沖液提供屏蔽帶負電的磷酸骨架之間的排斥作用的陽離子。
為了弄清楚GABA不能支持雜交是酸環(huán)境還是不能提供足夠的陽離子屏蔽的結(jié)果，用中性骨架(PNA)代替俘獲寡核苷酸的帶負電的磷酸酯骨架，并檢驗替換的效果。PNA雜合體被證明具有類似的親和性，但很大程度上是鹽依賴的(Egholm’93)。在圖25中顯示了檢查PNA替換效果的四組實驗的的一組代表結(jié)果。該圖表示使用PNA或DNA俘獲寡核苷酸和一個共用的熒光標(biāo)記的DNA寡核苷酸在組氨酸和GABA中的比較。可以看到在200nA下在GABA中的雜交在不帶電荷的PNA骨架寡核苷酸和DNA報告寡核苷酸之間，對相應(yīng)的DNA∶DNA配對沒有觀察到雜交。因為達到了類似程度的局部核苷酸濃度，這就表明磷酸二酯骨架的屏蔽雜交過程是在這些條件下的一個重要部分。這一觀察進一步通過在200nA的GABA中和500nA的組氨酸中獲得的pH(圖24)而得到支持。在200nA的GABA中沒有觀察到雜交，盡管pH的范圍與DNA∶DNA雜交的相近。因此一些除了pH之外的成分看來對雜交是必需的。
然而，如果pH降低到臨界水平之下，酸性將對于支持核苷酸堿基之間的雜交太強。這可以解釋為什么在500nA下GABA中PNA∶DNA或DNA∶DNA雙鏈體不能雜交的原因。
相反，在組氨酸中的DNA∶DNA雜交只在500nA下產(chǎn)生，而PNA∶DNA雜交在所有電流下都有幾乎相等的效率。在組氨酸中比在GABA中這些電流對應(yīng)于較高pH值。在200nA，溶液的pH》5，在500nA，pH》5。因此，在200nA同在500A相比，較少的組氨酸分子被質(zhì)子化。較高濃度的質(zhì)子化的種類將適合于屏蔽磷酸二酯骨架并允許DNA雜交。
為了檢驗是否組氨酸有助于雜交，在組氨酸中進行被動(非電)雜交。如圖26所示，在其等電點的組氨酸不能有助于雜交。在這一pH，不管多么長的時間組氨酸分子幾乎不擁有凈正電荷。相反，在pH6.0和5.0的組氨酸促進雜交。因此，在組氨酸支持雜交的能力和其質(zhì)子話程度之間看來有對應(yīng)關(guān)系。通過含近1M鹽的SSC與50mM組氨酸對比有更高的效率證明屏蔽可以是更有效的。然而，因為溶液變得更酸性，在組氨酸中的雜交降低。這可能是由于對寡核苷酸自身的影響以及對增加組氨酸的質(zhì)子化沒有貢獻，而組氨酸的質(zhì)子化將增加在組氨酸上的凈正電荷并有助于雜交。和前面的結(jié)果一起看，因此在這些條件下包括濃縮、維持pH在近中性和產(chǎn)生合適屏蔽核苷酸磷酸二酯骨架的陽離子類都促進電介導(dǎo)的DNA∶DNA復(fù)合體雜交。
討論將電場施加到微規(guī)模的寡核苷酸陣列上將使得雜交反應(yīng)顯著增強和精確控制。這些優(yōu)點通過使用低電導(dǎo)率或某些兩性離子緩沖液來增強。一般地，在施加電流的情況下這些低離子強度的緩沖液允許寡核苷酸有效遷移到離散的位點。因為在被動條件下這些緩沖液對雜交是不適宜的，這就為雜交的控制提供只提供了可編程的陽極位點。除了濃度的質(zhì)量作用效應(yīng)，我們的結(jié)果表明電化學(xué)介導(dǎo)的產(chǎn)生的帶正點的緩沖液離子也有助于雜交過程。我們已經(jīng)注意到在這些條件下支持雜交的低電導(dǎo)緩沖液選擇的小組。因此，我們可以通過應(yīng)用緩沖液和電流把遷移從雜交分離出來。
這一編程的pH梯度使得雜交區(qū)離散激活，并對微點子裝置是一種新型的應(yīng)用。在我們所說的情況下，緩沖液起到兩個作用1)盡可能維持pH接近中性；2)主動參與反應(yīng)。實際上，如果pH低至臨界域值之下，雜交將被阻止。簡而言之，在減輕在陽極水解產(chǎn)生的有害pH效果上，我們形成了對雜交反應(yīng)有利的一些緩沖液種類。
有趣的是，這些緩沖液支持雜交過程的的效率取決于所具有的官能團的特性。這就是說，一旦滿足在雜交窗口內(nèi)具有的緩沖能力和并結(jié)果產(chǎn)生帶正電種類的標(biāo)準，其他的官能團也可能影響雜交過程。組氨酸和相關(guān)分子比咪唑自身的效率增加5倍也可以反映出組氨酸能在咪唑環(huán)以及伯胺上維持正電荷。向簡單的二價陽離子鹽例如Mg++，這兩個正電荷將更有效地減少骨架的排斥作用。進而這些兩性離子的修飾可以導(dǎo)致雜交率額外增加。
對這些微電極裝置的利用才剛剛開始。隨著我們對這些裝置的行為和允許它們優(yōu)化使用的條件更清楚的理解，它們的利用將從核酸擴展到其他帶電物質(zhì)上。最終，通過合適的顯微裝置它們可以代替我們目前的分子生物裝置。
