專利名稱：吸附樹脂法從甜菊糖中富集、分離菜鮑迪甙a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬大孔吸附樹脂的合成及其應(yīng)用。
甜菊糖是從甜葉子中提取出來的一種高甜度、低熱值、非糖、非營(yíng)養(yǎng)型安全可靠的天然甜味劑，它主要由8種已知糖甙組成。其名稱和化學(xué)結(jié)構(gòu)如表1所示[1]。(1.Hansib J.R.，DeOliveira B.H.，Stevioside and related sweet diterpenoid glycosides，Natural Product Reports，1993，301-309)表1甜葉菊總糖甙中各組份結(jié)構(gòu)及相對(duì)于葉含量
G葡萄糖基Rh-鼠李糖基其中甜菊甙(Stevioside)、萊鮑迪甙A(RebaudiosideA)和萊鮑迪甙C(Rebaudioside c)在總糖中的相對(duì)含量較高，也是影響甜菊糖味質(zhì)的主要成份。S甙的甜度是蔗糖的270-280倍，但它呈味速度慢，帶有一定的不良余味。(甙的甜度不到蔗糖的50倍，且有較強(qiáng)的后苦味及不良余味。C甙的甜度不到蔗糖的50倍，且有較強(qiáng)的后苦味及不良余味。A甙的甜度最高，大于蔗糖的300倍，而且味質(zhì)也最好，不含任何不良余味，是一種最為理想的天然甜味劑。提取分離高A甙含量的甜菊糖產(chǎn)品是近年來國(guó)際、國(guó)內(nèi)甜菊糖生產(chǎn)工業(yè)的研究熱點(diǎn)。然而，由于這幾種糖甙具有相同的甙元，其結(jié)構(gòu)與分子極性都非常相近，因此很難用常規(guī)手段將其分離，特別是分離高純度、高品質(zhì)的A甙產(chǎn)品。迄今為止，有關(guān)甜菊糖各組份分離報(bào)導(dǎo)的主要手段有高效液相色譜法(HPLC)[2-5][2.Dobberstein R.H.，Almed M.S.，Extraction，separationand recovery of diterpene glycosides fromStevia rebaudiana plants.US 4,361,697，1982；3.AhmedM.S.，Dobberstein R.H.，Stevia rebaudiana.II High-performance“quid chromatographicseparation and quantitation of stevioside，rebaudioside A and rebaudioside C.J.Chromatogr，1982，236(2)523-526；4.Ahmed M.S.，Dobberstein R.H.，Stevia rebaudiana.II High-performanceliquid chromatographic separation and quantitation of rebaudioside B，Dand E，dulcoside A andsteviolbioside.J.Chromatogr.，1982，245(3)373～376；5.Makapugay H.C.，Nanayakkara N.P.D.，Kinghorn A.D.，Improved high-performance liquid chromatographic separation of the steviarebaudiana sweet diterpene glycosides using linear gradient elution，J.Chromatogr.，1984，283，390～395]、薄層色譜法(TLC)[6-7][6.Metivier J，Viana A.M.，Determination of microgramquantities of stevioside from leaves of Stevia rebaudiana Bert.bytwo-dimensional thin layerchromatography.J.Exp.Bot.，1979，30(117)805～810；7 Sherma J.，Norfolk E.，Quantitative TLCdetermination of stevioside and rebaudioside A in beverages J Liq.Chromatogr.，1992，15(17)2981～2988]、滴液逆流色譜法[8][8.Kinghorn A.D.，Nanayakkara N.P.D.，Soejarto D.D.etal.，Potential sweetening agents of plant orgin I Purification of Stevia rebaudiana sweetconstituents by droplet countercurrent chromatography.J.Chromatogr.，1982，237(3)478-483]、毛細(xì)管電泳法[9-10][9.Liu J.，Li S.F.Y.，Separation and determination of Stevia sweeteners bycapillary electrophoresis and high performance liquid chromatogr.，J.Liq.Chromatogr.，1995，18(9)1703-1719；10.Mauri P.，Catalano G.，Gardana C.，Pietta P.，Analysis of Stevia glycosides bycapillary electrophoresis.Electrophoresis，1996，17(2)367～371]、超臨界萃取法[11-12][11.KienleUdo，Process for the preparation of a natural sweetening agent from Stevia rebaudiana and its use.EP 335，265，1989；12.Tan S.，Shibuta Y.，Tanaka O.，Isolation of sweetener from SteviarebaudianaJP63，177，764，1988]等，但這些方法的可處理量小，都不適合開發(fā)工業(yè)化生產(chǎn)。近兩年來，日本出現(xiàn)了從一種特殊的高A甙含量的甜菊葉中通過重結(jié)晶法提取分離A甙的報(bào)導(dǎo)[13-14][13.Morita T.，Nishimura M，Ishikawa H.，Manufacture of a sweetener difficult to dissolve inwater from Stevia extract.JP 07,177,802，1995；14.Katanami T.，Kitatsume M.，Prep.of Steviasweetener.JP 07,143,860，1995]，其產(chǎn)品已開始打入國(guó)際市場(chǎng)。但他們所選用的甜菊葉原料較難獲得，A甙含量大于80％的甜菊糖產(chǎn)品成本高于普通甜菊糖的4-5倍。
利用樹脂吸附的弱選擇性特點(diǎn)分離甜菊糖的研究目前尚未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)和專利報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)合成了系列具有高選擇性大孔吸附樹脂，首次嘗試了利用大孔吸附樹脂選擇性吸附的作用通過簡(jiǎn)單可行，易于工業(yè)化的手段從高S甙甜菊糖中分離出富集A甙的甜菊糖產(chǎn)品，再經(jīng)進(jìn)一步純化，得到純度大于90％的A甙產(chǎn)品。
本發(fā)明的內(nèi)容主要有樹脂的設(shè)計(jì)合成；樹脂法分離富集A甙工藝，以及A甙的進(jìn)一步純化。樹脂的合成方法如下于三口瓶中將工業(yè)二乙烯苯、4--乙烯基吡啶和過氧化苯甲?；旌暇鶆?，加入混合致孔劑烷基苯與液體石蠟。加入NaCl水溶液，使水油相體積比控制在一定范圍內(nèi)，加入聚乙烯醇，做表面活性劑，開動(dòng)攪拌，控制攪拌速度，使小球的粒徑分布在80-200目之間，升溫至80℃，恒溫反應(yīng)2小時(shí)，繼續(xù)升溫至90℃，恒溫反應(yīng)4小時(shí)。最后升溫至95-100℃煮球2小時(shí)，使聚合完全。所得樹脂用熱水充分洗滌，涼干后分別用乙醇、石油醚各抽提8小時(shí)，室溫下減壓干燥備用。
樹脂法分離富集A甙包括樹脂的活化及A甙的富集，樹脂的活化方法如下稱取一定量的樹脂用適量乙醇溶脹過夜，然后逐漸過渡到水相。準(zhǔn)確量取一定體積的濕樹脂并將其轉(zhuǎn)入內(nèi)徑為0.8～1.0cm樹脂柱中，以1BV/h的流速使20-30ml 5％的稀HCl溶液緩慢流過樹脂床、水洗至中性備用。
A甙的富集可用下列兩個(gè)方法其中一個(gè)方法是配制一定濃度的甜菊糖水溶液，使其以一定流速緩慢流過樹脂床。此時(shí)樹脂對(duì)甜菊糖分子產(chǎn)生吸附與選擇性吸附作用。檢測(cè)流出液，自泄漏點(diǎn)起每10ml或20ml為一組份等體積接收流出液，并用HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至流出液中A甙含量小于S甙。合并流出液濃縮至干燥，所得甜菊糖中A甙含量高于S甙。另一個(gè)富集A甙的方法是將高S甙甜菊糖用甲醇重結(jié)晶，結(jié)晶母液濃縮至干燥。然后將母液糖配成一定濃度的水溶液，使其以一定流速緩慢流過樹脂床。檢測(cè)流出液，自泄漏點(diǎn)起每10ml或20ml為一組份等體積接收流出液，并用HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至流出液中的雜質(zhì)含量與原母液接近為止。合并流出液，濃縮至干燥，所得甜菊糖中A甙含量高于S甙，并且雜質(zhì)含量低于原母液。