盡管DNA被用作首要的例子，上述裝置和方法也可以用于處理和分析靶RNA分子、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)和其他大分子。
所有參考的刊物在在這里都被引用作為參考，包括在每一刊物中列出的核酸序列和氨基酸序列。
實施例14雙鏈DNA片段的電雜交和單堿基錯配分析下面描述了在基本上含雙鏈(ds)核酸靶序列的樣品中進行迅速的電雜交和單堿基錯配識別的基本實驗步驟。在這一實施例中，靶材料是從鐮刀形紅細胞陽性人胎盤組織中擴增的β-球蛋白序列的123個堿基對(bp)PCR擴增子。β-球蛋白序列含有鐮刀形細胞突變位點(密碼子7)其中有一個A---→T的堿基變換。
標(biāo)準的有80微米試驗位點(微定位區(qū))的25位APEX芯片被用于這些實驗。芯片被覆蓋上一層0.7微米的厚/薄瓊脂糖(見實驗13)，其中上層含有抗生物素蛋白鏈菌素，以提供要尋址的寡核苷酸生物素俘獲探針的附著位點。三個不同的俘獲探針被電尋址到在25微定位區(qū)APEX芯片上的5行試驗位點之一的2，3，和4試驗位點(列)位置。這些俘獲探針是(1)GCAP-1，與野生型β-球蛋白靶序列互補的24聚體序列；(1)GCAP-2，與錯配(突變)序列互補的24聚體序列；和ATA-4，與野生型β-球蛋白靶序列互補的17聚體序列。序列如下所示GCAP-15’-CAGACTTCTCC(T)CAGGAGTCAGGT-3’-生物素GCAP-25’-CAGACTTCTCC(A)CAGGAGTCAGGT-3’-生物素ATA-4 5’-GTCTCCTTCCTCTCCAG-3’-生物素使用下面的方法尋址上述俘獲探針。在50mM組氨酸(pH7.4)中的約500uM濃度供應(yīng)每一探針。約5ul的GCAP-1俘獲探針溶液被加到第2列芯片表面的主動區(qū)域上。電尋址條件是每微定位區(qū)200那安培(nA)1分鐘，同時使尋址的定位區(qū)相對于偏壓為負的周邊對照墊片偏壓為正。然后用50mM的組氨酸進行浸洗。接著將約5ul的GCAP-2俘獲探針溶液加到芯片表面的主動區(qū)域上并電尋址到第3列中的五個微定位區(qū)上。電尋址條件是每個微定位區(qū)200nA 1分鐘，同時使尋址的定位區(qū)相對于偏壓為負的周邊對照墊片偏壓為正。
最后，將5ul的ATA-4俘獲探針加到芯片表面的主動區(qū)域，并電尋址到第4列芯片的第5微定位區(qū)上。電尋址條件是每微定位區(qū)200nA 1分鐘，同時使尋址的定位區(qū)相對于偏壓為負的周邊對照墊片偏壓為正。
使用標(biāo)準的PCR條件進行鐮刀細胞陽性人胎盤組織的PCR擴增。這時將約2νl PCR擴增材料直接從PCR反應(yīng)試管中取出并與98νl 50mM組氨酸(pH7.4)混合，將樣品加熱到100℃并迅速冷卻到室溫。然后將5νl這一樣品直接加到芯片表面。然后將在芯片上的每一行(1到5)的三個試驗定位區(qū)(在2，3和4列)通過偏壓為正(相對地周邊對照電極偏壓為負)雜交到產(chǎn)生1.8νA直流電(每一試驗位點為60nA)的三個試驗微定位區(qū)2分鐘。在電雜交到試驗位點后，用組氨酸和40mM磷酸鈉/500mM氯化鈉(pH7.4)緩沖液進行洗滌。然后用與靶擴增序列的另一部分互補的熒光(bytr)報告探針被動雜交芯片5分鐘。應(yīng)當(dāng)指出的是如果擴增子具有已經(jīng)結(jié)合(通過PCR引物之一)的熒光標(biāo)記，或如果使用插入染料技術(shù)之一能檢測雜合體，這一步驟不是必需的。在報告探針雜交后，用組氨酸緩沖液洗滌芯片。在20mM磷酸鈉/Tris(pH9.5)下進行電嚴緊控制，在如下的電流水平使用150DC脈沖(0.1秒/0.1秒切斷)30秒(對每行的三個試驗位點)行電流(νA)/3個墊片 錯配/匹配率(1)1.6 1.3到1(2)1.7 1.4到1(3)1.8 2.0到1(4)1.9 1.8到1(5)1.8 1.7到1在進行電嚴謹控制后通過測定熒光強度的相對差異確定匹配/錯配率?？梢钥吹?，最優(yōu)選的電嚴緊控制是對三個點1.8到1.9νA，或?qū)γ總€點600到630nA。
盡管上述發(fā)明為了清楚和便于理解在一定程度上是通過舉例和實施例描述的，但對本發(fā)明的講述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言很清楚可以進行一定程度的改動和修改，而不偏離附加的權(quán)利要求的精神和范圍。
權(quán)利要求