A甙的進(jìn)一步純化方法將用樹脂法處理得到的高A甙含量的甜菊糖產(chǎn)品，用含水量為0～50％的甲醇進(jìn)行重結(jié)晶。
通過上述方法得到的高A甙含量甜菊糖產(chǎn)品，用含水量為0～50％的甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，通過控制重結(jié)晶條件可以得到A甙含量大于90％的結(jié)晶產(chǎn)品熔點(diǎn)為227～229℃。
實(shí)例1于三口瓶中將工業(yè)二乙烯苯95克、4-乙烯基吡啶5克和過氧化苯甲酰1克，混合均勻后加入混合致孔劑烷基苯與液體石蠟，總重量為200克，其中烷基苯與石蠟的重量比為2∶1。加入NaCl水溶液，使水油相體積比控制在5∶1，并加入0.5％的聚乙烯醇作表面活性劑。開動(dòng)攪拌，控制攪拌速度，使小球粒徑分布在80～200目之間。以5℃/10min的速度勻速緩慢升溫至80℃，恒溫反應(yīng)2小時(shí)。繼續(xù)升溫至90℃，恒溫反應(yīng)4小時(shí)。最后升溫至95～100℃煮球2小時(shí)，使聚合完全。所得樹脂用熱水充分洗滌，涼干后分別用乙醇、石油醚各抽提8小時(shí)，室溫下減壓干燥備用。
稱取一定量的樹脂用適量乙醇溶脹過夜，然后逐漸過渡到水相。準(zhǔn)確量取20ml濕樹脂并將其轉(zhuǎn)入內(nèi)徑為0.8～1.0cm樹脂柱中，以1BV/h的流速使20～30ml 5％的稀HCl溶液緩慢流過樹脂床，然后水洗至中性。再以1BV/h的流速使20～30ml 1N的NaOH溶液緩慢流過樹脂床，水洗至中性備用。
配制4mg/ml的甜菊糖水溶液，使其以1BV/h的流速緩慢流過樹脂床。此時(shí)樹脂對(duì)甜菊糖分子產(chǎn)生選擇性吸附作用。檢測(cè)流出液，流出液達(dá)380ml開始泄漏，自泄漏點(diǎn)起每20ml為一組分，等體積接收流出液，并用HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至500ml后流出液中A甙含量小于S甙。合并流出液，濃縮至干燥，得到高A甙含量甜菊糖約200mg，其中A甙與S甙的含量比約為(2.8～1.0)∶1。樹脂可用70％乙醇再生，用水洗凈后可反復(fù)使用。

圖1給出原糖液與流出液的HPLC譜圖。
實(shí)例2于三口瓶中將工業(yè)二乙烯苯97克、4-乙烯基吡啶3克和1克過氧化苯甲?；旌暇鶆颉⒓尤牖旌现驴讋┩榛脚c液體石蠟，總重量為200克，其中烷基苯與石蠟的重量比為5∶1。以NaCl水溶液做為分散劑，水油相體積比控制在5∶1，并加入0.5％的聚乙烯醇做為表面活性劑。開動(dòng)攪拌，控制攪拌速度，使小球粒徑分布在80～200目之間。以5℃/10min的速度勻速緩慢升溫至80℃，恒溫反應(yīng)2小時(shí)。繼續(xù)升溫90℃，恒溫反應(yīng)4小時(shí)。最后升溫至90～100℃煮球2小時(shí)，使聚合完全。所得樹脂用熱水充分洗滌，涼干后分別用乙醇、石油醚各抽提8小時(shí)，室溫下減壓干燥備用。
稱取一定量的樹脂用適用乙醇溶脹過夜，然后逐漸過渡到水相。準(zhǔn)確量取10ml濕樹脂并將其轉(zhuǎn)入內(nèi)徑為0.8～1.0cm樹脂柱中，以1BV/h的流速使20～30ml 5％的稀HCl溶液緩慢流過樹脂床，然后水洗至中性。再以1BV/h的流速使20～30ml 5％的稀HCl溶液緩慢流過樹脂床，然后水洗至中性備用。
稱取20克甜菊糖，用250ml甲醇溶解，于3～5℃冷卻結(jié)晶48小時(shí)。過濾，并將母液濃縮至干燥。將母液糖配制成4mg/ml的甜菊糖水溶液，使其以1BV/h的流速緩慢流過樹脂床。此時(shí)，樹脂對(duì)甜菊糖及其雜質(zhì)分子產(chǎn)生選擇性吸附作用。檢測(cè)流出液，達(dá)185ml后開始泄漏，自泄漏點(diǎn)起每20ml為一組份等體積接收流出液，并用HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，445ml以后流出液中的雜質(zhì)含量開始顯著增高，并且A甙與S甙的比值也基本接近母液糖。停止收集，合并流出液，濃縮至干燥，得到高A甙含量甜菊糖約610mg，其中A甙與S甙的含量比約為(8.1～1.7)∶1。圖2給出母液糖與流出液糖的HPLC譜圖。
實(shí)例3于三口瓶中將工業(yè)二乙烯苯50克、4-乙烯基吡啶10克和過氧化苯甲酰0.8克混合均勻，加入混合致孔劑烷基苯與液體石蠟，總重量為60克，其中烷基苯與石蠟的重量比為1∶1。加入NaCl水溶液，使水油相體積比控制在4∶1，并加入0.8％的聚乙烯醇做為表面活性劑。開動(dòng)攪拌，控制攪拌速度，使小球粒徑分布在80～200目之間。以5℃/10min的速度勻速緩慢升溫至80℃，恒溫反應(yīng)2小時(shí)。繼續(xù)升溫90℃，恒溫反應(yīng)4小時(shí)。最后升溫至90～100℃煮球2小時(shí)，使聚合完全。所得樹脂用熱水充分洗滌，涼干后分別用乙醇、石油醚各抽提8小時(shí)，室溫下減壓干燥備用。
稱取一定量的樹脂，用適量乙醇溶脹過夜，然后逐漸過渡到水相。準(zhǔn)確量取10ml濕樹脂并將其轉(zhuǎn)入內(nèi)徑為0.8～1.0cm樹脂柱中，以1BV/h的流速使20～30ml 5％的稀HCl溶液緩慢流過樹脂床，然后水洗至中性。再以1BV/h的流速使20～30ml 1N的稀HCl溶液緩慢流過樹脂床，并水洗至中性備用。
配制4mg/ml的甜菊糖水溶液，使其以1BV/h的流速緩慢流過樹脂床。此時(shí)，樹脂對(duì)甜菊糖分子產(chǎn)生選擇性吸附作用。檢測(cè)流出液，120ml開始泄漏，自泄漏點(diǎn)起每10ml等體積接收流出液，并用HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至245ml以后流出液中A甙與S甙基本相等。合并流出液，濃縮至干燥，得到高A甙含量甜菊糖約135mg。
實(shí)例4準(zhǔn)確稱取5克用樹脂法處理得到的高A甙含量甜菊糖產(chǎn)品，用含水量為10％的甲醇溶液加熱溶解，過濾，冷卻至3～5℃進(jìn)行重結(jié)晶，可以得到A甙含量約為91-93％的結(jié)晶產(chǎn)品約2～2.5克，熔點(diǎn)為219～221℃。
圖3給出A甙的HPLC譜圖。
圖1甜菊糖溶液分離前后的HPLC譜圖，其中a為原溶液，b為動(dòng)態(tài)分離后的流出液圖2母液甜菊糖溶液分離前后的HPLC譜圖，其中a為母液糖(4mg/ml)，b為樹脂分離后的流出液圖3重結(jié)晶后萊胞迪甙A的HPLC譜圖
權(quán)利要求
1.一種用于分離富集萊鮑迪甙A的大孔吸附樹脂，其特征在于它是用下列方法合成于三口瓶中將工業(yè)二乙烯苯50～100克、4-乙烯基吡啶1～15克，過氧化苯甲酰0.5～1.5克，混合均勻，加入混合致孔劑烷基苯與液體石蠟，總重量為50～300克，其中烷基苯與石蠟的重量比為1∶1～10∶1。加入NaCl水溶液，使水油相體積比控制在3∶1～5∶1，并加入0.5～1.0％的聚乙烯醇做為表面活性劑。開動(dòng)攪拌，控制攪一速度，使小球粒徑分布在80～200目之間。以5℃/10min的速度勻速緩慢升溫至80℃，恒溫反應(yīng)2小時(shí)，繼續(xù)升溫至90℃，恒溫反應(yīng)4小時(shí)。最后升溫至95～100℃煮球2小時(shí)，使聚合完全。所得樹脂用水充分洗滌，涼干后分別用乙醇、石油醚各抽提8小時(shí)，室溫下減壓干燥備用。稱取一定量的樹脂用適量乙醇溶脹過夜，然后逐漸過渡到水相。準(zhǔn)確量取20ml濕樹脂并將其轉(zhuǎn)入內(nèi)徑為0.8～1.0cm樹脂柱中，以1BV/h流速使20～30ml稀HCl溶液緩慢流過樹脂床，然后水洗至中性。再以1BV/h的流速使20～30ml 1N的NaOH溶液緩慢流過樹脂床，水洗至中性備用。
2.一種以樹脂法分離富集萊鮑迪甙A的方法，其特征在于在上述大孔吸附樹脂床中，以1BV/h的流速緩慢流過濃度為4mg/ml的甜菊糖水溶液，此時(shí)樹脂對(duì)甜菊糖分子產(chǎn)生選擇性吸附作用，檢測(cè)流出液，380ml開始泄漏，自泄漏點(diǎn)起每20ml為一組分等體積接收流出液，并用HPLC進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至500ml后流出液中A甙含量小于S甙。合并流出液，濃縮至干燥，得到高A甙含量甜菊糖約200mg。樹脂可用70％乙醇再生，用水洗凈后可反復(fù)使用。
全文摘要
甜菊糖是從甜葉菊葉子中提取出來的一種天然甜味劑,它主要由8種已知糖甙組成,其中A甙的甜度最高,大于蔗糖的300倍,而且味質(zhì)也最好。利用樹脂吸附的弱選擇性特點(diǎn)分離甜菊糖A甙的研究目前尚未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)和專利報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了系列具有高選擇性大孔吸附樹脂,首次嘗試了利用大孔吸附樹脂選擇性吸附的作用分離高A甙含量的甜菊糖產(chǎn)品,再經(jīng)重結(jié)晶可得到純度大于90%的A甙產(chǎn)品。
文檔編號(hào)B01J20/26GK1192447SQ9810477
公開日1998年9月9日 申請(qǐng)日期1998年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月18日
發(fā)明者何炳林, 陳天紅, 張楊, 史作清 申請(qǐng)人:南開大學(xué)