1．一種用來在一種主動式電子系統(tǒng)中遷移和雜交DNA的方法，包括在所述裝置上提供一種低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液，把所述核酸電泳遷移到一個微定位區(qū)，向微定位區(qū)施加電流和電壓以影響遷移，其中，在其微定位區(qū)上的局部pH低于緩沖液在其等電點的pH，從而使核酸和位于微定位區(qū)的探針之間的雜交得到加強。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的用來增強核酸的遷移和雜交的方法，其特征在于低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液是組氨酸緩沖液。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的用來增強核酸的遷移和雜交的方法，低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液是L-組氨酸緩沖液。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的用來增強核酸的遷移和雜交的方法，低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液是D-組氨酸緩沖液。
5．一種用來在一種主動式電子陣列式裝置上有效遷移和雜交DNA的方法，該裝置具有多個微定位區(qū)，并至少在某些微定位區(qū)包括探針，該方法包括步驟向裝置上提供第一種低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液，把所述核酸提供到裝置的所述低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液中，向至少某些微定位區(qū)施加電流和電勢以使所述核酸向選定的微定位區(qū)遷移，將該緩沖液改換成具有高的鹽濃度的第二種緩沖液，和使所述核酸與在選定的微定位區(qū)的探針之間進行雜交。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的用來增強核酸的遷移和雜交的方法，其特征在于低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液是胱氨酸緩沖液。
7．根據(jù)權(quán)利要求5所述的用來增強核酸的遷移和雜交的方法，其特征在于低電導(dǎo)率的兩性離子緩沖液是丙氨酸緩沖液。
8．根據(jù)權(quán)利要求5所述的用來增強核酸的遷移和雜交的方法，其特征在于所述鹽濃度為約50mM到100mM。
9．一種用來檢測在雙鏈擴增子中的點突變的方法，包括步驟向一個主動式、可編程電子陣列式裝置提供擴增子產(chǎn)物，在低電導(dǎo)組氨酸緩沖液中稀釋所述產(chǎn)物，使所述產(chǎn)物變性，在裝置上的組氨酸緩沖液中雜交所述變性產(chǎn)物，進行嚴緊型控制以鑒別匹配與錯配，和檢測和分析所述產(chǎn)物。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的用來檢測在擴增子中的點突變的方法，其特征在于嚴緊控制包括電子嚴緊控制。
11．根據(jù)權(quán)利要求9所述的用來檢測在擴增子中的點突變的方法，其特征在于該檢測是熒光檢測。
12．根據(jù)權(quán)利要求9所述的用來檢測在擴增子中的點突變的方法，其特征在于熒光指示探針序列與所述產(chǎn)物雜交。
全文摘要
設(shè)計和制造了一種自尋址、自組裝微電子裝置以顯微尺寸主動進行和控制多步和多路分子生物反應(yīng)。這些反應(yīng)包括核酸雜交、抗體/抗原反應(yīng)、診斷和生物聚合物合成。使用微—光刻技術(shù)和微—加工技術(shù)都可以制造出該裝置。該裝置可以電子控制特異結(jié)合體向特異微定位區(qū)的遷移和附著。該特異結(jié)合體包括分子生物分子,例如核酸和多肽。裝置可以隨后控制在尋址的特異微定位區(qū)上的分析物或反應(yīng)物的遷移和反應(yīng)。該裝置能夠富集分析物和反應(yīng)物,去除非—特異性結(jié)合分子,對DNA雜交反應(yīng)提供嚴緊控制,并改善分析物的檢測。該裝置在電子上可以被復(fù)制的。
文檔編號B01L3/00GK1284082SQ98813432
公開日2001年2月14日 申請日期1998年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月5日
發(fā)明者羅納德·G·索斯諾烏斯基, 威廉·F·巴特勒, 尤金·圖, 麥克爾·I·內(nèi)倫伯格, 麥克爾·J·海勒, 卡爾·F·埃德曼 申請人:內(nèi)諾金有限公司